HU203579B - Process for producing fusion-proteins - Google Patents
Process for producing fusion-proteins Download PDFInfo
- Publication number
- HU203579B HU203579B HU864872A HU487286A HU203579B HU 203579 B HU203579 B HU 203579B HU 864872 A HU864872 A HU 864872A HU 487286 A HU487286 A HU 487286A HU 203579 B HU203579 B HU 203579B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- plasmid
- sequence
- protein
- amino acid
- fusion protein
- Prior art date
Links
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 36
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 85
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 27
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 abstract description 22
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 abstract description 16
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 abstract description 15
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 abstract description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 10
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 abstract 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 abstract 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 abstract 1
- 101150010487 are gene Proteins 0.000 abstract 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 abstract 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical group N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 5
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 5
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Asp-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100244625 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pph-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CNKBMTKICGGSCQ-ACRUOGEOSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-diamino-1-oxohexyl]amino]-1-oxo-3-phenylpropyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CNKBMTKICGGSCQ-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 101100004202 Arabidopsis thaliana BBM gene Proteins 0.000 description 1
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- CQMQJWRCRQSBAF-BPUTZDHNSA-N Asn-Arg-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N CQMQJWRCRQSBAF-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- AWXDRZJQCVHCIT-DCAQKATOSA-N Asn-Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC(N)=O AWXDRZJQCVHCIT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XDGBFDYXZCMYEX-NUMRIWBASA-N Asp-Glu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O XDGBFDYXZCMYEX-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100191238 Caenorhabditis elegans pph-5 gene Proteins 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- XLLSMEFANRROJE-GUBZILKMSA-N Cys-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N XLLSMEFANRROJE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- QNJNPKSWAHPYGI-JYJNAYRXSA-N Glu-Phe-Leu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QNJNPKSWAHPYGI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- CAQXJMUDOLSBPF-SUSMZKCASA-N Glu-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CAQXJMUDOLSBPF-SUSMZKCASA-N 0.000 description 1
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- QYZYJFXHXYUZMZ-UGYAYLCHSA-N Ile-Asn-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N QYZYJFXHXYUZMZ-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N L-Leucyl-L-Arginyl-L-Proline Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N Leu-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- JKGHDYGZRDWHGA-SRVKXCTJSA-N Leu-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JKGHDYGZRDWHGA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IWTBYNQNAPECCS-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 IWTBYNQNAPECCS-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- REPBGZHJKYWFMJ-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N REPBGZHJKYWFMJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- RTIRBWJPYJYTLO-MELADBBJSA-N Leu-Lys-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N RTIRBWJPYJYTLO-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- FHIAJWBDZVHLAH-YUMQZZPRSA-N Lys-Gly-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FHIAJWBDZVHLAH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- XDGFFEZAZHRZFR-RHYQMDGZSA-N Met-Leu-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XDGFFEZAZHRZFR-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- WXXNVZMWHOLNRJ-AVGNSLFASA-N Met-Pro-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O WXXNVZMWHOLNRJ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- VADLTGVIOIOKGM-BZSNNMDCSA-N Phe-His-Leu Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CN=CN1 VADLTGVIOIOKGM-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- VHDNDCPMHQMXIR-IHRRRGAJSA-N Phe-Met-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 VHDNDCPMHQMXIR-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N Ser-Asn Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- HDBOEVPDIDDEPC-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HDBOEVPDIDDEPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N Ser-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- PCJLFYBAQZQOFE-KATARQTJSA-N Ser-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PCJLFYBAQZQOFE-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N Thr-Glu Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- UGFSAPWZBROURT-IXOXFDKPSA-N Thr-Phe-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O UGFSAPWZBROURT-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- WPSKTVVMQCXPRO-BWBBJGPYSA-N Thr-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WPSKTVVMQCXPRO-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 229940045883 glutathione disulfide Drugs 0.000 description 1
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- UOEFDXYUEPHESS-QMGXLNLGSA-N isopropyl beta-D-galactopyranoside Chemical compound CC(C)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UOEFDXYUEPHESS-QMGXLNLGSA-N 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010090333 leucyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- -1 nucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000013138 pruning Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L sodium tetrathionate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás eukarióta proteinek előállítására géntechnológiai úton. A proteinek expresszióját a 2-interleukint kódoló DNS-ból származó „nyitott olvasóraszter” segítségével végezzük.
Kisebb (mintegy 15 000 daltonig terjedő) mól tömegű, diszulfid-hidakat tartalmazó eukarióta proteinek géntechnológiai előállításakor baktériumokban a hozam gyakran alacsony. Feltételezhető, hogy a gazdasejt saját proteáz enzimjei a képződött proteint hamar lebontják. Ezért célszerű olyan génszerkezet létrehozása, amely fúziós proteint kódol; a fúziós protein nem kívánt része a gazdasejt egyik proteinje, ezt a részt később lehasítják.
Azt találtuk, hogy lényegében a 2-interIeukin Nterminális részének első 100 aminosavának megfelelő más. Primer termékként tehát teljesen vagy legnagyobb részében eukarióta proteinből álló fúziós protein keletkezik. Feltehető, hogy a gazdasejt a protein idegen voltát nem fedezi fel, ezért nem is bontja le a terméket. Előnyös továbbá, hogy a találmány szerint előállított fúziós proteinek nehezen oldódó, illetve oldhatatlan vegyületek, ezért egyszerű módon, célszerűen centrifugálissal választhatók el az oldott proteinek mellől.
Tekintve, hogy a fúziós protein interleukinrésze csak „ballasztként” szerepel, nem játszik szerepet az a tény, hogy az interleukin biológiailag aktív molekula. Ezért nem szükséges az interleukinnel való teljes azonosság. A találmány céljaira elég, ha lényegében az N-terminális rész első 100 aminosav van jelen. így az N-terminális részt olyan módon variálhatjuk, hogy a kívánt protein lehasíthatóvá váljék (amennyiben az N-terminálishoz kötődik). Ha a kívánt protein - a szokásos módon - C-terminálisan kötődik a fúziós proteinben, a lehasíthatóság érdekében a C-terminálist módosítjuk.
A humán 2-interleukint (az alábbiakban 2-IL) kódoló természetes DNS-szekvencia az EP-A1-0 091539 szám alatt publikált európai szabadalmi bejelentésből ismert. Az említett bejelentés égés és patkány 2-IL-re is kiterjed; ez az emlős 2 EL szintén alkalmazható a találmány szerinti protein-szintézishez, előnyösebb azonban, ha szintetikus DNS-ből indulunk ki. Különösen előnyös a 0 163 248 szám alatt publikált európai bejelentésnek megfelelő, köre nem bocsátott 34 19 995 számú NSZK-beli szabadalmi bejelentésben leírt DNS, amely humán 2IL-t kódol. Ezt a szekvenciát az 1. mellékletben tüntettük fel. E szekvenicának az az előnye, hogy kodonjai a leggyakrabban használt gazdasejtnek, az E. coli adottságaihoz illenek, továbbá, hogy néhány restrikciós endonukleázos vágóhelyet tartalmaz, amely a találmány szerinti eljárás során felhasználható. Az alábbi I. táblázatban a DNS-eleje és 100. aminosava közötti részben fellelhető előnyös vágóhelyeket tüntettük fel, a két vágóhely közötti részt kívánt esetben módosíthatjuk, a fent említett szabadalmi bejelentésben ismertetett további vágóhelyek felhasználásával.
