HU214057B

HU214057B - Process for producing balhimycin derivates and pharmaceutical compositions containing them as active component

Info

Publication number: HU214057B
Application number: HU9202163A
Authority: HU
Inventors: Joachim Betz; Hans-Wolfram Fehlhaber; Michael Limbert; Laszlo Vertesy
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1991-06-29
Filing date: 1992-06-29
Publication date: 1997-12-29
Also published as: KR930000537A; EP0521408B1; FI106032B; HRP920191B1; YU60392A; HRP920191A2; CZ199192A3; ES2091369T3; IE922115A1; SI9200126A; AU3308995A; CA2072725A1; IL102326A; NO922520L; IE74901B1; YU48512B; IL102326A0; JPH05271284A; HU9202163D0; FI922954A0

Abstract

(57) KIVONAT A találmány szerinti eljárás az (I) képletű dezmetil--balhimycin, a(II) képletű dezmetil-leűcil-balhimycin, a (III) képletű dezglükő-balhimycin, a (IV) képletű űreidő--balhimycin, az (V) képletűdezmetil-dezglükő-balhimycin, a C67H75Cl2N9O24 összegképletű metil-balhimycin, a C72H83Cl2N9O28 összegképletű balhimyci R és aC73H84Cl2N10O26 összegképletű balhimycin V, valamint azőkfiziőlógiailag elfőgadható savaddíciós sóinak előállítására szőlgál.Az eljárás sőrán a fermentléből a célvegyület ket a balhimycintőlgradiens elűálással lefőlytatőtt őszlőpkrőmatőgráfiás eljárássalizőlálják, és az őszlőpkrőmatőgráfiás izőlálási eljárás megismétlésevagy vizes őldatból vízőldható szerves őldósz r hőzzáadása mellettlefőlytatőtt kristályősítás útján tisztítják, és kívánt esetben i)dezglükő-balhimycin előállítására balhimycint hidrőlizálnak, vagy ii)dezmetil-dezglükő-balhimycin előállítására dezmetil-balhimycinthidrőlizálnak. A találmány tárgyköréhez tartőzik még eljáráshatóanyagként a fenti vegyületeket tartalmazó, baktériűmellenes hatásúgyógyászati készítmény előállítására. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás az (I) képletű dezmetil-balhimycin, a (II) képletű dezmetil-leucil-balhimycin, a (III) képletű dezglüko-balhimycin, a (IV) képletű ureido-balhimycin, az (V) képletű dezmetil-dezglükobalhimycin, a C67H75CI2N9O24 összegképletű metil-balhimycin, a C72H83CI2N9O28 összegképletű balhimycin R és a C₇₃H₈₄Cl₂N₁₀O₂₆ összegképletű balhimycin V, valamint azok fiziológiailag elfogadható savaddíciós sóinak előállítására. A felsorolt vegyületek újak. A találmány vonatkozik még a fenti vegyületek legalább egyikének hatásos mennyiségét tartalmazó gyógyászati készítmény előállítási eljárására is.

A szakirodalom nagyszámú glükopeptid típusú antibiotikumot ismertet. Ezek közül azonban számos antibiotikum hatása gyengébb, mint a glükopeptidek első típusa, a vancomycin nevű kereskedelmi termék, és ezek különösen in vivő hatásuk terén maradnak el a vancomycin nevű terméktől [R. Nagarajan: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1991. április, 605-609. old.].

A vancomycin alkalmazható ugyan Gramm-pozitív kórokozók által okozott fertőző betegségek esetén, azonban alkalmazhatóságát számos súlyos mellékhatás, így az ún. „red mán” szindróma, nekrózisképződés és hasonlók jelentősen korlátozzák. További, nagyon hatásos glükopeptid típusú antibiotikum a balhimycin [468 504 számú európai szabadalmi leírás].

Meglepő módon azt állapítottuk meg, hogy a balhimycinnel rokon vegyületekkel baktériumok ellen nagyon hatásos anyagokat szolgáltathatunk, amelyekkel a vancomycin ismert mellékhatásai nem vagy csak csökkent mértékben járnak együtt. A találmány eljárás az (I) képletű dezmetil-balhimycin, a (II) képletű dezmetilleucil-balhimycin, a (III) képletű dezglüko-balhimycin, a (IV) képletű ureido-balhimycin, az (V) képletű dezmetil-dezglüko-balhimycin, a C₆₇H₇5C1₂N9O₂₄ összegképletű metil-balhimycin, a C₇₂H83C1₂NqO₂₈ összegképletű balhimycin R és a C₇3H₈₄C1₂Ni₀O₂6 összegképletű balhimycin V, valamint azok fiziológiailag elfogadható sóinak előállítására, ahol Y-86,21022 (DSM 5908) Actinomyces mikroorganizmus törzset vizes táptalajon tenyésztünk, majd a fermentlevet elkülönítjük, és a balhimycinszármazéko(ka)t izoláljuk. Az eljárás során a fermentléből a célvegyületeket balhimycintől gradiens eluálással lefolytatott oszlopkromatográfiás eljárással izoláljuk, és az oszlopkromatográfiás izolálási eljárás megismétlése vagy vizes oldatból vízoldható szerves oldószer hozzáadása mellett lefolytatott kristályosítás útján tisztítjuk, és kívánt esetben

i) dezglüko-balhimycin előállítására balhímycint hidrolizálunk, vagy ii) dezmetil-dezglüko-balhimycin előállítására dezmetil-balhimycint hidrolizálunk.

