HU210111B

HU210111B - Process for producing polypeptides with human gamma-interferon activity

Info

Publication number: HU210111B
Application number: HU851393A
Authority: HU
Inventors: Joachim Engels; Michael Leineweber; Eugen Uhlmann; Wolfgang Ulmer
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1984-04-19
Filing date: 1985-04-15
Publication date: 1995-02-28
Also published as: NO171983C; DK164940B; EP0161504A1; DK176285A; FI90436C; JPS60233100A; FI90436B; ATE69241T1; HUT37815A; PT80300A; PH25251A; DE3414831A1; IE59460B1; NO171983B; ES542337A0; JPH07100037B2; MA20411A1; US4832959A; IL74947A; ZA852900B

Description

A találmány tárgya eljárás humán gamma-interferon aktivitással rendelkező polipeptidek, ezen polipeptideket kódoló, kémiailag szintetizált gének, valamint a polipeptidek kifejezésére képes vektorok és gazdaszervezetek előállítására. A találmány kiterjed továbbá az új polipeptidekre, amelyekből a gamma-interferontól eltérően olyan részszekvenciák kihagyhatok, amelyek a biológiai aktivitás szempontjából nem lényegesek. Ezek az új polipeptidek a gamma-interferonnál stabilabbak, jobban oldhatók és antivírusos aktivitásuk specifitása változó, mindegyik alkalmas azonban - a gamma-interferonhoz hasonlóan - antivírusos, daganatellenes, antineoplasztikus vagy immunszabályozó szerként.

A gamma-interferont (amelyet korábban immuninterferonnak vagy II típusú interferonnal neveztek; a továbbiakban röviden IFN-γ jellel jelöljük) 1965-ben F. Wheelock fedezte fel (Wheelock, Science 149 /1965/, 310), és kimutatta, hogy az IFN-γ bizonyos sejteket a vírusfertőzéssel szemben meg tud védeni. Az emberi IFN-γ (bázisok ismertetése: W. E. Stewart, II, The Interferon System, Springer Verlag /2. kiadás/, 1981) olyan 146 aminosavból álló polipeptid (Gray és munkatársai, Natúré 295/1982/, 503), amely természetes állapotban glükózzal helyettesítve van. A glükoprotein móltömege kb. 63 000-73 000 (Pestka és munkatársai, J. Bioi. Chem. 258 /1983/, 9706), és funkcionális formájában valószínűleg tetramerként fordul elő. Az IFN-γ funkciója szempontjából nem lényeges az, hogy glükózzal helyettesítve legyen, így ha az IFN-y-t glükozidázzal kezeljük, a fibroblasztsejtkultúrában nem változik antivirális aktivitása (Kelker és munkatársai, J. Bioi. Chem. 258 /1983/, 8010).

Továbbá, az IFN-γ az alfa-interferonnal és béta-interferonnal szemben, pH = 2 értéknél instabil és hőhatásra (60 °C) dezaktiválódik.

A humán IFN-γ emberi sejtvonalak vagy leukociták sejtkultúrájából csak nagyon rossz kitermeléssel és kis mennyiségben nyerhető. A találmány szerinti eljárás lehetőséget nyújt arra, hogy gamma-interferonhoz hasonló tulajdonságokkal rendelkező polipeptideket állítsunk elő géntechnológiai úton. A humán IFN-γ peptidszekvenciája a következő (Devos és munkatársai, Nucl. Acids Research 10 /1982/, 2487):

Cysl	- Tyr	- Cys ·	- Gin	- Asp	- Pro -	- Tyr	- Val	- Lys	- GlulO-
Alá -	Glu -	Asn -	Leu -	Lys -	Lys -	Tyr -	Phe -	Asn -	Ala20-
Gly -	His -	Ser -	Asp -	Val -	Alá -	Asp -	Asn -	Gly -	Thr30-
Leu -	Phe -	Leu -	Gly -	Ile -	Leu -	Lys -	Asn -	Trp -	Lys40-
Glu -	Glu -	Ser -	Asp -	Arg -	Lys -	Ile -	Met -	Gin -	Ser50-
Gin -	Ile -	Val -	Ser -	Phe -	Tyr -	Phe -	Lys -	Leu -	Phe60-
Lys -	Asn -	Phe -	Lys -	Asp -	Asp -	Gin -	Ser -	Ile -	Gln70-
Lys -	Ser -	Val -	Glu -	Thr -	Ile -	Lys -	Glu -	Asp -	Met80-
Asn -	Val -	Lys -	Phe -	Phe -	Asn -	Ser -	Asn -	Lys -	Lys90-
Lys -	Arg -	Asp -	Asp -	Phe -	Glu -	Lys -	Leu -	Thr -	AsnlOO-
Tyr -	Ser -	Val -	Thr -	Asp -	Leu -	Asn -	Val -	Gin -	ArgllO-
Lys -	Alá -	Ile -	His -	Glu -	Leu -	Ile -	Gin -	Val -	Metl20-
Alá -	Glu -	Leu -	Ser -	Pro -	Alá -	Alá -	Lys -	Thr -	Glyl30-
Lys -	Arg -	Lys -	Arg -	Ser -	Gin -	Met -	Leu -	Phe -	Argl40-
Gly -	Arg -	Arg -	Alá -	Ser -	Glnl46.

A találmány tárgya biológiai aktív humán EFN-γrészszekvenciák, éspedig a fenti szekvencia 1-127, 5146 és 5-127 részszekvenciáinak előállítása.

