HU199883B - Process for producing anticoagulant proteins and pharmaceutical compositions comprising same - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás új véralvadásgátló proteinek előállítására.

A véralvadásgátló proteineket, amelyek a legtöbb emlősállatban előfordulnak, három csoportba oszthatjuk. A beosztás a proteinek hatásmechanizmusának különbségén alapszik.

1. Az alvadási faktorral komplexet alkotó és ezáltal az alvadási faktort hatástalanító proteinek. Ide tartoznak

a) antitrombin-III (Thromb. Rés., 5, 439-452./1974/|

b) m-proteáz inhibitor [Ann. Rév. Biochem., 52,655-709./1983/j ,c) a₂-makroblobulin [Ann. Rév. Biochem., 52,655 - 709./1983/)

d) C'i-inhibitor [Biochemisstry, 20, 2738- 2743. /1981/)

e) Nexin proteáz [J. Bioi. Chem., 258, 10439-10444. /1983/).

2. Az alvadási faktort proteolízis révén elbontó és ezáltal az alvadási faktort inaktiváló proteinek. Csak egyetlen ilyen proteint írtak le eddig, ez a C protein [J. Bioi. Chem., 251, 355-363. /1976/1.

3. Azok a proteinek, amelyek a negatív töltésű foszfolipideket leárnyékolják és/vagy hidrolizálják és így a véralvadási mechanizmus foszfolipidfüggő reakcióit gátolják. Ezidáig csak foszfolipázokat írtak le, amelyeket különböző kígyóméregféleségekből izoláltak JEur. J. Biochem., 112, 25-32/1980/].

A véralvadás lépcsőzetesen végbemenő folyamatának rendszerét az utóbbi években behatóan tanulmányozták. Megállapítást nyert, hogy különböző egymással összefüggő proleolitikus reakciók fokozatos, többlépcsős rendszeréről van szó, amelyben egy enzim egy zimogént aktív formává alakít )C. M. Jackson, Y. Nemerson, Ann. Rév. Biochem., 49, 765—811. /1980/]. A reakció sebességét foszfolipidek és más kofaktorok, ilyen az V_a faktor és a VIII_a faktor, döntő módon fokozzák. A prokoagulációs reakciókat in vivő a különböző gátló mechanizmusok szabályozzák, amelyek az alvadási folyamat kismértékű aktiválása után megelőzik a robbanásszerű trombotikus traumát.

Az anti-alvadási mechanizmusok a következőképpen csoportosíthatók [R.D. Rosenbert, J. S. Rosenbert, J. Clin. Invest., 74, 1 — 6. /1984/]:

1. A X_a szerin-proteáz faktor és a trombin az antitrombin-IU-hoz, illetve az antitrombin/heparin-komplexhcz való kötődés révén inaktiválódik. Ilyen módon mind a protrombin aktiválás, mind a fibrin képződés gátolt lesz. Az antitrombin-IIl-on kívül még különböző más plazma-proteáz inhibitorok is vannak, mint például az a₂* makroglobulin és az antitripszin, amelyeknek a hatása időtől függő.

2. A C protein felfedezése egy további anti-alvadási mechanizmus megismeréséhez vezetett. Ha a C protein aktiválódott, akkor ez antikoagulán&ként hat az V_a és Vili, protein faktorok szelektív protcolízisc révén, mivel ezek a proteinázt és az X faktorral reagáló enzimet inaktiválják.

3. A plazmin hasítja a monomer fibrin 1-et ez a trombin fibrinogénre való hatásának terméke -, s így megakadályozza, hogy oldhatatlan fibrin képződjék [J, L. Nőssel, Natúré, 291, 165167. /1981/].

A fent említett, az alvadási folyamatra ható és a szervezetben előforduló proteinek közül jelenleg csak az antitrombin-III-nak van klinikai alkalmazása. Kitűnt azonban jelentős hátránya, mivel e protein alkalmazásakor a vérzékenységre való hajlam növekszik.

Minden eddigi antikoagulánsként alkalmazott szer, akár szervezetben előforduló, akár szintetikus anyagról van szó, valamilyen módon hatástalanítja az alvadási faktorokat és ezáltal olyan mellékreakciókat okoz, amelyek hátrányosan befolyásolhatják az alvadási folyamatot.

Jelen találmány feladata az volt, hogy egy olyan szert szolgáltasson, amely véralvadásgátló tulajdonságokkal rendelkezik, de az eddig ismert antikoagulánsoknak az alvadási folyamatra ható hátrányos tulajdonságai nélkül.

Meglepő módon, olyan szervezetben előforduló proteineket tudtunk izolálni, amelyek véralvadásgátló tulajdonságokat mutattak, de nem növelték az elvérzés veszélyét. További meglepő tulajdonságuk az, hogy nagyobb vérzésekkor ezek a proteinek elvesztik gátló tulajdonságaikat, így a szokásos alvadási folyamatok zavartalanul lefolyhatnak és az elvérzés veszélye nem áll fenn.

Jelen találmány tárgya, a következőkben VAC-nak (Vascular Anti-Coagulant) nevezett olyan véralvadásgátló proteinek előállítása, amelyek az alvadási faktorokat nem inaktiválják. Ezek a proteinek képesek arra, hogy egy vaszkuláris prokoaguláns, azaz az X_a faktor által indukált alvadást meggátolják, de a trombin által indukált alvadást nem. Nem gátolják a X„ és II_g faktorok biológiai és amidolitikus aktivitását sem.

A találmány tárgya tehát olyan véralvadásgátló proteinek előállítása, amelyek az alvadási faktorokat nem inakliválják és gátolják:

— a módosított protrombin-időt és/vagy — a módosított, aktivált parciális tromboplasztin-időt és/vagy — a nem módosított protrombin-időt és/vagy — negatív töltési foszfolipidek és Ca^{2 +} ionok jelenlétében az X_a alvadási faktor hatására bekövetkező protrombin aktiválódást és/vagy — negatív töltésű foszfolipidek és Ca^{2 +} ionok jelenlétében a IX_a faktor hatására végbemenő intrinsic X faktor aktiválódást és/vagy — az izolált, stimulált trombociták által történő protrombin aktiválódást és/vagy — az érfal által indukált alvadást és/vagy az alvadásfüggő trombocita aggregációt.

A találmány tárgyát képező véralvadásgátló proteinek az alvadási faktorokat nem ínaktiválják és amelyeknek a gátló hatása a foszfolipidek mennyiségétől függ. A találmány szerinti proteinek idézik elő a X, faktor által létrejövő protrombin aktiválódás gátlását. A gátlás a foszfoüpid koncentrációtól függ és nagy foszfolipid kon-2HU 199883 Β centráció mellett kisebb. A találmány szerinti proteinek nem hidrolizálják a foszfolipideket.

A találmány tárgyát képező véralvadásgátló ?rőtéinek az alvadási faktorokat nem inaktiválik és amelyek kétértékű kationokon, a Ca^{2 +} és/vagy Mn²⁺ ionon keresztül a negatív töltésű foszfolipideket - ezek például vezikulákban, liposzómákban és eteroszómákban találhatók megkötik és/vagy megkötik kétértékű Ca^{2 +} és Mn^{2 +} ionon keresztül a Spherocillel összekapcsolt negatív töltésű foszfolipideket. E proteinek és a negatív töltésű foszfolipidek közti kötés reverzibilis és etilén-diamin-tetraecetsawal (DEAE) felbontható. A találmány szerinti proteinek képesek arra, hogy a X„ faktort és a protrombint negatív töltésű foszfolipid felületről kiszorítsák.

A találmány tárgyát képező véralvadásgátló proteinek, amelyek a véralvadási faktorokat nem ínaktiválják, molekulatömege körülbelül 70xl0³, 60xl0³, 34xl0³ és 32x10 , amelyek közül a 34xl0³, illetve a 32xl0³ molekulatömegű protein mindenkor csak egyetlen polipeptid láncból áll.

A találmány tárgyát képező véralvadásgátló proteinek az alvadási faktorokat nem gátolják, és a következőkkel jellemezhetők:

— emlősállatok érfalából izolálhatjuk, majd tisztítjuk őket,

- nem glükoproteinek,

- nem foszfolipázok,

- izoelektromos pontjuk pH 4,4-4,6 közé esik, — a véralvadásgátló proteinek aktivitását a tripszin és/vagy a kimotripszin teljesen nem rontja le, — a véralvadásgátló proteinek aktivitását a koliagenáz és/vagy eíasztáz nem befolyásolja, — a kétértékű Ca²⁺ és Mn²⁺ kationon keresztül megkötik a negatív töltésű foszfolipideket, amelyek vezikulákban, liposzómákban és eteroszómákban fordulnak elő, — a kétértékű Ca²⁺ és Mn²⁺ ionon keresztül megkötik azokat a negatív töltésű foszfolipideket, amelyek Sphérocilhez vannak kapcsolva, — e proteinek és a negatív töltésű foszfolipidek közti kötés reverzibilis és EDTA-val felbontható, — a X_a faktort és a protrombint kiszorítják a negatív töltésű foszfolipidek felületéről, — gátolják a módosított trombin-idő meghatározást, — gátolják a módosított, aktivált parciális tromboplasztin-idő meghatározást, — gátolják a nem módosított protrombin-idő meghatározást, — gátolják a negatív töltésű foszfolipidek és Ca^{2 +} ionok jelenlétében a X_a alvadási faktor által megindított protrombin aktiválódást,

- nem gátolják a X_a és U_a faktorok biológiai és amidolilikus aktivitását,

- in vitro gátolják a X faktor iutrinsic aktiválódását, amelyet a IX, faktor idéz elő negatív töltésű foszfolipidek és Ca^{2 +} ionok jelenlétében,

- in vitro gátolják a protrombin aktiválódását, amelyet izolált, stimulált trombociták indukálnak,

- in vitro gátolják az érfal által indukált alvadást és

- a proteinek által indukált protrombin aktiválódás gátlás (az aktiválódást a X_a faktor váltja ki) és foszfolipid koncentrációtól függ, és nagy foszfolipid koncentráció mellett a gátlás kisebb.