A találmány továbbá eljárás gyógyászati készítmény előállítására, amelynek során egy a találmány szerinti eljárással előállított (I), (II), (III), (IV) vagy (V) képletű vegyületet vagy metil-balhimycint, balhimycin R-et vagy balhimycin V-t vagy annak fiziológiailag elfogadható sóját gyógyászatilag elfogadható segéd- és/vagy hordozóanyagokkal keverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.

A fenti mikroorganizmust 1990. április 6-án a Budapesti Szerződés előírásai szerint letétbe helyeztük.

A megnevezett mikroorganizmust a fenti európai szabadalmi leírásban ismertetett módon szén- és nitrogén-tápanyagforrást, valamint ásványi sókat tartalmazó vizes tápközegben tenyésztjük. A fenti európai szabadalmi leírás ismertet előnyös tenyésztési körülményeket; további előnyös körülményeket az alábbi példákban ismertetünk.

A fenti mikroorganizmus tenyésztése során elsősorban balhimycin keletkezik, és csak csekély mértékben keletkeznek az előzőekben megnevezett vegyületek. A táptalaj összetételének, különösen a nitrogén-tápanyagforrásnak változtatása révén elérhetjük, hogy a találmány szerinti vegyületekből lényegesen nagyobb mennyiség keletkezzen. Meglepő módon azt állapítottuk meg, hogy metionin, szerint és piruvát mmól koncentrációjú mennyiségének adagolásával a balhimycin képződését visszaszoríthatjuk. Ha a metionin antagonistáit, így 1 mmol α-metil-metionint alkalmazunk, a balhimycin dezmetil-komponensének kifejezetté válásával jelentősen fokozódik a kitermelés. Az aszpartátanyagcsere alloszterikus inhibitorai, így L-lizin vagy L-treonin, valamint a leucin antagonistái ugyancsak befolyásolják a termékek spektrumát.

Az Y-86,21022 Actinomyces törzs termék-spektrumát ezenkívül genetikai beavatkozásokkal is befolyásolhatjuk. Önmagában ismert, fizikai vagy kémiai természetű mutagén hatásokkal kiváltott mutációk alkalmas kiválasztási eljárásokkal, így az anyagcserét gátló anyagokkal szembeni ellenálló képesség felhasználásával olyan mutánsokat eredményeznek, amelyek a kívánt mellékkomponenseket erősen megnövekedett arányban termelik, vagy csak kizárólag azokat termelik.

A fenti vegyületek gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sói többek között az acetátok, hidrokloridok, foszfátok és szulfátok, amelyek előállíthatok ismert módon úgy, hogy egy szabad bázis alakjában lévő vegyületet gyógyászatilag elfogadható szerves vagy szervetlen savval, így ecetsavval, sósavval, foszforsavval vagy kénsavval reagáltatunk.

A fenti glükopeptideket előnyösen kationcserélőkkel választjuk el olyan pufferrendszerekben, amelyek nagy arányban tartalmaznak szerves oldószereket. Alkalmas oldószerek többek között a vízzel elegyedő szerves oldószerek, így rövid szénláncú alkoholok, aceton, acetonitril, glikol, dioxán, dimetil-szulfoxid, formamid és hasonlók, de vizes karbamidoldatok is. Előnyös oldószerek a metanol, etanol, izopropanol és aceton. Az oldószerek különösen alkalmas aránya a vizes pufferoldatokban 5-95 térfogat% szerves oldószer, különösen előnyösen 25 és 85 térfogat% közötti arányt alkalmazunk. Minthogy az oldószer növekvő arányával javul az elválasztás, a gyakorlatban célszerűen legalább 35 térfogat% szerves oldószert alkalmazunk.

Az elválasztás műszakilag kivitelezhető léptékű másik lehetőségét „ellentétes fázisok” alkalmazása teszi lehetővé, amelynek során az elválasztás élességét alkalmas intézkedésekkel javíthatjuk. Ilyen intézkedések adalékok, így sók, foszfátpuffer és egyebek vagy kaotrof anyagok, így karbamid, kálium-perklorát vagy további

HU 214 057 Β anyagok, így komplexképzők, ionpárképzők és hasonlók alkalmazása az eluálószerekben.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek elválasztásának további lehetősége a kristályosítás. Ennek során a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek izoelektromos pont közelében mutatott kristályosodási hajlamát, annak az anyagban lévő oldószeradalékoktól és az ellenionok anyagi minőségétől való függését használjuk ki. Vizes oldatban lévő, találmány szerinti eljárással előállított vegyületeket vízoldható szerves oldószer, így etanol vagy izopropanol hozzáadásával kikristályosíthatunk.

Savanyú kémhatású vizes oldatban lévő vegyületeket a pH-érték növelése, így ammónia hozzáadása útján kristályosítunk ki. A kapott kristályos vegyületek, így az ureido-balhimycin, amely a Pl nem centrumszimmetrikus tércsoportban, két molekulát tartalmazó elemi cellában kristályosodik, ahol a cellaállandók értéke a következő: a = 17,909 A, b = 18,466 Á, c = 18,873 Á, a = 96,65°, β = 114,15° és γ = 114,78°, szintén a találmány tárgyköréhez tartoznak.

A dezglüko-balhimycin előállítására szolgáló egyik eljárás során balhimycint hidrolizálunk. Különösen előnyös hidrolizálószer a legalább 4 mol/1 koncentrációjú trifluor-ecetsav, amelyet előnyösen enyhén megnövelt hőmérsékleten alkalmazunk.

Dezmeti-dezglüko-balhimycint úgy is előállíthatunk, hogy dezmetil-balhimycint hidrolizálunk. Különösen előnyös hidrolizálószer a legalább 4 mol/1 koncentrációjú trifluor-ecetsav, amelyet különösen szobahőmérsékleten vagy enyhén megnövelt hőmérsékleten alkalmazunk.

