HU202250B - Process for producing nukleinic acid derivatives and pharmaceutical compositions containing them - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás nukleinsavak és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.

A nukleinsavak purinból vagy pirimidinből, a gyűrűhöz kapcsolódó ribózból vagy más cukorból állnak, és ezeket az alapelemeket foszfátcsoportok kötik össze, láncszerű szerkezetet alkotva.

A nukleinsavak közül az RNS (ribonukleotid polimer) olyan láncszerkezetű makromolekuláris vegyület, amely cukorrészként ribózt tartalmaz, és amelyben a cukorrészek foszfátcsoportokon keresztül diészter kötésben kapcsolódnak egymáshoz. A kétszálú nukleinsavakban a nukleinsavat alkotó bázisok (például inozin, adezozin, citidin, uridin, stb.) purin vagy pirimidin gyűrűit úgynevezett komplementer hidrogénkötések kötik össze kettős hélix térbeli szerkezetet alkotva. Mivel feltételezik, hogy a kettősszálú szerkezettel rendelkező nukleinsavak hasznos fiziológiai szerepet játszanak, számos tanulmányt végeztek az ilyen nukleinsavakon (Biochemical and Biophysical Research Communications 58, 1974, stb.).

Az ilyen típusú nukleinsavak közül a szintetikus, kettősszálú RNS-t, a poliinozinsav-policitidinsav-származékot a továbbiakban „poli-I.poli-C” kifejezéssel jelöljük. A poliinozinsavat, amely ennek a származéknak alapvető alkotóeleme, „poli-I” kifejezéssel, míg a politicitidinsavat „poli-C” kifejezéssel jelöljük.

Számos olyan természetes és szintetikus kettősszálú RNS-t ismerünk, amelyek interferon-indukáló hatással rendelkeznek [Field et al, Proc. Nat. Acad. Sci., U.S., 58, 1004, 1967; Field et al, Proc. Nat. Acad. Sci., U.S., 58, 2102, 1967; Field et al, Proc. Nat. Acad. Sci., U.S., 61, 340, 1968; Tytell et al, Proc. Nat. Acad. Sci., U.S., 58, 1719, 1967; Field et al, J. Gén. Physiol., 56, 905, 1970; De Clercq et al, Methods in Enzymology, 78, 291, 1981],

Jellegzetes szintetikus nukleinsavszármazékok például a következők.

Interferon indukáló szintetikus nukleinsavszármazékok (I) Homopolimer.homopolimer-komplexek (kettősszálú nukleinsav- polimerek, amelyek poli-I.poli-C szerkezettel rendelkeznek):

(1) Bázismódosított származékok: poliinozinsav.poli(5-bróm-citidilsav), poliinozinsav.poli(2-tiocitidilsav), poli(7-dezazainozinsav).policitidilsav, poli(7-dezazainozinsav).poli(5-bróm-citidilsav).

(2) Cukormódosított származékok; poli(2’-azidoinozinsav).policitidílsav.

(3) Foszforsavmódosított származékok: poliinozinsav.poli(citidin-5’-tiofoszforsav).

(II) Intermódosított kopolimerek: poli(adenilsav-uridilsav) (ΠΙ) Homopolimer.kopolimer-komplexek:

poliinozinsav.poli(citidilsav-uridilsav), poliinozinsav.poli(citidilsav-4-tiouridilsav).

(IV) Szintetikus sav/polikation komplexek: poliinozinsav-policitidilsav.poli-L-lizin (a továbbiakban „poli- ICLC”).

(V) Mások:

poliinozinsav.poli(5-vinil-citidilsav).

Amint említettük, az utóbbi években számos kettősszálú RNS-t, különösen poli-I.poli-C egységekből felépülő származékot ismertettek. Ezek közül számos 2 nukleinsavszármazékról feltételezik, hogy összefüggés van a szerkezet és a funkció között (De Clercq és munkatársai, Texas Reports on Biology and Medicine, 41, 77, 1982).

Kísérleteink során úgy találtuk, hogy ha poli-I.poli-C és ezek különböző, poli-I.poli-C-maradékot tartalmazó származékainak méretét úgy állítjuk be, hogy a teljes molekula mérete ülepedési konstanssal kifejezve 4S és 13S közé essen (vagy bázisszámmal kifejezve 50 és 10 000 közé essen), akkor az így kapott származék toxicitása lényegesen lecsökken, de még rendelkezik fiziológiai aktivitással (v.ö. 62/167 433 számú japán szabadalmi bejelentés).

Különböző módszereket dolgozunk ki a fenti termékek előállítására. Különösen arra vonatkozó tanulmányokat folytattunk, hogy 50-10 000 bázisszámú nukleinsavakat kapunk, és kettősszálú nukleinsav polimereket állítsunk elő két különböző egyszálú nukleinsavból. A nukleinsavszármazékok molekulaméreteloszlásának meghatározott értékhatárok közé történő szűkítését „méretezés” kifejezéssel említjük. Mivel a találmány értelmében a méretezés kisebb molekulaméretű anyagok előállítását jelenti, ez a méretezés magában foglalja a „láncrövidítést”.