1. táblázat
| Restrikciós enzim | felismerés szekvenciája | A felismerés szekvenciája elsőnukleotidjének helye a kódoló szálon |
| AhaII,BanI | 5’ | 3’ |
| Hae Π, Nar I Bán Π, Sac I | GGCGCC | 8 |
| SstI | GAGCTC | 291 |
| Hhal | GCGC | 9 |
| HinfI | GACTC | 35 |
| Pvul | CGATCG | 346 |
| Taql | TCGA |
Amennyiben a Bán Π, Sac I vagy Ssr I nukleázt alkalmazzuk, mintegy 95 aminosavat kódoló 2-ILrészszekvenciát kapunk. A lánc ezen hossza általában elég ahhoz, hogy oldhatatlan fúziós protein keletkezzék. Olyan esetben, ahol - például hidrofileukarióta protein esetén - az oldódás még mindig túl jó, de a minél kevesebb ballaszt termelése érdekében a C-terminálishoz közelebb eső vágóhelyet nem kívánunk felhasználni, az N- és/vagy C-terminális végét képező DNS-szekvenciát megfelelő adapter, illetve linker alkalmazásával meghosszabbíthatjuk, úgyszólván méretre szabott ballasztot alakítva ki. Természetesen a DNS-szekvenciát többé-kevésbé a teljes terjedelmében is hasznosíthatjuk, így - adott esetben módosított - biológiaüag aktív 2-IL-t kapunk melléktermékként, illetve kettős hatású proteint alakítunk ki, amely a 2-EL hatáson túlmenően a kódolt protein hatásával is rendelkezik.
A találmány tárgya tehát eljárás la és Ib képletű fúziós proteinek előállítására
Met-X-(Y)m-Z Met-Z-(Y)m-X (la) (ib) ahol
Z a célfehérjét vagy -pepiidet jelenti,
X jelentése 2-IL, előnyösen emberi 2-D első 90133 aminosavának szekvenciája, illetve ennek legfeljebb 6 aminosav cseréjével megváltoztatott variánsa,
Y jelentése 1-4 aminosavból álló híd, amely kémiai úton vagy enzimesen hasítható, illetve lehasítható és m jelentése zéró, ha a kívánt proteinhez szomszédos aminosav a kívánt protein lehasítását lehetővé teszi, máskülönben m jelentése 1,2,3 vagy 4.
Ahogy az (la) és (Ib) képletek mutatják és a fentiekben már említettük, a kívánt proteint a 2-IL-rész előtt, de utána is kifejezhetjük. Az egyszerűség kedvéért az alábbiakban főleg az első lehetőséget ismertetjük, amely a fúziós proteinek hagyományos előállításának felel meg; e klasszikus” módszer ismertetése azonban a másik lehetőséget nem zárja ki.
A fúziós protein hasítása önmagában ismert módon kémiai vagy enzimes úton történhet. Az alkal-2HU 203579Β más módszer főleg a kívánt protein aminosavszekveniájától függ. Amennyiben a protein nem tartalmaz metionint, Y helyén Met állhat, és klór-, illetve brómciánnal végzett kémiai hasítás lehetséges. Ha az Y jelű közbenső tag a karboxilterminálisan ciszteint tartalmaz, vagy Y jelentése Cys, cisztein-specifikus enzimmel vagy kémiailag, például előzetesen végzett specifikus S-cianilezés után lehet hasítani. Amennyiben az Y jelű áthidaló tag a karboxilterminálisan triptofánt tartalmaz, vagy Y jelentése Trp, a kémiai hasítás N-bróm-szukcinimiddel lehetséges.
Az aminosav-szekvenciában Asp-Pro-t nem tartalmazó és máskülönben savval szemben eléggé ellenálló proteineket ismert módon proteolítikusan hasítunk. Ez úton N-terminálisan prolint, illetve Cterminálisan aszparaginasvat tartalmazó proteint, azaz módosított proteint állíthatunk elő.
Az Asp-Pro-kötést még jobban savérzékennyé lehet tenni, ha az áthidaló tag jelentése (Asp)n-Pro vagy Glu-(Asp)n-Pro, ahol n jelentése 1,2 vagy 3.
Enzimes hasításra is ismertek példák, és módosított, azaz javított specifitású enzimek alkalmazása is lehetséges [C. S. Craik és mts-i, Science 228 (1985), 291-297]. Ha kívánt eukarióta peptidként humán proinzulint akarunk nyerni, az Y jelű szekvenciaként olyan peptidszekvenciát választhatunk, amely a proinzulin N-terminális amínosavához (Phe) kapcsolódó, tripszinnel lehasítható aminosavat (Arg, Lys) tartalmaz, így Y lehet például AlaSer-Met-Thyr-Arg, és az arginin-specifikus hasítást tripszin proteázzal lehet végezni.
Amennyiben a kívánt proteinben az De-Glu-GlyArg aminosavszekvencia nem szerepel, a hasítás az Xa faktorral is végezhető (0161937 sz. európai szabadalmi bejelentés).
A fúziós proteint alkalmas expressziós rendszerben ismert módon exprimál juk. Bármely gazdavektor-rendszer alkalmas, tehát például emlős sejtek és mikroorganizmusok, így élesztők, de előnyösen baktériumok, különösen előnyösen E. Coli.
A kívánt proteint kódoló DNS-szekvenciát ismert módon olyan vektorba építjük, amely a választott expressziós rendszerben jó expressziót biztosít.
Ha a gazdasejt baktérium, előnyösen a λ-fág Lac, Tac, Pl vagy Pr csoportjából választunk promotort és operátort, alkalmasak hsp, omp vagy szintetikus promotorok is, amelyeket a 3 430 683. számú európai szabadalmi bejelentés) ismertet. Előnyös a tac promotor-operátor-szekvencía, amely most már kereskedelmi termék (pl. a pKK223-3 expressziós vektor, Pharmacia, „Molecular Biolpgicals, Chemicals and Equipment fór Molecular Biology, 1984, 63. old.).
A fúziós protein expressziója során célszerű lehet, ha az ATG indító kodont követő első aminosavak egyes triplettjeit megváltoztatjuk, hogy a küldönc RNS szintjént esetleg bekövetkező bázispár képződést megakadályozzuk. Az üyen módosítások, mint ahogy a 2-IL-részben egyes aminosavak megváltoztatása, kihagyása vagy hozzáadása is szakember számára ismert műveletek, és a találmány ezekre is kiterjed.