A találmány tárgyát a fenti olyan VAC-proteinek előállítása képezi, amelyek lényegében mentesek mindenfajta állati szövettől és amelyeket előnyösen tiszta formában állítunk elő.

A VAC-proteinek izolálásához alkalmas kiindulási anyagok a következők: érfal, különböző emlősökből, például szarvasmarhából, patkányból, lóból és emberből származó erekkel erősen behálózott szövetek, valamint ezen emlősök endotál-sejttenyészetei. Különösen alkalmasak a marhából, patkányból, lóból származó és emberi artéria falak, valamint a humán köldökzsinór-véna és -artéria.

A találmány tárgyát képező eljárás, amellyel a találmány szerinti proteineket előállítjuk, tulajdonképpen ismert izolálást és tisztítási módszerekből áll. Különösen alkalmas erre az alábbi eljárás, amelynek sémája a következő:

A homogenizált kiindulási anyagot először differenciál-centrifugában centrifugáljuk. A felülúszó folyadékot ezután - tetszés szerinti sorrendben egymás után — a következőképpen kezeljük. Ammóniumszulfáttal kicsapjuk a nemkívánt alkotórészeket. A felülúszót ezután affinitás-kromatográfiával - például hidroxi-apatiton -, molekulaszűrőn való kromatográfiával — például Sephadex G100-on — és immunadszorpciós-kromatográfiával — például poliklonális antitestek segítségével — tovább tisztítjuk. A mindenkori kiindulási anyag minősége szerint változtathatjuk ezt a tisztítási sémát vagy más tisztítási módszereket is alkalmazhatunk, például a foszfolipid vezikulák segítségével való tisztítást.

A klasszikus antitrombotikus kezelés, az orális alvadás gátlás mellett legújabban — látható tünetekkel járó trombózis esetén - bioszintetikus szövet-plazminogén-aktivátort alkalmaznak intravaszkulárisan [N. Engl. J. Med., 310, 609- 613. /1984/j.

A találmány szerinti proteinek kiválóan alkalmasak arra, hogy például műtéteknél megelőzzék a trombózis kialakulását különösen véralvadásgátló tulajdonságaik révén, s ezzel egyidejűleg az alvadásfüggő trombocita-aggregáció gátlásával.

A találmány a fentiek alapján tehát a találmány szerinti proteineknek, mint antitrombotikus szereknek az alkalmazására is vonatkozik.

A találmány további tárgyát képezik azok a gyógyszerkészítmények is, amelyek legalább egy találmány szerinti proteint tartalmaznak.

A VÁC szarvasmarha aortából történő izolálásának és tisztításának eredményeit az A táblázatban mutatjuk be. A VAC-aktivitás mennyiségi meghatározása a 100.000 g-vel való centrifugá-3HU 199883 Β léskor nyert felülúszóból értékelhetetlen volt prokoaguláns aktivitás jelenléte miatt.Az ezen aktivitásért felelős alkotórészt ammóniumszulfáttal, 35%-os telítés mellett, csapjuk ki. Megállapítottuk, hogy a fenti oldat 35%-os ammónium-szulfátos kicsapás után 100% VAC-aktivítást tartalmaz. Az oldatot úgy koncentráljuk, hogy 90%-ra telítjük ammóniumszulfáttal, majd a VÁC proteineket tartalmazó csapadékot TBS jelenlétében hidroxi-apatit oszlopon kötjük meg. Mosás után az oszlopról a VÁC proteineket növekvő foszfát-grádienssel eluáljuk. Ezután alacsony ionerősség mellett DEAE-Sephacel oszIqpra kötjük a VÁC proteineket. Az oszlopról a VÁC proteineket csökkenő nátrium-klorid koncentráció-grádienssel eluáljuk. A végső tisztítás abból áll, hogy a proteineket molekulasúlyuk szerint választjuk el Sephadex G100-on, gélszűréssel. Az eluáló folyadék nagy sótartalmú puffer, hogy a VÁC és a Sephadex anyagának kölcsönhatását a minimálisra szorítsuk. A VÁC erről az oszlopról az oszlop üres-volumenének 1,6szoros mennyiségében eluálódik (lásd az 1. ábrát). Ezután a végső tisztítási lépés után a VACaktivitás össz-kitermelése 35%-os. Az SDSPAGE (nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamidgél-elektroforézis) szerint minden olyan G100 frakció, amely VAC-aktivitást mutat, két polipeptidet (molekulasúlyuk 34.000, illetve 32.000) tartalmaz. Egyes esetekben a 60.000-es molekulasúlyú frakció is mutatott VAC-aktivitást. Az SDS-PAGE szerint csak a 138 — 140. csúcsfrakciók homogének a két polipeptidre vonatkozóan.

A szarvasmarha aortából történő tisztítás adatait az A táblázat foglalja össze. A két polipeptidre vonatkozóan homogén G100 frakciókat használjuk ezen leírásban szereplő minden további kísérlethez, kivéve azt a kísérletet, amelyet a VAC-nak a foszfolipid liposzómához való kötődése jellemzésére végzünk.

A 139-es G100 frakcióban a VAC-aktivitás 3,4%-a volt kimutatható, 1.480 egység/mg protein specifikus aktivitással, ahogy ezt az egylépcsős alvadási vizsgálatban megállapítottuk. Ez a frakció nem tartalmazott kimutatható mennyiségű foszfolipidet és a 280 nm-nél mért abszorpcióból és a protein tartalomból számítva, ezen tisztított VAC-proparátum extinkciós-koeficiense

A^1%i_cm « 8,5 értéket adott.

A VÁC jellemzése

A 2. ábrából kitűnik, hogy a tisztított protein-anyag két polipeptidet tartalmaz, 34.000 és 32.000 molekulasúllyal - ezeknek tulajdonítható a VÁC aktivitás - és e proteinek egyetlen láncból állnak. Bázikus fukszinos Schiff-reagenssel megállapítható, hogy a két protein kevés szénhidrát csoportot tartalmaz. Ezenkívül egyik proteinben sem mutatható ki Gla-csoport. Az izoelektromos fókuszálásnál mindkét protein egyetlen sávként vándorol, s ez 4,4-4,6 izoelektromos pontnak felei meg (lásd a 3. ábrát).

A PAG-lemczen (poliakrilamid) lévő gélből eluált sávból kapjuk meg a VÁC aktivitást. Az eluátum SDS-PAGE analízise mindkét protein jelenlétét újból kimutatta. így megállapítható, hogy mindkét protein egyetlen sávként vándorol a PAG-lemez pH-grádiensében. A módszer ellenőrzése érdekében humán hemoglobint (Hb) vizsgáltunk ugyancsak izoelektromos fókuszálás segítségével. A kapott 6,8-as érték az irodalmi adattal egyezett (lásd a 3. ábrát).

Kötési kísérletekkel kimutatható, hogy a VAC-aktivitás negatív töltésű foszfolipid-membránokhoz képes kötődni. A kötődés Ca² 4- és Mn²+ ionok jelenlétében jön létre, de Mg^{2 +} ion jelenlétében és kétértékű fémionok (lásd a D táblázatot) távollétében nem. A VAC-aktivitásnak a liposzómákhoz való kötődése megfordítható reakció és EDTA reagenssel felbontható.

SDS-PAGE-el kimutattuk, hogy mindkét protein Ca^{2 +} ion jelenlétében kötődhet liposzómákhoz és hogy e kötés EDTA hozzáadásakor diszszociál (lásd a 4. ábrát); ez egy újabb adat arra nézve, hogy a VAC-aktivitás e két proteinnek tulajdonítható.

10% glicerint tartalmazó TBS-ben tartva — 70 °C-on a VAC-aktivitás legalább 3 hónapig stabil, 0 'C-on legalább 12 órán át és 37 °C-on legalább fél óra hosszat stabil, 56 °C-on az aktivitás 2 percen belül eltűnik.

A VÁC hatása

Az egylépcsős koagulációs vizsgálatban, ahol az alvadási a BTP indítja meg, a VÁC meghoszszabbítja az alvadási időt. Ha ebben a vizsgálatban a BTP-t tisztított marha trombinnal vagy tisztított marha X_a faktorral helyettesítjük, azt látjuk, hogy a VÁC az alvadási időt csak meghosszabbítja, ha az X_a faktort a koaguláció megindítására használjuk, továbbá, hogy a trombin által indukált alvadást a VÁC nem befolyásolja. Ez arra mutat, hogy a VÁC az X_a faktor aktivitását közvetlenül gátolja, vagy hogy a protrombínáz-komplex-szel kölcsönhatásba lép. További bizonyításhoz az amidolitikus trombin-képződési vizsgálatot használjuk, amelyet tisztított marha X_g faktorral és protrombinnal végzünk. Az 5. ábrán bemutatjuk, hogy ha a protrombinnak az X_a faktor által történő aktivitása trombinná Ca^{2 +} és foszfolipid jelenlétében megy végbe, a VÁC a protrombin aktiválódását gátolja és hogy a gátlás mértéke függ a VÁC koncentrációjától. Ezenkívül a VÁC gátló hatása alacsonyabb foszfolipid koncentráció mellett erősebb.

A 6. ábra a protrombin aktiválás VÁC által indukált gátlásának foszfolipid-függését ábrázolja. Megemlítendő, hogy nulla foszfolipid koncentrációnál az X„ faktor általi trombin aktiválást nem gátolja a VÁC. A kontroll vizsgálatok azt mutatják, hogy maga a VÁC nem befolyásolja a mérést rendszert.

Ha 5 μΜ foszfolipidet [PS/PC; 1:4 mól/mól] 107 pg/inl VÁC (specifikus aktivitás/ 1.300 egység/mg) és 10 mM Ca^{2 +} keverékével inkubálunk, akkor 37 'C-on 3 percen belül csökken a prokoaguláns-aktivitás. Ez azt mutatja, hogy a VAC-nak nincs foszfolipáz aktivitása.