A „bázispár” (a továbbiakban „bp”) kifejezés, amelyet általánosan a nukleinsavak molekulamérete egységeként használnak, a nukleinsavat alkotó bázisok száma formájában jelöli a nukleinsavak molekula méretét. (Például 10 bp olyan kettősszálú polimert jelent, amely 10 bázisból épül fel.) A jelen leírásban nem csak kettősszálú nukleinsav polimerekről van szó, ezért a „bázisszám (bázisok száma)” kifejezést használjuk a „bp” helyett & nukleinsavak molekulaméretének jellemzésére. (így például egy „10 bázisszámú” nukleinsav polimer azt jelenti, hogy’ a polimerben 10 bázis található).

Amikor a nukleinsavak molekulaméretét kell meghatározni vagy azonosítani, általában széles körben az úgynevezett ülepedési konstanst (S érték) használják. A nukleinsavak említett bázisszáma azonban gyors folyadékkromatográfiával (HPLC) megkapható gélszűrő oszlopon vagy elektroforézissel (a későbbiekben részletesebben) ahol jelzőként ismert molekulaméretű kettősszálú standard DNS-eket (Ml3 fágDNS fragmenseket) használunk, és a nukleinsav meghatározandó bázisszámát a kontroll bázisszáma alapján számítjuk.

A makromolekulás nukleinsavak molekulatömegének jellemzésére mindeddig az ülepedési konstans értéket (S értéket) használták széles körben. A kereskedelemben kapható makromolekulás nukleinsavak jellemzése S értékükkel történik. A kísérleti technikák utóbbi években bekövetkezett fejlődése következtében azonban a gélelektroforézis, gélszűréses kromatográfia, ioncserélő kromatográfia, stb. sokkal pontosabb eszközt biztosít a makromolekulás anyagok molekulatömegének meghatározására, így a makromolekulás nukleinsavak lánchosszának meghatározása lehetővé vált. Ilyen körülmények között az S értékkel való jellemzés és a lánchosszal való jellemzés közötti összefüggés problematikussá válhat. Különösen mivel az illető nukleinsav-molekuláknak az S értékkel történt jellemzés esetén megvan a saját valódi értékük, nem mindig problémamentes annak megállapítása, hogy az S értékkel megadott méret és a lánchosszal meg-21

HU 202250 Β adott méret pontosan megfelel- e egymásnak a nukleinsavak molekulatömegének jellemzése szempontjából.

Ennek megfelelően a találmány szerinti nukleinsav polimerek molekulatömegének megadására az S értékkel történő jellemzést is alkalmazzuk a leírásban, a nukleinsav-kémia területén szokásos módszereknek megfelelően. Mivel azonban az „S érték”-et a makromolekulás nukleinsavak molekulái össztömegének mérése útján határozzuk meg ez az egész molekula-tömegre (vagy az anyag molekuláris állapotára) vonatkozik, az anyag lánchosszának (amelyet bázisszámként jelölünk) mérete alapján történő jellemzést is megadjuk az említett „S értékkel” együtt. Ez különösen azért történik így, mivel a molekulatömeg-eloszlás határtékeit differenciáltabban kell megjeleníteni a jelen találmánnyal kapcsolatban.

A poli-I.poli-C és ennek különböző, poli-I.poli-C egységeket tartalmazó származékai méretezésének módszere annak érdekében, hogy méretezett kettősszálú nukleinsavakat kapjanak, abban áll, hogy már meglevő kettősszálú nukleinsav polimereket kis molekulájú vegyületekké bontanak, vagy más módszer szerint egyszálú nukleinsavakat hidrolizálnak kismolekulájú vegyületekké a temperálás előtt. Ezek az ismert módszerek azonban kényelmetlenek a kívánt termék ipari méretekben történő előállítására, mivel a méretezés hosszú ideig tart, az eljárás nem gyorsítható. Emelett ezek módszerek nem mindig kielégítőek a termék kitermelése szempontjából.

Másrészt, ha egyszálú nukleinsavpolimereket méretezés után - kénezni kell, a polimereket hidrogén-szulfiddal kénezik, majd a hidrogén-szulfidot desztillációval eltávolítjuk az oldószerből, ismert módszerek szerint. így például piridines oldatban végzett kénezés után a hidrogén-szulfidot a reakcióelegyből úgy távolítják el, hogy vákuumbepárlással a kénhidrogént a piridinnel együtt eltávolítják. A hidrogénszulfid azonban ekként a levegőbe jut, így ez a módszer ipari méretekben környezetszennyezés miatt nem megfelelő. Emellett a piridin lepárlása után visszamaradó vizes fázist dializáló csőben ármaló vízzel szemben dializálják a tennék kinyerése céljából. Az eljárás végrehajtásához legalább 3 napra van szükség, és a terméket legfeljebb 80% körüli kitermeléssel nyerik. A módszernek tehát számos hátránya van a termék kitermelése, az előállítási költségek és a végrehajtáshoz szükséges idő szempontjából.

A technika állása szerinti méretezési módszerekkel kapcsolatban számos probléma adódik.

Általánosan ismert módszer szerint [D.H. Hayes: „The Hydrolisys of Ribonucletci Acid with Aqueous Formaldehidé Journal of Chemical Society, (1960) 1184-1187 oldal] a nukleinsav polimereket formaldehid jelenlétében hevítve kismolekulásjú vegyületekké hidrolizálják. Ezen ismert módszer szerint kívánt lánchosszúságú terméket úgy állítanak elő, hogy a reakcióidőt és rekacióhőmérsékletet megfelelően szabályozzák, majd a reakcióelegyet dialízisnek vetik alá a túlságosan elbomlott, túl kis molekulásjú vegyületek eltávolítására. Az ismert módszerrel azonban különböző molekulatömegű vegyületeket kapnak a méretezéssel, még akkor is, ha a reakciókörülményeket azonosan tartják, az alkalmazott nukleinsav polimerektől függően. így a módszer nehezen reprodukálható. Ennek oka az, hogy a nyersanyagot enzimreakcióval állítják elő, és a nyersanyag mérete nem tartható állandó értéken. Emelett a módszerben alkalmazott dialízissel elméletileg lehetetlen a kívánt terméknél nagyobb lánchosszúságú nukleinsav polimereket eltávolítani. A fentiek alapján szükség van olyan módszerre, amely a fenti hátrányok kiküszöbölését lehetővé teszi.