A találmány szerinti eljárással előállított új vegyületek a balhimycin glükopeptid-antibiotikum közeli származékai, és szerkezetileg abból vezethetők le. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületeket az alábbi adatokkal jellemezzük:

a) az (I) képletű dezmetil-balhimycint az Y-86,21022 (DSM 5908) Actinomyces törzs termeli, és a vegyület a következő tulajdonságokat mutatja:

Összegképlet: C65H71CI2N9O24, amelyet FAB tömegspektrométerrel határozzuk meg:

M+M⁺ =1432,4 a ¹²C65'H7i³⁵Cl₂ ¹⁴N9¹⁶O24 izotópra vonatkoztatva,

Kémiai molekulatömeg: 1433,25 dalton

Aminosav-elemzés (5 mólos sósavoldatban 100 °C-on 20 óra időtartamig végzett hidrolízis után): aszparaginsav, leucin, egyéb nem szokásos ninhidrin-pozitív anyagok mellett,

UV-maximum: 281 nm (lóg E 3,8).

A dezmetil-balhimycin abban különbözik a balhimycintől, hogy leucin helyett N-metil-leucint tartalmaz.

b) a (II) képletű dezmetil-leucil-balhimycint az Y86,21022 (DSM 5908) Actinomyces törzs termeli, és a vegyület a következő tulajdonságokat mutatja: Összegképlet: C5₉H6oCl₂Ns0₂3, amelyet FAB tömegspektrométerrel határozunk meg:

M+H⁺=1319,3 a ¹²C59¹H6o³⁵C12¹⁴N8¹⁶0₂3 izotópra vonatkoztatva,

Kémiai molekulatömeg: 1320,08 dalton

Aminosav-elemzés (5 mólos sósavoldatban 100 °C-on 20 óra időtartamig végzett hidrolízis után): aszparaginsav, egyéb nem szokásos ninhidrin-pozitív anyagok mellett, hiányoznak: elucin és N-metil-leucin,

UV-maximum: 281 nm (lóg E 3,8).

A dezmetil-elucil-balhimycin abban különbözik a balhimycintől, hogy a N-metil-leucin hiányzik.

c) a (III) képletű dezglüko-balhimycint az Y86,21022 (DSM 5908) Actinomyces törzs termeli, és a vegyület a következő tulajdonságokat mutatja: Összegképlet: CfjoHfyCFNgOiq, amelyet FAB tömegspektrométerrel határozunk meg:

M+H⁺ =1284,4 a

12C₆o¹H63³⁵Cl2¹⁴N9¹⁶0,9 izotópra vonatkoztatva,

Kémiai molekulatömeg: 1285,12 dalton

Aminosav-elemzés (5 mólos sósavoldatban 100 °C-on 20 óra időtartamig végzett hidrolízis után): aszparaginsav,

N-metil-leucin, egyéb nem szokásos ninhidrin-pozitív anyagok mellett,

UV-maximum: 279 nm (lóg E 3,8).

A dezglüko-balhimycin abban különbözik a balhimycintől, hogy egy glükózcsoport hiányzik.

d) a (IV) képletű ureido-balhimycint az Y-86,21022 (DSM 5908) Actinomyces törzs termeli, és a vegyület a következő tulajdonságokat mutatja:

Összegképlet: 06₇Η740ΐ₂Νιο0₂5, amelyet FAB tömegspektrométerrel határozunk meg:

M+H⁺=1489,4 a ¹²C67¹H74³⁵C12¹⁴Nio¹⁶0₂5 izotópra vonatkoztatva,

Kémiai molekulatömeg: 1490,29 dalton

UV-maximum: 280 nm (lóg E 3,8).

Az ureido-balhimycin a balhimycin antibiotikumnak a dehidrovankozamin 3. és 4. szénatomján lévő ciklusos karbamidja.

e) a metil-balhimycint az Y-86,21022 (DSM 5908)

Actinomyces törzs termeli, és a vegyület a következő tulajdonságokat mutatja:

Összegképlet: C67H₇5C1₂N₉O₂4, amelyet FAB tömegspektrométerrrel határozunk meg:

M+H⁺ =1460,45 a ¹²C67¹H75³⁵Cl2¹⁴N9¹⁶O₂4 izotópra vonatkoztatva,

f) a balhimycin R-t az Y-86,21022 (DSM 5908)

Összegképlet: C₇₂H₈3C1₂N₉O₂₈, amelyet FAB tömegspektrométerrel határozunk meg:

M+H⁺=1592,48 a ¹²C72¹H83³⁵C12¹⁴N9¹⁶O₂8 izotópra vonatkoztatva,

Kémiai molekulatömeg: 1593,41 dalton

UV-maximum: 280 nm (lóg E 3,8).

balhimycin R abban különbözik a balhimycintől, hogy egy további ramnozilcsoportot tartalmaz.

