HU210418B

HU210418B - Process for prepg. 2"-n-acyl derivs of elsamycin a and pharmaceutical compositions containing them

Info

Publication number: HU210418B
Application number: HU9201733A
Authority: HU
Inventors: Takayuki Naito; Soichiro Toda; Haruhiro Yamashita; Yuji Nishiyama
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1991-05-30
Filing date: 1992-05-25
Publication date: 1995-04-28
Also published as: CA2069717A1; AU655023B2; FI922442L; IE921766A1; FI922442A0; JPH05208992A; TW218881B; IL102000A0; KR920021572A; AU1723992A; OA09752A; CS159092A3; HUT61775A; ZA923818B; MX9202570A; US5374711A; EP0516156A1; HU9201733D0

Description

A találmány eljárás az elsamicin A antibiotikum új, (ΠΙ) általános képletű, a 2”-aminocsoporton acilcsoporttal helyettesített származékainak az előállítására; a képletben R jelentése karboxil-, amino- vagy ftálimidocsoporttal helyettesített 1-3 szénatomos alkilcsoport. Az új származékok az elsamicin A-hoz hasonlóan tumorellenes hatásúak, de általában jobb vízoldékonyságot, egyesek csökkentett toxikusságot és/vagy farmakokinetikai előnyöket mutatnak.

Az elsamicin A tumorellenes antibiotikum, amelyet az Actinomycetales rendbe tartozó, J907-21 (ATCC 39417) jelzésű elsamicin A-termelő fajnak vagy ennek egy mutánsának a tenyésztésével állítanak elő. Az elsamicin A antibakteriális hatást mutat aerob Gram-pozitív baktériumokkal és anaerob baktériumokkal szemben. A vegyület hatást fejt ki in vitro és in vivő különféle murine (patkány/egér) tumorsejtekkel szemben is; az ilyen tumorsejtek közé tartoznak például a következők: P388 leukémiasejt, L1210 limfoid (nyirok-) leukémiasejt és B16 melanózisos melanomasejt. Konishi et al., Elsamicins, new antitumor antibiotics related to chartreusin. I. Production, isolation, characterization and antitumor activity, J. Antibiotics, 39: 784-791, (1986); 4 518 589 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Konishi et al., 1985. 05. 21.).

Az elsamicin A szerkezetét korábban már meghatározták, s az ennek eredményeképpen kapott struktúra, amelyet az (I) képlet mutat be, igen nagy mértékben hasonlít a chartreusin (Π) képletű szerkezetéhez. Sugawara et al., Elsamicin A and B, new antitumor antibiotics related to chartreusin. Π. Structures of elsamicins A and B. J. Org. Chem., 52: 996-1001, (1987).

Mind az elsamicin A, mind a chartreusin azonos aglikonnal, a chartarinnal rendelkezik, de az antibiotikumok a diszacharidrészben eltérőek. Lach et al., Chartreusin, a new antibiotic produced by Streptomyces chartreusis, a new species, J. Am. Chem. Soc., 75: 4011-4012, (1953); Beisler, J. A., Chartreusin, a glycosidic antitumor antibiotic fór Streptomyces, In progress in Medicinái Chemistry, Ed., G. P. Ellis and G. B. West, 19: 247-268, Elsevier Biomedical Press Amsterdam, (1982); Simonitsch et al., Über die Struktur des Chartreusins I, Helv. Chim. Acta, 47: 1459-1475, (1964); Eisenhuth et al., Über die Struktur des Chartreusins II, Helv. Chim. Acta, 47,1475-1484, (1964).

A két vegyület kémiai eljárással történő egymásbaalakításáról korábban még nem számoltak be.

Konishi et al. a 4 518 589 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetik az (I) képletű, elsamicin A-ként jelölt tumorellenes ágens termelését és elkülönítését. A fent említett elsamicin A vegyület az Actinomycetales rendbe tartozó, J907-21 (ATCC 39417) jelzésű elsamicin A-termelő faj fermentációjának fő komponense.

Az elsamicin A új 2”-N-acil-származékai az elsamicin A-nál jobb vízoldékonyságot, megnövelt tumorellenes aktivitást és/vagy csökkentett toxicitást mutatnak. A találmány kiteljed a (III) általános képletű vegyületek legalább egyikét hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására is.

Az új (ΠΙ) általános képletű, a 2”-helyzetben helyettesített elsamicin A származékokat - amelyek képletében R jelentése karboxil-, amino- vagy ftálimidocsoporttal helyettesített 1-3 szénatomos alkilcsoport a találmány értelmében oly módon állítjuk elő, hogy elsamicin A-t valamely R’-COOH általános karbonsavval vagy ennek aktív észterével vagy anhidridjével - ahol R’ jelentése karboxilcsoporttal vagy ftálimidocsoporttal helyettesített 1-3 szénatomos alkilcsoport reagáltatunk és kívánt esetben egy kapott ftálimidoszármazékban a ftálimidocsoportot aminocsoporttá alakítjuk.