A találmány szerinti módszer lehetővé teszi, hogy (1) méretezett kettősszálú nukleinsav polimereket nyerjünk gyors eljárással;

(2) nagy kitermeléssel dolgozzunk, (3) ipari méretekben se okozzunk környezetszennyezést és más zavarokat, (4) a műveletek sora kellőképpen kvantitatív eredményeket adjon és reprodukálható legyen.

A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás kettősláncú nukleinsavszármazékok előállítására RNSből, amelyben a molekulák méretének maximális eloszlása 50 és 10 000 bázis illetve 4S és 13S ülepedési konstans közé esik, amelynek során a nukleinsav polimereket a temperálás előtt méretezzük.

A találmány lényege a következő:

(1) az egyszálú nukleinsav polimereket temperálás előtt méretezzük.

(2) az (1) lépésben a méretezésre HPLC-t (nagysebeségű folyadékkromatográfiás gélszűrés) végzünk a szokásos eíektroforézis helyett, úgy, hogy a termék molekulaméret eloszlása számszerűen meghatározható legyen. Ennek megfelelően a molekulaméret eloszlás fluktuációja könnyen kiküszöbölhető úgy, hogy a kívánt, 4S és 13S ülepedési konstans (vagy 50 és 10 000 bázisszám) molekulaméret eloszlási határok közé eső termékek gyorsan megkaphatok. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi a termékek gyors és pontos elválasztását a lánchossz szerint.

(3) méretezés után rövídszénláncú alkohol adagolásával elválasztjuk a terméket az oldatból (ismert módon a terméket dialízissel nyerjük). A találmány szerinti módszer lehetővé teszi a termék nagyon egyszerű módszerrel, magas kitermeléssel történő kinyerését.

(4) méretezés után, ha a kapott egyszálú nukleinsav polimerek kénezésére van szükség, a polimereket először kénhidrogénnel kénezzük, majd a reakcióelegyhez aril-alkoholt adunk, és a kapott oldatból centrifugálással eltávolítjuk a terméket, így a kénhidrogén az oldatban marad. (Az ismert módszerekben a kénhidrogént közvetlenül desztillációval választják el az oldószertől).

Ennek megfelelően a találmány szerinti módszerrel nagyon egyszerűen távolítható el a kénhidrogéa a kitermelés növelése mellett.

(5) a méretezett egyszálú nukleinsav polimerek molekulaméret eloszlásának ellenőrzésére és szűkítésére ioncserélő gyantát használunk.

Temperáláson olyan módszert értünk, amelynek során komplementer egyszálú nukleinsav polimereket kettősszálú polimerekké kapcsolunk, ez a művelet könnyen elvégezhető. Ha a méretezést temperálás után végezzük, a kénezés mértéke nagyon ingadozó lesz, így nehéz a terméket kvantitativen megkapni. Ezért megpróbáltuk a méretezést a temperálás előtt végezni. Az eredmény igen kiváló lett. A találmány lényegeként az (1) pontban említett szempont szoros 3

HU 202250 Β összefüggésben van a (2) pont alatt említett szemponttal. A molekulatömeg elektroforézissel végzett szokásos meghatározási módszere szerint legalább egy teljes éjszaka szükséges a vándorláshoz, festődéshez és más lépésekhez. A találmány értelmében ezzel szemben HPLC gélszűrést végzünk a nukleinsav származékok molekulatömegének meghatározására, így a kívánt molekulaméret eloszlású (azaz a 4S és 13S ülepedési konstansú vagy 50-10 000 bázisszámú) származékok eluálása előtt szükséges idő jelentősen lerövidíthető.

A találmány értelmében a reakciót leállítjuk, amikor azt észleljük, hogy a méretezési reakció végbement, és evégett egy rövidszénláncú alkoholt adunk a reakcíóelegyhez. A rövidszénláncú alkoholok közül különösen az etanol előnyös.

Az etanolos kicsapás után az poli-C-ből nyert L-poli-C (azaz méretezett poli-C: az „L” előtag a továbbiakban azt jelenti, hogy méretezett) kitermelése 93%, és poli-I-ből nyert L-poli-I kitermelése 78%. A méretezett tennék kitermelése tehát magas.

Az ismert módszereknél ezzel szemben a reakcióoldatot dializáló csőbe kell helyezni. Ebben az esetben a kitermelés csupán 60% körüli, és a poli-I-ből mindössze 40% körüli L-poli-I várható. Emellett a dialízishez körülbelül 3 nap szükséges.

A találmány szerinti etanolos kicsapási módszer szeirint, etanolt adunk a reakcióoldathoz annak térfogatára számítva kétszeres mennyiségben, és addig keverjük, míg a kívánt termék ki nem csapódik, majd a kapott csapadékot centrifugáljuk, mossuk és megszárítjuk. Ez az eljárás egy órán belül befejezhető.