A genetikai kód ismert módon „elfajult”, ami azt jelenti, hogy két aminosavat egyetlen nukleotidszekvencia kódol, míg a többi 18 genetikai kódolható aminosavhoz 2-6 triplet van rendelve. Az ebből adódó variációs lehetőséget a különböző fajokhoz tartozó gazdaszervezetek nem mindig azonos módon használják ki. A gének szintéziséhez ezáltal a kodon-lehetőségek beláthatatlan sokfélesége adódik. Úgy találtuk, hogy az I. DNS-szekvencia (1. függelék), amely a teljes 1-146 aminosavszekvenciát kódolja, valamint az ebből levezethető IA, IB és IC DNS-szekvencia különösen előnyösen alkalmazható az IFN-y-aktivitással rendelkező polipeptidek géntechnológiai szintéziséhez. Az I. DNS-szekvencia kódoló ágának 5’ végéhez csatlakozik a metionin-kodon („0 sz. triplett”), és az előtt egy „átvezető” DNS-szekvencia, amely egy restrikciós endonukleáznak, pl. Eco Rínék felel meg. A kódoló ág 3’ végén egy stop-kodonhoz· vagy előnyösen két stop-kodonhoz - közvetlenül vagy egy közbeékelt DNS-szekvencián át - csatlakozva található egy restrikciós enzimnek megfelelő szekvencia, pl. Sál I. A különböző felismerő szekvenciák teszik lehetővé, hogy a DNS a plazmidokba a megfelelő orientáltsággal kerüljön be.

A kódoló ág 5’-végén a metionin kodonjához vagy egy bakteriális vagy más gazdaszervezet prote50 in preszekvenciája (más néven szignál vagy vezérszekvencia) állhat (összefoglaló cikk: Perlman és Halvorson, J. Mól. Bioi. 167, 391 /1083/), amely a kívánt polipeptid citoplazmából való kiválasztását segíti elő, és amelyet ennél a kiválasztási folyamat55 nál a gazdaszervezetben természetesen előforduló szignál-peptid lehasít.

A három génfragmens, IFN-I, IFN-II és IFN-III (lásd II. DNS-szekvenciát) szubklónozását két belső, egyszeres, a BamHi és a Hind III restrikciós enzi60 meknek megfelelő hasítási hely (a kódoló ág 34., ill.

HU 210 111 Β

97. kodonjában vagy a nemkódoló ág 35., ill. 98. kodonjában) teszi lehetővé, amelyek a már jól ismert klónozó vektorokba, mint pl. a pBR 322 vagy a pUC 8 vektorokba beépíthetők. Ezen felül a struktúrgénen belül egy sor további felismerő szekvencia építhető be a restrikciós enzimek számára, amelyek lehetővé teszik egyrészt az IFN-γ részszekvenciáinak az előállítását, másrészt a variációk megvalósítását.

Restrikciós enzim	Nukleotidszám
Ava II^a)	20
Alu I^b)	39
Hinfl^a)	134
Dde I^c)	159
AhaIII^c)	199
Taq I^c)	294
AhaIII^d)	327
Sst I^a)	357
Bst NI^d)	362
Pst l^a)	388
Bbv I^a)	398
Sst II^a)	430
Dde I^d)	444

a) egyszeres a teljes DNS szekvencia I-re vonatkozóan

b) egyszeres az IFN-I részszekvenciára vonatkozóan

c) egyszeres az IFN-Π részszekvenciára vonatkozóan

d) egyszeres az IFN-III részszekvencíára vonatkozóan.

Az I. DNS-szekvenciát és a végeihez kapcsolódó szekvenciákat 34, 18-33 nukleotid hosszúságú oligonukleotidból lehet felépíteni (lásd II. DNS-szekvencia) úgy, hogy ezeket először kémiai úton szintetizáljuk, majd a kapcsolódó végüknél 4-6 nukleotidot enzimatikusan összekapcsoljuk.

Az I. DNS-szekvenciánál figyelembe kell továbbá venni, hogy azoknál az aminosavaknál, amelyekhez több kodon rendelhető, ezek nem egyenértékűek, hanem a mindenkori gazdassejtben különböző preferenciát mutatnak. Továbbá, a palindrom szekvenciák minimálisra redukálódnak.

Az I. DNS-szekvencia tehát viszonylag kis „építőkövekből” egyszerűen megkapható, és ez lehetővé teszi a három génfragmens szubklónozását jól ismert vektorokban, ezek kombinációját a teljes génben, valamint módosításukat. így az I. DNS-szekvenciával rendelkező gén klónozása után ebből, meghatározott restrikciós enzimekkel végzett hasítással DNS részszekvenciák nyerhetők, különösen az ΙΑ, IB és IC részszekvenciák, amelyek az 1-127, 5-146 és 5-127 aminosavaknak megfelelő interferon-részszekvenciákat kódolják.

Egy részszekvencia például az IA DNS-szekvencia, amely az IFN-γ első 127 aminosavját tartalmazó polipeptidhez vezet, ahol az I. DNS-szekvencia úgy van átalakítva, hogy a 127. számú tripletthez közvetlenül egy stop-triplett vagy előnyösen két stop-triplett, valamint egy restrikciós enzimnek, pl. Sál I-nek megfelelő vég csatlakozik.

Az I. DNS-szekvencia Ava II restrikciós endonukleázzal végzett hasításával, majd az így kapott nagy, adaptorszekvenciával rendelkező fragmensek ligálásával ezzel szemben IB DNS-szekvenciát kapunk, ahol az IFN-γ első négy aminosavjának kodonjai törölve vannak, azaz az 5. számú aminosav (aszparaginsav) előtt közvetlenül metionin áll. Ebből az IB DNS-szekvenciából a Pst I hasítási helyeken keresztül egy IC DNS-szekvencia alakítható ki, amely az IFN-γ 5-127 aminosavjainak megfelelő polipeptidet kódolja.