HU 214 057 Β

Ureido- Metil- balhi-balhi- -balhi- mycin mycin mycin R

g) az (V) képletű dezmetil-dezglüko-balhimycint az Actinomyces Y-86,21022 (DSM 5908) törzs termeli, és a vegyület a következő tulajdonságokat mutatja: összegképlet: CsciH^CENgO^, amelyet FAB tömegspektrométerrel határozunk meg:

M+H⁺=1270,35 a ¹²C59^lH₍-,|³⁵Cl2^l4N9^l6Oi9 izotópra vonatkoztatva,

Kémiai molekulatömeg: 1271,09 dalton

UV-maximum: 280 nm (lóg E 3,8).

h) a balhimycin V-t az Y-86,21022 (DSM 5908) Actinomyces törzs termeli, és a vegyület a következő tulajdonságokat mutatja:

Összegképlet: C73H84CI2N10O26, amelyet FAB tömegspektrométerrel határozunk meg:

M+H⁺=1587,50 a ¹²C73¹H84³⁵C1₂ ¹⁴Nio¹⁶026 izotópra vonatkoztatva,

Kémiai molekulatömeg: 1588,44 dalton

UV-maximum: 280 nm (lóg E 3,8).

A balhimycinV abban különbözik a balhimycintől, hogy egy további 4-dehidro-vankozaminil-csoportot tartalmaz.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek színtelen, vízben vagy vizes oldatokban oldódó anyagok, amelyek szilárd anyag vagy oldat alakjában meglepő, összehasonlítható stabilitást mutatnak.

A következő I. táblázat biológiai adatokat foglal össze: agar-hígítási módszerrel meghatározott minimális bakteriosztatikus gátló koncentrációk pg/ml mértékegységben:

I. táblázat

Dezmetil- Dezmetil- Dezglü-balhi- -leucil- ko-balhimycin -balhimycin mycin

Staph. aureus	SG511	0,1	3	0,2
Staph. aureus	285	0,1	6	0,2
Staph. aureus	503	0,05	6	0,1
Strept. pyogenes	308 A	0,05	12,5	0,1
Strept. pyogenes	77 A	0,05	3	0,1
Strept. faecium	D	0,2	6	0,2
Escherichia coli	DC2	10	>100	>100
Bact. fragilis	312	100	50	25
Bact. fragilis	960	25	50	25
Bact. fragilis	1313	50	100	100
Bact. vulgatus	1446	50	100	>100
Peptostrept. anaerob	932	25	50	0,4
Propioni acnes	6916	0,8	6	0,2
Propioni acnes	6922	0,4	6	0,2
Clostridium tetani
ATCC 1940650		50	50	0,4
Clostridium perfringens	194	0,2	6	0,1
		Ureido-	Metil-	balhi-
		-balhi-	-balhi-	mycin
		mycin	mycin	R
Staph. aureus	SG511	0,8	0,4	0,2
Staph. aureus	285	1,5	0,4	0,8

Staph. aureus	503	1,5	0,4	0,2
Strept. pyogenes	308 A	0,8	0,4	0,2
Strept. pyogenes	77 A	0,8	0,4	0,2
Strept. faecium	D	1,5	0,8	0,4
Escherichia coli	DC2	>100	25	50
Bact. fragilis	312	25	100	>100
Bact. fragilis	960	25	100	>100
Bact. fragilis	1313	25	50	>100
Bact. vulgatus	1446	50	>100	100
Peptostrept. anaerob	932	6,2	0,8	100
Propioni acnes	6916	0,8	0,4	6,2
Propioni acnes	6922	1,5	0,4	3,1
Clostridium tetani
ATCC 1940650		12,5	3,1	100
Clostridium perfringens	194	0,4	1,5	-

	Dezmetil- -dezglüko- -balhimycin	balhimycin V
Staph. aureus !	SG 511	0,2	0,4
Staph. aureus	285	0,2	0,4
Staph. aureus	503	0,1	0,1
Strept. pyogenes	308 A	0,1	0,05
Strept. pyogenes	77 A	0,1	0,05
Strept. faecium	D	0,2	0,2
Escherichia coli	DC2	>100	>100
Bact. fragilis	312	50
Bact. fragilis	960	25
Bact. fragilis	1313	50
Bact. vulgatus	1446	>100
Peptostrept. anaerob	932	0,2
Propioni acnes	6916	0,2
Propioni acnes	6922	0,1
Clostridium tetani
ATCC 1940650
Clostridium perfringens	194	0,1

Amint az I. táblázat adataiból látható, a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek különösen kiemelkedő hatást mutatnak Gramm-pozitív baktériumokkal szemben, beleértve az ún. Methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus törzseket (MRSA). A vegyületek ezért különösen alkalmasnak bizonyulnak ilyen kórokozók által okozott fertőző betegségek kezelésére. Ennek értelmében a találmány gyógyászati készítmény előállítási eljárására is vonatkozik, ahol a készítmény egy találmány szerinti eljárással előállított vegyület hatásos mennyiségét tartalmazza. A baktériumellenes hatású gyógyászati készítmények előállítása hagyományos, általánosan ismert módon történik.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek a mezőgazdaságban is alkalmazhatók a növekedés gyorsítására.

HU 214 057 Β

A találmányt a továbbiakban példákkal szemléltetjük.

1. példa

A balhimycin-komponensek fermentációja A fermentáció alapkultúrájaként az NL 5276 típusú tápoldat szolgál. Ez a következő alkotórészekből áll.

NL 5276: glicerin, 99 tömeg%-os 20 g/1 desztillált víz

HySoy T típusú szójapepton 10 g/1 glükóz 5 g/1 kalcium-karbonát 3 g/1

Oxoid típusú élesztőkivonat 3 g/1

PH a sterilezés előtt 7,0

Glükóz kivételével a fenti anyagokat keverés közben 10 liter vízhez adagoljuk, majd 18 liter térfogatra töltjük fel. Sterilezés előtt a pH-értékét hígított, 20-30 tömeg%os nátrium-hidroxiddal 7,0 értékre állítjuk be. A fenti összetételben előírt mennyiségű glükózt külön 1 liter vízben oldjuk, és 20 perc időtartamig 120 °C hőmérsékleten autoklávban sterilezzük, majd lehűlés után a sterilezett elegyhez adjuk. A sterilezést 45 perc időtartamig 120 °C hőmérsékleten és 1,2-1,4 bar nyomáson végezzük. Az üzemi hőmérsékletre történő lehűlés és a glükózoldat hozzáadása után a fermentációs közeg térfogata 20 liter, pH-értéke 7,0. A 0 468 504 számú európai szabadalmi leírás 2. és 3. példája szerint előállított, Y86,21022 (DSM 5809) Antinomyces mikroorganizmus tartalmazó előkultúra 500-1000 ml térfogatú mennyiségével oltást végzünk.