A leírásban és az igénypontokban használt „1-3 szénatomos alkilcsoport” meghatározás, ha a szövegben más utalás nincs, egyenes vagy elágazó láncú, 1-3 szénatomot tartalmazó telített szénhidrogéncsoportot, így metilcsoportot, etilcsoportot, propilcsoportot és izopropilcsoportot jelent.

A találmány szerinti vegyületeket például a 2. és 3. táblázatban feltüntetett szintézismódszerekkel állíthatjuk elő. Amint az a 2. táblázatban látható, az elsamicin A ecetsavval és borostyánkősavval, a savanhidrides módszer szerint végzett N-acilezése a megfelelő 3a. és 3b. számú vegyületeket eredményezi. A 3d. számú N-glicilszármazékot a ftalil-glicin egy aktív észterével végzett acilezéssel, majd ezt követően a védőcsoport hidrazinnal történő eltávolításával jó hozammal állítottuk elő.

Az 1. táblázat összefoglalóan megadja a leírásban szereplő vegyületeket és sorszámaikat.

/. táblázat

A találmány szerinti eljárásban szereplő vegyületek és sorszámaik

Sorszám	Vegyületnév
1.	elsamicin A
2.	chartreusin
3a.	2”-N-acetil-elsamicin A
3b.	2”-N-(3-karboxi-propionil)-elsamicin A
3c.	2”-N-(ftálimido-acetil)-elsamicin A
3d.	2”-N-glicil-elsamicin A
	2. táblázat
	Az elsamicin A N-acilezése
A (III) általános képletű vegyületek előállítása

	Termék
Reakció	száma	R
1. + borostyánkősavanhidrid	3b.	CH₂CH₂COOH
1. + (a) képletű vegyület	3c.	ftálimido-metil-csoport
3c. + NH₂NH₂	3d.	ch₂nh₂

A 2-N-acil-elsamicin A származékok tumorellenes hatása

Számos 2”-N-acil-elsamicin A származékot állítottunk elő, és az alapvegyülettel összehasonlítva vizsgáltuk a vegyületek B16 melanomasejtekkel szembeni

HU 210 418 Β citotoxicitását in vitro, illetve a P388 leukémiasejtek és a B16 melanomasejtek elleni tumorellenes hatást in vivő.

Az in vitro citotoxicitási kísérletekhez murine melanoma B16-F10 sejteket tenyésztettünk és a sejteket EMEM-ben [Eagle’s minimum essential médium (Nissui)] tartottuk fenn, amely EMEM 60 gg/ml kanamycint, 10% hőkezelt (inaktivált) magzati borjúszérumot és 0,6% nemesszenciális aminosavakat tartalmazott. A fenntartás 37 °C hőmérsékleten, párásított atmoszférában, egy 5% CO₂ tartalmú inkubátorban történt. Az exponenciálisan növekvő B16-F10 sejteket összegyűjtöttük, számláltuk, majd 2,0 x 10⁴ sejt/ml koncentrációban a tenyészközegben szuszpendáltuk. A szuszpenziót (180 μΐ) 96 lyukú mikrotiter lemezbe helyeztük és 24 órán keresztül inkubáltuk. A tesztvegyületeket (20 fxl) a lyukakba mértük és a lemezeket további 72 órán keresztül inkubáltuk. A citotoxikus aktivitást az életképes sejtek neutrálvörös-oldattal történő megfestése után, 540 nm hullámhosszon kolorimetriásan határoztuk meg. Valamennyi vizsgált származék esetén azt tapasztaltuk, hogy azok vagy nem mutattak citotoxicitást a B16-F10 sejtekkel szemben in vitro, vagy a citotoxicitás kisebb volt, mint az elsamicin A esetében (4. táblázat).

A vizsgált származékok közül a 3d. vegyületnek a tumorellenes aktivitása relatív potens citotoxicitást mutatott a P388 nyirokleukémiasejt- és B16 melanomasejt-rendszerekben végzett tesztekben. A P388-hoz nőstény egereket, míg a B 16-hoz hím BDF! egereket egerenként 10⁶P388 sejttel, illetve 10%-os B16 brei 0,5 ml-ével ip. injekció útján inokuláltunk (0. nap). A tesztvegyületeket intraperitoneálisan adtuk be az egereknek, a P388 rendszerben naponta egyszer az 1-3. napokon (Q1D x 3), illetve a B16 rendszerben naponta egyszer az 1., 5. és 9. napon (Q4D X 3), és az állatokat 50 napon keresztül megfigyeltük. A kezelt állatok közepes túlélési idejének (médium survival time, MST) a kezeletlen kontrollállatokéhoz viszonyított százalékos növekedését T/C %-ként határoztuk meg, illetve adtuk meg. Azokat a vegyületeket, amelyek 125 vagy nagyobb T/C % értékeket mutatnak, jelentős tumorellenes hatással rendelkezőnek tekintjük.