Az At-IU-al ellentétben a VÁC nem befolyásolja a tisztított trombin amidolitikus aktivitását

-4HU 199883 Β és nincs tartós befolyása az X_a faktor aktivitására, mint ezt az S 2238, illetve S 2237 jelű kromogén szubsztrátumokkal megmértük (lásd a C táblázatot). Ebben a táblázatban azt is bemutatjuk, hogy a X_a faktor és a trombin/AT-Ul inaktiválását nem erősíti a VÁC, ezzel szemben a heEirin határozottan növeli az AT - III aktivitását.

z azt mutatja, hogy a VÁC sem heparinszerű, sem AT - ΙΙΙ-szerű aktivitással nem rendelkezik.

Ugyanezen módszerrel humán véralvadásgátló protein izolálása is lehetséges elvileg, emberi köldökzsinór artériák homogenizátumából.

Az antikoaguláns felfedezését az a tulajdonsáε segítette elő, hogy egy protrombin-idő megtározásnál az alvadási időt meghosszabbította. Az artéria-homobenizátum Sephadex G100-on történő frakcionálása után ez a képessége mérhetővé vált. Az izolálás további lépései alapján feltételezhető, hogy az aktivitás egy vagy több vízoldható anyagnak tudható be, amelyek pH 7,9 mellett együttesen negatív töltésűek.

Egy Sephadex G75 frakció (az eddigi utolsó tisztítási lépés) gél-elektroforézises vizsgálatának eredménye szerint korreláció van a 32.000 molekulasúlyú sáv intenzitása és az MPTT-vel (modificol protrombine time = módosított protrombin idő) mért alvadási idő meghosszabbodása közt (15. ábra).

A 32K-sáv és az alvadás-ellenes aktivitás közti összefüggés kétségtelen, mivel a poliakrilamid gél 32K-sávjából véralvadás gátló aktivitás eluálható. Az eredmények alapján, illetve, hogy az antikoaguláns 56°C-on inkubálva aktivitását gyorsan elveszti, és a proleázok megsemmisítik az aktivitását, fel kell tételezzük, hogy nyilvánvalóan egyetlen 32.000 Dalton molekulasúlyú protein idézi elő az alvadás-ellenes aktivitást.

A tripszin, az 1 típusú proteázzal ellentétben, rosszabb inaktivátora az antikoagulánsnak. Ez arra mutat, hogy az antikoaguláns csak kevés lizin- és arginin-csoportot tartalmaz, minthogy a tripszin számára ezek a hozzáférhetőek.

A véralvadásgátlás hatásmódját a különbözőképpen kiváltott alvadásokon vizsgáltuk. Akár a vaszkuláris prokoagulánssal, a HTP-vel, akár az X, faktorral váltjuk ki az alvadást, az antikoaguláns ezt gátolni fogja, de a trombin által indukált alvadást nem. Ebből arra lehet következtetni, hogy az antikoaguláns a trombin képződésénél nem játszik szerepet, de a trombin aktivitásánál igen.

A találmány szerinti protein alvadásgátló mechanizmusának további felderítésére protrombinázt használtunk [J. Rosing, G. Tans, J.

W. P. Govers-Riemslag, R.F.A. Zwaal és H.C.Hemker, J. Bioi. Chem., 255, 274-283 /1980/j. A kísérleti feltételek mellett az antikoaguláns képes arra, hogy gátolja a protrombin aktiválódását, amelyet a teljes protrombináz (X_a faktor, V_a faktor, foszfolipid, Ca^{2 +} és a foszfolipidhez kötött Xa faktor (Xa faktor, foszfolipid, Ca²*) idéz elő, do a szabad Xa faktor (X, faktor, Ca^{2 +}) által történő aktiválódást nem.

Az alvadásgátló anyag jelenlétében történő protrombin aktiválódás időbeli lefutása a protrombin aktiválódás azonnali gátlására utal, amely időben konstrans marad. Ebből megállapíthatjuk, hogy az antikoaguláns sem foszfolipázszerű hatást, sem proteolitikus hatást nem fejt ki. Az a tény, hogy a X„ faktor és Ca²⁺ által történő protrombin aktiválást egyáltalában nem befolyásolja az antikoaguláns, igen erős bizonyíték arra nézve, hogy e vaszkuláris protein alvadásellenes mechanizmusa az általánosan ismert plazmaproteáz inhibitorokétól - ilyen az antitrombin-lll - különbözik. Mint ahogy ezt Walker és munkatársai (F. J. Walker, P. W. Sexton és C.T. Esmon, Biochim. Biophys. Acta, 571, 333-342. /1979/) kimutatták, az aktivált C protein a X_a faktor, Ca²⁺ és foszfolipid által történő protrombin aktiválódást nem gátolja; ennek következtében a találmány szerinti protein nem identikus a C proteinnel sem.

Az első kötési kísérletek arra mutatnak, hogy a vaszkuláris alvadásellenes szer a X_a faktornak és/vagy a protrombinnak a lipidhez való kötődésénél avatkozik be. Hogy vajon az antikoagulánsnak a protrombin aktiválódás teljes gátlását előidéző képessége felelős-e teljesen a protrombinidő vizsgálatban az alvadási időt meghosszabbító hatásért, még ki kell deríteni.

Abból a tényből, hogy a találmány szerinti anyagot különböző fajta artériákból elő lehet állítani és gyengén ereződött szövetekből nem, arra lehet következtetni, hogy a találmány szerinti protein a hemosztális és trombózis fiziológiás modulátora, amely vaszukuláris felületre hat.

A VÁC meghatározott tulajdonságai és hatásai alapján a véralvadást mechanizmus a VÁC hatása alatt a következőképpen mehet végbe:

A VÁC a Ca^{2 +} ionokon keresztül negatív töltésű foszfolipidekhez kötődik, amelyek a szövetek sérülésekor és/vagy a stimulált trombociták révén keletkeznek és ezáltal csökkenti bizonyos alvadási faktoroknak (ezek a K vitamin-függő alvadási faktorok) negatív töltésű foszfolipid-felülethez való kötődését, amely ezen alvadási faktorok számára katalizátor felületként hat (Biochem. Biophys. Acta, 515, 163-205. /1978/), és a következmény az lesz, hogy a foszfolipid-függő véralvadási reakciókat a VÁC gátolni fogja. A hatásmechanizmus alapján a VÁC a

3. protein csoportba (lásd fent) sorolható.

Döntő jelentőségű azonban mégis a VAC-nak az ezen csoportba tartozó proteinektől való különbözősége: a VÁC ugyanis nem hidrolizálja a foszfolipideket és így nem tudja a membránszerkezeteket lényegesen megbontani.

Továbbá különösen jelentősek és előnyösek a VÁC azon tulajdonságai, amelyekkel még egyetlen eddig ismert antikoaguláns sem rendelkezik:

- A VÁC alvadásellenes hatása azoknak a foszfolipideknek a mennyiségétől függ, amelyek az alvadási folyamatban résztvesznek. Ez a függőség azt eredményezi; hogy az alvadási folyamatot, amelyet például egy csekély érfal-károsodás és/vagy egy kismértékben trombocita aktiválódás vált ki - például egy trombotikus folyamat révén — a VÁC meglepő módon gátolhatja. Másrészt azt az alvadási folyamatot, amelyet egy

-5HU 199883Β drasztikus érfal sérülés vált ki és amelynél a főszfolipidek magas koncentrációban keletkeznek, éppen ezen magas foszfolipid koncentrációk miatt a VÁC nem gátolja. Ezért az elvérzés veszélye VÁC alkalmazása esetén meglepően rendkívül csekély.

Minden eddig ismert antikoagulánssal szemben, amelyek egy vagy több alvadási faktort hatástalanná tesznek és ezáltal az elvérzés veszélyét növelik, a VÁC különb tulajdonságokkal rendelkezik!

— A VÁC különös módon nem inaktiválja magukat az alvadási faktorokat! Ezáltal az alvadási faktoroknak a továbbiakban is lehtőségük van egyéb feladataikat - amelyekből egyre többet fedeznek fel - betölteni. Néhány aktív alvadási faktornak például fontos, nem hemosztatikus feladata a kemotaxis létrehozása az inflammator sejtek számára. Ezek a sejtek hozzájárulnak a sérült érfal gyógyulásához.

Ezt a folyamatot — meglepő módon — nem akadályozza a VÁC!

A jelen találmány először írja le egy újfajta osztályát a véralvadásgátló proteineknek, amelyek az alvadási faktorokat nem inaktiválják. Semmiképpen nem korlátozzuk a találmány oltalmi körét a találmány megvilágítását szolgáló példákra és a leírt tulajdonságokra. A szakemberek a leírt eljárások ismeretében minden leleményes teljesítmény nélkül képesek arra, hogy további olyan proteineket állítsanak elő, amelyek véralvadásgátló tulajdonságokat mutatnak fel anélkül, hogy az alvadási faktorokat inaktiválnák. Ezek a proteinek is a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.

A találmány leírásában használt rövidítések jelentése a következő:

VÁC = vaszkuláris antikoaguláns

PFP = trombocita mentes plazma

TBS 100 mM NaCI, 50 mM trisz.HCl, pH -7,5

EDTA = etilén-diamin-tetraecetsav

TBSE - TBS 2 mM EDTA-val

BTP = marha-agy tromboplasztin

HTP humán-agy tromboplasztin

TBSA - TBS 0,5 mg/ml humán szérum albuminnal, pH/7,9

S 2337 » N-benzoil-L-izoleucil-L-glutamil-L-pipekolil-glicil-L-arginil-p-nitroanilid-dihidroklorid

S 2238·= H-D-penilalanil-L-pipekolil-L-arginin-p-nitroanilid-dihidroklorid

AT—III humán antitrombin-III

S.A. — specifikus aktivitás

Ole₂Gro-P-Cho l,2-dioleil-sn-glicero-3-foszfokolin (PC)

Ole2Gro-P-Ser l,2-dioleil-sn-glicero-3-foszfoszerin (PS)

Gla- -r-karboxi-glutaminsav

A véralvadási faktorok nomenklatúráját illetően a Task Force on Nomenclature of Blood Clotting Zymogens and Zymogen lntcrmediates ajánlásait alkalmazzuk.

A felhasznált anyagok származása a következő: az analitikai SDS-PAGE, a hidroxi-apatit és

HTP a BioRad termékei, a Sephadex G100 és G75, a DEAE-Sephacel és a Low Molecular Weight Calibration Kit a Pharmacia cég, az S 2337 és S 2238 kromogén szubsztrátum a KabiVitrum cég és a Diaflo PM10 ultraszűrő membrán az Amicon cég gyártmánya.

Az alábbiakban ismertetjük az ábrákat.

1. ábra: A VÁC gélszűrése Sephadex G100 oszlopon

Az oszlopot (3.80 cm) 60 cm-es nyomómagassággal készítjük el és 500 mM NaCl-t és 20 mM trisz.HCl-t tartalmazó oldattal (pH= 7,5) egyensúlyba hozzuk. A DEAE kromatografálás után kapott VÁC tartalmú frakciót 2 ml-re koncentráljuk és felvisszük a Sephadex GlOO-ra. A 60 cm-es nyomómagasságot tartjuk. Az üres térfogat 245 ml (70 frakció) volt. Ezután 2 ml-enként gyűjtjük a frakciókat. A frakciókat 10% glicerint tartalmazó TBS-ben dializáljuk, s ezután VÁC aktivitásra vizsgáljuk egylépcsős alvadási módszerrel, ahogyan ezt az 1. példában leírjuk. Az alvadási időket a G 100-as frakciók TBS-sel történő 1:10 hígításaivl kapjuk. VÁC távollétében 65 másodperc az alvadási idő.

2. ábra: A VÁC SDS - PAGE analízise

Az SDS-PAGE-t Laemmli (U. K. Laemmli, Natúré, 227, 680-685. /1970/) szerint végezzük. A gél összetétele: 10% akrilamid, 0,27% N,N³-metilén-bisz-akrilamid és 0,1% SDS. Az x-tengelyen lévő számok jelentése:

1. standard molekulasúlyú anyagok, amelyekben redukált diszulfidkötések vannak;

2. 25 μg redukált VÁC;

3. 25 μg nem redukált VÁC.

3. ábra: A VÁC izoelektromos pH-jának meghatározása

Az elektrofókuszált 3,5-9,5 pH tartományban, PAG-lemezekkel végezzük (lásd az 1. példát). 200 μg humán Hb-t és 20 μg VAC-t viszünk a gélre, ha abban már kialakult a pH-grádiens. A humán Hb referenicaként szolgál, tekintve, hogy izoelektromos pontja ismert: pH >

6,8. Mielőtt a gélt Coomassie Blue-val megfestjük, 30 percig 0,7 mólos triklórecetsawal fixáljuk.

4, ábra: A VÁC negatív töltésű foszfolipid liposzómához való kötődésének analízise SDS-PAGE-el

Az SDS-PAGE-t Laemmli szerint ]U. K. Laemmli, Natúré, 227, 680 — 685. /1970/] végezzük, ugyanolyan lemezeken, mint amilyeneket a

2. ábránál leírtunk. A vizsgált minták a kötődési kísérletekből származnak, lásd a B táblázat magyarázatánál. Az x-tengelyen lévő számok jelentése:

1. standard-molekulasúlyú anyagok, amelyekben redukált diszulfid-kötések vannak;

2. VAC-készítmény liposzóma nélküli centrifugálásnál kapott felülúszó;

3. VAC-készítmény liposzóma jelenlétében történő centrífugálásnál kapott felülúszó,

HU 199883 Β

4. VAC-készítmény liposzóma és Ca^{2 +} jelenlétében történő centrifugálásnál kapott felülúszó,

5. felülúszó, amelyet a 4 alatti liposzóma üledék újbóli szuszpendálása - 10 mM EDTA-t tartalmazó TBS-ben — után végzett centrifugálással kapunk.

5. ábra: A VÁC koncentráció hatása a trombin képződés gátlására

A VÁC adott koncentrációi a kísérleti rendszerekben meglévő koncentrációk. A trombin képződést a következő reakció-keve rékben mérjük: 10 mM CaCl₂ tartalmú TBSA-ban 1 μΜ protrombin, 10 mM X_a faktor és 0,5 Μ (Δ — Δ) vagy 5 M (·—·) foszfolipid membrán (PC/PS; 4:1 mól/mól). A reakciókeveréket a VÁC (S.A. = 1.300 egység/mg) említett mennyiségeivel 3 percen át 37 ’C-on protrombinnal keverjük. A protrombin hozzáadásával indítjuk meg a trombin képződést A keverékben (lásd az 1. példát), s ennek sebességét mérjük. A trombin képződés sebessége VÁC nélkül 3,3 nM II_a/perc (Δ -Δ), illetve 10,9 nM II/_a/perc (· -·) volt.

6. ábra: A foszfolipid koncentráció hatása a trombin képződés VÁC okozta gátlásra

A trombin képződését a következő reakciókeverékben mérjük TBSA-ban 1 μΜ protrombin, 10 nM X_a faktor, 10,7 _Mg/ml VÁC (S.A. = 1.300 egység/mg) és foszfolipid membrán [PC/PS; 4:1 mól/mól] különböző koncentrációkban. Az X_a faktort, VAC-t és foszfolipidet 3 percig 37 ’C-on TBSA-ban keverjük. A trombin képződést úgy váltjuk ki, hogy a reakció keverékhez hozzáadjuk a protrombint. A trombin képződés sebességét az 1. példában leírt módon mérjük. A trombin képződés gátlásának százalékos arányát (·-·) minden foszfolipid koncentrációra megadjuk a VÁC nélkül végbemenő trombin képződés sebességére (Δ - Δ) vonatkoztatva.

7. ábra: Köldökzsinór homogenizátum 10.000 g-vel való centrifugálása után kapott felülúszó gélszűrése Sephadex G 100-on

Egy 10.000 g-vel kapott felülúszó 2 ml-ét TBS-el előzőleg kiegyensúlyozott Sephadex G100 oszlopra (1,5x80 cm) visszük fel. Az oszlopot TBS-sel eluáljuk. A kapott frakciók alikvot mennyiségeit MPTT-vel vizsgáljuk. Bizonyos frakciók ( ) prokoaguláns aktivitást mutatnak és az MPTT meg-, átárazásban megindítjuk az alvadást. HTP, X_a faktor vagy trombin hozzáadása nélkül. Más frakciók ( ) meghosszabbítják az alvadási időt az MPTT meghatározásban, ha az alvadást HTP-vel indítjuk meg. Ezeket a frakciókat összegyűjtjük és tovább frakcionáljuk.

8. ábra: Az antikoagulánsok kromatografálása DEAE-Sephacel-en [A] és Sephadex G75-ön [B]

A Sephadex G100 oszlopról gyűjtött antikoagulánst tartalmazó poolt DEAE-Sephacel-re visszük. Az elúciót lineáris NaCl grádiensben 50 mM -· 300 mM NaCl (—) — végezzük és 4 ml-es frakciókat szedünk, adszorpciójukat 280 nm-en mérjük (---), antikoagulánc aktivitásukat MPTT-vel vizsgáljuk, ahol HTP-t használunk (végkoncentráció 95 μg protein/ml) az alvadás megindításához. Az antikoaguláns aktivitású frakciókat összegyűjtjük, koncentráljuk, majd Sephadex G75-re (B) visszük fel. 2 ml-es frakciókat gyűjtünk, ezek abszorpcióját 280 nm-en (---) mérjük és antikoaguláns aktivitásukat (·) ellenőrizzük. V_o-al jelöljük az oszlop ürestérfogatát.

9. ábra: Az antikoagulánsok dózis-függése az MPTT-ben

MPTT meghatározásnál különböző antikoaguláns mennyiségeket adunk a reakcióhoz. Az alvadást HTP-vel (végkoncentráció 95 μg proteϊη/ml) indítjuk meg. A kontroll alvadási idő 65 másodperc.

10. ábra: A Sephadex G75-eluátum különböző frakcióinak gélelektroforézise

A G75-eluátum különböző frakcióinak egy meghatározott mennyiségét gél-elektroforézissel vizsgáljuk, ahogyan ezt leírtuk. A géleket ezüsttel festjük Merril és munkatársai (C.R. Merni,

D. Goldman és M.L. van Keuren, Electrophoresis, 3, 17 — 23. /1982/] szerint. 1 sáv: redukált, alacsony molekulasúlyú standardok; 2—6 sáv: a 35, 39, 41, 43 és 50-es számú G75-frakciók redukálatlan alikvot mennyiségei.

11. ábra: Proteolitikus enzimek hatása az antikoaguláns aktivitásra

Az antikoagulánst 37 ’C-on I típusú proteázzal ( , végkoncentráció 0,11 egység/ml), tripszinncl (Δ, végkoncentráció 88 BAEE egység/ /ml) és proteolitikus enzim nélkül (·) inkubáljuk. A reakció keverékekből az adott időpontokban 5 μΐ, 6 μ§ antikoaguláns proteint tartalmazó mintái veszünk és hozzáadjuk MPTT-hez. Az alvadást HTP-vel indítjuk meg (végkoncentráció 18 μg protein/ml). A kontroll alvadási idő 110 másodperc volt. A proteolitikus enzimek egységeit a gyártók adatai alapján adjuk meg.

12. ábra: A vaszkuláris antikoaguláns hatása az alvadási időre, amelyet MPTT-ben HTP-vel vagy X_a faktorral vagy trombinnal indukálunk

Az alvadást megindító anyagok koncentrációit (HTP= 18 Mg protein/ml; X_a faktor = 1,5 nM, trombin = 0,4 nM) úgy választjuk meg, hogy a kontroll alvadási idő körülbelül 110 másodperc legyen (üres hasábok). X_a faktor alkalmazása esetén a reakció keverékhez foszfolipid vezikulákat adunk (végkoncentráció: 10 μΜ). A foszfolipid Ole₂Gro-P-Ser/Ole₂Gro-P-Cho 20:80 mólarányú összetételéből áll. Az alvadási időket, amelyeket az említett anyagokkal 3,5 Mg antikoaguláns protein jelenlétében kapunk, a sraffozott hasábokkal ábrázoljuk.

13. ábra: Az antikoaguláns hatása a protrombin aktiválására, ha ezt (X_a, V„ foszfolipid, C^{2 +} ), (Xa, foszfolipid, C²⁴) és (Xa, Ca₂₊) indukálja

-7HU 199883 Β

A reakciókeverékek összetétele a kővetkező:

A 1 pM protrombin, 0,3 nM X_a faktor, 0,6 αΜ V, faktor, 0,5 pm foszfolipid és 10 mM CaCl₂ 12 pg/ml antikoagulánssal ( ), 4,8 (pg/ml antikoagulánssal (Δ) és antikoaguláns nélkül (·)·

Β 1 pg protrombin, 10 nM X_a faktor, 0,5 pM foszfolipid és 10 mM CaCl₂ 2,4 pg/ml antikoagulánssal ( ), 0,48 pg/ml antikoagulánssal (Δ) és antikoaguláns nélkül (·).

C 1 pM protrombin, 75 nM X_a faktor és 10 nM CaCl₂ 120 pg/ = ml antikoagulánssal (Δ) és antikoaguláns nélkül (·). A megadott időpontokban próbát veszünk és a már leírt módon meghatározzuk a keletkezett trombint.

14. ábra: Immunobiot módszer

A blot-okat a leírás szerint kapjuk meg.

1. sáv: marha aortából izolált, VÁC aktivitású protein frakció.

2. sáv: marha aortából izolált, VÁC aktivitású protein frakció.

3. sáv: marha tüdőből izolált,VÁC aktivitású protein frakció.

4. sáv: humán köldökzsinór artériából izolált, VÁC aktivitású frakció.

5. sáv: patkány aortából izolált, VÁC aktivitású protein frakció.

6. sáv: ló aortából izolált, VÁC aktivitású protein frakció.

15. ábra: A Sephadex G75 eluátum különböző frakcióinak gélelektroforézise [A] és alvadásgátló hatása [B]

A Sephadex G75-ról eluált különböző frakciók meghatározott mennyiségeit gélben elektroforetizáljuk, ahogy ezt leírjuk. A sávokat Merril és munkatársai szerint (lásd a fent idézett közleményt) ezüsttel festjük meg.

1- es futtatás: alacsony molekulasúlyú standard anyagok;

2— 6 futtatás: azonos mennyiségű, növekvő eluciós térfogat szerinti, nem redukált G75 frakciók. A G75 frakciók meghatározott mennyiségeit, amelyeket gél-elektroforézissel analizáltunk, MPTT-vel vizsgálunk (lásd a fenti leírást), amikor is az alvadás megindításához HTP-t alkalmazunk. A kontroll alvadási időket az üres hasábok jelentik. A sraffozott hasábok alatti számok a 15A. ábrán lévő elektroforetikus futtatások számozásának felelnek meg.

16. ábra: A vaszkuláris alvadásgátló anyag hőinaktiválása

Az alvadásgátlót 56 ”C-on inkubáljuk és különböző inkubációs idők elteltével 5 pl-es próbákat veszünk, amelyek 3,6 pg proteint tartalmaznak. A próbákat azonban jéggel hűtjük, majd MPTT-vel vizsgáljuk, HTP - mint alvadás kiváltó — alkalmazása mellett. A kontroll próba alvadási ideje 110 másodperc.

1. példa

A VÁC izolálása és tisztítása

Vágás után fél órán belül kivesszük a marhákból az aortát. A marhavért trinátrium-citrátba (végkoncentráció: 0,38%) vesszük le, majd 10 percig szobahőmérsékleten 2.000 g mellett centrifugáljuk (15 percig 10.000 g mellett). Ilyen módon trombocita mentes plazmát (PFP) kapunk.

Az állatok aortáját közvetlenül a kivétel után TBS-sel alaposan átöblítjük. Az aortákból az érbelhártyát eltávolítjuk és magasfordulatú homogenizátor, például Braun HX32 homogenizátor alkalmazásával, szója-tripszin-inhibitort (16 mg/ml) és benzamidint (1,57 g/1) tartalmazó TBSE-ben homogenizáljuk.

A 8 aortából származó homogenizált anyagot, amely 20 t/tf.% szárazanyagot tartalmaz, 60 percen át 100.000 g-vel centrifugáljuk. A felülúszó folyadékot szilárd ammónium-szulfáttal 30%-ig telítjük, 30 percig keverjük és ezután 20 percig 12.000 g mellett centrifugáljuk. A kapott folyadékot szilárd ammónium-szulfáttal 90%-ig telítjük, 30 percig keverjük, s ezután 20 prcig 12.000 g-vel centrifugáljuk.

A szárazanyagot kísmennyiségű TBS-ben szuszpendáljuk és benzamidin (1,57 g/1) tartalmú TBS ellenében dializáljuk. A dializált frakciót hidroxi-apatit oszlopra (1x20 cm) visszük fel, amelyet TBS-el egyensúlyoztunk ki. Az oszlopot az agytérfogat négyszeresének megfelelő menynyiségű TBS-sel mossuk. A VÁC proteineket 200 ml nátrium-foszfát pufferrel (pH = 7,5), O - 500 mM lineár-grádiens alkalmazásával eluáljuk az oszlopról. Az alábbi vizsgálatok alapján meghatározott VÁC tartalmú frakciókat egyesítjük és 50 mM NaCl és 20 mM triszxHCl (pH = 7,5) tartalmú oldattal szemben dializáljuk.

Ugyanezt a puffért használjuk a DEAE-Sephadex oszlop (3x5 cm) kiegyensúlyozására, amelyen a dializált VAC-anyagot kromatografáljuk. Az oszlopot négyszeres ágytérfogatnak megfelelő kiegyensúlyozó pufferrel mossuk, majd a VÁC eluálása 200 ml 20 mM-os triszxHCl-el (pH =

7.5) , 50-300 mM NaCl lineár-grádiens mellett történik. A VÁC tartalmú frakciókat összegyűjtjük, 500 mM NaCl és 20 mM triszxHCl (pH =

7.5) tartalmú oldattal szemben dializáljuk, s ezután Amicon cellában PM-10 ultraszűrő membrán alkalmazásával koncentráljuk. A koncentrált anyagot 2 ml térfogatban Sephadex G100 oszlopra (3x80 cm) visszük fel, miután az oszlopot 500 mM NaCl és 20 mM triszxHCl (pH = 7,5) tartalmú oldattal egyensúlyba hoztuk.

Az eluátumot 2 ml-es frakciókban szedjük le, és az alábbiak szerint aktív frakciókat (1.1. ábra) elkülönítjük és 10 térfogat% glicerint tartalmazó TBS-el szemben dializáljuk, majd — 70 “C-on tároljuk. Az egész tisztítási eljárást 0—4 ‘C-on végezzük.

A VÁC aktivitás meghatározása

A VÁC aktivitás meghatározására két különböző módszert használunk:

a) egylépcsős alvadási vizsgálatot (módosított protrombin idő vizsgálat),

b) trombin képződési vizsgálatot.

Az egylépcsős alvadási vizsgálatot a következőképpen végezzük.

HU 199883 Β

Szilikonozott üveg küvettában a vizsgálandó frakció 175 μΙ-ét, illetve a kontroll TBS 175 μΙ-ét 50 μΐ PFP-vel és 25 μΐ hígított BTP-vel rázzuk (900 ford/perc); 3 perc inkubációs idő után (37 *C-on) a koaguláció kiváltása 80 mM NaCl, 20 mM CaCl₂ és 10 mM triszxHCl tartalmú puffer (pH = 7,5) hozzáadásával történik. A fibrin kép* ződést egy Payton Dual Aggregation Modulé [G. Hornstra, Phil. Trans. R. Soc. London B, 294, 355-371. /1981/J használatával regisztráljuk. A kontroll alvadási ideje 65 másodpercet tesz ki. Ezt a vizsgálatot használjuk a tisztítás folyamán a különböző frakciókban lévő VÁC aktivitás meghatározására. A tisztítás folyamán a VÁC kitermelés meghatározásánál egy egység VAC-aktivitásnak az a VÁC mennyiség felel meg, amely a fent említett vizsgálatban az alvadási időt 100 másodpercre hosszabbítja meg.

Egyes esetekben a BTP-t tisztított marha trombinnal vagy tisztított marha X_a faktorral helyettesítettük. Ebben a fél-tisztaságú alvadási rendszerben a trombin vagy a X_a faktor mennyiségét úgy választottuk meg, hogy a kontroll alvadási ideje ugyancsak 65 másodperc legyen.

A trombin képződés vizsgálatát a következőképpen végezzük:

Műanyag küvettában lévő 181 μΐ TBSA-hoz hozzáadunk 20 μΐ tisztított marha X_a faktort (150 mM), 30 μΐ PS/PC-foszfolipid membránt, 30 μΐ CaCl₂-t (100 mM), 30 μΐ tisztított VAC-t (a végső koncentrációk adatait az ábrák magyarázata tartalmazza).

A keveréket 37 °C-on 3 percig teflon keverővei keverjük. A trombin képződést 9 μΙ tisztított marha 11 faktorral (33,33 μΜ) váltjuk ki. Különböző idő elteltével 50 μΙ-es próbákat veszünk ki a reakció keverékből és ezeket olyan 1 ml-es műanyag küvettába visszük át, amelyet termosztáttal 37 °C-on tartunk, és amely 900 μΐ TBSE-t és 50 μΐ S 2238 kromogén szugsztrátumot (5 mM) tartalmaz. Az extinkciós érték változását 405 nm-en, Kontron Uvikon 810 spektrofotométerben mérjük és a reakciókeverékben lévő trombin mennyiségét standard görbe segítségével ezt marha trombin ismert mennyiségével vesszük fel — határozzuk meg. A VÁC által előidézett gátlás százalékos arányát a következőképpen definiáljuk:

gátlás %-ban = (1 — a/b) x 100, ahol a a trombin képződés sebessége VÁC jelenlétében, U_a nM/perc-ben és b a trombin képződés sebessége VÁC távollétében II_a nM/perc-ben.

Proteinek

A K vitamin függő faktorokat, a protrombint és a X_a faktort citrátos marha-plazma tisztításával kapjuk meg [J. Steflo, J. Bioi. Chem., 251, 355 — 363 (1976)]. Bárium-citrátos adszorpció, elució, ammónium-szulfátos frakcionálás és DEAE-Sephadexen való kromatografálás két

Sirotein frakciót eredményez, egy protrombin-IX aktor keveréket, illetve a X faktor keveréket, illetve a X faktort. A X faktort Fujikawa és munkatársai módszerével (Biochemistry, 11, 4882-4891. (1972)] izoláljuk és RVV-X használatával [Fujikawa és munkatársai, Biochemistry, 11, 4892 - 4899 (1972)] aktiváljuk. A protrombint a IX faktortól heparin-agaróz-affinitás kromatográfiával [Fujikawa és munkatársai, Biochemistry, 12, 4938 — 4945 (1973)] választjuk el. A heparin-agróz oszlopról leszedett protrombin tartalmú frakciókat egyesítjük és a továbbiakban Owens és munkatársai [J. Bioi. Chem., 249, 594— 605. (1974)] módszere szerint tisztítjuk. A protrombin és a X_a faktot koncentrációját Rosing és munkatársai [J. Bioi. Chem. 255, 274— 283 (1980)1 módszerével határozzuk meg. A BTP-t rutin eljárással állítjuk elő, Van Dam Mieras és munkatársai (Blood Coagulation Enzymes, Methods of Enzymatic Analysis Verlag Chernie GmbH, Weinheim) leírása szerint. A protein koncentrációkat Lowry és munkatársai módszerével [J. Bioi. Chem., 193, 265 (1951)] határozzuk meg.

Foszfolipid, foszfolipid-vezikula és foszfolipid-liposzóma előállítása

Az 1,2dioleil-sn-glicero-3- foszfokolin [l8:l_cjs/18:l_Ci_SPC] és az l,2-dioleil-sn-glicero-3foszfoszerin [18:1(.^18:1^-PS] előállítását Rosing és munkatársai leírása szerint végezzük: PC-ből és PS-ből álló két külön gyártási tétel foszfolipidvczikulát állítunk elő ultrahang segítségével Rosing és munkatársai leírása szerint (lásd az idézett közleményben). Foszfolipid-liposzómában úgy állítunk elő reagens-oldatot, hogy kloroformban feloldjuk a szükséges menynyiségű foszfolipidet, a kloroformot nitrogén mellett pároljuk el. A visszamaradó foszfolipidet 5% glicerint tartalmazó TBS-ben szuszpendáljuk, 3 percig óvatosan keverjük üveggolyókkal, majd 10 percig 10.000 g mellett centrifugáljuk. A felülúszó oldatot eldobjuk, az üledéket újra óvatosan 5% glicerin tartalmú TBS-ben szuszpendáljuk; ily módon kapjuk meg a foszfolipidiiposzóma-reagens oldatot. A liposzómákat szobahőmérsékleten tartjuk el. A foszfolipid koncentrációkat Böttcher és munkatársai [Anal. Chim. Acta, 24, 203-207. )1961)] szerint, foszfát-analízissel határozzuk meg.

SDS-PAGE

A gél-elektroforézist lemezeken végezzük SDS jelenlétében, Laemmli [Natúré, 227, 680-685. (1970)] módszere szerint. A gél 10% akril-amidot, 0,27% N,N³-bisz-akrilamidot és 0,1% SDS-t tartalmaz. A gép-próbák diszulfid-hidakat tartalmazó béta-merkapto-etanolból 5%-ot tartalmaznak. A géleket a következőképpen festjük meg:

1) 50% etanolt és 15% ecetsavat tartalmazó oldatban feloldott 0,25% Coomassie Blue R —250-el; a szintelenítés 10% etanolt és 10% ecetsavat tartalmazó oldattal történik;

2) Schiff reagenssel, amelyet bázikus fukszinnal (Mérek) állítunk elő Segrest és munkatársai (Methods in Enzymology (1972) 28. kötetének 54-63. oldalai) módszere szerint, vagy

3) ezüsttel, Merril és munkatársai [Electrophoresis, 3,17-23. /1982/] leírása szerint.

(A fenti százalékok tömegszázalékot jelentenek!)

HU 199883 Β

Elektrofókuszálás

A proteinek izoelektromos pH-jának meghatározásához kész vékonyréteg-poliakrilamid-géleket használunk, ezek Ampholine hordozó Ampholyte tartalmúak (LKB féle PAG-lemezek) 3,5-9,5 pH tartományban, s az eljárást a gyártó utasítása szerint végezzük. A gélben lévő pH grádienst közvetlenül az elektrofókuszálás után határozzuk meg, úgy, hogy az anód és katód között egy vonal mentén csíkot vágunk ki a gélből. A csíkokból desztillált vízzel eluáljuk az elektroliteket és a víz pH értékét kombinált üvegelektróddal mérjük meg.

_ Glutaminsav meghatározás

A Gla meghatározását HPLC segítségével végezzük Nucleosil 5SB oszlopon (Chrompack) Kuwada és munkatársai módszere [Anal. Biochem., 131,173-179. (1983)} szerint.

2. példa

Foszfolipidek kötése a Sphérocil-hez

A kívánt foszfolipideket kloroformban oldjuk és hozzáadjuk a Sphérocil (Rhone-Poulenc cég gyártmánya) oszloptöltethez a következő arányban: 5 mg foszfolipid/g Sphérocil. A kloroformot nitrogén gázzal távolítjuk el, majd a száraz Sphérocil-foszfolipidet olyan pufferrel mossuk, amelyben előzőleg VAC-t szuszpendáltunk. A VÁC hozzákötődik a Sphérocil-fo&zfolipidhez Ca²⁺ és/vagy Mn²⁺ jelenlétében, ha a foszfolipide k egy része negatív töltésű.

3. példa μ\ citrátos trombocita-mentes plazmát keverünk 200 μϊ pufferhez (25 mM triszxHCl (pH = 7,5), 100 mM NaCl), amely kaolint (olyan mesterséges felület, amely a tulajdonképpeni alvadást katalizálja, ez esetben üvegdara), inozitint (foszfolipid forrás) és VAC-t tartalmaz. Ezt a keveréket 3 percig 37 ’C-on inkubáljuk, majd 250 ²⁰ pl Ca^{2 +}-puffért (200 mM triszxHcl (pH = 7,5), 80 mM NaCl, 20 mM CaCl₂) adunk hozzá. Az alvadási időt az 1. példában leírt módon határozzuk meg.

A táblázat

VÁC előállítása marha aorta belhártyából. Összefoglalás

Tisztítási lépés	Protein® mg	VÁC6 egység egység/mg	Specifikus aktivitás	Kitermelés %	Tisztasági fok
35% (NH4)2SO4-os felülúszó	630	19.500	31,0	100	1,0
90% (NH4)2SO4-os csapadék	470	19.000	40,4	97	1,3
Hidroxi-apatit frakció	206	17.300	84,0	89	2,7
DEAE-frakció	35,8	13.900	388	71	. 12,5
139-es Spehadex GlOO-frakció	0,45	666	1480	3,4	47,7

dában leírt próba hígítási sorok egylépcsős alvaa) A protein mennyiségi meghatározása Lowry és munkatársai (O.H.Lowry, N.V. Rosebrough, A. L. Farr és R. J. Randall, J. Bioi. Chem., 193,265 /1951/) módszerével történik.

b) A VÁC egységek meghatározása az 1. pél dási vizsgálatával történik. Az a hígítás, amelyben a kontrolihoz (65 másodperc) képest az alvadási idő 100 másodpercre nő, a definíciós sze50 rint 1 VÁC egységet tartalmaz.

-101

HU 199883 Β

B. táblázat

A VÁC fém-ion függő kötődése negatív töltési foszfolipid liposzómákhoz

Kation (10 mM)	tc másodperc* felülúszó	EDTAC
Kontroll (liposzóma nélkül)	180	N.D.d
Kontroll (kation nélkül)	174	64„8
CaCl2 b	64,2	134
MgCl2	165	N.D.d
MnCl2 b	65,1	N.D.d

a) A t_c alvadási idő meghatározása az 1. példában leírt egylépcsős alvadási vizsgálattal történt.

b) A foszfolipid-liposzóma reagens-oldatból (PS/PC; 50/50 mól/mp: 1 mM) 50 μΙ-t és 100 μΙ 5% glicerin és a megfelelő kation tartalmú TBSt (pH= 7,5) keverünk össze szobahőmérsékleten, a keveréket 15 percig 15.000 g mellett centrifugáljuk, a kapott felülúszó folyadék 25 μΙ-ét TBS-el 175 μΙ-re hígítjuk, majd az egylépcsős alvadási vizsgálattal mérjük. A felülúszó maradékát SDS-PAGE-el analizáljuk (4. ábra).

c) A kapott liposzóma üledéket újból szuszpendáljuk 150 μΐ 5% glicerint és 10 mM EDTA-t tartalmazó TBS-ben (pH= 7,5). A szuszpenziót 15 percig 15.000 g-val centrifugáljuk. A felülúszó VÁC aktivitását a b) pontban leírt módon mérjük.

d) N.D. - nincs meghatározva.

C táblázat

A VÁC hatása a X_a faktor és a II_a faktor amidolitikus aktivitására

	Á4os/percxlO3 8 VÁC
—	+
x.	110,5	110,5
X„ ΑΤ-ΙΠ	80,8	81,5
X„, heparin Xa, heparin.	110,5	109,0
AT-III	47,5	N.D.b
H.	7,5	8,5
II., AT-III	5,4	5,6
IIa, heparin Ua, heparin,	7,5	7,1
AT-III	0,56	N.D.b

a) Az amidolitikus aktivitást a következőképpen mérjük: X_a faktort vagy a ll_a faktort az említett anyaggal együtt TBSA-ban oldjuk. A reakciókeveréket teflonnal bevont keverővei, műanyag küvettában — amelyet termosztát segítségével 37 ’C-on tartunk - keverjük; 10 perc múlva 100 μΐ (X_a) vagy 50 μΐ (Il_a) mintát veszünk a küvettából. Ezt a mintát egy másik — 37 ’C-os termosztáttal temperált - műanyag küvettába visszük át, amely 800 μΐ TBSE-l és 100 μΐ S 2337 reagenst (2 mM), illetve 900 μΐ S 2338 reagenst (5 mM) tartalmaz. Az abszorpció változását spektrofotométerrel (Kontroll Uvikon 810; 37 ’C-os termosztáttal temperálva) 405 nm-en mérjük. A reakciókeverékben a különböző anyagok végkoncentrációja a következő volt: 18,7 nM X_a faktor, 1,5 nM II_a faktor; 18,7 nM AT —III; 1 egység/ml heparin és 10,7 μg/ml VÁC (S.A. 1.3000 egység'mg).

b) Nincs meghatározva.

4, példa

Vénapunkcióval emberi vért veszünk le trinátrium-citrát oldalba (végkoncentráció: körülbelül 13 mM citrát) és szobahőmérsékleten 10 percig 2.000 g mellett centrifugáljuk. Az így kapott plazmát újból 15 percig centrifugáljuk 10.000 g mellett, hogy trombocita mentes plazmát (PFP) nyerjünk. A standardként szolgáló PFP-t különböző egészséges véradók plazmájának keverékéből készítjük.

Humán köldökzsinórokat gyűjtünk a születés után 15 perc elteltével. Az artériákat azonnal jéghideg TBS-pufferrel mossuk át, majd megtisztítjuk a Warton-féle géltől (Jelly von Warton), majd Braun MX32 típusú homogenizátorban homogenizáljuk. A 10%-os homogenizátumokal ezután frakcionáljuk.

A 10.000 g-vel centrifugált homogenizátum felülúszójának frakcionálása Sephadex G100-on reprodukálható, specifikus elució képet ad (lásd a 7. ábrát).

Azokat a frakciókat, amelyek az MPTT mérésénél az alvadási rendszert befolyásolják, a 7. ábrában mutatjuk be. Az előfrakcióval prokoaguláns aktivitás eluálódott. Ezt az aktivitást az MPTT vizsgálatban csak a Vll faktor jelenlétében lehet kimutatni olyan kísérletekkel, ahol emberi veleszületett VII faktor hiányos plazmát használunk. Ennek megfelelően ezt a prokoagulánst szöveti tromboplasztinnak kell tekinteni.

Azokat a frakciókat, amelyeknek kifejezett alvadás ellenes hatásuk van, egyesítjük, majd DEAE-Sephacel kromatográfiával tovább tisztítjuk (8A. ábra). Az antikoaguláns a DEAE-Sephacel-hez 50 mM NaCl és 50 mM trisz^HCl (pH = 7,9) sókoncentrációnál kötődik. Az aktivitást lineáris NaCl-grádiensben, pH= 7,9-nél, 150-160 mM NaCl-el eluáljuk. Az antikoaguláns aktivitást tartalmazó DEAE-frakciókat egyesítjük és gélszűrést végzünk. A Sephadex G75 használatával. Az oszlopot (1,5x50 cm) TBS-el egyensúlyozzuk ki. Az aktivitás a 30.000-60.000 Dalton molekulasúlyú frakciókkal oldódik ki. Az antikoaguláns mennyiségi meghatá11

-11HU 199883 Β rozására az MPTT vizsgálat, mint quantitatív assay* szolgál (9. ábra). Egy egység antikoaguláns aktivitás az a mennyiség, amely az MPTT vizsgálatban - ahol HTP-t használunk az alvadás kiváltására (végkoncentráció 95 Mg protein/ /ml) - az alvadási időt, a 65 másodperces kontroll időhöz képest 100 másodpercre növeli meg. Ennek az assay-nek a segítségével kiszámítottuk, hogy 10 g nedves artéria-szövetből mintegy 2 mg protein termelhető, közel 1200 egység antikoaguláns aktivitással.

Módosított protrombin-idő meghatározás (MPTT)

Módosított protrombin idő meghatározást (MPTT) a következőképpen végezzük: szilikonozott üvegküvettában 37 °C hőmérsékleten 50 μΐ PFP-t keverünk össze 150 μΐ TBS-el, 25 μΐΐ rutin HTP-hígítással és 25 μΐ TBS-el (kontroll), vagy a homogenizált artéria-anyag egy frakciójának 25 μΐ-ével. Három perces inkubálás után az alvadást 250 μΐ Ca^{2 +}-puffer (80 mM NaCl, 20 mM CaCl₂ és 10 mM triszxHCl /pH = 7,9/) hozzáadásával indítjuk meg. A fibrin képződést Payton Dual Aggregation Modulé [ G. Hornstra, Phil. Trans. R. Soc. London B, 294, 355-371. /1981/] segítségével regisztráljuk. Amennyiben az MPTT meghatározásában az alvadás megindításához X„ faktort használunk, a HTP-t elhagyjuk és a hígított PFP-hez 25 μΐ tisztított faktort adunk 250 μΐ Ca^{2 +} -pufferrel együtt.

Módosított trombin-idő meghatározás (MTT)

A módosított trombin-idő meghatározást (MTT) a fent leírtakkal azonos módon végezzük, azzal a különbséggel, hogy a X_a készítményt 25 μΐ tisztított trombinnal helyettesítjük.

Proteinek

Az I típusú proteáz és a tripszin (EC 3.4.2.1.4) a Sigma cégtől származik. A HTP-t Van Dam-Mieras és munkatársai (M.C.E. van Dem-Mieras, A.D. Muller, G. van Dieijen és H.C. Hemker, Methods of Enzymatic Analysis,

5. kötet, 352 — 365. oldal; Verlag Chemie GmbH, Weinheim, NSZK /1984/] módszerével állítjuk elő, emberi agyból. A X_a faktort protrombint és trombint citrátos marhavérből izoláljuk és tisztítjuk Rosing és munkatársai módszerével [J. Rosing, G. Trans, J.W.P, Govers -Riemslag, R.P.A. Zwaal és H.C. Hemker, J. Bioi. Chem., 255, 274—283 /1980/]. Az V faktort marhavérből állítjuk elő Lindhout és munkatársai szerint (T. Lindhout, J.G. Gosevrs - Riemslag, J. P. Waart, H.C. van de Hemker és F.Rosing, Biochemistry, 21, 4594-5502 /1982/]. Az V, faktort ügy kapjuk, Eögy az V faktort trombinnal inkubáljuk (lásd Lindhout és munkatársai idézett közleményét). A protrombin koncentráció számításánál a következő adatokat használjuk: M_r« 72.000 és A^^» 15,5 [W.G.Owen, C. T. Esmon és

C.M. Jackson, J. Bioi. Chem., 249, 594 - 605 /1974/]; az V faktor koncentrációjának számításakor pedig a következőket: M_r=» 330.000 és A^1%280- 9,6 (E.M.Nesheim, K.H.Myrmel, L.Hibbard és K.G. Mann, J. Bioi. Chem., 254, 508—517. /1979/). A X, faktor és a trombin koncentrációját az aktív helyek titrálásával (lásd Rosing és munkatársai idézett közleményét) határozzuk meg. A többi protein koncentrációját Lowry és munkatársai módszerével (lásd fent) határozzuk meg.

Foszfolipidek és foszfolipid-vezikulák előállítása

Az Ole₂Gro-P-Cho és Ole₂Gro-P-Ser készítményeket Rosing és munkatársai (lásd a fent idézett közleményben) szerint állítjuk elő. E készítményekből néhány kétrétegű vezikulát állítunk elő ultrahanggal (20:80 mólarányú Ole₂Gro-P-Cho és Ole₂Gro-P-Ser) Rosing és munkatársai szerint (lásd a fenti közleményt).

A foszfolipid koncentrációkat a Böttcher-féle (lásd a fent idézett közleményben) foszfát-analízissel határozzuk meg.

A protrombin aktiválás mérése

A protrombin aktiválás időbeli lefolyását az alvadásgátló különböző koncentrációival vizsgáljuk. A következő keveréket: (X_a, Ca^{2 +} ), (Xa, foszfolipid, Ca^{2 +} ) vagy (Xa, V_a, foszfolipid, Ca^{2 +} ) az alvadásgátló különböző mennyiségeivel keverjük 37 °C-on, 50 mM triszxHCl, 175 mM NaCl és 0,5 mg/ml humán szérum albumin tartalmú oldatban (pH = 7,9); 3 perc múlva protrombin hozzáadásával indítjuk meg a reakciót. A reakciókeverékből különböző időközönként 25 μΙ-es mintákat veszünk, amelyeket 37’Con tartott küvettákba viszünk át. A küvetták TBS-t, 2 mM EDTA-t és 0,23 mM S 2238 szubsztrátumot tartalmaznak (az összmennyiség végül 1 ml lesz). Az abszorpció változásokat 405 nm-en, Uvikon 810 spektrofotométerben mérjük, s egy standard görbe segítségével, amelyet ismert mennyiségű tisztított trombinnal vettünk fel, kiszámítjuk a különböző alvadásgátló koncentrációknál képződött trombin mennyiségét. A foszfolipidet 20:80 mólarányú Ole₂Gro-P-Ser és Ole₂Gro-P-Cho vezikulaként adjuk a reakciókeverékhez.