A fermentáció körülményei: fermentációs hőmérséklet 28 °C levegőztetés 201/perc = 1 wm nyomás 0,5 bar fordulatszám 250 fordulat/perc.

Szükség esetén 5 ml, a fermentációs térfogatra vonatkoztatva 0,025% Desmophen 3600 (poliol, gyártja: Bayer AG, Leverkusen, NSZk) habzásgátlót adagolunk steril víz-dezmofén-elegy alakjában.

A fermentáció időtartama 96-120 óra. A pH-értékét a fermentáció során nem korrigáljuk, a tenyészetet azonban sterilitás, nitrogénfogyás és a termék képződése szempontjából ellenőrizzük, utóbbihoz nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárást (HPLC) alkalmazunk. Ezt követően a tenyészetből a sejttömeget centrifugálással eltávolítjuk.

A HPLC-analízis során alkalmazott vizsgálati körülmények a következők:

hordozó: Lichrosper RP 18,5 pm, 250*4 mm², eluáló rendszer: 1 4 térfogat% acetonitril 0,1 tömeg%-os vizes trifluor-ecetsav-oldatban detektálás: UV-abszorpció 210 nm hullámhosszúságnál.

2. példa

A balhimycin-komponensek elegyének elválasztása

Az 1. példa szerint kapott kultúra szűrletének 10 literét egy előkészített, 1 liter térfogatú Diaion HP-20 (gyártó cég: Mitsubishi Chem. Ind.) töltetet tartalmazó oszlopra visszük fel. Ezt követően ioncserélt vízzel mossuk az adott terhelésű hordozóanyagot. A balhimycin-komponenseket 0-50 térfogat% izopropanolt tartalmazó gradienssel eluáljuk és az oszlopból kilépő folyadékot az izopropanolkoncentráció egyenként 2,5 térfogat%-os növekményének megfelelő frakciókként fogjuk fel. Az egyes frakciókat megvizsgáljuk a baktériumellenes hatásosság szempontjából, és HPLC útján meghatározzuk a komponensek összetételét. Először a dezmetil-balhimycint (1) tartalmazó, majd a balhimycint (2) tartalmazó és végül a dezmetil-leucil-balhimycinben (3) dús frakciót kapjuk. A frakciókat elkülönítve gyűjtjük, és azok betöményítés, valamint fagyasztva szárítás után rendre 650 mg, 1,1 g és 380 mg terméket adnak az (1), (2), illetve a (3) frakciókból.

A HPLC-analízis során alkalmazott vizsgálati körülmények a következők:

hordozó: Lichrosper RP 18,5 pm, 250*4 mm², eluáló rendszer: 14 térfogat% acetonitril 0,1 tömeg%-os vizes trifluor-ecetsav-oldatban detektálás: UV-abszorpció 210 nm hullámhosszúságnál.

3. példa

A dezmetil-balhimycin ionkromatográfiás elválasztása

Egy 100 ml térfogatú kromatográfiás oszlopot Fractogel EMD-SO3 típusú kationcserléövel töltünk meg, és 66 térfogat% metanolban lévő 25 mol/1 koncentrációjú nátrium-acetát-pufferrel pH=4,8 értékre (A puffer) állítjuk be. Ezután a 2. példa szerinti eljárással kapott dezmetil-balhimycin-tartalmú antibiotikum 650 mg-ját 100 ml A pufferben oldjuk, felvisszük az oszlopra, majd 100 ml A pufferrel mossuk. Az irodalomban ismertetett, baktériumellenes aktivitású dezdehidro-vancosamin-származék az átfolyó folyadékban és a mosóvízben található.

Ezt követően 0-200 mol/1 nátrium-klorid-gradienst viszünk fel 5,0 pH-jú A pufferben. Az ioncserélőről nátrium-klorid 130-150 mol/l-es oldata a balhimycint, nátrium-klorid 160-175 mol/l-es oldata a dezmetil-balhimycint eluálja. A megfelelő frakciókat 0,01 mol/les ecetsavoldattal szemben dializáljuk és kifagyasztással szárítjuk. Vizes oldatból etanol hozzáadásával végzett kristályosítás útján 210 mg 98%-os tisztaságú balhimycin-acetátot és 160 mg 97%-os tisztaságú dezmetil-balhimycin-acetátot kapunk. Nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) útján kapott adatok: hordozó: Lichrospher RP 18,5 pm, 250*4 mm², eluáló rendszer: 14 térfogat% acetonitril 0,1 tömeg%-os vizes trifluor-ecetsav-oldatban, detektálás: UV-abszorpciós 210 nm hullámhosszúságnál, retenciós idő: 8,3 perc, balhimycin összehasonlító anyag: 10,0 perc, [a]²²D: -77±2°.