A szintetikus gének, illetve génfragmensek klónozóvektorokba, például a forgalomban levő pUC 8 és pBR 322 plazmidokba, illetve más általánosan hozzáférhető plazmidokba, mint pl. ptac 11 és pKK 177,3 plazmidba való beépítése önmagában ismert módon történik. A kémiai úton szintetizált gének előzőleg alkalmas, kémiai úton szintetizált kontrollterületekkel láthatók el, amelyek a proteinek expresszióját lehetővé teszik. Utalunk itt Maniatis tankönyvére (Molecular Cloning, Maniatis és munkatársai, Cold Sprong Harbor, 1982). Az így kapott hibridplazmidok alkalmas gazdaszervezetekbe, például E. coliba való transzformációját az említett tankönyv szintén mélyrehatóan ismerteti. A kifejezett protein kinyerése és tisztítása szintén ismert (J. A. Georgiades, Texas Reports in Biology and Medicine 41 /1981/, 179; Came and Carter /szerzők/, „Interferons and Their Applications”, Springer-Verlag, 1984).

A találmány szerinti, gamma-interferon-aktivitással rendelkező, IA, IB és IC DNS-szekvenciának megfelelő polipeptidek újak és a találmány tárgyát képezik. Ugyanez érvényes az új, I. DNS-szekvenciából levezethető DNS-szekvenciákra, az abból kapható gammainterferon analógokra, IFN-I, IFN-II és IFN-III génfragmensre, valamint azok változataira, az ezekkel kapható hibridplazmidokra és transzformált gazdaszervezetekre.

További, a találmány szerinti eljárással nyerhető termékek a szabadalmi igénypontokban találhatók.

A következő példákban néhány, a találmány szerinti eljárással nyerhető további terméket bemutatunk, ezekből szakember számára nyilvánvaló a lehetséges kombinációk és változatok sokfélesége. A példákban megadott százalékértékek tömegszázalékot jelölnek, hacsak nincs másképpen megadva.

1. példa

1. Egyszálú oligonukleotid kémiai szintézise

Az IA „gén-építőelem”, amely az 1-23 nukleotidot kódoló szálat foglalja magában, kémiai szintézisét ismert módon (M. J. Gait és munkatársai, Nucleic Acids Rés. 8 /1980/ 1081-1096) úgy végezzük, hogy a 3’-végen álló nukleozidot, jelen esetben a citidint (23. számú nukleotid), 3’-hidroxil-csoportokon keresztül szilikagélen (^RFRACTOSIL, Merck gyártmány) kovalensen megkötjük. Ehhez a szilikagélt először 3-(trietoxi3

HU 210 111 Β szilil)-propil-aminnal etanol lehasítása mellett kezeljük, amelynek során a Si-O-Si-kötés kialakul. A citidint N⁴-benzoil-3 ’ -O-szukcionil-5 ’ -dimetoxi-tritil-éter formájában paranitrofenol és N,N’-diciklohexil-karbodiimid jelenlétében a módosított hordozóval kezeljük, melynek során a szukcionilcsoportok szabad karboxilcsoportjai a propilamino-csoportok amino-csoportjait acilezik.

A következő szintézislépésben a báziskomponenseket 5 ’ -O-dimetoxi-tritil-nukleozis-3 ’-foszforsav-monometil-észter-dialkil-amid vagy -klorid formájában alkalmazzuk, amelynek során az adenin, mint N⁶-benzoil-származék, a guanin, mint N²-izobutiril-származék, és az aminocsoportot nem tartalmazó timidin védőcsoport nélkül áll rendelkezésre.

mg polimer hordozót, amely 2 μτηόΐ citozint tartalmaz megkötve, egymás után a következő reagensekkel kezelünk:

a) nitrometán,

b) telített nitrometános, 1% vizet tartalmazó cink-bromid-oldat,

c) metanol,

d) tetrahidrofurán,

e) acetonitril,

f) 40 μπιόΐ megfelelő nukleozid-foszfit és 200 pmól tetrazol 0,5 ml vízmentes acetonitrilben (5 perc),

g) 20% acetanhidrid tetrahidrofuránban 40% lutidinnel és 10% dimetil-amino-piridinnel (2 perc),

h) tetrahidrofurán,

i) tetrahidrofurán 20% vízzel és 40% lutidinnel,

j) 3% jód 5:4:1 térfogatarányú kollidin-víz-tetrahidrofurán elegyben,

k) tetrahidrofurán és

l) metanol.

A „foszfit” kifejezésen itt dezoxiribóz-3’-monofoszforsav-monometil-észtert értünk, ahol a harmadik vegyértéket klór vagy tercier aminocsoport, például egy morfolinocsoport köti le. Az egyes szintézislépések kitermelése a b) detritilezési reakció után spektrofotometriásán a dimetoxi-tritil-kation 496 nm hullámhossznál bekövetkező abszorpciójának mérésével határozható meg.

Az oligonukleotid szintézisének befejezése után az oligomer metil-foszfát-védőcsoportjait p-tiokrezol és trietil-amin segítségével lehasítjuk. Végül az oligonukleotidot a szilárd hordozóról 3 óra hosszat tartó ammóniás kezeléssel választjuk le. Ha az oligomert 2-3 napig koncentrált ammóniával kezeljük, a bázisok aminovédőcsoportjai teljesen lehasadnak. Az így kapott nyersterméket nagynyomású folyadékkromatográfiásán (HPLC) vagy poliakrilamid-gél elektroforézissel tisztítjuk.

