HU217586B - Eljárás aktivált limfociták eliminálására szolgáló, hatóanyagként 2-metil-1-oktadecil-glicero-(3)-foszforilkolint tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás hatóanyagként 2-metil-1-őktadecil-glicerő-(3)-főszfőril-kőlint tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására. Atalálmány szerinti eljárást az jellemzi, hőgy az önmagában ismertmódőn előállítőtt hatóanyagőt antigén- vagy mitőgén-aktiváltlimfőciták eliminálására szőlgáló gyógyszerkészítménnyé dőlgőzzák fel. ŕ

Description

A találmány tárgyát hatóanyagként 2-metil-l-oktadecil-glicero-(3)-foszforil-kolint tartalmazó aktivált limfociták eliminálására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítása képezi.

Az Immunobioi folyóiratban, [156/4/5, (1979), pp 498-508], R. Adressen et al. részéről megjelent „Alkyllysophospholipid induced suppression of humán lymhosyte response to...” című közleményben in vitro kísérleteket imák le. Mint ismeretes azonban, az immunológia területén az in vitro kísérletek nem vihetők át in vivő körülményekre.

Az ET18OCH₃ specifikus toxicitását ismertetik a Lipids, 22(11) (1987) 967-999. oldalán W. E. Berdel és szerzőtársai.

Emlősök esetében az immunrendszer lényeges elemei a T- és B-limfociták. Ezek fejlődésük során antigénekre specifikus receptorokat képeznek, úgyhogy minden ilyen limfocita élettartama fennmaradó részére egy ilyenfajta antigénre való specifitást nyer. A nyugvó limfociták (kis limfociták), beleértve az emlékezősejteket, a testszöveteken és a nyirokszerveken valamint a testfolyadékokon keresztül keringenek, és innen ellenőrzik, hogy a testben antigénjeik feltűnnek-e. Amennyiben megjelenik a specifikus antigén, akkor az aktivált nagy limfociták keletkezése közben egy antigén által indukált limfocitaszaporodás indul meg. Ez a szaporodás in vitro is előidézhető a limfoid sejtek speciális antigénekkel való kezelésével. Ugyanezzel a rendszerrel az is kimutatható, hogy mitogén lektinek, tehát fehérjék, amelyek olyan specifikus sejtfelület-determinánsok, melyek szénhidrátokat tartalmaznak, azokhoz kötődnek és azokat összekötik, szintén stimulálnak limfoid sejteket. A vagy antigénekkel vagy mitogénekkel történő limfocitaaktiválás végül a limfocita limfoblaszttá való éréséhez vezet. Kísérletileg a limfociták mitogén stimulációja mind humán, mind állati eredetű Tsejtek esetében például fitohemagglutininnal (PHA) és konkanavalin A-val (ConA), míg B-sejtek esetében lipopoliszacharidokkal (LPS) kiváltható.

Az elsődleges immunválasz ezért az antigénre vagy mitogénre specifikus limfociták stimulálásának eredménye, úgyhogy ezek a nyugalmi állapotból az aktivált állapotba mennek át, nagy limfocitákká alakulnak, amelyek szaporodnak és effektorsejtekké (például citotoxikus vagy más funkciókkal rendelkező T-sejtekké vagy antitestképző plazmasejtekké, amelyek érett B-sejtekből képződnek) vagy emlékezősejtekké diferenciálódnak. A másodlagos immunválasz azután a nyugvó emlékezősejtek aktiválásával váltódik ki, ami újból effektorsejtek és emlékezősejtek létrejöttét eredményezi.

Az elsődleges vagy másodlagos immunválasz kívánt vagy nemkívánatos jelenségeket okozhat. A legtöbb esetben nemkívánatos jelenségek közé tartoznak például a transzplantátum kilökődések, allergiás reakciók és hasonlók. Ezek általánosságban szerzett, külső antigének által okozott immunológiai betegségekként vagy jelenségekként jellemezhetők.