Az alábbi példákkal a találmányt a rajzok alapján közelebbről ismertetjük. Az
1. ábra, valamint annak folytatása, az la. ábra a hirudin-szekvenciát tartalmazó fúziós proteint kódoló pK360 plazmid előállítására szemlélteti, a
2. ábra, valamint annak folytatása, a
2a. ábra a pK410 plazmid szintézisét mutatja; ez a plazmid szintén egy, a hirudin aminosav-sorozatát tartalmazó fúziós proteint kódol; a
3. ábra, és folytatását képező
3a-3c. ábrák a pH 15,16,20 és 30 plazmidok szerkesztését ábrázolják, e plazmidok a majom-proinzulins aminoasv-sorozatát tartalmazó fúziós proteint kódolnak. A
4. ábra a pH 100 plazmid szintézisét ábrázolja, a benne kódolt fúziós protein a hirudin aminosav-sorozatát tartalmazza. Az
5. ábra, valamint annak folytatása, az
5a. ábra a pK 370 plazmid szerkesztését mutatja; szintén olyan fúziós proteint kódol, amely a hirudin-szekvenciát tartalmazza, míg a
6. ábra, valamint annak folytatása, a
6a. ábra a pHIOl plazmid szintézisét szemlélteti; e plazmid egy, a majom-proinzulin aminosav-sorozatát tartalmazó fúziós proteint kódol.
A példákban alkalmazott vektorok, plazmidok és baktériumok az alábbiak szerint hozzáférhetők:
pKK 223-3 és pUC 12: a kereskedelmi forgalomban kapható plazmidok, a Pharmacia Inc. USA-beli cég 1984-ben kiadott gyártmányismertetőjének 58., illetve 63. oldalán szerepelnek.
pKK 177-3: Amannetal.,Gene 25,167/1983 p 159/6:34 19 955 sz. NSZK-beli közrebocsátási irat. A 3. példában említett (26) jelű DNS-szekvencia előállítását is ez a közrebocsátási irat ismerteti.
E. coli HB101
E. coli MM 294: az ATCC-katalógusban 33694, illetve 39604 szám alatt szerepel.
A rajzok nem méretarányosak, főlega polilinkerek feltüntetésekor „nyújtás” történt.
A példákban említett műveletek egy részét T. Maniatis, E.F. Fritsch és J. Sambrook „Molecular Cloning, a Laboratory Manual” c. könyvében (Cold Spring Habor Laboratory, New York, 1982) részletesen és reprodukálhatóan leírták. Tekintettel arra, hogy a következő példákban e műveletek többszörösen szerepelnek, az alábbiakban hivatkozási listát közlünk, amelyben hivatkozási szám mellett az adott műveletek és a fent említett könyv egy-egy oldalszáma szerepel; a példa vonatkozó részében csak a hivatkozási számot adjuk meg, amelyhez a lista alapján a pontos irodalmi hely nehézség nélkül hozzárendelhető.
1. DNS vágása, plazmid nyitása: 104. oldaltól kezdve, valamint az enzimet előállító cég prospektusa
2. DNS utókezelései
2.1 Rövidítés
2.1.1 Exonuklázos kezelés rövidítés céljából: A BamHl enzimet alkalmaztuk, lásd 135. oldal
2.1.2 túlnyúló végek levágása: 140. oldal
2.1.3 túlnyúló végek feltöltése: 113.oldal
3. DNS-fragmensek izolálása
A DNS-fragmensek szétválasztása gél-elektroforézis útján, agaróz-gél segítségével (150-172. oldal), vagy - rövid, azaz 1 kb-nál kisebb fragmensek ese3
-3HU 203579Β tén - poliakrilamid-gél segítségével (173-181. oldal) történik.
4. Ligálás: 146., valamint 390-301. old.
5. E coli sejtek transzformálása: 249-251. old.
6. Azonosítás
6.1 Szélesztés: 55-61., 68-79. és 249-250. old.
6.2 Restrikciós elemzés: 104. old.
6.3 szekvencia elemzés: 475. old.
A hivatkozási számokat szögletes zárójelben [] tüntetjük fel, hogy a rajzokra való hivatkozásoktól megkülönböztethetők legyenek.
1. példa
A lac-represszort (P. J. Farabaugh, Natúré 274 (1978), 756-769) a pKK 177-3 plazmidba (Amann és munkatársai, Gebe 25 (1983) 167) juttatva a pJF 118(1) plazmidot kapjuk (1. ábra: P 35 26 995.2. sz. NSZK-beli szabadalmi bejelentés 6. példája és 6. ábrája). Ezt az Ava I restrikciós enzim kizárólagos vágóhelyénél megnyitjuk [1] és ismert módon exonukleázzal kezelve [2.1.1] mintegy 1000 bázispárral rövidítjük. Ligálás [4] után a pEW 1000 (2) plazmidot (1. ábra) kapjuk. A plazmid a teljes lac-represszor-gént tartalmazza, ugyanakkor a kicsinyítés következtében szignifikánsan magasabb darabszámban fejeződik ki, mind a kiinduló plazmid.
A pKK 177-3 plazmid helyett a már említett, kereskedelmi forgalomban levő pKK223-3 plazmádból is indulhatunk ki, ez esetben is a lac-represszor beépítése után a plazmidot rövidítjük.
a pEW 1000 plazmidot (2) az EcOR I és Sál I resktrikciós enzimmel megnyitjuk (3) [ 1 ].
A hirudint kódoló plazmidot (4) (előállítva a 34 29 430 sz, NSZK-beli közrebocsátási irat 4. példája és 3. ábrája szerint: ez a 0 171024 szám alatt közzétett európai szabadalmi bejelentésnek felel meg), az Acc I és Sál I restrikciós enzimmel megnyitjuk [1], és az (5) számú, majdnem teljesen a hirudin-szekvenciából álló kis fragmenst elkülönítjük [3],
A pl59/6 plazmidot (6) (előállítva a 34 19 995. számú NSZK-beli közrebocsátási irat 4. példája szerint; ez a O 163 249. szám alatt publikált európai szabadalmi bejelentésnek felel meg) az Ecó Rí és Pvu I restrikciós enzimmel megnyitjuk [1], és a 2IL-szekvencia legnagyobb részét tartalmazó kis fragmenst (7) elkülönítjük [3], Ezt a rész-szekvenciát - a későbbiekben más rövidített 2-IL-szekvenciákat is - a rajzokon „AIL2”-ként jelöltük meg.
A (3), (5) és (7) jelű szekvenciát, valamint az la. rajzon (8) szám alatt szereplő szintetikus DNSszekvenciát T4-ligázzal kezeljük [4], ami a pK360 plazmidhoz (9) vezet.
A ligális termékét kompetens E. coli sejtekbe juttatjuk [5] és a sejteket 25 pg/ml ampicillint tartalmazó tápagar lemezeken szélesztjük [6.1]; a kiónok plazmid DNS-ét restrikciós [6.2] és szekvenciaelemzéssel [6.3] jellemezzük.