A (3) pont alatt említett szempont a találmány szerinti eljárás egyik legfontosabb szempontja.

Méretezett egyszálú nukleinsav polimerben levő nukleinsav- maradékban található nitrogénatom helyettesítése kénatommal (például poli-C-ben levő citidin-maradék aminocsoportjának merkaptocsoporttal történő részleges szubsztitúciója) úgy, hogy az illető nukleinsav-maradékot más nukleinsavvá alakítsuk (amely reakciót a továbbiakban kénezésként említünk), kopolimerek szintézisénél gyakran hasznosított reakció. A találmány szerinti eljárás egy másik jellemzője az, hogy a kénezett kopolimerek izolálása végett aril-alkoholt adunk a méretezett egyszálú nukleinsav polimerekhez. Ez a fent említett (4) szempont.

Aril-alkoholként például fenolt vagy krezolt alkalmazhatunk.

Például úgy járunk el, hogy fele mennyiségű fenolt adunk a piridint, vizet és kénhidrogént tartalmazó rekacióelegyhez, keverjük, centrifugáljuk, így a vizes fázis elválik a fenolos rétegtől, és a reakcióelegyben levő színező anyag, valamint a melléktermékként képződött kén a fenolos fázisba kerül. Ezután a vizes fázist elválasztjuk, és a kívánt terméket vizes sóoldattal és alkohollal kicsapjuk. Ezután az így kicsapott terméket centrifugálással elválasztjuk, majd alkohollal mossuk, és így a tisztított terméket kapjuk.

Az említett eljárással a kénhidrogén majdnem teljes mennyisége a felülúszóba kerül kénhidrogénoldat formájában, és így könnyen eltávolítható a rekacióterméktől.

A találmány értelmében fenolt alkalmazva a művelet egy órán belül, majdnem 100% kitermeléssel elvégezhető. Emellett a termék kvantitatíve izolálható.

A fenti (2) - (4) szempontok fontosak a temperálás előtti méretezés céljából. Nevezetesen ezek különösen fontosak ahhoz, hogy a méretezési műveletet a temperálás előtt hatékonyan elvégezzük.

A fenti (5) szempont a találmány szerinti eljárás egy további fontos jellemzője, amely szerint a méretezés és a temperálás között méretmeghatározást hajtunk végre. Ezt az alábbiakban részlegezzük.

Ebben a lépésben egy ioncserélő gyantát alkalmazunk. Nagymolekulája nukelinsavakhoz ioncserélő gyantaként például DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex, benzoilezett DEAE-Cellulose vagy hasonló a tRNS-hez is alkalmazott gyanták használhatók. (BBA, 47, 193, 1961; BBRC, 10, 200, 1963; Biochem. 6, 3043,1967). Gyakorlatilag azonban ioncserélő gyantát csak kismolekulájú, körülbelül 80 bázist tartalmazó nukleinsavak tisztítására alkalmaznak.

Kutatásokat folytattunk arra vonatkozóan, hogy az ioncserélő gyanták tekintettel „töltés-adszorbeálló” tulajdonságukra megfelelőek-e nagymolekulájú nukleinsav polimerek tisztítására és a bázisszám alapján történő elválasztására. Tekintettel arra, hogy a termékek különösen előnyösek gyógyszerkészítmények hatóanyagaiként, különösen fontos a molekulaméretek pontos behatárolása ioncserélő gyanták segítségével. (Az eljárást a továbbiakban „ioncserélő módszer”ként említjük).

A találmány szerinti ioncserélő módszerben az ioncserélő gyantát egy, a kezelendő gyantát tartalmazó tárolóedénybe helyezzük (szakszos eljárás), vagy eljárhatunk úgy is, hogy kromatografáló oszlop tölteteként alkalmazzuk (oszlop-eljárás). Közelebbről úgy járunk el, hogy az ioncserélő gyantát az oszlopba helyezzük, és a nukleinsav polimer oldatát az oszlopba juttatjuk úgy, hogy a polimer az ioncserélő gyantán adszorbeálódjon. Ezután egy eluálószert, például trispuffert engedjük át az oszlopon folyamatosan vagy lépésenként, változó sókoncentrációval úgy, hogy egyenletes mennyiségű eluátumot kapjuk. Az eluált fraklciókban található nukleinsav polimer bázisszámát ugyanazzal a HPLC gélszűréssel határozzuk meg, jelzőként egy markért használva, és így azok a frakciók, amelyek a kívánt terméket tartalmazzák, összegyűjthetők.

Annak érdekében, hogy a találmány szerinti eljárásban a fenti ioncserélő módszerrel a megfelelő terméket nyerjük, nagyon fontos, hogy az oszlopba töltendő ioncserélő gyantát és az eluálószert jól válasszuk meg.

így például, ha poli-I-t tris-HCl pufferben oldunk, és QAE-n (kvatemer amino-etilén) adszorbeáljuk, a kívánt terméket nem tudjuk előállítani, még akkor sem, ha kölünösen magas sókoncentrációt alkalmazunk az eluálószerben. Ez azért van így, mert a poli-I maga oldahatatlanná válik, amikor a sókoncentráció az eluálószerben magasabb, mint az a koncentráció, ami megfelelő lenne poli-I leoldására a QAE gyanáról. Ez nyilvánvaló, ha figyelembe vesszük, hogy az inozinsav, amely a poli-I alkotóegysége, stnikturálisan inkább hidrofób. Ebben az esetben a poli- I-hez megfelelő sókoncentráció a poli-C esetén alkalmas koncentrációval történő összehasonlítás alapján határozható meg.