4. táblázat

In vitro citotoxicitás B16-F10 melanomasejtek ellen és in vivő tumorellenes hatás P388 leukémiasejtek ellen egerekben

Vegyület	R	Citotoxicitás IC₃₀(pg/ml)	MST^aT/C%
			20^b	10	3	1	0,3	0,1
3.b	-CH₂CH₂COOH	56		c	c
' 3d.	-ch₂nh₂	4,1		110	110	95
Elsamicin A (1)	0,07	Tox	205	170	150	137	120

a: Közepes túlélési idő napokban; b: mg/kg/nap, Q1D x 3, ip; c: nincs hatás

A találmány kiterjed az olyan gyógyászati készítmények előállítására is, amelyek a (III) általános képletű vegyületek tumorgátló hatású mennyiségét tartalmazzák inért, gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal vagy hígítószerrel együttesen. 40

A megfelelő készítmények magukban foglalják az orális bejuttatásra alkalmas szilárd készítményeket, így a tablettákat, kapszulákat, pirulákat, porokat vagy granulákat, az orális bejuttatásra alkalmas folyékony kompozíciókat, így az oldatokat, szuszpenziókat, szirupo- 45 kát és elixíreket, továbbá a parenterális kezelésre alkalmas készítményeket, így a steril oldatokat, szuszpenziókat és emulziókat. Előállíthatok olyan steril, szilárd készítmények formájában is, amelyeket közvetlenül az alkalmazás előtt steril vízben, fiziológiás sóoldatban 50 vagy néhány más, steril, injektálható közegben lehet feloldani.

Meg kell jegyezni, hogy a találmány szerinti elsamicin A származék konkrét előnyös dózisát számos tényező befolyásolja, így az alkalmazott pontos vegyü- 55 let, az adott készítményforma, az alkalmazás módja és a kezelendő beteg állapota, a betegség jellege, valamint előrehaladottsága. A szakterületen ismert számos olyan további tényezőt figyelembe kell venni, amelyek a gyógyszer hatását módosíthatják, így például az élet- 60 kort, testsúlyt, a beteg nemét, diétáját, a kezelés idejét, a kiválasztás sebességét, a beteg állapotát, a gyógyszerkombinációkat, az érzékenységet és a betegség súlyosságát. A maximálisan elviselhető dózison belül a kezelés folyamatosan vagy periodikusan végezhető. A szakember számára az optimális kezelés körülményei egy adott esetben könnyen meghatározhatóak a szokásos dózis meghatározási tesztek alapján.

A következő példák a találmányt illusztratív jelleggel mutatják be, anélkül, hogy azok a találmány oltalmi körét bármely szempontból is korlátoznák.

1. példa

A 2”-N-(3-karboxi-propionil)-elsamicin A (3b. számú vegyület) szintézise

Szobahőmérsékleten 3 órán keresztül kevertettük 65,4 mg elsamicin A és 20 mg borostyánkősavanhidrid 6,5 ml száraz dioxános keverékét. Hozzáadtunk 3 ml metanolt 5 °C hőmérsékleten, majd a keveréket szárazra pároltuk. A maradékot preparatív vékonyréteg-kromatográfiával tisztítottuk, eluensként diklór-metán:metanol:ecetsav 80:20:2 térfogatarányú elegyet alkalmazva. így 75 mg sárga port kaptunk, amelyet híg, vizes nátriumhidrogén-karbonát-oldatban oldottunk fel. Az oldat pHját 3-ra állítottuk be, majd Diaion HP-20 oszlopon kro3

HU 210 418 Β matografáltuk. Az oszlopot vízzel és 50%-os vizes acetonitrillel erőteljesen eluáltuk. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat egyesítettük, bepároltuk és liofilizáltuk. Sárga por formájában a 3b. számú vegyület 44 mg-ját kaptuk, ami 55%-os kitermelésnek felel meg.

Olvadáspont: 198-200 °C (bomlás).

IR v_max (KBr) cm'¹: 3400,1715, 1640, 1610, 1505.