4. példa

A dezmetil-leucil-balhimycin tisztítása

A 2. példa szerint kapott dezmeti-leucil-balhimycin-tartalmú (3) termék 300 mg-ját a 2. példának megfelelően még egyszer utótisztítjuk 100 Mel CHP20P típusú gélen (gyártó cég: Mitsubishi Chem. Ind.), A pufferként

HU 214 057 Β azonban 10 mol/l-es 7,6 pH-jú IGHPCL-puffert, B pufféiként pedig 10 mol/l-es 7,6 pH-jú K₂HPO₄-puffért alkalmazunk 40 térfogat%-os metanolban. A gradiens eljárással végzett eluálás útján kapott frakciókat HPLC alkalmazásával analizáljuk. A 90%-os tisztaságot meghaladó dezmetil-leucil-balhimycin-tartalmú frakciókat egyesítjük, vákuumban betöményítjük, és RP 18 típusú ellentétes fázison 0,05 térfogat% trifluor-ecetsav/acetoniril rendszerben ioncserét végzünk. A fő frakció kifagyasztásos szárításával 120 mg dezmetil-leucil-balhimycin-trifluor-acetátot kapunk 98%-os tisztaságban. Nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) útján kapott adatok: hordozó: Lichrospher RP 18,5 pm, 250*4 mm², eluáló rendszer: 14 térfogat% acetonitril 0,1 tömeg%-os vizes trifluor-ecetsav-oldatban, detektálás: UV-abszorpció 210 nm hullámhosszúságnál, retenciós idő: 16 perc, balhimycin összehasonlító anyag: 10,0 perc, [a]²²D: +27±2°.

5. példa

Dezglüko-balhimycin és dezmetil-dezglüko-balhimycin előállítása A 2. példa szerint kapott (3) tennék 300 mg-ját vízben oldjuk, és felvisszük egy 500 ml térfogatú HPLC-oszlopra (250-50 mm), amely preparatív munka céljából Nukleosil 1015 C18P típusú hordozóval (gyártó cég: Macherey-Nagel, Düren) van töltve. Ezt követően gradiens eljárással 0,1 térfogat% trifluor-ecetsavban 0-20 térfogat% acetonitrillel eluálunk. Míg előbb 8-10 térfogat% oldószerhányadnál a balhimycin és a dezmetil-leucil-balhimycin antibiotikumok távoznak az oszlopról, 14-15 térfogat% acetonitril-tartalomnál a dezmetil-dezglüko-balhimycint és a dezglüko-balhimycint kapjuk. A dezmetil-dezglüko-, illetve a dezglüko-balhimycin-tartalmú frakciók kifagyasztásos szárítása és ugyanazon rendszerben végzett ismételt kromatografálása útján 1,3 mg dezmetil-dezglüko-balhimycin-trifluor-acetátsót és 4 mg dezglüko-balhimycín-trifluor-acetátsót kapunk.

6. példa

A balhimycin hidrolízise dezgliiko-balhimycinné A 468 504 számú európai közrebocsátási irat 4. példája szerint kapott 5 b balhimycint 120 ml 4 mol/l-es trifluor-ecetsavban oldunk, és éjszakán át 45 °C hőmérsékleten reagáltatjuk. Ezt követően az oldószert vákuumban, majd kifagyasztásos szárítással eltávolítjuk. Az így betöményített reakcióelegyet vízben oldjuk, és 800 ml Mcl CHP20P típusú gélen (gyártó cég: Mitsubishi Chem. Ind.) gradiens eljárással 0,1 tömeg% ecetsav/50 térfogat%-os izopropanolban oldott 0,1 tömeg% ecetsav rendszerben elválasztjuk. Előbb balhimycin és dezamido-balhimycin távoznak az oszlopról, majd dezglüko-balhimycin és végül dezamido-dezglüko-balhimycin. A kívánt, 90%-os tisztaságot meghaladó frakciókat összegyűjtjük, ismételten kromatografáljuk és kifagyasztással szárítjuk. Ezekből a frakciókból 1,3 g 98,5%-os tisztaságú dezglüko-balhimycin-acetátot kapunk. nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) útján kapott adatok:

hordozó: Lichrospher RP 18,5 pm, 250*4 mm², eluáló rendszer: 19% acetonitril 0,1%-os vizes trifluorecetsav-oldatban, detektálás: UV-abszorpció 210 nm hullámhosszúságnál, retenciós idő: 10,0 perc, [a]²²D: -70,5±2°.

7. példa

Ureido-balhimycin előállítása

A 2. példa szerint kapott nyers balhimycin (2) termék 1 g-ját 25 ml vízben oldjuk, a pH-értékét ecetsavval 3,5-re állítjuk be, és egy előkészített, 3,5 pH-nál egyensúlyi állapotba hozott, 150 ml Fractogel EMD-SO3 típusú kationcserélőt tartalmazó oszlopra visszük fel.

A felvitelt követően először 200 ml tiszta vízzel, azután 200 ml 25 mol/1 koncentrációjú 4,0 pH-jú nátrium-acetát-pufferral (A puffer) utómosást végzünk.

Az oszlopból kifolyó ezen pufferoldat tartalmazza az ureido-balhimycint, amit WP eluátumnak nevezünk. Ezt követően az oszlopot 4,0 pH-jú 25 mol/1 nátrium-acetátban lévő 0-0,1 mol/1 nátrium-klorid gradienssel eluáljuk. 20-30 mol/1 nátrium-klorid-koncentrációnál balhimycin R-t (R eluátumot), 30-70 mol/1 koncentráció esetén túlnyomórészt balhimycint (B eluátumot), és 80-100 mol/1 nátrium-klorid koncentrációnál dezmetil-, valamint metil-balhimycint (M eluátumot) kapunk.