Az Ib—ΠΙ1 „gén-építőkövek”-et, amelyek nukleotis-sorrendje a II. DNS-szekvenciából következik, egészen hasonló módon szintetizáljuk.

2. Az egyszáló oligonukleotid enzimatikus kapcsolása IFN-I, IFN-II és IFN-III génfragmensekké Az oligonukleotid 5’-végen történő foszforilezéséhez 1-1 nmól la és Ib oligonukleotidot kezelünk 5 nmól adenozin-trifoszfáttal, 4 egység T4-polinukleotid-kinázzal 20 μΐ, 10 mmól/l magnézium-kloridot és mmól/l ditiotreitolt (DTT) tartalmazó 50 mmól/l-es Tris-HCl-pufferben 30 percig 37 °C-on (C. C. Richardson, Progress in Nucl. Acids Rés. 2 /1972/ 825). Az enzimet 95 °C-on 5 percig tartó kezeléssel dezaktiváljuk. Végül az la és Ib oligonukleotidokat egymással szemben hibridizáljuk úgy, hogy vizes oldatban 2 percre 95 °C-ra felmelegítjük, majd lassan 5 °C-ra lehűtjük.

Hasonló módon foszforilezzük és párosával hibridizáljuk az Ic és ld, le és If, lg és Ih, valamint az Ii és Ij oligonukleotidokat. Az IFN-II szubfragmenshez a Ila-t Ilb-vel, stb. egészen a Ilk és III oligonukleotidig, és az IFN-III szubfragmenshez a Illa és Illb, stb. egészen a Ilik és ΠΙ1 oligomerekig végezzük a foszforilezést és páronkénti hibridizálást.

Az ilyen módon az IFN-I génfragmenshez kapott öt oligonukleotidpárt, illetve az IFN-II és IFN-III-hoz kapott hat oligonukleotidpárt mindig a következő módon ligáljuk:

A kettősszálú nukleotidokat egyesítjük, és 20 mmól/l magnézium-kloridot és 10 mmól/l DTT-t tartalmazó 40 μΐ 50 mmól/l-es Tris-HCl-pufferben 100 egység T4-DNS-ligáz segítségével 15 °C-on 16 óra alatt ligáljuk.

Az IFN-I-től IFN-III-ig terjedő génfragmensek tisztítását gélelektroforézissel végezzük 10%-os poliakrilamid-gélen (karbamid hozzáadása nélkül, 20,40 cm 1 mm vastag), ahol marker anyagként HinfI-vel vágott 0X 174 DNS-t (Fa. BRL) vagy Hae ΙΠmal vágott pBR 322-t használunk.

3. Az IFN-I, IFN-II és IFN-III génfragmenseket tartalmazó hibridplazmidok előállítása

a) az IFN-I génfragmens beépítése pBR 322-be

A kereskedelmi forgalomban levő pBR 322 plazmidot Eco Rí és Bam Hl restrikciós endonukleázzal ismert módon az előállító adatai szerint megnyitjuk. Az emésztendő anyagot 5%-os poliakrilamid-gélen elektroforetikus úton megosztjuk, és a darabokat etidiumbromidos festéssel vagy radioaktív jelzéssel (,NickTranslation” Maniatis id. h.) láthatóvá tesszük. A plazmidfoltokat végül az akrilamid-gélből kivágjuk, és a poliakrilamidból elektroforetikus úton elválasztjuk. Az emésztendő anyag megosztását 2%-os, alacsony olvadáspontú agarózgélen is végezhetjük (1. 6a. példát).

Ezután 1 μg plazmidot 10 ng IFN-I génfragmenssel egy éjszakán át 16 °C-on ligáljuk. így az 1. ábrán bemutatott hibridplazmidot kapjuk.

b) Az IFN-II génfragmens beépítése pUC 8-ba

Az a) pont alattihoz hasonló módon vágjuk a kereskedelmi forgalomban levő pUC 8 plazmidot Bam Hl és Hind III-mal, és ligáljuk az IFN-II génfragmenssel. így a 2. ábrán bemutatott hibridplazmidot kapjuk.

c) Az IFN-III génfragmens beépítése pUC 8-ba

Az a) pont alattihoz hasonlóan vágjuk a pUC 8 plazmidot Hind III és Sál I-vel, és az IFN-III génfragmenssel ligáljuk. így a 3. ábrán bemutatott hibridplazmidot kapjuk.

HU 210 111 Β

4. A komplett gén szintézise

a) Transzformáció és amplifikáció

A fenti módon kapott hibridplazmidokat E. coli-ba transzformáljuk. Ehhez az E. coli K 12 törzset 70 mmól/l-es kalcium-klorid-oldattal kompetenssé tesszük, és a hibridplazmidok CaCL-re nézve 70 mmól/l-es, 10 mmól/l-es Tris-HCl-pufferrel készült oldatával kezeljük. A transzformált törzseket szokásos módon, a plazmid által közvetített antibiotikum-rezisztencia, illetve -érzékenység alapján szelektáljuk, és a hibridvektorokat amplifikáljuk. A sejtek elölése után a hibridplazmidokat izoláljuk, az eredetileg alkalmazott restrikciós enzimekkel felvágjuk és az IFN-I, IFN-II és IFN-III génfragmenseket gélelektroforézissel elkülönítjük.

b) A génfragmens kapcsolása

A kiterjesztéssel kapott IFN-I, IFN-Π és IFN-III szubfragmenseket a 2. példában leírthoz hasonló módon enzimatikusan kapcsoljuk, és az így kapott, I. DNS-szekvenciával rendelkező szintetikus gént a pUC 8 klónozó vírusba visszük. így a 4. ábrán bemutatott hibridplazmidot kapjuk,