A (9) jelű plazmidot tartalmazó E. coli transzformáit egyedekből álló, 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-közegben (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) egy éjszakán át tenyésztett kultúrából mintegy 1:100 új tenyészetet állítunk be, és a növekedést OD-méréssel figyeljük. OD - 0,5 értéknél a tenyészethez annyi izopropil-p-D-galaktopiranozidot (IPTG) adunk, hogy koncentrációja a közegben 1 mmól legyen. 150-180 perc elteltével a baktériumokat lecentrifugáljuk, 5 percen át pufferoldatban (7 M karbamid, 0,1 % SDS, 0,1M nátrium-foszfát, ph 7) forraljuk, majd mintákat SDS-gél-elektroforézis lemezre viszünk. A (9) jelű plazmidot tartalmazó baktériumok az elektroforézis során olyan proteinsávot adnak, amely a várt fúziós protein móltömegének megfelel. Á baktériumok feltárása (French Press; (K'Dyno-malom) és centrifugálása után a fúziós protein a csapadékban van, így a felülúszó rész eltávolításával a többi protein zömét már elválasztjuk.
Az elkülönítés után brómciános hasítással felszabadítjuk a kívánt hirudin-peptidet. Ehhez 4 g nedves fúziós proteint (szárazanyag tartalom kb. 25 tömeg%) 10 ml 98-100%-os foszforsavban oldunk, és az oldathoz 0,5 g brómciánt adunk. Az elegyet 40 °C-on 6 órán át reagálni hagyjuk, utána 100 ml vízzel hígítjuk és fagyasztva szárítjuk.
A BrCN-hasi tás során kapott termék 5 g-ját 0,1 liter pufferben (6 M karbamid, 0,1 M trisz-HCl, pH 8,5) oldjuk, az oldatot 30 °C-ra melegítjük, és 5 g nátrium-szulfotot, valamint l,25gnátrium-tetrationátot adunk hozzá. 90 perc elteltével az oldatot azonos térfogatú vízzel hígítjuk és FRAKTOGEL TSK DEAE-650M gélen kromatografáljuk. Eluensként 0,05 M-tól 0,5 M-ig változó NaCl-gradienst (6 litert) alkalmazunk. A hirudin-tartalmú frakciókhoz a hétszeres mennyiségű acetont adva a proteint kicsapjuk. A csapadékot 20 ml vízzel mossuk, majd fagyasztva szárítjuk.
A protein hajtogatása, valamint a diszulfid-hidak kialakítása céljából a kapott S-szulfonátot 50 ml puffer-oldatban (8 M karbamid, 0,02M triszHCl, pH 7,5) oldjuk, és néhány csepp oktanol adagolása után 15 percen át nítrogéngázt vezetünk az oldaton keresztül. Ezt követően 16 ml 2-merkaptoetanolt adagolunk, és az elegyet szobahőmérsékleten egy órán át keverjük. Az oldatot 5x60 cm méretű SEPHADEX G25 adszorbenssel töltött kromatográfiás oszlopra adjuk és 300 ml puffer-oldattal (0,05 M glicin/trisz-HCl, pH 8,5, 3 mM glutation, 0,5 mM glutation-diszulfid) eluáljuk. Az eluátumot 4 °C-on 2 napon keresztül állni hagyjuk, utána ultraszűréssel töményítjük. Ezt követően a protein-elegyet fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiásán (szilikagél RP 18, eluens: 20%-tól 50%ig változó acetongradiens 0,1 %-os trifluor-ecetsavban) szétválasztjuk és a hirudin-tartalmú frakciókat összegyűjtjük. A proteint szekvencia-elemzéssel [6.3] azonosítjuk.
Az itt megadott indukciós körülmények rázott tenyészetre érvényesek; nagyobb térfogatú fermentálás esetén megfelelően megváltozott OD-értékek és adott esetben némiképp módosított IPTG-koncentrációk alkalmazandók.
2. példa
A (4) plazmidot (1. ábra) AccI enzimmel megnyitjuk [1], és a túlnyúló végeket Klenow-polimerázzal feltöltjük [2.1.3]. Ezt követően Sac I enzimmel vágjuk [1 ], így a hirudin-szekvencia legnagyobb részét tartalmazó (10) fragmenst kapjuk, A kereskedelemben kapható pUC 13 vektort a Sac I és Sma I
-4HU 203579Β restrikciós enzimekkel megnyitjuk [ 1 ] és a (11) jelű nagy fragmenst izoláljuk [3; agaróz-fél].
Ezt követően a két fragmenst (10 és 11) T4-ligázzal a pK 400 jelű, (12) számú plazmiddá ligái juk [4], Ezt a plazmidot a 2. ábrában kétszer ábrázoltuk; az alsó rajzon a kapható hirudin-származék aminosavszekvenciája látható.
A (4) plazmidot (1. ábra) Κρη I és Sál I restrikciós enzimekkel megnyitjuk [1] és a hirudin rész-szekvenciát tartalmazó kis (13) fragmenst izoláljuk [3]. Az 1 a. ábrán (9) számmal jelölt plazmidot Ecor I enzimmel parciálisán vágjuk [ 1 ], a szabad végeket Klenow-polimerázzal feltöltjük (”fill in” reakció) [2.1.3], majd Sál I enzimmel vágjuk [1]. így a pK.360 plazmid (15) jelű származékot kapjuk.
A (3), (13), (14) és (15) fragmenseket ligáivá a 2a. sz. rajzon kétszer feltüntetett pK410 plazmidot (16) kapjuk; az alsó rajz a fúziós protein, illetve a savval végzett hasítás után kapott hirudin aminosav-sorozatát mutatja.
A kifejezés és az 1. példa szerint végzett feldolgozás után új hirudin-származékot kapunk, amely az 1-es és a 2-es helyzetben prolint, illetve hisztidint tartalmaz. Ez a hirudin ugyanolyan aktivitást mutat, mint a 34 29 430 sz, NSZK-beli közrebocsátási iratban ismertetett természetes hirudin, amely az említett pozíciókban treonint és tirozint tartalmaz. Az új hirudin-származék azonban aminopeptidáz enzimekkel szemben ellenállóbb, amiből előnyök adódhatnak az in vivő alkalmazás során.
3. példa
A kereskedelmi forgalomban beszerezhető pBR 322 vektort BamH I enzimmel megnyitjuk [ 1 ]. A kapott kiegyenesített (17) plazmid szabad végeit dATP, dGTP és dTTP (nukleotid-trifoszfátok) segítségével feltöltjük, és a túlnyúló G nukleotidot S1 nukleázzal lebontjuk [2.1.2], így a pBR 322 plazmidot (18) sz. származékát kapjuk.
A majom-proinzulinból származó Hae ΙΠ fragmenst (19) (Wetekam és munkatársai, Gene 19 /1982/ 181) a módosított (18) plazmiddal ligái juk [4], így a pPH 1 (20) plazmidot kapjuk. Az inzulinrészszekvencia a tetraciklin-génben helyezkedik el, ezért a pPH 1 plazmidot tartalmazó kiónok tetraciklinnel szemben nem reziksztensek, és ennek révén azonosíthatók [6.1].