Az ureido-balhimycin tisztításához a WP eluátumot egy (20 mm belső átmérőjű, 250 mm magas) Nucleosil ΙΟ-Cig AB típusú ellentétes fázisú oszlopra visszük fel, és az elválasztást az 5. példában leírtak szerint 0,1 tömeg% trifluor-ecetsav/acetonitril rendszerrel végzett gradiens eljárással végezzük. Az ureido-balhimycin-tartalmú frakciók kifagyasztásos szárításával ezen antibiotikum 20 mg-ját kapjuk trifluor-acetát-só alakjában.

Nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) útján kapott adatok:

hordozó: Lichrospher RP 18,5 pm, 250*4 mm², eluáló rendszer: 14 térfogat% acetonitril 0,1 tömeg%-os vizes trifluor-ecetsav-oldatban, detektálás: UV-abszorpció 210 nm hullámhosszúságnál, retenciós idő: 13,5 perc, balhimycin összehasonlító anyag: 10,0 perc, [a]²²D: -26° (c = 1 % vízben).

8. példa

Metil-balhimycin előállítása

A 7. példa szerint kapott M eluátumot 20 mm belső átmérőjű és 250 mm magas, Nucleosil 10-Cig AB típusú oszlopon tisztítjuk gradiens eljárással a következő rendszerben: 10 mol/1 K₂HPO₄, pH=7,5/10 mol/l-es, 7,5 pHjú K₂HPO₄-oldatban 45 térfogat% metanol.

Az oszlopot elhagyó folyadékot az alább ismertetett analitikai HPLC-rendszerrel elemezzük, a metil-balhimycint tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, vákuumban betöményítjük, és a 6. példában leírt módon Mcl CHP 20 P típusú gélen történő adszorpció útján ioncserét végzünk. A foszfátmentes, tiszta antibiotikum-oldatból kifagyasztásos szárítással 11 mg 98%-os tisztaságú metilbalhimycin-acetátot kapunk. Nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) útján kapott adatok:

HU 214 057 Β hordozó: Lichrospher RP 18,5 pm, 250*4 mm², eluáló rendszer: 14 térfogat% acetonitril 0,1 tömeg%-os vizes trifluor-ecetsav-oldatban, detektálás: UV-abszorpció 210 nm hullámhosszúságnál, retenciós idő: 15,8 perc, balhimycin összehasonlító anyag: 10,0 perc, [a]²²[> -59° (c = 1 % vízben).

9. példa

Dezmetil-balhimycin hidrolízise dezmetil-dezglüko-balhimycinné 100 mg 3. példa szerint előállított dezmetil-balhimycint 2 ml 90 térfogat%-os trifluor-ecetsavban oldunk, és 70 órán keresztül szobahőmérsékleten reagáltatjuk. Ezt követően a reakcióelegyet a 6. példa szerint dolgozzuk fel. 72 mg 98%-os tisztaságú dezmetil-dezglüko-balhimycin-acetátot kapunk. Nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) útján kapott adatok: hordozó: Lichrospher RP 18,5 pm, 250*4 mm², eluáló rendszer: 19 térfogat% acetonitril 0,1 tömeg%-os vizes trifluor-ecetsav-oldatban, detektálás: UV-abszorpció 210 nm hullámhosszúságnál, retenciós idő: 9,1 perc.

10. példa

Balhimycin R előállítása

150 mg 7. példa szerint előállított, ioncserélt és kifagyasztással szárított R eluátumot a 7. példában leírt Fractogel oszlopon ismételten kromatografálunk. Az ennek során kapott, 79%-os tisztaságú balhimycin R-t tovább tisztítjuk, és ioncserét végzünk a 7. példában leírt módon, ellentétes fázisú Nucleosil 10 RP,8 AB típusú töltetű oszlopon 0,1 tömeg%-os trifluor-ecetsav rendszerben. Az (52 mg) kifagyasztással szárított antibiotikumot 3 ml vízben feloldjuk, a pH-értékét lassan 6-ra állítjuk be, és a kristályosodás megindulása után még 0,6 ml etanolt adunk az oldathoz. A kristályosodás befejeződése után centrifugálunk, a kristályosodott anyagot etanollal mossuk és vákuumban szárítjuk. 22 mg 99%-os tisztaságú balhimycin R-t kapunk. Nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) útján kapott adatok: hordozó: Lichrospher RP 18,5 pm, 250*4 mm², eluáló rendszer: 14 térfogat% acetonitril 0,1 tömeg%-os vizes trifluor-ecetsav-oldatban, detektálás: UV-abszorpció 210 nm hullámhosszúságnál, retenciós idő: 7,9 perc, balhimycin összehasonlító anyag: 10,0 perc.

11. példa

Balhimycin V előállítása

Egy 100 ml-es kromatográfiás oszlopot Fractogel EMD-SO3 típusú kationcserélővei töltünk meg, és4,2 pH-jú 25 mol/1 ammónium-formiát-pufferrel (A puffer) egyensúlyi állapotba hozzuk. Ezután a 2. példa szerint (2) termékként kapott nyers balhimycin 1 g-ját 100 ml vízben oldjuk, pH-ját 4-re állítjuk be, majd felvisszük az oszlopra, és 200 ml A pufferrel utánmosást végzünk.