5. ΙΑ, IB és IC DNS-szekvenciával rendelkező' hibridplazmidok szintézise

a) IB beiktatott részt tartalmazó hibridplazmid

A 4. ábrán bemutatott, I. DNS-szekvenciával rendelkező hibridplazmidot ismert módon az Eco Rí és Sál I restrikciós enzimekkel vágjuk, a kis Eco Rí- és Sál I-fragmenseket poliakrilamid-gélelektroforézissel elválasztjuk, és Ava II enzimmel újravágjuk. Az előbb képzett nagy DNS-fragmenseket a következő adapterral

5' AA TTC ACC ATG 3'

3' G TGG TAC CTG 5'

Eco Rí Ava II ligáljuk, majd az Eco Rl-gyel és Sál I-gyel hasított pUC 8-ba építjük be, és így olyan hibridplazmidot kapunk, amely az IB DNS-szekvenciát tartalmazza.

b) IA beiktatott részt tartalmazó hibridplazmid

Az I. DNS-szekvenciát az előállító adatai alapján Pst I restrikciós enzimmel vágjuk, és az Eco Rl-Pst I-fragmenseket izoláljuk. Ezalatt a pUC 8 plazmidot Eco Rí és Sma I restrikciós enzimekkel megnyitjuk, és az előbb izolált fragmenst a következő adapter segítségével

5' GCT TAG TAA CCC 3'

3' A CGT CGA ATC ATT GGG 5'

Pst I Sma I beiktatjuk, így a 6. ábrán bemutatott hibridplazmidot kapjuk.

c) IC beiktatott részt tartalmazó hibridplazmid

Az 5a. példában leírt módon kapott hibridplazmidot Eco Rí-vei és Pst I-vel emésztjük. Az izolált (Eco

Ri - Pst I)-fragmenseket az 5b. példában leírthoz hasonló módon új hibridplazmiddá ligáljuk, amely már a beiktatott IC DNS-szekvenciát tartalmazza (7. ábra).

6. Hibridplazmidok előállítása az IA, IB és IC

DNS-szekvenciák kifejezéséhez

a) Beépítés a pHH 177.3-ba

ApKK 177.3 expressziós plazmidot (ptac 11 plazmid [Amman és munkatársai, Gene 25, /1983/ 167, amelybe az Eco Rl-felismerőhelynél szintetikusan olyan szekvencia van beépítve, amely egy Sál I-vágóhelyet tartalmaz] Eco Rí és Sál I restrikciós enzimekkel megnyitjuk. Az 5. ábra szerinti plazmidból az IB beiktatott részt Eco Rí és Sál I restrikciós enzimekkel kivágjuk. Hasonló módon izoláljuk a (kissé meghoszszabbított) IA* és IC* beiktatott részeket, mert a pUC 8 plazmidban a két génfragmens tulajdonképpeni vége után, amelyet az Sma I restrikciós enzim vágóhelye jellemez, néhány nukleotid Sál I-vágóhelyet tartalmaz (6. és 7. ábra).

Az IA*, IB és IC* fragmenseket 2%-os alacsony olvadáspontú agarózra visszük, ahonnan a plazmidDNS-t elválasztjuk, és a beiktatott részeket a gél felmelegítéssel történő (az előállító utasításai szerint) feloldásával visszanyerjük. A felvágott pKK 177.3 plazmid IA*, illetve IB vagy IC* fragmensekkel történő ligálásával olyan hibridplazmidot kapunk, amelynél a beiktatott részek mindig egy expressziós, illetve regulációs terület elé vannak kapcsolva. Alkalmas induktor, pl. izopropil-p-tiogalaktopiranozid (IPTG) adagolása után olyan mRNS képződik, amely az IA, illetve IB vagy IC DNS-szekvenciának megfelelő metionil-polipeptid expressziójához vezet.

b) Beépítés a pMX 2-be

A pMX 2 expressziós plazmid egy 21 nukleotiddal megrövidített pUC 8 plazmidból áll, és a következő módon lehet előállítani:

A pUC 8 plazmidot Eco Rí restrikciós endonukleázz'al megnyitjuk, és utána Bal 31 exonukleázzal kezeljük olyan körülmények között, amelyek az Eco Rí vágóhely mellett mindkét oldalon mintegy 20 nukleotid lehasadását eredményezik (Maniatis, id. h.). Végül az így kezelt plazmid esetleg kiálló végeit KlenowDNS-polimerázzal feltöltjük, a plazmidot Hind III restrikciós endonukleázzal utánavágjuk, és a plazmidot 1 %-os alacsony olvadáspontú agarózgélen, az előállító utasításai szerint tisztítjuk. A plazmidba az eredetileg a pUC 8-ban levő, Eco Rí és Hind III restrikciós enzimes vágásokkal határolt polilinkert, amelyet az előbb említett manipulációkkal széttörtünk, átiktatjuk. Ehhez a pUC 8-at Eco Rí restrikciós enzimmel megnyitjuk, és a kiálló végeket Klenow-DNS-polimerázzal, ³²P-vel jelzett nukleozid-trifoszfát alkalmazása mellett feltöltjük. A polilinkert végül a plazmidból Hind III restrikciós enzimmel kivágjuk, és 10%-os akrilamidgélen végzett elektroforézissel a plazmidtól elválasztjuk. A polilinker foltok autoradiográfia segítségével végzett azonosítása

HU 210 111 Β után a polilínkert az akrilamid maradékoktól elektroelúcióval megszabadítjuk, és a megrövidített pUC 8 plazmiddal ligáljuk. Az így kialakított pMX 2 plazmidot végül Eco Rí és Sál I restrikciós enzimekkel megnyitjuk, és az IA, illetve IB vagy IC* γ-interferon-génfragmenseket, amelyek a végükön Eco Rí- és Sál I-felismerőszekvenciákat tartalmaznak, a pMX 2 expressziós plazmidba ligáljuk (8-10. ábrák). Azokat a kiónokat, amelyek magas interferon-titert mutatnak, biológiai aktivitásmeghatározással azonosítjuk [Standardisation of Interferons, WHO Technical Report fér. No. 687 (1983); Antiviral Research 4, 75-98 (1984)].