Egy másik kísérletben megfigyeltük, hogy a poli-I oldata fehérré és zavarossá válik, azaz csapadékot képez a pufferben, amelynek megfelelő a sókoncent-41

HU 202250 Β rációja a QAE gyantáról történő leoldáshoz. A találmány szerinti eljárás ioncserélő módszerében tehát nagyon fontos, hogy az alkalmazott ioncserélő gyantát és a megfelelő eluáló sókoncentrációt helyesen határozzuk meg.

így például poli-I esetén a DEAE gyanta különösen jó eredményeket adott. Poli-C esetén úgy találtuk, hogy mind a QAE, mind a DEAE gyanta előnyös eredményeket ad. Eluálásra akár lineárisan emelkedő sókoncentrációt, akár lépcsőzetesen emelkedő sókoncentrációt alkalmazhatunk, ezáltal a polimereket frakcionálhatjuk és eluálhatjuk a polimerek lánchosszának megfelelően.

így például, poli-C-t (38 mg, S20, 8,6) adszorbeáltunk DEAE-Toyopearl 650 C gyantán (10x130 mm), és a következő (A) és (B) oldat 100-100 ml-ével lineáris gradiens eluciót végeztünk:

(A) - 0 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCL (pH=7,0) (B) - 0,5 mól/I NaCl/10 mmóVl tris-HCl (pH-7,0)

A (B) oldatra nézve a lineáris gradiens 0-100% volt.

Az eluálás körülményei a következők voltak: lineáris átfolyási sebesség: 1,32 ml/perc, eluálási térfogat: 175 csepp/frakció.

A következő frakciókat eluáltuk, az egyes lánchosszaknak megfelelően:

Frakció bázisszám

340

470

740

1000

1500

Emellett ugyanezt a mintát eluáltuk lépcsőzetes gradiens eluálással, amikoris az 500 bp alatti frakciót eluáltuk először 0,3 mmól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0) (50 ml) segítségével, majd az 500-1500 bp frakciókat eluáltuk 0,5 mól/1 NÁCI/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0) (50 ml) segítségével.

Ugyanilyen módon poli-I-t (7,8 mg, S20, 7,3) eluáltunk lineáris gradiens elucióval ugyanilyen feltételek mellett. A következő frakciókat kaptuk:

Frakció bázisszám

30

140

230

350

460

540

Emelett ugyanezt a mintát lépcsőzetes gradiens eluálással is eluáltuk, amikor is a 300 bp alatti frakciókat eluáltuk először 0,3 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH=7,0) (50 ml) segítségével, majd a 300600 bp frakciót eluáltuk 0,5 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0) (50 ml) segítségével.

Ahogyan említettük, a nagymolekulájú nukleinsavak is frakcionálhatók a találmány szerinti módszer értelmében meghatározott lánchosszúságú nukleinsav frakciókra (méretmeghatározás), ha megfelelően választjuk meg az eluálószer sókoncentrációját.

Amint a fenti két példa is mutatja, gyógyszerkészítmények céljára megfelelő lánchosszúságú frakciók (főkomponensként) könnyen nyerhetők különböző nagymolekulájú, eltérő lánchosszúságú nukleinsavak keverékéből frakcionálással, és a frakcionálás ipari elvégezhető. A találmány szerinti „ioncserélő” eljárás egy fontos szempontja a frakcionálás.

A találmány szerinti eljárással előállított nukleinsavszármazékok fiziológiai aktivitása különösen előnyös a gyógyszekészítmények előállítása szempontjából. A találmány szerinti eljárással előállított nukleinsavszármazékok erős karcinosztatikus aktivitást mutatnak, amelyet a következőkben részletezünk. Ez csak egyike a különböző fiziológia aktivitásoknak, amelyeket a találmány szerinti eljárással előállított nukleinsavszármazékok mutatnak.

A találmány szerinti eljárással előállított, poli-I.poli-C csoportot tartalmazó nukleinsavszármazékok további fiziológiai tulajdonságként megemlíthető még a TNF-interferon-, valamint interleukin-2-termelést fokozó képesség, makrofág-aktiváló képeség, NK sejt aktiváló képeség, tumor sejtek osztódását gátló aktivitás, tumor sejtek osztódását gátló aktivitás humán tumor sejteket hordozó meztelen egerekben, „made nice” tumor sejtek metasztázisát gátló aktivitás tüdőben, stb.

A találmány szerinti eljárással előállított nukleinsavszármazékok lényegesen biztonságosabbak, mint a szokásos poli-I.poli-C vegyületek, például az interferon-indukálószerek. Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek alkalmasak antivirális antitumor, stb. hatóanyagként napi

10-1000 mg/személy dózisban.

A találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav származékok fiziológiai tulajdonságait a párhuzamos, 62-167 433 számú japán szabadalmi bejelentésben mutattuk be.

A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül.

Példa (1) L-poli-I előállítása és tisztítása (méretezett poli-I)

200 ml desztillált vizet, 250 ml formamidot és 500 ml 5 mól/l-es nátrium-klorid oldatot hozzáadunk 10 g kereskedelmi poli-I-hez, és az oldatot 4 óra hosszat 80 ’C-on hevítjük.