Ezt követően A pufferben lévő 0-0,5 mol/1 nátrium-klorid gradienst alkalmazunk. Előbb a balhimycin-sor kevésbé bázikus antibiotikumai hagyják el az oszlopot, majd 0,34—0,36 mol/1 nátrium-klorid-oldattal távozik a balhimycin V. A megfelelő balhimycin V-tartalmú frakciókat egyesítjük, és a 6. példában leírt módon 100 ml Mcl CHP 20 P típusú gélen ioncserét, majd kifagyasztásos szárítást végzünk. A leírt műveletekkel 80 mg balhimycin V-acetátot kapunk, nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) útján kapott adatok: hordozó: LICHROSPHERRP18,5 pm, 250*4 mm², eluáló rendszer: 14 térfogat% acetonitril 0,1 tömeg%-os vizes trifluor-ecetsav-oldatban, detektálás: UV-abszorpció 210 nm hullámhosszúságnál, retenciós idő: 10,3-10,4 perc széles csúcsként, balhimycin összehasonlító anyag: 10,0 perc.

FAB-tömegspektrum: az összes molekulaionból számított tömeg 1588 dalton.

ESI tömegspektrum: az összes molekulaionból számított tömegek 1588 dalton (diketon-alak), 1606 dalton (monohidrát), 1624 dalton (dihidrát).

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás az (I) képletű dezmetil-balhimycin, a (II) képletű dezmetil-leucil-balhimycin, a (III) képletű dezglüko-balhimycin, a (IV) képletű ureido-balhimycin, az (V) képletű dezmetil-dezglüko-balhimycin, a C67H75CI2N9O24 összegképletü metil-balhimycin, a C72H83CI2N9O28 összegképletü meetil-balhimycin R és a C73H84CI2N10O26 összegképletü balhimycin V, valamint azok fiziológiailag elfogadható savaddíciós sóinak előállítására, amelynek során Y-86,21022 (DSM 5908) Actinomyces mikroorganizmus törzset vizes táptalajon tenyésztünk, majd a fermentlevet elkülönítjük, és a balhimycinszármazéko(kat) izoláljuk, azzal jellemezve, hogy a fermentléből a célvegyületeket balhimycintől gradiens eluálással lefolytatott oszlopkromatográfiás eljárással izoláljuk, és az oszlopkromatográfiás izolálási eljárás megismétlése vagy vizes oldatból vízoldható szerves oldószer hozzáadása mellett lefolytatott kristályosítás útján tisztítjuk, és kívánt esetben

i) dezglüko-balhimycin előállítására balhimycint hidrolizálunk, vagy ii) dezmetil-dezglüko-balhimycin előállítására dezmetil-balhimycint hidrolizálunk.

(Elsőbbsége: 1992. 06. 29.)
2. Eljárás az (I) képletű dezmetil-balhimycin, a (II) képletű dezmetil-leucil-balhimycin, a (III) képletű dezglüko-balhimycin, a (IV) képletű ureido-balhimycin, a C67H75CI2N9O24 összegképletü metil-balhimycin és a C72H8₃C1₂N9O₂8 összegképletü balhimycin R, valamint azok fiziológiailag elfogadható savaddíciós sóinak előállítására, amelynek során Y-86,21022 (DSM 5908) Actinomyces mikroorganizmus törzset vizes táptalajon tenyésztünk, majd a fermentlevet elkülönítjük, és a balhimycinszármazéko(ka)t izoláljuk, azzal jellemezve, hogy a fermentléből a célvegyületeket balhimycintől

HU 214 057 Β gradiens eluálással lefolytatott oszlopkromatográfiás eljárással izoláljuk, és az oszlopkromatográfiás izolálási eljárás megismétlése vagy vizes oldatból vízoldható szerves oldószer hozzáadása mellett lefolytatott kristályosítás útján tisztítjuk, és kívánt esetben dezglükobalhimycin előállítására balhimycint hidrolizálunk. (Elsőbbsége: 1991. 10. 19.)
3. Eljárás az (I) képletű dezmetil-balhimycin, a (II) képletű dezmetil-leucil-balhimycin és a (III) képletű dezglüko-balhimycin, valamint azok fiziológiailag elfogadható savaddíciós sóinak előállítására, amelynek során Y-86,21022 (DSM 5908) Actinomyces mikroorganizmus törzset vizes táptalajon tenyésztünk, majd a fermentlevet elkülönítjük, és a balhimycinszármazéko(ka)t izoláljuk, azzal jellemezve, hogy a fermentléből a célvegyületeket balhimycintől gradiens eluálással lefolytatott oszlopkromatográfiás eljárással izoláljuk, és az oszlopkromatográfiás izolálási eljárás megismétlése vagy vizes oldatból vízoldható szerves oldószer hozzáadása mellett lefolytatott kristályosítás útján tisztítjuk, és kívánt esetben dezglüko-balhimycin előállítására balhimycint hidrolizálunk.

(Elsőbbsége: 1991. 06. 29.)
4. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerinti eljárással előállított (I), (II), (III), (IV) vagy (V) képletű vegyületet vagy metil-balhimycint, balhimycin R-et vagy balhimycin V-t vagy annak fiziológiailag elfogadható savaddíciós sóját gyógyászatilag elfogadható segédés/vagy hordozóanyagokkal keverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk. (Elsőbbsége: 1992. 06. 29.)
5. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 2. igénypont szerinti eljárással előállított (I), (II), (III) vagy (IV) képletű vegyületet vagy metil-balhimycint vagy balhimycin R-et vagy annak fiziológiailag elfogadható savaddíciós sóját gyógyászatilag elfogadható segéd- és/vagy hordozóanyagokkal keverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.

(Elsőbbsége: 1991. 10. 19.)
6. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 3. igénypont szerinti eljárással előállított (I), (II) vagy (III) képletű vegyületet vagy annak fiziológiailag elfogadható savaddíciós sóját gyógyászatilag elfogadható segéd- és/vagy hordozóanyagokkal keverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.