Jellemzők

A Sephadex G75-el végzett kromatografálás különböző frakcióit MPTT-vel vizsgáltuk és SDS-PAGE analízist is végeztünk. Az eredmények azt mulatják (lásd a 10. ábrát), hogy az alvadásgátló molekula súlya 32.000. Az antikoaguláns aktivitás és a 32K-sáv közti összefüggést úgy állapítottuk meg, hogy a poliakrilamid gélből csíkokat vágtunk, s ezekből a proteineket 0,5 mg/ml marhaszérum albumin tartalmú TBS-el oldottuk ki. Csak abban a csíkban volt antikoaguláns aktivitás, amely a 32K-sávnak felelt meg. Ezenkívül kimutattuk, hogy ez az aktivitás 56’Con termolabílis, és ugyanaz a dózis ugyanolyan hatást fejt ki az MPTT vizsgálatban, mint a kiindulási anyag. Azokat a Sephadex G75 frakciókat, amelyekben a legnagyobb volt az alvadásgátló aktivitás, egyesítettük és az alvadásgátló szer további ismertetőjegyeinek vizsgálatára használtuk fel. Ha az alvadásgátló anyagot 56 ’C-on inkubáljuk, úgy aktivitása gyorsan csökken és 2 perc múlva már nem mérhető (lásd a 16. ábrát). Az alvadásgátló teljesen elveszti aktivitását 2 órán belül, ha I típusú proteázzal inkubáljuk, ezzel

-121

HU 199883 Β szemben a tripszin 3 órás inkubációs idő alatt is alig inaktiválja az alvadásgátlót (lásd a 11. ábrát). Az ezekben a kísérletekben használt I típusú proteáz és tripszin koncentráció 15 percen belül inaktivál 2,5 nM trombint. Azok az I típusú proteáz és tripszin mennyiségek, amelyeket a reakció keverékekből az MPTT vizsgálatokba viszünk át, nem befolyásolják a kontroll alvadási időt.

Az MPTT mind az alvadásgátló anyag jelenlétében (lásd a 12. ábrát), mind a HTP-vel való aktiváláskor és az alvadásnak a X„ faktorral történő megindításakor meghosszabbodik. A trombin által indukált alvadás azonban nem gátolt.

Ezeknek a tapasztalatoknak az alapján vizsgáltuk az alvadásgátló anyag hatását a protrombinnak trombinná való átalakulására, amit X_a faktor, V_a faktor, foszfolipid és Ca^{2 +} vált ki. Az említett kísérleti feltételek mellett az alvadásgátló szer dózisától függően gátolja a trombin képződését (lásd a 13A. ábrát). Ha V= faktor nélkül, X_a faktorral, foszfolipiddel és Ca^{2 +} ionnal történik a protrombin aktiválása, ezt ugyancsak gátolja az alvadásgátló anyag (lásd a 13B. ábrát). Ez a gátlás azonban nem figyelhető meg akkor, ha az aktiválási foszfolipid nélkül végezzük (lásd a 13C. ábrát).

5. példa

VAC elleni poliklonális antitest

Marha VAC ellen nyulakban termelünk poliklonális antitesteket. A fentiekben leírt módszerrel tisztított marha VAC-t egyenlő arányban keverjük komplett Freund adjuvánssal. A keveréket a nyulaknak szubkután oltjuk be. Négy hét múlva emlékeztető oltás következik, azaz a nyulak újból kapnak tisztított marha VAC-ból szubkután oltást. Ezt a booster-oltást kétszer ismételjük 2 hetenként. Az utolsó booster-oltás utáni

10. napon a nyulakból próbavért veszünk és a vért megalvasztjuk, hogy szérumot kapjunk.

A szérumból az immunglobulinokat (lg) a következő séma szerint izoláljuk:

a) a szérumot 30 percig 56 °C-on melegítjük;

b) a szérumot ezután DEAE-Sephacel-re visszük, amelyet előzőleg 50 mM trisz és 100 mM NaCl tartalmú oldattal (pH = 8,2) ekvilibráltunk;

c) a nem kötődött proteineket ammóniumszulfáttal csapjuk ki 50%-os telítés mellett;

d) a kicsapott proteineket centrifugálással ülepítjük, az üleueket 50 mM trisz és 100 mM NaCl tartalmú oldatban (pH = 7,9) reszuszpendáljuk, majd ugyanezen pufferrel szemben gondosan kidializáljuk,

e) a kapott protein keverék az lg.

A marha aortából, marha tüdőből, patkány- és ló aortából, valamint humán köldökzsinór artériából a fent leírt eljárással izolált protein frakciók VAC aktivitást mutatnak. A proteineket poliakrilamid gélben SDS jelenlétében és nem redukáló körülmények közt elektroforézíssel választjuk el. Az elektroforézis befejezésé után a proteineket a gélből nitroeellulóz csíkokra visszük át Towbin és munkatársai szerint [H. Towbin, Th.

Staehelin, J. Gordon, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354 /1979/]. A csíkokat antiVAC-Ig-vel inkubáljuk, ezután intenzíven mossuk, majd torma-peroxidázhoz kötött kecske anti-nyúl-Ig-vel inkubáljuk. A konjugátumot diamin-benzidin-tetrahidrokloriddal (a peroxidáz szubsztrát urna) tesszük láthatóvá. Amikor az eljárást befejeztük, a nitroeellulóz csíkokon egy barna sáv mutatja a kecske anti-nyúl-Ig jelenlétét. Ezenkívül ebben a foltban anti-VAC-Ig és anti-VAC-Ig-t kötő proteinek is megtalálhatók.

A marha aortából, marha tüdőből, patkány- és ló aortából, valamint humán köldökzsinór artériából izolált, VAC aktivitású proteinek immunoblotjait a 14. ábrán mutatjuk be.

A fenti eredményekből az alábbi következtetések vonhatók le: a leírt izolálási eljárás alkalmazásával marha aortából, marha tüdőből, patkány- és ló aortából, valamint humán köldökzsinór artériából VAC aktivitású protein frakció állítható elő. Továbbá az izolált VAC aktivitású protein frakciók olyan körülbelül 32.000, 34.000 és 70.000 molekulasúylú proteineket tartalmaznak, amelyek anti-VAC-IG-vel (tisztított marha VAC ellen nyúlban termelt 1G) reagálnak.

6. példa

A VAC egy tisztítási lépése nagyvolumenfl foszfolipid-vezikula alkalmazásával

A nagyvolumenű foszfolipid-vezikulát (LVV, amely PS-ből és PC-ből áll) van de Waart és munkatársai szerint [P. van de Wart, H. Bruls, H.C.Hemker, Th. Lindhout, Biochemistry, 22, 2427-2432 /1983/] állítjuk elő. A tisztítási lépéshez a PS/PC-t (mólaránya = 20:80) tartalmazó LVV-t használjuk. Azonban más mólarányok is használhatók azzal a megszorítással, hogy negatív töltésű foszfolipideknek kell lenniük. A foszfolipidekben a zsírsav láncok hosszúsága szintén változtatható.

Eljárás:

LVV-t 1 mM foszfolipidet 5 mM triszxHCl és 100 mM NaCl (pH= 7,9) tartalmú pufferben azonos volumenű VAC aktivitást kifejtő protein frakcióval keverünk össze. A proteineket 50 mM triszxHCl, 100 mM NaCl és 10 mM CaCl₂ (pH = 7,9) tartalmú oldatban oldjuk. A keveréket 5 percig szobahőmérsékleten tartjuk, ezután 30 percig 20.000 g mellett centrifugáljuk.Az üledéket 50 mM triszxHCl, 100 mM NaCl és 10 mM CaCl₂ (pH = 7,9) tartalmú oldatban reszuszpendáljuk és megint centrifugáljuk. A kapott felülúszó tartalmazza a VAC aktivitást. A fentiekben leírt módszer a tisztított VAC előállításának egy igen eredményes tisztítási lépése.

Claims (5)

1. Eljárás véralvadásgátló proteinek előállítására, amelyek emlősökből származó erekkel erősen átszőtt szövetekből izolálhatók, a véralvadást faktorokat nem inaktiválják, a foszfolipideket nem hidrolizálják,

-131

HU 199883 Β λ Ca^{2 +} és/vagy Μη^{2 +} kétértékű kationon keresztül negatív töltésű foszfolipidekhez reverzibilisen kötődnek, képesek az X, faktort és a protrombinokat negatív töltésű foszfolipid-felületről kiszorítani, és nem gátolják az X_g és 11a faktorok biológiai és amidolitikus aktivitását, azzal jellemezve, hogy véredényfalakat, erekkel erősen átszőtt szöveteket vagy endotél-sejt tenyészeteket homogenizálunk és differenciál-centrifugálunk, majd a felülúszó folyadékot tetszőleges sorrendben egy vagy több alábbi tisztítási műveletnek vetünk alá:

. (1) só-kicsapás, (2) affinítás-kromatografálás, (3) ioncserélő kromatografálás, (4) kromatografálás molekulaszflrőn, és kívánt esetben bármely műveletben kapott anyagot dializáljuk, kívánt esetben utólagos tisztítást végzünk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az utólagos tisztítást immun-abszorpciós kromatográfiával végezzük.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az utólagos tisztítást foszfolipid vezikulák segítségével végezzük.

4. Az 1 — 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az (1) műveletnél a kicsapáshoz ammónium-szulfátot, a (2) műveletnél a kromatografáláshoz hidroxi-apatitot, a (3) műveletnél a kromatografáláshoz dietil-aminoetil-cellulózt és a (4) műveletben történő kromatografáláshoz térhálósított dextrán-gélt használunk.

5. Eljárás az 1. igénypontban meghatározott véralvadásgátló proteineket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1 - 4. igénypont bármelyike szerinti eljárással kinyert proteint a szokásos gyógyszerészeti segédanyagokkal összekeverjük.