A (20) plazmidot BamH I Dde I enzimekkel megnyitjuk [ 1 ], és a (21) kis fragmenst izoláljuk [3].
Járulékosan a majom proinzulin szekvenciájából a Dd I és Pvu Π vágóhelyek közötti (22) rész különítjük el [1; 3].
Az inzulin (21) és (22) részszekvenciáit a megnyitott (23) plazmiddal ligáivá [4] a pPH5 plazmidot (24) kapjuk. Ezt BamHI és Pvu Π enzimmel megnyitjuk [1] és a kis (25) fragmenst izoláljuk [3]. Az inzulin szerkezetének kiegészítése céljából a (26) DNS-szekvenciát szintetizáljuk.
A kereskedelemben kapható pUC 8 vektort BamH I és Sál I enzimekkel megnyitjuk [1] és a (27) maradék plazmidot izoláljuk [3]. Ezt a (25) és (26) DNS-szekvenciákkal a (28) pPH 15 plaziddá ligáljuk [4], amelyet Sál I enzimmel megnyitjuk [1], a túlnyúló végeket feltöltjük [2.1.2], A kapott (29) plazmid-származékból Bam Η I enzimmel a (30) szekveniát lehasítjuk [ 1 ].
A pUC 9 vektort (kereskedelmi termék) BamH I és Sma I enzimmel megnyitjuk és a nagy (31) fragmenst izoláljuk [1;3]. Ezt a fragmenst a (3) DNSszekvenciával ligái juk [4], így a (32) pPH 16 plazmidot kapjuk.
A (32) plazmidot Sál I enzimmel megnyitjuk, a kapott kiegyenesített (33) plazmidot dCTP, dGTP és dTTP alkalmazásával parciálisán feltöltjük [2,1,3], és a megmaradt T nukleotidot SÍ-nukleázzal lehasítjuk [2.1.2], A kapott (34) plazmidot BamH I enzimmel kezeljük [ 1 ], és a (35) termékből S1 -nukleázzal a túlnyúló GATC-szálat eltávolítjuk [2.1.2], így a (36) plazmidhoz jutunk.
A (36) plazmid tompa végeit a (37) pPH 20 plazmiddá cüdizáljuk [4],
Kompetens E. coli HB 101 sejteket a ligáit eleggyel transzfomálunk [5] és szelektív táptalajon szélesztünk [6.1]. A kívánt plazmidot tartalmazó kiónok proinzulint exprimálnak: 70 megvizsgált klón közül 28-ban volt radioimmunológiaüag kimutatható proinzulin. A plazmidokat DNS-szekvenciaelemzéssel is azonosítjuk [6.3]. A bennük levő DNS a B-lánc első aminosavjának (Phe) kodon ja előtt arginint kódol.
A (37) plazmidot Hind III enzimmel megnyitjuk [1], a túúínyúló végeket feltöltjük [2.1.3] és Dde I enzimmel utóvágjuk [ 1 ]. A kis (38) fragmenst izoláljuk [3].
A 3a rajzon (28) számmal szereplő plazmidot Sál I és Dde I enzimmel megnyitjuk és a kis (39) grafmenst elkülönítjük [ 1 ;3].
A (9) plazmidot (la.ábra) először AccI enzimmel megnyitjuk [ 1 ], a szabad végeket feltöltjük [2.1.3] és EcoR I enzimmel részlegesen utóvágjuk. A rövidített 2-IL-szekvenciát tartalmazó (40) fragmenst izoláljuk [3].
A kiegyenesített (3) plazmidot (1. ábra) a (38), (39) és (40) DNS-szegmensekkel ligái juk [4]. A kapott (41) plazmid olyan fúziós proteint kódol, amely a 2-IL1-114. aminosavja után az Asp-Phe-Met-BeThr-Thr-Tyr-Ser-Leu-Ala-Ala-Gly-Arg szekvenciát tartalmazza. Az arginin mint az áthidaló tag utolsó aminosava lehetővé teszi az inzulinláncok tripszinnel végzett lehasítását.
A (9) plazmidból (la. ábra) kiindulva az alábbi úton is juthatunk a (41) plazmidhoz: a (9) plazmidot AccI enzimmel megnyitjuk [1], a túlnyúló végeket feltöltjük [2.1.3] és Sál I enzimmel utóvágjuk [1], majd a kapott (42) plazmidszármazékot a (3) és (39) szegmensekkel ligáljuk [4],
4. példa
A (6) plazmidot (1. ábra) a Taq I és EcoR I restrikciós enzimekkel megnyitjuk [1] és a (43) kis fragmenst izoláljuk [3]. Ezt a fragmenst a (44) szintetikus DNS-szekvenciával és a (3) és (5) szegmensekkel a (45) pPH 100 plazmiddá ligáljuk [4]. Ez a plazmid olyan fúziós proteint kódol, amelyben a 2-IL első 132 aminosava után az Asp-Pro képletű áthidaló tag, majd ezután a hirudin aminosav-szekvenciája következik. A fúziós protein proteolítikus hasítása módosított, biológiailag aktív 2’-IL-t ad (amelyben a 133. helyen Thr helyett Asp van), amellett olyan hirudin-származékot, amely a természetes termék
-5HU 203579Β aminosav-sorozata előtt N-terminálisan Pro-t tartalmaz. Ez a termék szintén biológiailag aktív, ugyanakkor proteázokkal szemben a természetes hirudinnál ellenállóbb.
A 2’-IL-es fúziós protein biológiai aktivitást mu- 5 tatott olyan sejtproliferációs tesztben, amelyet 2EL-től függő sejtvonallal (CT 112) végeztünk (D,
Stull ésS. Gillis, J. Immunoi. 126,1680-1683/1981/;
539 sz. európai szabadalmi leírás 15. oldala).
A proteint 6 mólos guanidinium-hidrolklorid-ol- 10 dattal denaturálva, majd puffer-oldattal (10 mM trisz-HCl, pH 8,5, 1 mM EDTA) regenerálva továbbra is nagy 2-IL-aktivitást tapasztaltunk. Emellett a fúziós protein savval és trombinnal kezelt vér alvadási idejét meghosszabbította. A kapott fúziós 15 protein tehát kettős hatású.
5. példa
A kereskedelmi forgalomban levő pUC 12 vektort EcoR I és Sac I enzimekkel megnyitjuk [ 1 ] és a 20 kapott (46) kiegynesített plazmidba olyan 2-IL-rész szekvenciát ültetünk be [4], amelyet a 6 plazmidból (1. ábra Eco Rí és Sac I enzimekkel kivágtunk. A (47) szekvencia a 2-IL első 94 aminosavjának komplett triplettjeit tartalmazza. A (46) és (47) 25 fragmenseket ligáivá [4] a (48) pK 300 plazmidot kapjuk.