A reakcióelegy aliquot részét, pl. 10 μΐ-t, amelyet a reakció kezdetétől számított 2 óra eltelte után, majd óránként veszünk, HPLC gélszűrésnek vetjük alá, TSK gél G-DNA-PE oszlopon (7,88x300 mm), eluálószert: 50 mmól/1 trisz-HCl puffer (pH=7,5), 0,3 mól/1 NaCl oldat, 2 mmól/1 EDTA, átfolyási sebesség: 0,5 ml/perc. A reakció pl. jeges hűtéssel leállítjuk, amikor egy 21,86±0,2 perc retenciós idejű frakció megjelenését észleljük.

A reakcióelegyhez kétszeres térfogatú etanolt adunk, és a képződött csapadékot centrifugálással összegyűjtjük (3000 ford/perc, 4 ’C). A kapott terméket 70%-os etanollal mossuk, vákuumban megszárítjuk, és így 10,2 g L-poli-T-t kapunk.

Az eljárásban alkalmazott víz és oldatok sterilizált anyagok. Ugyanezt az eljárást alkalmazzuk a továbbiakban.

(2) L-poli-C előállítása és tisztítása (méretezett poli-C)

200 ml desztillált vizet, 250 ml formamidot és 50 ml 5 mól/l-es nátrium-klorid-oldatot hozzáadunk

HU 202250 Β g poli-C-hez, és 4 óra hosszat 80 ’C-on melegítjük. A fent leírt HPLC gélszűréssel követjük a reakciót (végpont a 21,33±0,2 perc retenciós idejű frakció megjelenésekor).

A rekacióeíegyhez kétszeres térfogatú etanolt adunk, és a képződött csapadékot centrifugálással összegyűjtjük (300 ford/perc, 4 ’C). A kapott terméket 70%-os etanollal mossuk, vákuumban megszárítjuk, és így 9,5 g L-poli-C-t kapunk.

(3) L-poli-C kénezése

8,0 L-poli-C-t, amelyet az előző, (2) lépés szerint állítottunk elő, feloldunk 240 ml vízben és egy 500 ml-es acél reaktorba helkyezzük. Jeges hűtés közben hozzáadunk 12 g kénhidrogént tartalmazó 120 ml piridint. Lezárás után a reaktort 50 °C-on hevítjük 10 óra hosszat. Lehűtés után hozzáadunk 200 ml TE-vel telített fenolt, keverjük, majd 3000 ford/perc sebességgel, 15 ’C-on 5 percig centrifugáljuk. Tizedrész 5 mól/-es nátrium-klorid-olatot és kétszeres mennyiségű etanolt adunk a vizes oldathoz, és a képződött csapadékot 3000 ford/perc sebességgel, 4 ’C-on, 10 percig centrifugálva elválasztjuk, 70% etanollal mossuk, vákuumban megszárítjuk, így 8,0 g L-poli(C20, S⁴U)-t kapunk, azaz olyan méretezett poli-C-szánnazékot, amelyben a citidilsavak egy részét 4-tiouridilsavval cseréltük ki olyan mennyiségben, hogy 20 citidilsavra egy 4-tiouridilsav jusson.

Az említett TE jelentése: 10 mmól/l-es tris-HCl puffer (pH-7,5), amely 1 mmól/1 EDTA-t tartalmaz.

(4) Temperálás

6,00 g a (3) lépés szerinti módon kapott L-poli(C20,S⁴U)-t és 6,44 g, az (1) lépés szerinti módon kapott poli-I-t feloldunk 300 ml 10 mmól/l-es tris-HCl pufferben (pH-7,5), amely 50 mmól/1 nátrium-kloridot tartalmaz, és jól elkeverjük. A kapott oldatot 70 ’C-ra melegítjük vízfürdőn, és ezen a hőmérsékleten tartjuk 10 percig. Ezután hagyjuk lehűlni, és egy éjszakán át állni. A temperált oldatra számítva fele térfogatú fenollal extraháljuk, a vizes fázist elválasztjuk, a temperált oldatra számítva kétszeres térfogatú etanolt adunk hozzá, a képződött csapadékot az eredeti temperált oldat kétharmadának megfelelő vízzel feloldjuk. Ezután a kapott oldatot 4 ’C-on 100-szoros mennyiségű vízzel szemben dializáljuk. A dializáláshoz Spectrapor 2 membránt használunk (Spectrum Medical Industries, Inc., Los Angeles, USA gyártmány). A dialízis 2. napján a só eltávolítását egy elektromos vezetőképesség mérővel ellenőrizzük (CD-35MÜ modell, M and S Instruments Inc., Japán gyártmány). A dializátumot vákuumban 40 ’C-on felére bepároljuk, majd fagyasztva szárítjuk, és így 12,4 g temperált, sómentes terméket kapunk.

(5) Méretmeghatározás ioncserélő módszerrel

Az ioncserét lineáris gradiens elucióval vagy lépésenként! elucióval végezzük. Mindkét esetben azonos a kitermelés és a termék lánchossza, feltételezve, hogy az eluálás körülményeit alkalmasan választottuk meg. L-poli-C és L-poli(C,S⁴U) lépésenkénti eluálásához 0,15 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0) és 1,0 mól/1 NaCl/10 mmól/I tris-HCl (pH-7,0) oldatokat használunk.

L-poli-I lépésenkénti eluálás szempontjából az alábbi (5-1) példákra hivatkozunk.