UV (MeOH) nm (ε) 236 (39700), 265 (36900),

334 (6010), 380 (8350), 400 (13800), 423 (16000). ’H-NMR (CD₃OD) δ ppm: 2,83 (3H, s), 3,30 (3H, s),

5,52 (IH, d, J = 8 Hz), 5,83 (IH, d, J = 4 Hz),

8,15 (IH, d, J = 8 Hz).

Elemanalízis C₃₇H₃₃NOi₆Na · 3/2 H₂O összegképletre:

számított: C: 55,36, H: 5,15, N: 1,74; talált: C: 55,40, H:4,87, N: 1,92.

2. példa

A 2”-N-(ftálimido-acetil)-elsamicin A (3c. számú vegyület) szintézise

65,6 mg Elsamicin A 4 ml dioxánnal készült oldatához 60,4 mg ftaloil-glicin N-hidroxi-szukcinimid észterét [(a) képletű vegyület] és 20 mg trietil-amint adtunk. A keveréket két napon keresztül szobahőmérsékleten kevertettük, majd vákuumban bepároltuk. A maradékot vízzel eldörzsölve sárga, szilárd anyagot kaptunk, amelyet szilikagélen oszlopkromatográfiával tisztítottunk, s így 76 mg (90%) 3c. számú vegyületet nyertünk.

Olvadáspont: 187-189 °C (bomlás).

IR v_max (KBr) cm ’: 1770, 1715, 1250, 1140, 1110,

1065,775.

UV (MeOH) nm (ε) 220 (56700), 235 (47600),

266 (37000), 333 (6050), 379 (8480), 399 (14200),

422 (15700).

’H-NMR (CD₃OD) δ ppm: 1,32 (3H, d, J = 6 Hz), 1,43 (3, d, J = 6 Hz), 1,45 (3H, s), 2,78 (3H, s), 3,30 (3H, s), 5,58 (IH, d, J = 8 Hz), 5,90 (IH, d, J = 4 Hz), 7,08 (4H, s).

Elemanalízis C₄₃H₄₀N₂Oi₆ · 2 H₂O összegképletre: számított: C: 58,90, H:5,06, N:3,19; talált: C: 58,71, H:4,71, N: 3,03.

3. példa

A 2”-N-glicil-elsamicin A (3d. számú vegyület) szintézise

A 3c. számú ftálimidoszármazék (62 mg) etanollal (0,5 ml) készült oldatához 80%-os vizes hidrazint (10 μΐ) adtunk, majd a keveréket 6 órán keresztül szobahőmérsékleten tartottuk, és ezt vákuumban bepároltuk. A maradékot preparatív vékonyréteg-kromatográfiával tisztítottuk, a kifejlesztéshez 2% metanolt tartalmazó kloroformot alkalmazva. így 52 mg szilárd anyagot kaptunk, amelyet további kromatográfiás tisztításnak vetettünk alá HP-20 töltetű oszlopon, s ennek eredményeképpen 45 mg (86%) 3d. számú vegyületet nyertünk.

Olvadáspont: 203-210 °C (bomlás).

IR v_max (KBr) cm¹: 1685, 1375, 1250, 1150, 1110,

1070, 1045, 775.

UV (MeOH) nm (ε) 236 (37000), 266 (32900),

332 (5540), 379 (7530), 400 (12400), 422 (13900). ’H-NMR (CD₃OD) δ ppm: 1,32 (3H, d, J = 6 Hz), 1,40 (3H, s), 1,41 (3H, d, J = 6 Hz), 1,82 (2H, s), 2,80 (3H, s), 3,30 (3H, s), 5,46 (IH, d, J = 8 Hz), 5,81 (IH, d, J = 4Hz).

EI-MS (beam) m/z: 710 (M⁺), 494,376, 334,217.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás a (ΠΙ) általános képletű elsamicin A származékok - ebben a képletben R jelentése karboxil-, amino- vagy ftálimidocsoporttal helyettesített 1-3 szénatomos alkilcsoport - előállítására, azzal jellemezve, hogy elsamicin A-t valamely R’-COOH altalános karbonsavval vagy ennek aktív észterével vagy anhidridjével - ahol R’ jelentése karboxilcsoporttal vagy ftálimidocsoporttal helyettesített 1-3 szénatomos alkilcsoport - reagáltatunk és kívánt esetben egy kapott ftálimido-származékban a ftálimidocsoportot aminocsoporttá alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás 2”-N-(3-karboxi-propionil)-elsamicin A, 2”-N-(ftálimido-acetil)-elsamicin A vagy 2”-N-glicil-elsamicin A előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazunk.
3. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított vegyületet egy vagy több gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal vagy hígítószenei összekeverünk.

HU 210 418 Β Int. Cl.⁶: C 07 H 17/08