7. A hibridplazmidok transzformációja

A kompetens E. coli sejteket 0,1-1 pg hibridplazmiddal, és amplicit tartalmazó agarlemezeken szélesztjük. Végül azokat a kiónokat, amelyek korrekt, a megfelelő plazmidba beépült γ-interferon-szekvenciát tartalmaznak, DNS-gyorsfeldolgozással azonosítjuk (Maniatis id. h.).

8. A y-interferon-aktivitást mutató polipeptidek expressziója

Az ismertetett hibridplazmidok E. coliba való transzformációja után olyan polipeptideket exprimálunk, amelyek az aminoterminálison levő megfelelő γ-interferon- aminosavszekvencián kívül egy további metionilcsoportot tartalmaznak, azaz az IA konstrukciójánál Met-(IFN-Y, 1-127. aminosav), az IB konstrukciójánál Met-(IFN-Y, 5-146. aminosav), az IC konstrukciójánál Met-(IFN-Y, 5-127. aminosav),

9. Feldolgozás és tisztítás

A kívánt optikai sűrűségig tenyésztett baktériumtörzseket egy alkalmas induktorral, pl. IPTG-vel kellő hosszú ideig, például 2 óra hosszat inkubáljuk. Végül a sejteket 0,1% krezollal és 0,1 mól benzil-szulfonil-fluoriddal elöljük. Centrifugálás vagy szűrés után a sejttömeget pufferoldatban (50 mmól/1 Tris,

50 mmól/1 EDTA, pH = 7,5) felvesszük, és mechanikusan feltárjuk, például French-préssel, illetve DYNOmalommal (Fa. Willy Bachofer, Basel gyártmány), majd a fel nem oldható részeket lecentrifugáljuk. A maradékból a γ-interferon-aktivitással rendelkező pro10 teneket szokásos módszerrel tisztítjuk. Éne a célra alkalmasak az ioncserélő-, adszorpciós-, gélszűrő oszlopok vagy antitest-oszlopon végzett affinitás-kromatográfia. Nátrium-dodecil-szulfát-akrilamidgél- vagy HPLC-elemzéssel ellenőrizzük a termék töménységét és tisztaságát.

A termékek γ-interferon-aktivitásra vonatkozó biológiai jellemzéséhez ismert módon indikátor sejtvonalakat, pl. Vero-sejteket használunk, amelyeket az interferontartalmú baktérium-extraktumok hígítási sorával inkubálunk. Végül egy vírussal, pl. VSV (Vesicular Stomatitis Vírus) való fertőzés útján meghatározzuk, hogy a baktériumextraktum milyen hígítási foka az, amellyel a Vero-sejteknél antivírusos állapot idézhető elő. A kiértékelést végezhetjük mikroszkopikusan vagy a neutrálvörös-felvétel meghatározásával.

A γ-interferon-aktivitás meghatározását valamely forgalomban levő olyan radioimmun-elemző módszerrel is végezhetjük, amely γ-interferon elleni monoklonális antitesteken alapszik. (Celltech Ltd.).

10. A DNS-szekvencia módosítása

a) Egy olyan y-interferon-analóg előállításához, amely a 102-es helyzetben szerin helyett glutamin35 savat tartalmaz, az I. vagy 2. példa szerint a következő nukleotidot szintetizáljuk:

5' AG CTT ACT AAC TAC 3' A TGA TTG ATG

Hind III

Az IFN-III génffagmenst az Aha III restrikciós enzimmel emésztjük, a nagyobb fragmenst elválasztjuk, és a fenti nukleotiddal ligáljuk. A pUC 8 plazmidba való beépítést a 3c. példa szerint végezzük. A 4a. példa szerint végzett transzformáció és ampiifikáció után a módosított IFN-ΙΠ szekvenciát Maxam-Gilbertszekvenciameghatározással ellenőrizzük. Ezt a módosított szubfragmenst az IFN-I és IFN-II génfragmensekkel ligáljuk a 4. példa szerint, majd tovább az 5-9.

Glu
GAA	GTT	ACT GAT	TT
CTT	CAA	TGA CTA	AA
	•	Aha	III

példában bemutatott eljárást végezzük, és így módosí45 tott ΙΕΝ-γ-hez jutunk, ahol a 102-es helyzetben szerin helyett glutaminsav van beépítve. A termék antivírusos aktivitással rendelkezik.

b) y-interferon-analógok, 1-136 aminosavszekvenciával, és azt követő ciszteinnel A következő nukleotidot szintetizáljuk az 1. és 2.

példa szerint:

5' GCT AAA ACT GGT AAA CGT AAA

3' A CGT CGA TTT TGA CCA TTT GCA TTT

Pst I

Cys

5' CGT TCC CAG TGC TAA TAG

3' GCA AGG GTC ACG ATT ATC AGC T Sál I

HU 210 111 Β

Az UFN-III fragmenst Pst I restrikciós enzimmel vágjuk, és a nagyobbik fragmenst elválasztjuk. Ezt az előbbi nukleotiddal ligáljuk, és tovább dolgozunk vele a fenti módon. Olyan módosított γ-interferont kapunk, amely az 1-136. aminosavat és egy karboxil-terminális ciszteint tartalmaz. Ez a γ-interferon-analóg stabil és a feldolgozáskor kromatográfiásan könnyebben kezelhető, mint a természetes γ-interferon.