L-poli-I lineáris gradiens eluálására a következő (A) és (B) oldatot használjuk, és az eluálást a (B) oldat O-tól 100%-ig változó gradiense mellett végezzük.

(A) : 0 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0), (B) : 0,5 mól/1 NaCl/10 mmóVl tris-HCl (pH-7,0).

L-poli-C és L-poli(C,S⁴U) lineáris gradiens eluálása szempontjából az alábbi (5-2) és (5—4) példákra hivatkozunk.

(5-1) L-poli-I méretmeghatározása

210 mg, az (1) lépés szerinti módon kapott Lpoli-I-t feloldunk 5 ml 10 mmól/l-es tris-HCl pufferben (pH-7,0) és DEAE- Toyopearl^R™ 650 C oszlopon (10 mm x 130 mm) adszorbeáljuk. Ezután

1,30 cm/perc lineáris átfolyási sebsség mellett lépésenkénti eluálást végzünk 50 ml 0,03 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH=7,0) és 80 ml 0,5 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH=7,0) oldattal. A 0,5 mól/1 NaCllel eluált frakciót összegyűjtjük, és retenciós időt ugyanolyan HPLC gélszűréssel mérjük, mint a fenti (1) lépésben, amely 21,90±0,2 percnek adódik.

Az L-poli-I-t, amelynek bázisszáma 100-1000, 91%-os kitermeléssel kapjuk.

(5-2) L-poli-C méretmeghatározása

610 mg, a (2) lépés szerinti módon kapott L-poli-C-t feloldunk 10 ml tris-HCl pufferben (pH=7,0), és QAE-Toyopearl^R™ 550 C oszlopon (10 mm x 130 mm) adszorbeáljuk. Ezután lineáris gradiens eluálást végzünk 1,30 cm/perc átfolyási sebességgel, 100-100 ml (A) és (B) oldattal, ahol a (B) oldat O-tól 100%-ig változik.

(A) : 0,0 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0), (B) : 1,0 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0).

A fő csúcsként előuált eluált frakciót összegyűjtjük, és a retenciós időt megmérjük HPLC gélszűréssel, amely 21,35±0,2 percnek adódik. Az L-poli-C-t, amelynek bázisszáma 100-1000, 93% kitermeléssel kapjuk.

(5-3) L-poli(C]2,U) méretmeghatározása mg poli(Ci2U)-t (amelyben a citidilsav egy részét uridilsavra cseréltük olyan mennyiségben, hogy 12 citidilsavra egy uridilsav jusson), amelynek retenciós ideje az (1) lépés szerinti HPLC gélszűrés szerint 18,67 perc, feloldunk 5 ml tris- HCI pufferben (pH=7,0), és DEAE-Toyopearl^R™ 650 C oszlopon (10 mm x 130 mm) adszorbeáljuk. Ezután ezt lineáris gradiens eluállással, 1,30 cm/perc átfolyási sebességgel eluáljuk, 100-100 ml alábbi (A) és (B) oldatot használva eluálószerként úgy, hogy a (B) oldat mennyisége O-tól 100%-ig változik.

(A) : 0,0 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0), (B) : 0,5 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0).

A főcsúcsnként eluált frakciókat öszegyűjtjük, és a retenciós időt HPLC gélszűréssel megmérjük, amely 18,97±O,2 percnek adódik. Az L-poli(Ci2,U)-t, amelynek bázisszáma 100-1000, 87% kitermeléssel kapjuk.

(5-4) L-poli(C20,S⁴U) méretmeghatározása

600 mg, a (3) lépés szerinti módon kapott L-poli(C20,S⁴U)-t feloldunk 10 ml tris-HCl pufferben (pH-7,0), és QAE-Toyopearl^R™ 550 C oszlopon (10 mm x 130 mm) adszorbeáljuk. Ezután lineáris gra-61

HU 202250 Β diens eluálást végzünk 1,30 cm/perc átfolyási sebességgel, 100-100 ml (A) és (B) oldattal, ahol a (B) oldat mennyisége 0-tól 100%-ig változik.

(A) : 0,0 mól/1 NaCl/10 mmóVl tris-HCl (pH-7,0), (B) : 1,0 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0).

A retenciós időt HPLC gélszűrssel a fenti, (5-2) lépés szerinti módon mérjük, amely 21,35+0,2 percnek adódik.

Az L-poli(C20,S⁴U) terméket, amelynek bázisszáma 100-1000, 90%-os kitermeléssel kapjuk.

(6) Temperálás (6—1) L-poli-I és L-poli-C

3,0 g (5-2) lépés szerinti módon kapott, méretezett L-poli-C-t és 3,2 g, (5-1) lépés szerinti módon kapott, méretezett L-poli-I-t külön-külön feloldunk 150 ml 10 mmól/l-es tris-HCl puffer (pH=7,5)/50 mmól/l-es NaCl elegyben, és jól elkeverjük. A kapott oldatot vízfürdőn 70 °C-ra melegítjük, és ezen a hőmérsékleten tartjuk 10 percig. Ezután hagyjuk lehűlni, és egy éjszakán át állni. A fenolos kezelést, etanolos kicsapást és a dializálást a (4) példa szerinti módon végezzük. így 6,2 g temperált vegyületet kapunk.

(6-2) L-poli-I és L-poli-(C20,S⁴U)

1,46 g, (5-4) lépés szerinti módon kapott, méretezett L-poli- (C₂o,S⁴U)-t és 1,57 g (5-1) lépés szerinti módon kapott, méretezett L-poli-I-t a fenti, (6-1) lépés szerinti módon kezelünk, és így 3,0 g temperált terméket kapunk.