A (9) plazmidot (la. ábra) Eco Rí enzimmel megnyitjuk [1], a túlnyúló végeket feltöltjük [2,1.3] és Hind ΠΙ enzimmel utóvágjuk [ 1 ]. A hirudint kódoló 30 szekvenciát követően a pUC 12 plazmidból származó polilinker egy részét tartalmazó kis (49) fragmenst izoláljuk.
A (48) plazmidot Sma I és Hind ΙΠ enzimmel megnyitjuk [1] és a nagy (50) fragmenst izoláljuk 35 [3]. A (49) és (50) fragmenst ligáljuk az (51) pK 301 plazmiddá [4],
A ligáit eleggyel kompetens E. coli 294 sejteket transzformálunk [5]. Az (51) plazmidot tartalmazó kiónokat restrikciós elemzéssel [6.2] azonosítjuk; 40 olyan DNS-t tartalmaznak, amely a 2-EL első 96 aminosavjának kodonjait követve 6 aminosavból ál10 ló áthidaló tag kodonjait, majd a hirudin kodonjait tartalmazza.
Az (51) plazmidot Eco Rí és Hind ΠΙ enzimmel megnyitjuk. A kapott kiegyenesített (53) plazmidot az (52) DNS-szekvenciával ligáljuk [4], így az (54) pK 370 plazmidot kapjuk.
Ha az (54) plazmidot az 1. példa szerinti módon E. coli sejtekben kifejezzük, olyan fúziós proteint kapunk, amely a 2-IL első 96 aminosavját követően az
Ala-Gln-Phe-Met-Ile-Thr képletű áthidaló tagot, majd utána a hirudin aminosav-szekvenciát tartalmazza.
6. példa
A (41) plazmidból (3. példa; 3a. ábra) az Eco Rí és Hind ΙΠ restrikciós enzimekkel a majom-proinzulint kódoló DNS-szegmenst kivágjuk [ 1 ]. A túlnyúló végeket feltöltjük [2.1.3], így az (55) DNS-szegrnenst kapjuk.
A (48) plazmidot (5. példa, 5. ábra) Sma I enzimmel megnyitjuk [1] és alkálikus marhafoszf átázzál kezeljük [Maniatis fent említett könyve 133. oldala]. Az így kapott kiegyenesített (56) plazmidot az (55) DNS-szegmenssel ligáljuk az (57) plazmiddá [1], A ligáit eleggyel E. coli 294 sejteket transzformálunk [5], és a kívánt plazmidot tartalmazó kiónokat először restrikciós elemzéssel [6.2], majd a plazmid-DNS szekvencia-elemzésével [6.3] azonosítjuk.
Az (57) plazmidból Eco Rí és Hind ΙΠ enzimmel a 2-IL-t és a majom-proinzulint kódoló (58) szegmenst kivágjuk [1],
A (2) plazmidot (1. példa, 1. ábra) szintén Eco Rí és Hind ΠΙ enzimmel megnyitjuk, és az így kiegyenesített (53) plazmidba az (58) szegmenst belelifáljuk [4]. így az (59) pKH 101 plazmidhoz jutunk.
Az 1. példa szerint exprimálva olyan fúziós proteint kapunk, amely a 2-IL első 96 aminosavja után 14 aminosavból álló áthidaló tagot (az 58 DNSszegmens Y-ját), majd a malomproinzulin aminosav-szekvenciát tartalmazza.
I. sz. melléklet: a 2-interleukin aminosav-sorozata
Triplett sorszáma 0 12
| aminoav nukleotid sorszáma kódoló szál nem kódoló szál | 5’ | AA 3’ | 1 TTC | Met ATG G | Alá GCG TAC | Pro 10 CCG CG(GGC | ||||
| 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| Thr | Ser | Ser | Ser | Thr | Lys | Lys | Thr | Gin | Leu | |
| 20 | 30 | 40 | ||||||||
| ACC | TCT | TCT | TCT | ACC | AAA | AAG | ACT | CAA | CTG | |
| TGG | AGA | AGA | AGA | TGG | TTT | TTC | TGA | GTT | GAC | |
| 13 | 1415 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | ||
| Gin | Leu | Glu | His | Leu | Leu | Leu | Asp | Leu | Gin | |
| 50 | 60 | 70 | ||||||||
| CAA | CTG | GAA | CAC | CTG | CTG | CTG | GAC | CTG | CAG | |
| GTT | GAC | CTT | GTG | GAC | GAC | GAC CTG | GAC | GTC |
-6HU 203579Β
12
I. sz. melléklet: a 2-mterleukin aminosav-sorozata folytatása
| 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | |
| Met | De | Leu | Asn | Gly | Ile | Asn | Asn | Tyr | Lys | |
| 80 | 90 | 100 | ||||||||
| ATG | ATC | CTG | AAC | GGT | ATC | AAC | AAC | TAC | AAA | |
| TAC | TAG | GAC | TTG | CCA | TAG | TTG | TTG | ATG | TTT | |
| 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | |
| Asn | Pro | Lys | Leu | Thr | Arg | Met | Leu | Thr | Phe | |
| 110 | 120 | 13 | ||||||||
| AAC | CCG | AAA | CTG | ACG | CGT | ATG | CTG | ACC | TTC | |
| TTG | GGC | TTT | GAC | TGC | GCA | TAC | GAC | TGG | AAG | |
| 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | |
| Lys | Phe | Tyr | Met | Pro | Lys | Lys | Alá | Thr | Glu | |
| 140 | 150 | 160 | ||||||||
| AAA | TTC | TAC | ATG | CCG | AAA | AAA | GCT | ACC | GAA | |
| TTT | AAG | ATG | TAC | GGC | TTT | TTT | CGA | TGG | CTT | |
| 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 | |
| Leu | Lys | His | Leu | Gin | Cys | Leu | Glu | Glu | Glu | |
| 170 | 180 | 190 | ||||||||
| CTG | AAA | CAC | CTC | CAG | TGT | CTA | GAA | GAA | GAG | |
| GAC | TTT | GTG | GAG | GTC | ACA | GAT | CTT | CTT | CTC | |
| 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 | 69 | 70 | 71 | 72 | |
| Leu | Lys | Pro | Leu | Glu | Glu | Val | Leu | Asn | Leu | |
| 200 | 210 | 220 | ||||||||
| CTG | AAA | CCG | CTG | GAG | GAA | GTT | CTG | AAC | CTG | |
| GAC | TTT | GGC | GAC | CTC | CTT | CAA | GAC | TTG | GAC | |
| 73 | 74 | 75 | 76 | 77 | 78 | 79 | 80 | 81 | 82 | |
| Alá | Gin | Ser | Lys | Asn | Phe | His | Leu | Arg | Pro | |
| 230 | 240 | 250 | ||||||||
| GCT | CAG | TCT | AAA | AAT | TTC | CAC | CTG | CGT | CCG | |
| CGA | GTC | AGA | TTT | TTA | AAG | GTG | GAC | GCA | GGC | |
| 83 | 84 | 85 | 86 | 87 | 88 | 89 | 90 | 91 | 92 | |
| Arg | Asp | Leu | De | Ser | Asn | He | Asn | Val | Ile | |
| 260 | 270 | 280 | ||||||||
| CGT | GAC | CTG | ATC | TCT | AAC | ATC | AAC | GTT | ATC | |
| GCA | CTG | GAC | TAG | AGA | TTG | TAG | TTG | CAA | TAG | |
| 93 | 94 | 95 | 96 | 97 | 98 | 99 | 100 | 101 | 102 | |
| Val | Leu | Glu | Leu | Lys | Gly | Ser | Glu | Thr | Thr | |
| 290 | 300 | 310 | ||||||||
| GTT | CTG | GAG | CTC | AAA | GGT | TCT | GAA | ACC | ACG | |
| CAA | GAC | CTC | GAG | TTT | CCA | AGA | CTT | TGG | TGC | |
| 103 | 104 | 105 | 106 | 107 | 108 | 109 | 110 | Tll | 112 | |
| Phe | Met | Cys | Glu | Tyr | Alá | Asp | Glu | Thr | Alá | |
| 320 | 330 | 340 | ||||||||
| TTC | ATG | TGC | GAA | TAC | GCG | GAC | GAA | ACT | GCG | |
| AAG | TAC | ACG | CTT | ATG | CGC | CTG | CTT | TGA | CGC | |
| 113 | 114 | 115 | 116 | 117 | 118 | 119 | 120 | 121 | 122 | |
| Thr | He | Val | Glu | Phe | Leu | Asn | Arg | Trp | He | |
| 350 | 360 | 370 | ||||||||