I. DNS-szekvencia*

Tríplett sz

CAG GAC GTC CTG

Aminosavak Nukleotid sz. Kódoló ág 5' Nem-kódoló ág 3'

MetCysTyrCysGlnAsp 1 10 AA TTC ATG TGC TAC TGC

G TAC ACG ATG ACG

6	7	8	9	10	11	12	13	14	15
Pro	Tyr	Val	Lys	Glu	Alá	Glu	Asn	Leu	Lys
		30	35		40			50
CCG	TAC	GTT	AAA	GAA	GCT	GAA	AAC	CTG	AAA
GGC	ATG	CAA	TTT	CTT	CGA	CTT	TTG	GAC	TTT
16	17	18	19	20	21	22	23	24	25
Lys	Tyr	Phe	Asn	Alá	Gly	His	Ser	Asp	Val
	60			70			80
AAA	TAC	TTC	AAC	GCT	GGT	CAT	TCT	GAC	GTT
TTT	ATG	AAG	TTG	CGA	OCA	GTA	AGA	CTG	CAA
26	27	28	29	30	31	32	33	34	35
Alá	Asp	Asn	Gly	Thr	Leu	Phe	Leu	Gly	Ile
	90		100			110
GCT	GAC	AAT	GGT	ACT	CTG	TTC	CTG	GGG	ATC
CGA	CTG	TTA	CCA	TGA	GAC	AAG	GAC	CCC	TAG
36	37	38	39	40	41	42	43	44	45
Leu	Lys	Asn	Trp	Lys	Glu	Glu	Ser	Asp	Arg
	120		130			140
CTG	AAA	AAC	TGG	AAA	GAA	GAA	TCT	GAC	CGT
GAC	TTT	TTG	ACC	TTT	CTT	CTT	AGA	CTG	GCA
46	47	48	49	50	51	52	53	54	55
Lys	Ile	Met	Gin	Ser	Gin	Ile	Val	Ser	Phe
	150			160			170
AAA	ATC	ATG	CAA	TCT	CAG	ATC	GTT	TCT	TTC
TTT	TAG	TAC	GTT	AGA	GTC	TAG	CAA	AGA	AAG
56	57	58	59	60	61	62	63	64	65
Tyr	Phe	Lys	Leu	Phe	Lys	Asn	Phe	Lys	Asp
		180			190			200
TAC	TTC	AAA	CTG	TTC	AAA	AAC	TTT	AAA	GAC
ATG	AAG	TTT	GAC	AAG	TTT	TTG	AAA	TTT	CTG
66	67	68	69	70	71-	72	73	74	75
Asp	Gin	Ser	Ile	Gin	Lys	Ser	Val	Glu	Thr
		210			220			230
GAC	CAG	TCT	ATC	CAG	AAA	TCT	GTT	GAA	ACT
CTG	GTC	AGA	TAG	GTC	TTT	AGA	CAA	CTT	TGA
76	77	78	79	80	81	82	83	84	85
Ile	Lys	Glu	Asp	Met	Asn	Val	Lys	Phe	Phe
	240		250			260
ATC	AAG	GAA	GAC	ATG	AAC	GTT	AAA	TTT	TTC
TAG	TTC	CTT	CTG	TAC	TTG	CAA	TTT	AAA	AAG
86	87	88	89	90	91	92	93	94	95
Asn	Ser	Asn	Lys	Lys	Lys	Arg	Asp	Asp	Phe
	270		280			290
AAC	TCT	AAC	AAA	AAA	AAA	CGT	GAC	GAC	TTC
TTG	AGA	TTG	TTT	TTT	TTT	GCA	CTG	CTG	AAG
96	97	98	99	100	101	102	103	104	105

* az Eco Rl-nek megfelelő szekvenciával, „O. triplett”-tel az amino-terminálison, két stop-triplettel és Sál I-nek megfelelő szekvenciával a karboxil-terminálison

HU 210 111 Β

Glu	Lys	Leu Thr Asn Tyr	Ser	Val	Thr 320	Asp
300	310
GAA	AAG	CTT ACT	AAC TAC	TCT	GTT	ACT	GAT
CTT	TTC	GAA TGA	TTG ATG	AGA	CAA	TGA	CTA
106	107	108 109	110 111	112	113	114	115
Leu	Asn	Val Gin	Arg Lys	Alá	Ile	His	Glu
		330	340			350
TTA	AAC	GTT CAA	CGT AAA	GCT	ATC	CAC	GAG
AAT	TTG	CAA GCA	GCA TTT	CGA	TAG	GTG	CTG
116	117	118 119	120 121	122	123	124	125
Leu	Ile	Gin Val	Met Alá	Glu	Leu	Ser	Pro
	360	370			380
CTC	ATC	CAG GTT	ATG GCT	GAA	CTG	TCT	CCT
GAG	TAG	GTC CAA	TAC CGA	CTT	GAC	AGA	GGA
126	127	128 129	130 131	132	133	134	135
Alá	Alá	Lys Thr	Gly Lys	Arg	Lys	Arg	Ser
	390	400			410
GCA	GCT	AAA ACT	GGT AAA	CGT	AAA	CGT	TCC
CGT	CGA	TTT TGA	CCA TTT	GCA	TTT	GCA	AGG
136	137	138 139	140 141	142	143	144	145
Gin	Met	Leu Phe	Arg Gly	Arg	Arg	Alá	Ser
	240	430			440
CAG	ATG	CTG TTC	CGC GGT	CGT	CGT	GTC	TCT
GTC	TAC	GAC AAG	GCG CCA	GCA	GCA	CGA	AGA