Amennyiben sikerülne az aktivált limfocitákat szelektíven eliminálnunk anélkül, hogy a nyugvó limfociták tulajdonságait hátrányosan megváltoztatnánk, úgy ezáltal általában a szerzett immunológiai betegségeket, amelyeket külső antigének okoznak, megakadályozhatnánk. Ilyen módon például mind allergiás reakciók, mind transzplantátum kilökődések meggátolhatok lennének.

A találmány feladataként azt tűztük ki, hogy olyan gyógyszerkészítményt találjunk, amely lehetővé teszi, hogy specifikusan aktivált limfocitákat anélkül elimináljunk, hogy nyugvó limfocitákat befolyásolnánk, különösen anélkül, hogy nyugvó limfocitákat antigénekkel vagy mitogénekkel való stimulálhatóságuk szempontjából hátrányosan befolyásolnánk.

Ezt a feladatot a 2-metil-l-oktadecil-glicero-(3)foszforil-kolint - a továbbiakban ET18OCH₃-ként jelölve - tartalmazó, antigén- vagy mitogén-aktivált limfociták eliminálására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítási eljárásának kidolgozásával oldottuk meg.

Az ET18OCH₃ és előállítása ismert. [Berchtold, R. (1982). Preparation ofl l-O-Oktadecyl-2-O-Methyl-snglycero-3-phosphochline. Chemistry and Physics of Lipids 30:389-392]. Ismeretes továbbá az is, hogy az ET18OCH₃ tumorok (DE-A1 2619686 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentés) és szklerózis multiplex (DE-A1 3530767 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentés) ellen hatásos szerként alkalmazható. Aktivált limfociták specifikus eliminációjára, ahogy azt a találmány bemutatja, azonban ebből nem lehetett következtetni. A találmány azon a felismerésen alapul, hogy az ET18OCH₃ szelektíven eliminál antigénnel vagy mitogénnel aktivált limfocitákat. Az ET18OCH₃-nak még hosszabb behatása sem befolyásolja negatívan a nyugvó limfocitákat, és lehetővé teszi antigénekkel vagy mitogénekkel való későbbi stimulálásukat. Különösen fontosnak találjuk azt a felismerést, hogy az ET18OCH₃-nak még hosszabb alkalmazása sem fejt ki semmiféle negatív hatásokat az in vivő immunreakcióra, mégpedig sem a B- sem a T-sejt-reakciókra.

A találmányunk szerinti megoldás új indikációs területe a következő szerzett, külső antigének által okozott immunológiai betegségek vagy jelenségek megakadályozására szolgáló gyógyszerkészítmény.

A találmány szerinti új indikáció ezért lehetővé teszi, hogy szelektíve aktivált nagy limfocitákat elimináljunk, és ezáltal az ezen limfociták által kiváltott immunreakciót elnyomjuk. Mivel a nyugvó limfocitákat egyidejűleg negatívan nem befolyásoljuk, a találmány szerinti készítmény magát az immunrendszert nem befolyásolja. Ez egy lényeges előny az eddig ismert immunszuppresszív készítményekkel szemben, amelyek magát az egész immunrendszert befolyásolják, és ezáltal a szervezetet más antigénekkel és mitogénekkel szembeni védekezőképességében döntően gyengítik.

Az ET18OCH₃ hatásos dózisa a beadás módjától függ. Általában embernél való alkalmazás esetében szájon át való beadási módnál 10 és 100 mg/személy/nap közötti dózisokat alkalmazunk. Ennél az alkalmazási módnál, amely például a hatóanyagnak valamilyen alkalmas hordozóban, például tejben való feloldásával hajtható végre, előnyösen 30-300 mg/személy/nap

HU 217 586 Β adagokat alkalmazunk. Infúzió útján való beadás esetén ezek a dózisok még jelentősen emelhetők. Helyi alkalmazáskor az általában alkalmazott hatóanyag-koncentrációk jönnek itt is számításba. A következő példák a találmányt rajzokkal együtt részletesen szemléltetik. A rajzokon a következőket ábrázoljuk:

1. ábra: Balb C egerek lépsejtjeiből nejlonvattán való átengedéssel izolált T-limfocitákkal végzett in vitro kísérletek (I) és nejlonvattán át tisztított Balb C egerek T-limfociták és C57B16 egerek lépsejtjei együttes tenyésztésével kapott eredmények (II) (1. és 2. példa).

IA. ábra: ³H-timidin (³H-Thy) beépülése a limfocitaaktivitás mértékeként sejtaktivátorok hozzáadásakor, ET18 nélkül.

IB. ábra: ³H-timidin beépülése limfociták révén a sejtaktivátorok hatása alatt ETI8OCH3 hozzáadása esetén az első napon.

IC. ábra: az IB.-hez hasonló állapot ETI8OCH3 hozzáadásakor a második napon.

Az 1 A.-IC. ábrákon: a=ConA, b=aT3, c = LPS, d=aC57B6.

2A. ábra: ³H-timidin beépülése stimulált limfocitákba, ET18 nélkül.

2B. ábra: a 2A.-hoz hasonló állapot, azonban ETI8OCH3 hozzáadásával és csak az ETI8OCH3 hozzáadása után végzett sejtstimulálással.

2C. ábra: A stimulálás és ETI8OCH3 hozzáadása nélküli kontrolieredmények.

A 2A.-2C. ábrákon: a=C57B6, b=CBA, c=ConA, d=aT3, e=LPS.

3A. ábra: ETI8OCH3 befolyása a specifikus antitesteket termelő sejtek keletkezésére.

3B. ábra: a timidinbeépülés T-limfocitákba ET18OCH₃-mal végzett előkezelés esetén és anélkül, 3 nap múlva.

3C. ábra: a 3B.-hez hasonló kísérlet eredményei Blimfocitáknál.

1. példa

Balb C egerek lépsejtjeiből a T-limfocitákat nejlonvattán való átengedéssel izoláljuk. Ezeket azután tenyészetben a poliklonális T-sejt-aktivátor ConA-val vagy anti-CD3-antitestekkel vagy kontroll céljából a B-sejt aktivátor LPS-sel aktiváljuk. A tenyészetek feléhez 1 vagy 2 nap múlva ET18OCH₃-at (10 pg/ml) adunk. A tenyészetek másik fele szolgál kontrollként. A 3. tenyésztési napon mindegyik tenyészethez 3H-timidint adunk, és ennek beépülését a 4. napon mérjük.

Az 1A. ábra a sejtek ConA-val vagy anti-CD3antitestekkel végzett poliklonális aktiválása utáni várható stimulálását mutatja fokozódott 3H-timidin-beépülés formájában. A B-sejt mitogén LPS hozzáadása utáni csekély növekedés azt jelenti, hogy a tenyészetekben még voltak maradék B-limfociták. Minden ilyen aktiválási eredményt teljesen visszaszorított az ET18OCH₃-nak az 1. napon a tenyészetekhez való hozzáadása (lásd az 1B. ábrát), a 2. napon való hozzáadás (lásd az IC. ábrát) még csaknem ilyen teljesen eredményes.

Ebből következik, hogy az ET18OCH₃ in vitro az egér T- és B-limfocitáinak szaporodását gyakorlatilag teljesen meggátolja. A használt aktivátorok körülbelül 24 óra múlva eredményezik az első sejtosztódást, úgyhogy az ET18OCH₃ ebben az időpontban adva is meggátolhatja a sejteknek az első S-fázisba való lépését. Mivel az ET18OCH₃-nak 48 óra után való adagolása is még csaknem teljes gátlást eredményez, ez azt bizonyítja, hogy a már osztódó sejtek is nagyon érzékenyek az ET18OCH₃-ra.

2. példa

A következő kísérleteket végeztük annak megállapítására, hogy az ET18OCH₃ megfelelő koncentrációkban használható-e ahhoz, hogy egy limfocitapopulációból specifikusan csak az aktivált és osztódó sejteket elimináljuk, a nyugvó sejteket viszont érintetlenül hagyjuk:

Nejlonvattán át tisztított Balb C egér (H-e) T-limfocitákat C57B16 egerek (H-2b) lépsejtjeivel együtt tenyésztünk egy „vegyes limfocita reakció” (mixed lymphocyte reaction) érdekében. A tenyészetek feléhez a 3. napon ET18OCH₃-at (10 pg/ml) adunk, a másik fél kontrollként szolgál. Egy további kontrolltenyészet az egyedül Balb C T-limfocitákból ET18OCH₃ nélkül készített tenyészet. 7 nap tenyésztés után az összes sejtet mossuk az ET18OCH₃ eltávolítása céljából, és C57B16 egerek sejtjeivel, illetve CBA egerek (H-2k) sejtjeivel készített tenyészetben újból stimuláljuk a ConA vagy Anti CD3 antitest poliklonális T-sejt aktivátorokkal vagy az LPS B-sejt mitogénnel. 3 nap elteltével azután 3H-timidint adunk hozzá, és a következő napon mérjük ennek beépülését.

A 2A. ábra az ET18OCH₃ nélküli kontrollokkal kapott eredményeket mutatja. Megjegyzendő, hogy a további adalékok nélküli tenyészetek is már viszonylag magas „háttér” timidinbeépülést mutattak, ami maszkírozott egy stimuláció utáni további növekedést. Egyedül ConA eredményezte a beépülés jelentős növekedését.

A 2B. ábrán az ET18OCH₃-mal kezelt tenyészet eredményeit mutatjuk be. A nemspecifikus háttérérték itt teljesen eltűnik, mivel a nemspecifikus szaporodó sejtek eliminálva lettek. A C57B16 sejtekkel restimulált tenyészeteknél sem mutatkozott többé 3H-timidinbeépülés. Említésre méltó azonban a CBA sejtekkel végzett új allogén stimulációra adott reakció és mindenekelőtt a ConA-ra és anti-CD3-antitestekre adott jó reakció. LPS nem eredményezett semmilyen stimulációt, mivel a B-limfociták a tenyésztés során elhaltak.

A 2C. ábra a teljesen stimulálatlan kontrollokkal és ET18OCH₃ nélkül kapott eredményeket mutatja. A ConA-val való stimulálás esetén is szignifikáns stimulációs következmények hiányát azzal kell magyarázni, hogy stimulálatlan egérlimfociták egy 9 napos tenyésztési periódust csak rosszul élnek túl.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy azok a Tlimfociták, amelyek specifikusan egy allo-antigénnel, itt C57B16 egerek H-2b-jével szaporodásra lettek akti3

HU 217 586 Β válva, ET18OCH₃ jelenlétében teljesen eliminálódtak. Ezzel ellentétben viszont más antigén specifitású olyan T-limfociták, amelyek nyugalmi állapotban maradtak, nemcsak megmaradtak, hanem ezt követően is szaporodásra még nagyon jól aktiválhatok voltak. Ezt a CBAra, ConA-ra és anti-CD3-antitestre adott reakciók bizonyították. Az, hogy a teljesen stimulálatlan limfociták (2C. ábra) ET18OCH₃ nélkül sem voltak többé stimulálhatok, azt mutatja, hogy az ET18OCH₃ nyugvó sejteket egyáltalán nem károsít.

Ez a kísérlet mutatja tehát, hogy ET18OCH₃ segítségével antigén-specifikusan aktivált T-sejtklónok szelektíve eliminálhatók, hogy viszont más antigén-specifitású T-sejteket ez egyáltalán nem érint, és ezáltal reaktívak maradnak.