| ACG | ATC | GTT | GAA | TTT | CTG | AAC | CGT | TGG | ATC | |
| TGC | TAG | CAA | CTT | AAA | GAC | TTG | GCA | ACC | TAG |
-7HU 203579Β
14
I. sz. melléklet: a 2-interleukin aminosav-sorozata folytatása
| 123 | 124 | 125 | 126 | 127 | 128 | 129 | 130 | 131 | 132 |
| Thr | Phe | Cys | Gin | Ser | De | He | Ser | Thr | Leu |
| 380 | 390 | 400 | |||||||
| ACC | TTC | TGC | CAG | TCG | ATC | ATC | TCT | ACC | CTG |
| TGG | AAG | ACG | GTC | AGC | TAG | TAG | AGA | TGG | GAC |
| 133 | 134 | 135 | |||||||
| Thr | 410 | ||||||||
| ACC | RGA | TAG | 3’ | ||||||
| TGG | ACT | ATC | AGC | T | 5’ |
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (2)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás la éslbképletű fúziós proteinek előállításáraMet-X-(Y)m-Z Met-Z-(Y)m-X (la) (Ib) aholZ a célfehérjét vagy -peptidet jelenti,X jelentése 2-IL, előnyösen emberi 2-IL első 90133 aminosavának szekvenciája, illetve ennek legfeljebb 6 aminosav cseréjével megváltoztatott variánsa,Y jelentése 1-4 aminosavból álló híd, amely kémiai úton vagy enzimesen hasítható, illetve lehasítható és m jelentése zéró, ha a kívánt proteinhez szomszédos aminosav a kívánt protein lehasítását lehetővé teszi máskülönben m jelentése 1,2,3 vagy 4, azzal20 jellemezve, hogy az X szekvenciát kódoló DNSfragmenst, a Z szekvenviát kódoló DNS-fragmenst és kívánt esetben az -(Y)m- hidat kódoló DNS-fragmenst egymással, valamint valamely E.coli-ban exprimálható plazmidból ligái juk, a kapott plazmid25 dal E. coli törzset transzformálunk, a törzset alkalmas tápközegben szaporítjuk, majd a fúziós proteint elválasztjuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fúziós proteint centrifugálással vá30 lasztjuk el az oldható proteinek mellől.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853541856 DE3541856A1 (de) | 1985-11-27 | 1985-11-27 | Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT43642A HUT43642A (en) | 1987-11-30 |
| HU203579B true HU203579B (en) | 1991-08-28 |
Family
ID=6286938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU864872A HU203579B (en) | 1985-11-27 | 1986-11-25 | Process for producing fusion-proteins |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (3) | EP0227938B1 (hu) |
| JP (1) | JP2566933B2 (hu) |
| KR (1) | KR950000300B1 (hu) |
| AT (2) | ATE127841T1 (hu) |
| AU (1) | AU595262B2 (hu) |
| CA (1) | CA1341203C (hu) |
| DE (4) | DE3541856A1 (hu) |
| DK (2) | DK172064B1 (hu) |
| ES (3) | ES2032378T3 (hu) |
| FI (1) | FI93471C (hu) |
| GR (1) | GR3005042T3 (hu) |
| HU (1) | HU203579B (hu) |
| IE (1) | IE59488B1 (hu) |
| IL (1) | IL80755A0 (hu) |
| NO (1) | NO176481C (hu) |
| PT (1) | PT83813B (hu) |
| ZA (1) | ZA868943B (hu) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3125021A (en) * | 1955-11-14 | 1964-03-17 | Smooth | |
| EP0168342B1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-03 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur Herstellung von Thrombin-Inhibitoren |
| DE3712985A1 (de) * | 1987-04-16 | 1988-11-03 | Hoechst Ag | Bifunktionelle proteine |
| DE3545568A1 (de) * | 1985-12-21 | 1987-07-16 | Hoechst Ag | Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung |
| DE3819079A1 (de) * | 1988-06-04 | 1989-12-07 | Hoechst Ag | Hirudin-derivate mit verzoegerter wirkung |
| DE3835815A1 (de) * | 1988-10-21 | 1990-04-26 | Hoechst Ag | Neue isohirudine |
| DE3844211A1 (de) * | 1988-12-29 | 1990-07-05 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| US5179196A (en) * | 1989-05-04 | 1993-01-12 | Sri International | Purification of proteins employing ctap-iii fusions |
| WO1991000912A1 (en) * | 1989-07-07 | 1991-01-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Production and use of hybrid protease inhibitors |
| CU22222A1 (es) * | 1989-08-03 | 1995-01-31 | Cigb | Procedimiento para la expresion de proteinas heterologicas producidas de forma fusionada en escherichia coli, su uso, vectores de expresion y cepas recombinantes |
| GB8927722D0 (en) * | 1989-12-07 | 1990-02-07 | British Bio Technology | Proteins and nucleic acids |
| DE3942580A1 (de) * | 1989-12-22 | 1991-06-27 | Basf Ag | Verfahren zur herstellung von hirudin |
| US5270181A (en) * | 1991-02-06 | 1993-12-14 | Genetics Institute, Inc. | Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules |
| DE4140381A1 (de) * | 1991-12-07 | 1993-06-09 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet |
| DE4404168A1 (de) * | 1994-02-10 | 1995-08-17 | Hoechst Ag | Hirudinderivate und Verfahren zu deren Herstellung |
| DE59711533D1 (de) | 1996-07-26 | 2004-05-27 | Aventis Pharma Gmbh | Insulinderivate mit erhöhter Zinkbindung |
| DE19726167B4 (de) | 1997-06-20 | 2008-01-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung |
| DE19825447A1 (de) | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
| DE10033195A1 (de) * | 2000-07-07 | 2002-03-21 | Aventis Pharma Gmbh | Bifunktionale Fusionsproteine aus Hirudin und TAP |
| US7202059B2 (en) | 2001-02-20 | 2007-04-10 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium |
| US7638618B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-12-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest |
| DE10114178A1 (de) | 2001-03-23 | 2002-10-10 | Aventis Pharma Gmbh | Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| DE10227232A1 (de) | 2002-06-18 | 2004-01-15 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| US9526764B2 (en) | 2008-10-17 | 2016-12-27 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Combination of an insulin and a GLP-1-agonist |
| WO2011058082A1 (de) | 2009-11-13 | 2011-05-19 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmazeutische zusammensetzung umfassend einen glp-1-agonisten und methionin |
| HUE038147T2 (hu) | 2009-11-13 | 2018-09-28 | Sanofi Aventis Deutschland | GLP-1 agonistát, inzulint és metionint tartalmazó gyógyászati készítmény |
| WO2012028172A1 (en) | 2010-08-30 | 2012-03-08 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Use of ave0010 for the manufacture of a medicament for the treatment of diabetes mellitus type 2 |