Biológiai vizsgálatok (1) Interferon indukáló aktivitás

A találmány szerinti eljárással előállított, kénezett poli- C.poli-I származék interferon indukáló aktivitását vírusellenes aktivitási vizsgálat módszerével határozzák meg. Az I. vizsgálati minta kénezett poli-C.poli-I volt, amely 50-2000 maradékból állt és kénezésaránya n-20 volt.

Humán perifériás vérből nyert limfocitákat (10⁶ sejt/ml) tenyészközegben (RPMI 1640; 20% FCS) 2 óra hosszat kezeltünk a mintával (10 gg/ml). Ezután a tenyészközeget friss közegre cseréltük (RPMI 1640; 20% FCS), 20 óra hosszat inkubáltuk, és a felülúszöt szokásos interferon- vírusellenes aktivitás-mérési módszerrel mérjük, Sindbi-vírus és Fl-sejtek alkalmazásával [v.ö. Rinsho Kensa, 28, 1726, (1984)]. Az eredményeket a következő táblázatban foglaltuk össze. Az interferon-titert CPEI 50 (Cytopathogenic Effect Inhibition 50) hígítási érték formájában mértük. Kontroll mintaként kereskedelmi poli-I.poli-C mintát használtunk.

300 maradékot tartalmazó, n=20 arányban kénezett származék, egy 200-2000 maradékot tartalmazó, n=20 arányban kénezett származék, valamint egy 20000nél több maradékot tartalmazó, n-20 arányban kénezett származék hasonló eredményeket adott.

(2) TNF (Tumor Necrosis Factor) indukáló aktivitása

Nyulakból, amelyeket 10-14 nappal korábban BCG-vel kezeltünk, alveoláris makrofágot vettünk, 10% FCS-t tartalmazó RPMI 1640 tápközeggel 2.10⁶/ml-re állítottuk be. Ebből 1-ml-t műanyag edénybe helyeztünk, és 5% CÜ2-t tartalmazó légtérben 37 ’C- on a minta jelenlétében vagy anélkül inkubáltuk.

A sejttenyészet felülúszóját 2 és 8 óra múlva TNF aktivitási tesztnek vetettük alá. Az eredményeket az alábbi táblázat tartalmazza. A TNF aktivitási titer a 72 óra múlva LM sejtekre kifejtett 50%-os sejtgátló aktivitáshoz tartozó hígítási érték, festékfelvevő módszerrel meghatározva. Azt, hogy a sejtgátlást a TNF okozza, nyúl TNF elleni monoklonális antitest aktivitás semlegesítésével igazoltuk.

TNF aktivitás Semlegesítés 2 óra 8 óra anti-TNF antitesttel

Kontroll	-	-	-
LPS (1 gg/ml)	32	64	+
I. vizsgálati minta	32	64	+
(10 gg/ml)
Kontroll minta	32	64	+
(10 gg/ml)

LPS: lipopoliszacharid

A „kontroll” fiziológiás sóoldat volt, a kontroll minta ugyanaz, mint az előző vizsgálatban.

Látható, hogy a találmány szerinti eljárással előállított nukleinsavszármazék TNF indulkáló aktivitása erős.

(3) Tumorsejt szaporodási gátló hatás

A VII. vizsgálati minta egy 50-10000 maradékot tartalmazó n=20 arányban kénezett, találmány szerinti eljárással előállított nukleinsavszármazék. A minta inhibitor hatását vizsgáltuk, amellyel egerekben a rák elburjánzását gátolja. A vizsgálati eredményeket az alábbi táblázat tartalmazza.

Interferon titer (egység/ml)

10 gg/ml 100 gg/ml 2C	K) gg/ml 500 gg/ml
I. vizsgálati minta	100	>6400	>6400	>6400
Kontroll minta	100	800	1600	>6400

	Egerek száma	Átlag±S.E.	Gátlás %
Kontroll	10	2,64±0,21	-
VII. vizsgálati	10	1,9310,23	27
minta (100 gg/egér)

Amint látható, a találmány szerinti nukleinsavszármazék erős interferon-indukáló hatással rendelkezik.

A találmány szerinti ejárással előállított, kénezett poli-C.poli- I nukleinsavszármazékok közül egy 50Az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított nukleinsavszármazék szaporodást gátló hatást mutat tumor sejtekre rákos egerekben.

Claims (6)

1. Eljárás 50-1000 bázisszámú kettősszálú, RNS egységekből álló nukleinsavszármazékok előállítására, azzal jellemezve, hogy egyszálú nukleinsav polimereket ioncserélő gyantán molekulaméret alapján osztályozzuk, a kívánt frakciót tartalmazó oldathoz 1-4 szénatomos alkoholt adunk, majd adott esetben előzetes kezelés után kettősszálúvá tesszük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 1-4 szénatomos alkoholként etanolt használunk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a meghatározott méretű egyszálú nukleinsav polimerek nukleinsav maradékait a kettősszálúvá tétel előtt kénezzük és egy aril-alkoholt adunk az elegyhez.

4. A 3. igénypont szerinti eljrás, azzal jellemezve, 5 hogy aril- alkoholként fenolt használunk.

5. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított, kettősszálú nukleinsavszármazékot a gyógyszerkészítésben szokásos vivő- és

10 kívánt esetben egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.