146

Gin

450

CAG TAA TAG 3'

GTC ATT ATC AGC T 5'

IA DNS-szekvencia*

Met (1-127. aminosav) Stp Stp 1 5

5' AA TTC ATG (9-389. nukleotid) G TAC (komplementer nukl

TAG TAA CCC ATC ATT GGG

IB DNS-szekvencia*

Met

5' AA TTC ATG G TAC (5-146. aminosav) (21-446. nukleotid)

Stp Stp

TAA TAG 3'

ATT ATC AGC T 5'

IC DNS-szekvencia*
	0
	Met	(5-127. aminosav)
5' AA TTC	ATG	(21-389. nukleotid)
G	TAC

Stp Stp TAG TAA CCC

ATC ATT GGG

II. DNS-szekvencia

IFN-I:

--la -►

Met Cys Tyr Cys Gin Asp

5' AA TTC ATG TGC TAC TGC CAG GAC 3' G TAC ACG ATG ACG GTC CTG

Eco Rí -Ib* az Eco Rl-nek megfelelő szekvenciával, „O. triplett”-tel az amino-terminálison, két stop-kodonnal és Sál I-nek megfelelő szekvenciával a karbo xil-terminálison

HU 210 111 Β

Ic

Pro Tar Val Lys Glu Alá Glu Asn CCG TAC GTT AAA GAA GCT GAA AAC

Leu Lys CTG AAA

GGC ATG

CAA TTT CTT CGA CTT TTG GAC TTT ,-_Id-,

	le
Lys	Tyr	Phe	Asn
AAA	TAC	TTC	AAC
TTT	ATG	AAG	TTG

•If ¹ lgGly His Ser Asp Val GGT CAT TCT GAC GTT

AGA CTG CAA --Ih-

Alá	Asp	Asn	Gly Thr	Leu	Phe
GCT	GAC	AAT	GGT	ACT	CTG	TTC
CGA	CTG	TTA	CCA	TGA	GAC	AAG r-í —

Ii'

Bam Hl

II. DNS-szekvencia IFN-II:

-Ha->

(Gly) Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp G ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAA TCT GAC

Bam Hl

Arg

CGT

GAC TTT TTG ACC TTT CTT CTT AGA CTG GCA

-_IIb-IIc-

Lys	Ile	Met	Gin	Ser	Gin	Ile	Val	Ser	Phe
AAA	ATC	ATG	CAA	TCT	CAG	ATC	GTT	TCT	TTC
TTT	TAG	TAC	GTT	AGA	GTC	TAG	CAA	AGA	AAG

•Ild-

HU 210 111 Β

Glu (Lys)

GAA A

CTT TTC GA Hind III

II. DNS-szekvencia IFN-III:

Illa(Lys) Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr AG CTT ACT AAC TAC TCT GTT ACT

Asp

GAT

Hind III

A TGA TTG ATG AGA CAA TGA CTA -Illb lile

Leu Asn Val Gin Arg Lys Aal Ile TTA AAC GTT CAA CGT AAA GCT ATC

His Glu CAC GAG

AAT

TTG CAA GTT GCA TTT CGA TAG GTG CTC «- Ilid- m_eLeu Ile Gin Val Met Alá Glu CTC ATC CAG GTT ATG GCT GAA

Leu Ser Pro CTG TCT CCT

GAG TAG GTC CAA TAC CGA CTT GAC AGA -111 f- IIlgAlá Alá Lys Thr Gly Lys GCA GCT AAA ACT GGT AAA

GGA «-mi —

Arg Lys Arg Ser CGT AAA CGT TCG

CGT CGA TTT TGA CCA TTT GCA TTT 111 h '

GCA AGG

Ilii

Gin Met Leu Phe Arg CAG ATG CTG TTC CGC

Ilik

Gly Arg Arg Alá Ser GGT CGT CGT GCT TCT

GTC TAC GAC AAG GCG CGA GCA -_TIIj -GCA CGA AGA «-HU —

Gin Stp Stp

CAG TAA TAG 3' GTC ATT ATC AGC T 5'

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Géntechnológiai eljárás humán gamma-interferon 5-127, 1-127 vagy 5-146 aminosavszekvenciával rendelkező részszekvenciáinak az előállítására, azzal 50 jellemezve, hogy egy gazdaszervezetben egy (PR)_x-X_y-R-Y_z-Z általános képletű DNS-t - ahol x, y, és z egyástól függetlenül 9 vagy 1 lehet, de abban az esetben, ha X jelentése Met-Cys-Tyr- 55

Cys-Gln-t kódoló DNS, akkor y és z egyszerre nem lehet 1,

Pr, X, R és Y olyan nukleotid-szekvenciát jelentenek, amelyek a következő aminosavakat, illetve aminosavszekvenciákat kódolják:

Pr olyan prepeptid, amely a gazdaszervezetben vagy in vitro lehasad,

X jelentése Met, Met-Cys-Tyr-Cys-Gln vagy HCys-Tyr-Cys-Gln,

R jelentése 5-127, aminosavak,

Y jelentése 128-146. aminosavak,

Z egy vagy két stop-kodont jelent tartalmazó gént kifejezünk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t használnuk, amely Z helyén két stop-kodont tartalmaz.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként E. coli-t használunk.