	2A.	2B.	2C.
ábrák szerinti esetben
Az aktivált sejtek száma 1 hét után a tenyészetben	2,4x10»	0,1x10»	1,3x10»
Összes sejtszám	-107	-107	-107

3. példa

C57B16 egereket (10-10 darab) 100-100 pg TNP-KLH-val (trinitro-fenil keyhole limpet hemocyanin), a klasszikus hordozó-haptén-antigénnel immunizálunk. Az állatok 8 hét múlva kapnak egy-egy 30 pg TNP-KLH-t tartalmazó Booster-injekciót. Ezzel egyidejűleg és utána naponta, összesen 5 napon át, az állatok egy része nyelőcsőszonda alkalmazásával tejben 1 mg ET18OCH₃-at kap állatonként és naponta, az állatok másik része tejet ET18OCH₃ nélkül. A Boost, illetve az első ET18OCH₃-beadás után egy héttel eltávolítjuk az állatokból a lépet. Kontrollként az ET18OCH₃mal kezelt és kezeletlen, nem immunizált állatok lépei szolgálnak.

A lépsejtek egy részével közvetlen és közvetett hemolitikus tarfoltvizsgálatokat végzünk olyan B-limfociták kimutatására, amelyek anti-TNP-specifikus IgM- vagy IgG-antitesteket termelnek.

A 3A. ábra azt mutatja, hogy specifikus antitesteket termelő sejtek keletkezését ET18OCH₃ in vivő nem befolyásolta. Az adatok specifitását a nem immunizált állatok esetében észlelt antitesttermelő sejtek csekély száma, ami a háttérértéknek felel meg, mutatja.

Ez az eredmény azt mutatja, hogy az ET18OCH₃ in vivő semmiféle gátló hatást nem fejt ki a primer vagy szekunder humorális immunreakcióra, amit antigénadás után specifikus antitestet termelő B-limfociták keletkezésével mértünk.

Az előbb említett lépsejtek egy további részét in vitro tenyésztettük, és KLH-t (T-limfociták restimulálására), illetve konkanavalin A-t (általános sejtmitogén) vagy TNP-KLH-t (a B-limfociták restimulálására), illetve SRBC-t (sheep red blood cell) (juheritrociták a B-limfociták in vitro primer stimulálásra) adtunk hozzájuk.

A T-sejt reakciókat szaporodási vizsgálatban 3Htimidin-beépüléssel, a B-sejt reakciókat hemolitikus tarfolt vizsgálatban határoztuk meg.

A 3B. ábra a KLH-val restimulált és a ConA-val aktivált T-limfociták timidinfelvételét mutatja, balra a kezeletlen, jobbra az in vivő ET18OCH₃-mal kezelt állatok eredményei. Ez azt bizonyítja, hogy a KLH-val végzett restimulálás dózisfüggő és specifikus. Az állatok ET18OCH₃-mal végzett in vivő előkezelésének semmiféle negatív hatása nincs a T-sejt restimulálásra, illetve a mitogén stimulálásra. Az adatok 5-5 egéren végzett vizsgálatokon alapulnak.

A 3C. ábra a B-limfocitákkal kapott eredményeket mutatja. A TNP-KLH-val végzett restimulálás specifikus, amint az SRBC-vel végzett primer stimulálás is az. Az ET18OCH₃-mal előkezelt állatokból származó sejtek legalább olyan jól reagálnak, mint a kontrollállatokból származó sejtek. Mind a nyugvó T-, mind a nyugvó B-sejtek megtartják stimulálhatóságukat ET18OCH₃ beadása után is. (Az adatok 5-5 egéren végzett vizsgálatokon alapulnak.)

Claims (1)

1. Eljárás hatóanyagként 2-metil-l-oktadecil-glicero(3)-foszforil-kolint tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az önmagában ismert módon előállított hatóanyagot antigén- vagy mitogén-aktivált limfociták eliminálására szolgáló gyógyszerkészítménnyé dolgozzuk fel.