| US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
| AR087693A1 (es) | 2011-08-29 | 2014-04-09 | Sanofi Aventis Deutschland | Combinacion farmaceutica para uso en el control glucemico en pacientes con diabetes de tipo 2 |
| AR087744A1 (es) | 2011-09-01 | 2014-04-16 | Sanofi Aventis Deutschland | Composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa |
| HRP20230470T1 (hr) | 2014-12-12 | 2023-07-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Formulacija fiksnog omjera inzulin glargin/liksisenatid |
| TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患治療 |
| TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患之治療 |
| KR20200080748A (ko) | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 인슐린 전구체의 정제방법 |
| KR20200080747A (ko) | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | 인슐린 전구체의 인슐린 효소 전환용 조성물 및 이를 이용하여 인슐린 전구체를 인슐린으로 전환하는 방법 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1985000817A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of interleukin ii |
| DK108685A (da) * | 1984-03-19 | 1985-09-20 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Vaekstfaktor i |
| CA1341417C (fr) * | 1984-03-27 | 2003-01-21 | Paul Tolstoshev | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine |
| EP0158198A1 (en) * | 1984-03-29 | 1985-10-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA and use thereof |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3526995A1 (de) * | 1985-07-27 | 1987-02-05 | Hoechst Ag | Fusionsproteine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| US4865974A (en) * | 1985-09-20 | 1989-09-12 | Cetus Corporation | Bacterial methionine N-terminal peptidase |
| CA1297003C (en) * | 1985-09-20 | 1992-03-10 | Jack H. Nunberg | Composition and method for treating animals |
-
1985
- 1985-11-27 DE DE19853541856 patent/DE3541856A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-11-21 AT AT91114411T patent/ATE127841T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-11-21 EP EP86116140A patent/EP0227938B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 DE DE3650322T patent/DE3650322D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 DE DE8686116140T patent/DE3684892D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 EP EP91114411A patent/EP0468539B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 AT AT91114412T patent/ATE122397T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-11-21 ES ES198686116140T patent/ES2032378T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 DE DE3650396T patent/DE3650396D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 EP EP91114412A patent/EP0464867B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 ES ES91114412T patent/ES2073081T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 ES ES91114411T patent/ES2077747T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-25 HU HU864872A patent/HU203579B/hu not_active IP Right Cessation
- 1986-11-25 IL IL80755A patent/IL80755A0/xx unknown
- 1986-11-25 FI FI864798A patent/FI93471C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-11-26 IE IE311986A patent/IE59488B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-11-26 CA CA000523857A patent/CA1341203C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-11-26 ZA ZA868943A patent/ZA868943B/xx unknown
- 1986-11-26 NO NO864759A patent/NO176481C/no unknown
- 1986-11-26 PT PT83813A patent/PT83813B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-11-26 KR KR1019860009990A patent/KR950000300B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1986-11-26 AU AU65693/86A patent/AU595262B2/en not_active Ceased
- 1986-11-26 JP JP61281621A patent/JP2566933B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-26 DK DK568586A patent/DK172064B1/da not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-04-21 DK DK052292A patent/DK172210B1/da not_active IP Right Cessation
- 1992-06-26 GR GR920401111T patent/GR3005042T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU203579B (en) | Process for producing fusion-proteins | |
| DK175217B1 (da) | Hirudinanalog, vektorer til ekspression af hirudinanalog, transformerede celler og fremgangsmåde til fremstilling af hirudinanalog | |
| JPH08242881A (ja) | 部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法 | |
| JP2533470B2 (ja) | 豚成長ホルモンを生産するためのｄｎａ配列，組換ｄｎａ分子および生産方法 | |
| KR940005585B1 (ko) | 과립구 대식세포 콜로니 촉진 인자(gm-csf)단백질의 제조방법 | |
| JPH07113040B2 (ja) | 融合タンパク質、その生産方法及びその用途 | |
| JPS59156284A (ja) | ヒト−レラキシンｈ２遺伝子 | |
| HU209747B (en) | Process for producing fusion proteins with eukaryotic ballastparts | |
| US5087564A (en) | Release of recombinant peptides from polypeptides using V8 endopeptidase | |
| US6171823B1 (en) | Process for producing extracellular proteins in bacteria | |
| CA2159079C (en) | Methods and dna expression systems for over-expression of proteins in host cells | |
| EP0437544A1 (en) | Recombinant pdgf and methods for production | |
| EP0745669B1 (en) | Mutant staphylococcus aureus V8 proteases | |
| AU643194B2 (en) | Recombinant fish hormone proteins | |
| AU655316B2 (en) | Increased expression of low molecular weight recombinant polypeptides | |
| AU780429B2 (en) | Chlamysin B antibacterial protein, gene encoding it and an expression system for it | |
| JPH04182498A (ja) | ポリペプチド | |
| Rhee et al. | High-level expression of human insulin-like growth factor II in Escherichia coli | |
| JP2887060B2 (ja) | グリセンチンの生産方法 | |
| FI97239B (fi) | Menetelmä fuusioproteiinin valmistamiseksi | |
| KR100283677B1 (ko) | 합성 분비 신호서열 및 그를 이용한 외래 단백질의 제조방법 | |
| JPH01165384A (ja) | 魚類成長ホルモン及びその製造法 | |
| WO1991000355A1 (en) | Genetic elements useful in production of active protein | |
| PL174955B1 (pl) | Sposób wytwarzania wektora do biosyntezy polipeptydu oraz nowy wektor do biosyntezy polipypteku |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |