HU194913B - Process for producing novel gonadoliberin derivatives containing in the sixth position aromatic amino carboxylic acid and medical preparations containing these compounds - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű, új

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X,-X₂-X₃-Pro-X₄ (I) — amely képletben

X, jelentése orto-amino-benzoesav- vagy meta-amino-benzoesav csoport,

X₂ jelentése leucil-, triptofil- vagy fenilalanilcsoport,

X₃ jelentése arginil-, leucil- vagy glutaminilcsoport,

X₄ jelentése glicil-amid- vagy etil-amid-csoport — nonapeptid etil-amid, illetőleg dekapeptid-ainid, valamint e vegyületek sóinak az előállítására.

A képletekben alkalmazott rövidítések megegyeznek a peptidkémiában elfogadott nomenklatúrával, amelyet például a J. Bioi. Chem. ismertet (241,527 (1966)). Ennek megfelelően a leírásban előforduló rövidítések jelentése a következő:

X Glp: piroglutaminsav	-x- (piroglutamil)
His: hisztidin	(hisztidil)
Trp: triptofán	(triptofil)
Ser: szerin	(szeril)
Tyr: tirozin	(tirozil)
Gly: glicin	(glicil)
Phe: fenil-alanin	(fenil-a 1 anil)
Leu: leucin	(leucil)
Pro: prolin	(prolii)
Glu: glutaminsav	(glutamil)
Gin: glutamin	(glutaminil)
Arg: arginin	(arginil)

Mab: m-amino-benzoesav Aa: antranilsav

Boc: terc.-butil-oxi-karbonil

Bzl: benzil

DCC: diciklohexil-karbodiimid

DCU: diciklohexil-karbamid

DIC: diizopropil-karbodiimid

DMF: dimetil-formamid

DNP: dinitro-fenil

EA: etil-amid

Et: etil

HPLC: nagynyomású folyadék-kromatográfia

Me: metil

ONP: p-nitro-fenil

OPCP: pentaklór-fenil

TEA: trietil-amin

TFA: trifluor-ecetsav

THF: tetrahidro-furán

TLC: vékonyréteg-kromatográfia

Tos: tozil

UV: ultraibolya

Z: benzil-oxi-karbonil

A gonadoliberin (Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂, a szakirodalomban ismert egyéb nevei: gonadotropin releasing hormon, GnRH, luteinizáló és follikulusz-stimuláló hormont felszabadító hormon LH/FSH-RH) és e hormon ismert származékainak általános tulajdonsága, hogy képesek a luteinizáló és a follikusz-stimuláló hormonok (LH és FSH) felszabadítására.

A 80-as évek elején vált ismertté, hogy bizonyos halakban és madarakban a gonadoliberin szerkezete eltér az emlősökben található gonadoliberin szerkezetétől (J. A. King és R. P. Millar,J. Bioi. Chem. 257, 10722-28 (1982); South-Aírican Journal of Science 78, 124 (1982); N- Sherwood et al., Proc.Natl.Acad. Sci. 80, 2794-2798 (1983)). Ezek az eltérések madarak esetében a 8. halak esetében a 7., illetve a 8. helyzetben lévő aminosavakat érintik.

Az irodalomból az is ismeretes, hogy azok a gonadoliberin-származékok, amelyek a 6-os helyzetű glicin helyett hidrofób alifás- vagy aromás oldalláncú D-aminosavakat tartalmaznak, a gonadoliberinhez viszonyítva megnövekedett hatást mutatnak (J. Sandow et al., Control of Ovulation, Butterworth, London, 1978, pp. 49-70; A. V. Schally, D. H. Coy, C. A. Meyers, Annu. Rév. Biochem. 47, 89-128 (1978)).

Ismeretes továbbá, hogy a 10-es helyzetben lévő glicin-amid csoportot alifás szénláncú amidcsoportokkal helyettesítve a gonadoliberin biológiai hatása tovább fokozható (M. Fujinoetal., J.Med. Chem. 16, 1144-1147 (1973)

Momany (F. A. Momany J. Amer. Chem. Soc. 98, 2990-2996 (1976) és J. Amer. Chem. Sqc.98,2996-3000( 1976)) a dekapeptid különböző lehetséges konformációinak energiatartalmát vizsgálva bebizonyította, hogy a legalacsonyabb energiatartalmat olyan térbeli elrendeződés képviseli, amelyben a 6-os helyzetű glicinnél vagy D-alaninnál a molekula „U alakban meghajlik (β-turn). Előállítottak olyan GnRH-származékot [(IV) képlet] (R.

M. Freidinger, D. F. Veber, P. D. Schwenk, J. R. Brooks, R. Saperstein, Science 210, 656-658 (1980)), amelyben ezt a térszerkezetet rögzítették a 6-os helyzetű glicinnek’ γ-laktámmal történő helyettesítésével. A vegyület biológiai aktivitása a natív gonadoliberinéhez viszonyítva megnövekedett.

A találmány célja olyan új gonadoliberin-származékok előállítása, amelyek az ismert vegyületeknél kedvezőbb biológiai hatékonyságot mutatnak, és emlősök mellett más fajok, pl. halak, kétéltűek stb. szaporítására is alkalmasak.

A találmány további célja olyan eljárás kidolgozása, amelynek során a 6-os helyzetű glicin helyére olyan új típusú aminosavat építünk be, amely a legelőnyösebb térszerkezet rögzítése mellett a biológiai hatást növelő aromás gyűrűt is tartalmazza, ugyanakkor a racemáció veszélye nem áll fenn.

A találmány alapja az a felismerés, hogy a fenti cél elérhető, ha a gonadoliberin 6-os helyzetű glicincsoportja helyére orto-amino-benzoesavat (antranilsav) [(V) képlet] vagy meta-amino-benzoesavat [(VI) képlet] építünk be.

A találmány további alapja az a felismerés, hogy az ilyen gonadoliberin-származékok hatása még tovább növelhető, ha a 10-es helyzetű

-2194913 glicin-amid csoportot 1-4 szénatomos alkil-amid csoportra cseréljük ki.

Végül a találmány alapja az a felismerés, hogy a gonadoliberin 8-as, vagy 7-es és 8-as helyzetű aminosavainak bizonyos aminosavakra való cseréjével olyan gonadoliberin-származékok állíthatókelő, amelyek emlősök mellett más fajok szaporítására is alkalmasak.

A lentiek alapján a találmány eljárás az (I) általános képletű

Glp-His-Trp-Sfer-Tyr-X,-X₂-X₃-Pro-X₄ (I) — amely képletben X,, X₂, X₃ és X₄ jelentése a fenti — nonapeptid etil-amid, illetve dekapeptid-amid és e vegyületek sóinak áz előállítására.

A találmány értelmében úgy járunk el, hogy

a) a lépésenkénti és a fragmens kondenzáció megfelelő kombinációt alkalmazva a védett aminosavakat kondenzáljuk, és a védőcsoportokat eltávolítjuk, vagy , b) a szilárd fázisú peptidszintézis módszerét alkalmazva valamely szilárd hordozóra a megfelelő sorrendben lépésenként kondenzáljuk a védett aminosavakat karbodiimides vagy aktív észteres kapcsolással, és a végterméket savas vagy lúgos hasítással távolítjuk el a szilárd hordozóról, és a védőcsoportokat a gyantáról való lehasítással egyidejűleg vagy azt megelőzően vagy követően távolítjuk el.

Az a) eljárás szerinti kombinációk közül az alábbi különösen előnyös:

valamely (II) képletű Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N₃ (II) pentapeptid-azidot valamely (III) általános képletű

X,-X₂-X₃-Pro-X₄ (III) — amely képletben X,, X₂, X₃ és X₄ jelentése a fenti — tetra- vagy pentapeptiddel kondenzálunk. Ab) eljárás szerinti eljárásnál szilárd hordozóként benzhidril-amin gyantát vagy klór-metilezett polisztirol gyantát célszerű használni.

A- A védőcsoportokat tartalmazó végterméket , hidrogén-fluoridos hasítással és/vagy etil-ammonolízissel előnyös eltávolítani a gyantáról. f A képződött nona-, illetve dekapeptid-amidot kívánt esetben gyógyászatilag elfogadható savval reagáltatva savaddíciós sóvá alakítjuk, vagy kívánt esetben a savaddíciós sóból bázissal reagáltatva felszabadítjuk a szabad bázist.

A találmány tárgya továbbá eljárás az (I) általános képletű vegyületek átalakítására gyógyászati és/vagy szaporodásbiológiai célokra alkalmas kompozíciókká. Ezt az eljárást úgy végezzük, hogy valamely (I) általános képletű vegyületet vagy annak savaddíciós sóját a szokásos hordozó és/vagy vívőanyagokkal összekeverve gyógyászati és/vagy szaporodásbiológiai célokra alkalmas készítménnyé alakítjuk.

Az (I) általános képletű gonadoliberin-származékok szarvasmarhák esetén intra4 muszkuláris, szubkután vagy intravénás injekcióban 5-200 pg dózistartományban, halak esetében 0,1-100 pg dózistartományban hatékonyak intramuszkuláris vagy szubkután injekcióval adagolva.

A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg.

A vékonyréteg kromatográfiás (TLC) R/ értékeket Kieselgel (DC Alufolien, Merck) lemezeken az alábbi oldószerelegyekben határoztuk meg:

1. Etilacetát-piridin-ecetsav-víz 30:20:6:11

2. Etilacetát-piridin-ecetsav-víz 60:20:6:11

3. Etilacetát-piridin-ecetsav-víz 120:20:6:11

4. Etilacetát-piridin-ecetsav-víz 240:20:6:11

5. n-Butanol-ecetsav-víz-etilacetát 1: 1:1: 1

6. n-Butanol-ecetsav-víz 4:1:1

7. i-Propanol-1 mólos ecetsav 2:1

8. Etilacetát-piridin-ecetsav-víz 5: 5:1: 3

9. Aceíon-toluol 1:1

10. Kloroform-ecetsav 24:2

11. Metil-etilketon-piridin-víz 65:15:20

12. Kloroform-metanol-ecetsav 85:10:5

13. n-Butanol-jégecet-ammónia (1 térfogat tömény ammóniumhidroxid -j- 4 térfogat v í z)-v í z 6:1:1:2

1. példa [Aa⁶, Gin⁸, desGly¹⁰]-gonadoliberin etil-amid előállítása

a) Boc-His(DNP)-Trp-OMe

Molekulasúly: 622,62

21,12 g (50 mmol) Boc-His(DNP)-OH-t feloldunk 100 ml dimetil-formamidban, majd 0°C-ra hűtjük. Keverés közben hozzáadunk 10,32 g (50 mmol) diciklohexil-karbodiimidet és 7,66 g (50 mmol) N-hidroxi-benztriazolt. Az elegyet 10 percig 0°C-on keverjük, majd a kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük.

12,74 g (50 mmol) H-Trp-OMe.HCl-ot feloldunk 70 ml dimetil-formamidban, és az oldatot 0°C-ra hűtjük. Hozzáadunk 6,94 ml (50 mmol) trietil-amint, majd 5 perc keverés után trietil-amin-hidrokloridot kiszűrjük.

A két oldatot egyesítjük, és éjszakán át 0°C-on keverjük. Másnap a kivált DCU-t kiszűrjük, és az oldatot szárazra bepároljuk. A kapott olajat 500 ml etil-acetátban feloldjuk, és háromszor 100 ml jéghideg 1 mol-os kálium-hidrogén-szulfát oldattal, majd ötször 100 ml telített nátrium-hidrogén-karbonát oldattal, végül kétszer 100 ml 10%-os nátrium-klorid oldattal kirázzuk. A szerves fázist vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, szűrjük és szárazra bepároljuk. A kapott olajos anyagot petroléterrel elporítjuk, szűrjük és szárítjuk. Az így kapott kristályos anyag, etil-acetátból petroléterrel átkristályosítható, termelés: 27,70 g (89%)

Op.;l 19-122°C [<x]2²=-H4,1° (c=l, DMF)

Rf=0,62; R⁶=0,41

b) H-His(DNP)-Trp-0Me.2HCI

Molekulasúly: 522,49 (szabad bázis);

595,41 (.2HC1)

24,9 g (40mmol) Boc-His (DNP)-Trp-OMe dipeptidet feloldunk 100 ml metanolban, és hozzáadunk 100 ml 4 n metanolos sósav-oldatot. Az elegyet 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, mialatt a dipeptidészter-hidroklorid kikristályosodik. Ezt kiszűrjük, éterrel mossuk és szárítjuk.

Termelés: 21,91 g (92%)

Op.: 198-202°C [a]0=0,49° ,(c= 1, DMF)

R|=0,46; RJ 0,18

c) Glp-His-(DNP)-Trip-OMe

Molekulasúly: 633,60

4,85 g (36,8 mmol) L-piroglutaminsavat,

7,58 g diciklohexil-karbodiimidet és 5,63 g N-hidroxi-benztriazolt feloldunk 100 ml dimetil-formamidban. Az elegyet 10 percig 5-10°C-on keverjük, majd a kivált DCU-t kiszűrjük.

20.84 g (35 mmol) H-His(DNP)-Trp-OMe. 2HCI-t feloldunk 100 ml dimetil-formamidban, és az oldathoz hozzáadunk 9,72 ml (70 mmol) trietil-amint. 5 perc keverés után a kivált trietil-amin-hidrokloridot kiszűrjük. A két oldatot egyesítjük,és éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük. Másnap az elegyhez 90 ml acetont adunk, és a kiváló oldhatatlan anyagot kiszűrjük. Az oldat bepárlásával olajos anyagot kapunk; ezt etil-acetáttal eldörzsöljük, szűrjük, majd szárítjuk. A száraz kristályos anyagot háromszor 25 ml vízzel mossuk és ismét szárítjuk. Az anyag etil-acetátból forrón oldva, majd lehűtve átkristályosítható.

Termelés: 18,42 g (83,1%)

Op. I48-151°C [<z]²³=+5,2° (c=l, DMF)

R3=0,53; Rf=0,38

d) GIp-His-Trp-OMe

Molekulasúly: 466,50

15.84 g (25 mmol) Glp-His(DNP)-Trp-OMe védett tripeptidet feloldunk 100 ml dimetil-formamid és 40 ml víz elegyében. Hozzáadunk 4 ml merkapto-etanolt, majd az oldat pH-ját trietil-aminnal 8-ra állítjuk. 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd vákuumban szárazra pároljuk. Az olajos anyagot éterrel eldörzsöljük, szűrjük és szárítjuk, A kapott anyagot kevés metanolban oldjuk, és éter hozzáadásával átkristályosítjuk. A kivált kristályokat szűrjük, majd szárítjuk. Termelés: 10,92 g (93,6%)

Op. 228-232°C [a] ²²=+4,04° (c=0,42, DMF)

Rf=0,30

e) Glp-His-Trp-N₂H₃

Molekulasúly: 466,51

9,33 g (20 mmol) Glp-His-Trp-OMe tripeptidet feloldunk 250 ml metanolban. Hozzáadunk 20 ml 98%-os hidrazin-hidrátot. A reakcióelegyet 3 órán át 40°C-on, majd éjszakán át 4 szobahőmérsékleten keverjük. Másnap a kivált anyagot szűrjük, majd hideg metanollal mossuk és szárítjuk.

Termelés: 7,58 g (81,2%)

Op. 166-169°C [ct]²D²=- 22,3° (c=0,5, DMF)

Rj=0,50; R|=0,14

f) GIp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe

Molekulasúly: 716,8

7,0 g (15 mmol) Glp-His-Trp-N₂H₃-ot (a példa e) lépésének terméke) feloldunk 60 ml DMF-ben. Az oldatot 0°C-ra hűtjük, majd keverés közben hozzáadunk 7,5 ml (45 mmol) 6 n sósav oldatot. Ezután lassan az elegybe csepegtetjük 1,035 g (15 mmol) nátrium-nitrit tömény vizes oldatát, és további 15 percig 0°Con keverjük, majd a reakcióelegyhez adjuk

4,78 g (15 mmol) H-Ser-Tyr-OMe.HCl 15 ml DMF-ben készült oldatát. 6,25 ml (45 mmol) trietil-aminnal) az elegy pH-ját semlegesre állítjuk. Az elegyet éjszakán át 0-4°C-on keverjük, másnap vákuumban szárazra pároljuk, és az olajos anyagot éterrel eldörzsöljük.

A kapott porított anyag súlya 12,1 g (100%); két kismennyiségű, szennyező foltot tartalmaz, azonban tisztítás nélkül hidraziddá alakítható, amely jól kristályosodik.

Metanolból átkristályosított ellenőrző anyag fizikai állandói:

Op. 188-190°C [a]J²= -3,48° (c=l, DMF)

Rf=0,58; Rj=0,26

g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N₂H₃

Molekulasúly: 716,8 g nyers, porított ólp-His-Trp-Ser-TyrOMe pentapeptid-észtert feloldunk 200 ml metanolban, hozzáadunk 10 ml 98%-os hidrazin-hidrátot, és az elegyet 3 órán át 40°C-on keverjük. Az elegyet éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, majd a kivált kristályokat kiszűrjük, és exszikkátorban tömény kénsav fölött szárítjuk. A szárított,kristályos anyagot 250 ml 0,5 n sósavoldatban oldjuk, majd telített nátrium-karbonát oldattal pH 8-ra semlegesítjük, és 2 órán át 0°C-on állni hagyjuk. A kivált kristályokat szűrjük, jéghideg vízzel mossuk és szárítjuk.

Termelés: 6,12 g (a két lépésre vonatkoztatva 56,9%)

Op. 205-206°C [a]²²=21,51° (c=l, DMF)

Rf=0,39; R|=0,14

Hidrazin-nitrogén: talált: 3,79%, 3,76% elméleti: 3,91%

h) H-GIn-Pro-NHEt.TFA

Molekulasúly: 367,3 (Boc: 370,49) g (70mmól)prolin-etil-amidot(72mmól) Z-Pro-NHEt-ből hidrogénezéssel) feloldunk 100 ml dimetil-formamidban, és a pH-t trietil-aminnal 8-ra állítjuk. Ezután keverés közben hozzáadjuk 32 g (87 mmol) Boc-Gln-ONP 100 ml dimetil-formamidban készült oldatát.

-4194913

A visszamaradó olajat 50 ml 30%-os TFA diklór-metánban készült oldatába feloldjuk és 20 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezt követően az oldatot vákuumban bepároljuk, a visszamaradó olajat éterrel eldörzsöljük. A szilárd anyagot a szűrön éterrel mossuk, majd vákuumban szárítjuk.

Termelés: 15,9 g (62%)

Op. Nem mérhető (erősen higroszkópos anyag) [<%]b°= -44,4° (c=I, metanol)

Rj=0,32; R_t ⁷=0,37; R'₊ ³==0,21

i) Z-Leu-GIn-Pro-NHEt

Molekulasúly: 518,57 g (26 mmol) H-Gln-Pro-NHEt.TFA-ot feloldunk 50 ml dimetil-formamidban, és az oldatot 0°C-ra hűtjük. Az oldat pH-ját trietil-aminnal 8-ra állítjuk, majd hozzáadjuk 14 g (27,3 mmol) Z-Leu-pentaklór-íenilészter 40 ml dimetil-formamidban készült oldatát, és éjszakán át 4-4°C-on keverjük. Másnap a reakcióelegyet vákuumban bepároljuk, és a maradékot feloldjuk 70 ml etil-acetátban. Az oldatot háromszor 15 ml hideg 0,01 n nátrium-hidroxiddal, majd háromszor 15 ml vízzel extraháljuk. A nátrium-hidroxidos és vizes extraktumokat egyesítjük és kétszer 10 ml etil-acetáttal kirázzuk. Az etil-acetátos fázisokat egyesítjük, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A maradékot éterrel eldörzsöljük, a szilárd anyagot szűrjük, éterrel mossuk és vákuumban szárítjuk. Termelés: 10,4 g (77%)

Op. 84-88°C [α]ρ^θ==-32,8° (c=l, metanol)

Rf=0,90

j) H-Leu-GIn-Pro-NHEt.HBr

Molekulasúly: 465,5

7,6 g (14,6 mmol) Z-Leu-Gln-Pro-NHEt-ot feloldunk 50 ml jégecetben, hozzáadunk 70 ml 4 n jégecetes hidrogén-bromidot, és az elegyet 90 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután az elegyet keverés közben, lassan 800 ml jéghideg éterbe öntjük. 30 perc elteltével a keverést megszüntetjük, majd a kiülepedett csapadékot szűrjük. A szilárd anyagot exszikkátorban foszfor-pentoxid fölött szárítjuk.

Termelés: 7,9 g

Op. 147°C [a]²⁰= -72,8° (c=l, 2 n ecetsav)

R₄=0,30; RV=0,82

k) Boc-antranilsav

Molekulasúly: 237,27 g (30 mmol) antranilsavat feloldunk 20 ml dimetil-íormamidban, és a pH-t trietil-aminnal 8-ra állítjuk. Ezután hozzáadunk 9 g terc.-butiloxi-karbonátot, és a reakcióelegyet másnapig szobahőmérsékleten keverjük. Az oldószert bepároljuk, a visszamaradó, sűrű olajat feloldjuk 50 ml etil-acetátban. A szerves fázist háromszor 20 ml jéghideg 0,01 n kénsavval,' majd háromszor 20 ml vízzel mossuk. Az etil-acetátos oldatot nátrium-szulfá8 ion szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A visszamaradó, sűrű olaj jégszekrényben kristályosodik.

Termelés: 5,7 g (80%)

Op. 91-93°C

R|=0,87; Rj°=0,79

l) Boc-Aa-Leu-GIn-Pro-NHEt

Molekulasúly: 603,85

2,3 g (5 mmol) H-Leu-Gln-Pro-NHEt-hidrogén-bromid sót feloldunk 10 ml DMF-ban, 0°C-ra hűtjük, és az oldat pH-ját TEA-nal 8-ra állítjuk. Ezután az oldathoz adunk 750 mg (5,5 mmol) N-hidroxi-benztriazolt és 1,1 g (5,5 mmol) DCC-t. Ezt követően lassan az oldathoz csepegtetjük 1,3 g (5,5 mmol) Boc-antranilsav 5 ml DMF-ban készült oldatát, majd a reakcióelegyet 48 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A kivált DCU-t kiszűrjük, majd az oldatot vákuumban bepároljuk. A maradékot feloldjuk 50 ml etil-acetátban, és háromszor 20 ml 10%-os citromsavval, háromszor 20 ml vízzel, háromszor 20 ml telített nátrium-hidrogén-karbonáttal, végül 20 ml telített nátrium-kloriddal kirázzuk. Az etil-acetátos fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. Az olajos maradékot éterrel eldörzsöljük, a kivált halványsárga, porszerű anyagot szűrjük, éterrel mossuk. Termelés: 2,4 g (80%)

Op. 119-12UC

R$=0,91

Aminosav-analízis: Gin 0,97; Pro 1,03; Leu 1,00; Aa 0,92

m) H-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt.TFA

Molekulasúly: 599,63 603 mg (1 mmol) Boc-Aa-Leu-Gln-Pro-etil-amidot oldunk 10 ml 30% -os trifluor-ecetsav diklór-metán a készült oldatában, majd szobahőmérsékleten keverjük 20 percen át. A TFA-t vákuumban gyorsan eltávolítjuk, majd a maradékot éterrel elporítjuk és szárítjuk.

Termelés: 515 mg (86%)

R|=0,52

n) GIp-His-Trp-Ser-Tyr-Aa-Leu-GIn-Pro-NHEt-acetát

Molekulasúly: 1188,48 358 mg (0,5 mmol) a példa g) lépésében előállított Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N₂H₃ pentapeptidet oldunk 10 ml dimetil-formamidban, 0^cC-ra hűtjük, és keverés közben 0,34 ml 6 n sósavat, majd 37,7 mg nátrium-nitrit tömény vizes oldatát csepegtetjük hozzá. 5 perc elteltével hozzáadjuk 230 mg (0,5 mmol) H-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt.TFA tetrapeptid 1 ml dimetil-formamidban 0,34 ml trietil-amin jelenlétében készült 0°C-os oldatát. A reakcióelegyet szükség esetén TEA-nal semlegesre állítjuk, 2 órán át 0°C-on keverjük, majd hagyjuk szobahőmérsékletre felmelegedni. A dimetil-formamidot vákuumban eltávolítjuk, a maradékot Sephadex G-25 oszlopon (2X95cm) 0,2 n ecetsavoldatban kromatografáljuk. Az

-51949!3 elválást 280 nm-nél mért UV elnyeléssel és TLC-va-1 követjük. A megfelelő frakciókat öszszegyüjtjük és liofilízáljuk.

R|=0,58; RÍ=0,83;	R|=	=0,72
Aminosav-analízis:	Ser	0,91;	Gin	2,03;
	Pro	0,95;	Leu	1,00;
	Tyr	1,10;	His	1,02;
	Trp	0,81;	Aa	0,95

2. példa [Aa⁶, desGly¹⁰]-gonadoliberin etil-amid előállítása

a) Z-Arg(NO₂)-Pro-NHEt-acetát

Molekulasúly: 465,47

3,24 g (22,8 mmol) prolin-etil-amidot feloldunk 70 ml tetrahidrofuránban. Az oldathoz adunk 7,33 g (20,7 mmol) Z-Arg(NO₂)-OH-t és 1,034 g N-hidroxi-benztriazolt. A reakcióelegyet jeges vízfürdőben hütjük, és keverés közben 5,34 g (25,9 mmol) diciklohexil-karbodiimid 50 ml tetrahidrofuránban készült oldatát adagoljuk hozzá. A reakcióelegyet jéghűtés mellett 5 órán át, m&jd további 20 órán át szobahőmérsékleten keverjük, ezután szűrjük és tetrahidrofuránnal mossuk. A szűrletet vákuumban bepároljuk, a maradékot kloroformban feloldjuk. A kloroformos oldatot háromszor 35 ml 1:5 arányú ammónium-hidroxid — víz eleggyel, kétszer 20 ml vízzel, majd háromszor 35 ml n sósav oldattal, végül kétszer 20 ml vízzel extraháljuk. A kloroformos részt vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük, kloroformmal mossuk, majd a kloroformos oldatot bepároljuk. A viszszamaradó anyagot 35 ml THF és 50 ml etilacetát elegyében oldjuk, szűrjük, és 30 ml 1:2 arányú THF-etil-acetát eleggyel mossuk. Az oldat bepárlása után a visszamaradó,szilárd habhoz 100 ml dietil-étert adunk. Szűrjük, éterrel mossuk és vákuumban szárítjuk. Termelés: 9,69 g (98%)

OP. 125°C [a]²⁰= -42,5° (c=l, metanol)

R|=0,5; R^=0,72

b) Z-Leu-Arg(N0₂)-Pro-NHEt

Molekulasúly: 578,65

5,6 g (11,73 mmol) Z-Arg(NO₂)-Pro-NHEt védett dipeptid-etil-amidot feloldunk 30 ml jégecetben. Az oldathoz 55 ml 4 n jégecetes hidrogén-bromid oldatot adunk. A reakcióelegyet másfél órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az oldathoz 250 ml absz. étert adunk, majd az elegyet 1 órán át állni hagyjuk. A kivált anyagról a felülúszót dekantáljuk, és a maradékot 100 ml étert adunk. 15 perc állás után szűrjük, és éterrel bőven mossuk. A hidroszkópos, szilárd anyagot vákuumban foszfor-pentoxid és nátrium-hidroxid jelenlétében szárított. A kissé hígroszkópos anyag súlya: 6,44 g.

A fenti dipeptid-etil-amid-hidrogén-bromidból 6,04 g-ot (11,0 mmol) szuszpendálunk 150 ml kloroformban. A szuszpenzióhoz 5,5 ml trietil-amint adunk. A szuszpenzió lassan oldódik, a teljes feloldódás érdekében további 6

2,5 ml TEA-t adunk hozzá. Ezután 6,4 g Z-Leu-OPCP 65 ml kloroformban készült oldatát csurgatjuk a reakcióelegybe, és éjszakán át keverjük. A reakcióelegyet 1 n sósav-oldattal, telített nátrium-klorid oldattal, majd 2 n ammónium-hidroxid oldattal, végül ismét telített nátrium-klorid oldattal extraháljuk. A kloroformos oldatot vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A maradékot éterrel eldolgozzuk. A szilárd anyagot szűrjük, éterrel mossuk és vákuumban szárítjuk. A nyerstermék súlya: 5,5 g (84,6%)

A fenti védett tripeptid-etil-amidot 30 ml etil-acetátban enyhe melegítéssel feloldjuk. Aktív szénnel derítjük, kétszer 10 ml etil-acetáttal átmossuk. A szűrlethez részletekben 75 ml dietil-étert adunk. A kiváló, olajos anyag gyorsan megszilárdul. Mintegy 2 óra állás után szűrjük, etil-acetát és éter (2:3) elegygyel, majd éterrel mossuk, és vákuumban szárítjuk.

Termelés: 4,7 g (74,3%)

Op. 116-118°C [α]ρ^θ=57,0° (c=l, metanol)

R,³=0,74; Rf=0,49

c) H-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NHEt.HBr

Molekulasúly: 537,4

1,18 g (2 mmol) Z-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NHEt tripeptidet oldunk 10 ml jégecetes hidrogén-bromid oldatban, majd 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. 100 ml vízmentes éterrel elporítjuk, szűrjük, majd a gyengén sárga, porszerű anyagot exszikkátorban szárítjuk. Halványsárga, hígroszkópos anyagot kapunk, amelynek súlya: 1,30 g.

RM-·⁴

d) Boc-Aa-OPFP

Molekulasúly: 403,32

2,4 g (10 mmol) Boc-antranilsavat feloldunk 20 ml THF-ban, és 0°C-ra hűtjük. Ezután keverés közben hozzáadunk 2,2 g (11 mmol) DCC-t és 2,0 g pentafluorfenolt 10 ml THFban oldva. A reakcióelegyet 3 órán át 0°C-on, majd szobahőmérsékleten másnapig keverjük. Az oldatot szűrjük, a maradékot 30 ml etil-acetátban oldjuk, és háromszor 10 ml jéghideg 10%-os citromsavval, majd háromszor 10 ml hideg vízzel, háromszor 10 ml telített nátrium-hidrogén-karbonáttal, végül háromszor 10 ml vízzel mossuk. Az etil-acetátos fázist vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük, vákuumban bepároljuk. A visszamaradó olaj +4°C-on kristályosodik.

Termelés: 3,06 g (76%)

R®=0,90; Rf°=0,85

e) Boc-Aa-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NHEt

Molekulasúly: 675,75

1,07 g (2 mmol) H-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NHEt.HBr tripeptid sót oldunk 5 ml dimetil-formamidban, és 0°C-ra hűtjük. Hozzáadjuk 0,28 ml (2 mmol) trietil-amin és 806 mg (2 mmol) Boc-Aa-OPFP 5 ml dimetil-formamidos oldatát. Az oldat pH-ját ezután TEA-6194913 nal 8-ra állítjuk, az oldatot hagyjuk felmelegedni, majd 20°C-on 48 órán át keverjük, miközben pH-ját TEA-nal 8 körüli értéken tartjuk. A dimetil-formamidot vákuumban eltávolítjuk, a maradékot 50 ml etil-acetátban oldjuk, és háromszor 20 ml 10%-os citromsavval, háromszor 20 ml vízzel, háromszor 20 ml telített nátrium-hidrogén-karbonáttal, végül 20 ml telített nátrium-kloriddal mossuk. Az etil-acetátos fázist vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük, és vákuumban bepároljuk. A visszamaradó olajat éterrel eldörzsöljük, a szilárd anyagot szűrjük.

Termelés: 1,05 g (77,8%)

Rj=0,90; R?=0,91; R'_f°=0,96

f) Boc-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt

Molekulasúly: 630,74 1,0 g (1,5 mmol) Boc-Aa-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NHEt tetrapeptidet oldunk 50 ml 50%-os ecetsavban, és 400 mg.10%-os palládiumos csontszén katalizátor jelenlétében hidrogénezzük 4 órán keresztül. A katalizátort kiszűrjük, az oldatot bepároljuk, és a maradékot éterrel eldörzsöljük.

Termelés:. 779 mg (82,5%)

R|=0,45

g) H-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt.(TFA)₂

Molekulasúly: 724,67 630 mg (1 mmol) Boc-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt tetrapeptidet oldunk 5 ml triíluor-ecetsavban, majd szobahőmérsékleten 20 percig keverjük. A TFA-t vákuumban gyorsan eltávolítjuk, majd a maradékot éterrel elporítjuk, szűrjük és szárítjuk.

Termelés: 648,5 mg (89,5%)

R|=0,34; R|=0,76

h) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt.CH₃COOH

Molekulasúly: 1276,54 358 mg (0,5 mmol) az 1. példa g) lépésében előállított Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N₂H₃ pentapeptidet oldunk 10 ml dimetil-formamidban, -10°C-ra hűtjük, és keverés közben 0,34 ml 6 n sósavat, majd 37,7 mg nátrium-nitrit tömény,vizes oldatát csepegtetjük hozzá 5 perc elteltével hozzáadjuk 362,3 mg (0,5 mmol) H-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt. (TFA)₂ tetrapeptid 1 ml dimetil-formamidban, 0,34 ml trietil-amin jelenlétében, készült -10°C-os oldatát. A reakcióelegyet 1 órán át -5°C-on, 1 órán át 0°C-pn keverjük, majd hagyjuk szobahőmérsékletre felmelegedni. A dimetil-formamidot vákuufriban eltávolítjuk, a maradékot Sephadex G-25 oszlopon (2 X 95 cm) 0,2 n ecetsav oldatban kromatografáljuk. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. Termelés: 365,7 mg (57,3%)

R|-0,65; R®=0,49; R?=0,69

Aminosav-analizis: Ser 0,87; Glu 0,99;

Pro 1,02;

Leu 1,00; Tyr 0,97;

His 1,03;

Trp 0,82; Aa 0,91;

Arg 1,01

3. példa [Mab⁶] -gonadoliberin előállítása

a) Boc-meta-amino-benzoesav (Boc-Mab) Molekulasúly: 237,25

1,0 g (7,5 mmol) m-amino-benzoesavat feloldunk 10 ml dimetil-formamidban, az oldat pH-ját trietil-aminnal 8-ra állítjuk, majd hozzáadunk 2,5 g terc.-butiloxi-karbonátot. Szobahőmérsékleten egy napig keverjük. A reakcióelegyet az 1. példa k) lépésében ismertetett eljárás szerint dolgozunk fel.

Termelés: 1,4 g (80,9%)

Op. 92°C

R'°=0,88; R;^o=O,84

b) Boc-Mab-Leu-Arg(N0₂)-Pro-Gly-NH₂

Molekulasúly: 704,78

1,5 g (2,5 mmol) H-Leu-Arg(NO₂)-Pro-Gly-NH₂-trifluor-acetát sót (N. Yanaihara et al., J. Med. Chem. 16, 373 1973)) oldunk 10 ml dimetil-formamidban, 0°C-ra hűtjük, és az oldat pH-ját TEA-nal 8-ra állítjuk. Ezután az oldathoz adunk 383 mg (2,5 mmol) N-hidroxi-benztriazolt és 515 mg (2,5 mmol) DCC-t. Ezt követően lassan az oldathoz csepegtetjük 593 mg (2,5 mmol) Boc-Mab 3 ml DMFban készült oldatát. A reakcióelegyet 48 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd a kivált DCU-t kiszűrjük és az oldatot vákuumban bepároljuk. A visszamaradó olajat feloldjuk 30 ml etil-acetátban, és háromszor 10 ml 10%os citromsavval, háromszor 10 ml vízzel, háromszor 10 ml telített nátrium-hidrogén-karbonáttal, végül 10 ml telített nátrium-kloriddal mossuk. Az etil-acetátos fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. Az olajos maradékot éterrel eldörzsöljük, a kivált fehér kristályos anyagot szűrjük, éterrel mossuk:

Termelés: 1,2 g (68%)

Op. 132-133°C

R°=0,43

c) Boc-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂

Molekulasúly: 659,78

1,0 g (1,5 mmol) Boc-Mab-Leu-Arg(NO₂)-Pro-Gly-NH₂ pentapeptidről a 2. példa f) lépésben leírtakkal megegyező módon távolítjuk el a védőcsoportot.

Termelés: 775 mg (78,3%)

R²=0,52

d) H-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂.(TFA₂)

Molekulasúly: 753,72

670 mg (1 mmol) Boc-Mab-Leu-Arg-ProGly-NH₂ pentapeptid-amidot feloldunk 5 ml trifluor-ecetsavban, majd szobahőmérsékleten 20 percig keverjük. A TFA-t vákuumban eltávolítjuk, a visszamaradó olajat éterrel elporítjuk, szűrjük és szárítjuk.

Termelés: 689 mg (91,5%)

R}=0,50; R^=0,53; Rj=0,42

e) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Mab-Leu-Arg-Pro -Gly-NH₂

Molekulasúly: 1244,39

358 mg (0,5 mmol) az 1. példa g) lépésé7

-7194913 ben előállított Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N₂H₃ pentapeptidet feloldunk 10 ml dimetil-formamidban, és az oldatot -10°C-ra hűtjük. Ezután keverés közben hozzáadunk 0,34 ml 6 n sósavat, majd 37,7 mg nátrium-nitrit tömény vizes oldatát csepegtetjük hozzá. 5 perc elteltével hozzáadjuk 377 mg (0,5 mmól) H-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂(TFA)₂ pentapeptid 1 ml dimetil-formamidban készült -10°C-os oldatát. A reakcióelegyet 2 órán át 0°C-on keverjük, majd hagyjuk szobahőmérsékletre felmelegedni. Másnap vákuumban bepároljuk. A visszamaradt, nyers dekapeptidet Sephadex G-25 oszlopon (2 X 95 cm) megoszlási kromatográfiával butanol : propanol : ecetsav : víz (15:1: :4:20) elegyében tisztítjuk. A frakciók anyagtartalmát vékonyréteg-kromatográfiával, illetve UV abszorpció mérésével vizsgáljuk. A dekapeptidet tartalmazó frakciót liofilizáljuk, majd ezt a műveletet híg ecetsavból megismételjük.

Termelés: 323 mg (52%)

R^=0,31; Rj=0,49; R⁸=0,62

Aminosav-analízis: Ser 0,91; Glu 1,03;

Pro 0,97; Gly 1,10;

Leu 1,00; Tyr 0,97;

His 1,05; Trp 0,87;

Mab 0,90; Arg 1,11

4. példa [Aa⁶]-gonadoliberin előállítása Molekulasúly: 1244,39 a) Szintézis

A vegyületet a szilárdfázisú peptidszintézis általánosan alkalmazott módszerével (Merrifield, R.B., J.Am. Chem. Soc.85,2149-2151 (1963)) állítjuk elő.

0,75 g (0,3 mmol) benzhidrilamint.HCl gyantát (0,4 mmol/g, Pierce) 2 órán át duzzasztunk diklór-metánban, majd az aminosavakkal történő acilezés során a következő ciklust ismételjük:

Lépés Reagens, művelet Keverési idő (perc)

1. CH₂C1₂, mosás háromszor 1

2. 33% TFA és 67% CH₂CI₂ elegye 1

3. 33% TFA és 67% CH₂CI₂ elegye 25

4. CH₂C1₂, mosás háromszor I

5. CHC1₃, mosás kétszer 1

6. 10% TEA és 90% CHC1₃ elegye, mosás kétszer 2

7. CHC1₃, mosás kétszer 1

8. Etanol, mosás kétszer l

9. CH₂C1₂, mosás kétszer 1

10. 3 ekv. Boc-áminosav

CH₂C1₂-DMF 60 - változó elegyében oldva, 3 ekv.

DCC v. DIC CH₂CI₂-ben oldva

11. CH₂C1₂, mosás kétszer 1

12. Etanol, mosás kétszer 1

Minden lépés után ninhi-drintesztet végzünk (Kaiser, E. et al., Anal. Biochem. 34, 5958

-598 (1970)), amennyiben szabad aminocsoportot mutatunk ki, a ciklust az 5. sortól megismételjük. Az utolsó lépés után a Glp-His(Tos) -Trp-Ser(oBzl)-Tyr (oBzl) -Aa-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly peptidgyanta súlya: Termelés: (AW): 344 mg (65%) (M védett peptid: 1764,92)

b) Hidrogén-fluoridos hasítás

A védőcsoportok eltávolítását és a peptid lehasítását a gyantáról egy lépésben végezzük, folyékony vízmentes hidrogén-fluoriddal (Sakakibara, S. et al., Bull. Soc. Japan 40, 2164-2167 (1967)). Az előző lépésben nyert peptidgyantához 5 ml anizolt, 100 mg ditiotreitet adunk, majd 20 ml HF-ot kondenzálunk az elegyhez, és 0°C-on keverjük 1 órán át. Ezt követően a HF-ot N₂-áram segítségével eltávolítjuk, a maradékot abszolút éterben szuszpendáljuk, majd szűrjük. A szilárd maradékot 50%-os ecetsavval mossuk, és a szűrletet 37°C on bepároljuk. Az így kapott dekapeptid.HFsót (371 mg) közvetlenül gélkromatográfiálak vetjük alá.

c) Gélkromatográfia

Az előző pontban kapott anyag tisztítását Sephadex G-25 oszlopon (2,5 X 100 cm) végezzük, eluensként 20%-os ecetsavat alkalmazva. Az elválást 280 nm-nél mért UV-elnyeléssel és TLC-val követjük. A dekapeptidnek megfelelő frakciókat gyűjtjük és liofilizáljuk.

Termelés: 202 mg (54%)

d) Preparatív HPLC

Ci₈-szilikagél LRP-1 (13-24 pm) (Whatman) preparatív HPLC oszlopot (2,5 X 45 cm) alkalmazunk. Az egyensúly kialakítását 15% metanol és 85% 20%-os ecetsav keverékével végezzük. Az egyensúly beállta után ebben az elegyben oldva visszük fel 202 mg gélkromatográíiával tisztított anyagot. Az elúciót először 15% metanol — 85% 20%-os ecetsav és 25% metanol — 75% 20%-os ecetsav lineáris gradiensével végezzük, majd 40%-os metanol — 60% 20%-os ecetsavval folytatjuk, végül 80% metanol — 20% 20%-os ecetsavval fejezzük be. A folyássebesség 2 ml/perc, nyomás 3,5X10⁵-Pa. A frakciókat 280 nm-nél detektáljuk, tartalmukat TLC-val ellenőrizzük. A végtermékként kapott tiszta [Aa⁶] -gonadoliberin súlya liofilizálás után 123 mg (61,0%). Op. 185-192°C [a]²⁰= -63,2° (c=l, 0,1 n ecetsav)

Rj=0,17

Aminosav-analízis: Ser 0,92; Glu 1,03;

Pro 1,1; Gly 0,97;

Leu 1,00; Tyr 0,95;

His 1,08; Trp 0,83;

Aa 0,90; Arg 1,05

5.-6. példa

A 4. példában ismertetett eljárást alkalmazva állítjuk elő a következő vegyületeket:

-8194913

A példa r| Tersorszáma A vegyület neve melés

5. [Aa⁶, Trp⁷, Leu*] -gonadoliberin 0,57 35%

6. [Mab*, Phe⁷, Gln^J-gonadoliberin 0,63 43%

Az 5.-6. példák szerinti vegyületek aminosavanalízisét az alábbi táblázatban adjuk meg;

A példa Ser Glu Pro Gly Leu Tyr Phe His Trp Aa/Mab sorszáma

5. 0,91 1,02 0,97 1,00 0,98 1,03 - 0,93 1,82 0,90

6. 0,93 2,02 1,12 1,00 - 0,97 1,07 0,95 0,87 0,89

7. példa

Injekció elkészítése intramuszkuláris, szubkután vagy intravénás beadás céljára:

a) Az (I) általános képletű gonadoliberin-származékot 1-10 mg/ml töménységben desz- 25 til Iáit vízben, fiziológiás sóoldatban vagy pufferolt vizes oldatban oldjuk. Az oldatot sterilre szűrjük, majd 50-500 pg anyagot tartalmazó térfogatokat ampullákba töltünk, liofilizálunk, és végül az ampullákat lezárjuk,

Az ampullák anyagtartalmát kezelés előtt

1-10 ml desztillált víz hozzáadásával frissen oldjuk, és a szükséges dózisnak megfelelő térfogatokat injektáljuk.

b) Az (I) általános képletű gonadoliberin- 35 -származékot 20-500 pg/ml töménységben tartalmazó, megfelelő fiziológiás sóoldatot, illetőleg benzilalkoholt ampullákba töltjük, és az ampullákat lezárjuk. Az így kapott oldatok közvetlenül alkalmasak injektálásra. 40

8. példa

Follikulus stimuláció megvalósítása infantilis nőstény patkányokon 40 db 21 életnapos, 7-8 g súlyú infantilis ₄₅ nőstény patkányt fiziológiás sóoldatban oldott antranilsav(6)GnRH analóggal kezeltünk intraperitoneálisan. A 3-5 napig tartó kezeléssorozat alatt naponta 1-2 alkalommal 1 pg-os (priming) dózisokat alkalmaztunk, 50 majd a kezelés utolsó napján 5-10 (resolving) adagot adtunk. A kezelés utolsó piming adagja és a resolving adag között 6 órás időintervallumot alkalmaztunk. A kezeletlen kontroll fiziológiás sóoldntot kapott intraperitoneáli- 55 san.

A kezelések befejezése után valamennyi állatot étergőzben tulaltattuk; majd petefészkeiket kipreparáltuk. Valamennyi kísérleti állatot 24 órával az utolsó kezelést követően θθ boncoltuk fel. A petefészek állapotának kiértékelését frissen vizuálisan és mikroszkóposán, majd szövettani minták készítését követően ismételten mikroszkóposán végeztük.

Megállapítottuk, hogy a kontroll infantilis patkányok petefészkein néhány fejlődő tű- 65 sző található, ezek között sem curpus hemoragicum, sem corpus luteum nem volt. A petefészkek mat^sárga színűek, kis méretűek voltak. Ezzel szemben valamennyi kezelt csoportban már a vizuális értékelés hormonhatást igazolt, amely intenzív tűszőnövekedésben, a tüszők Gráf-tüszővé alakulásában, a nagytüszők ovulációjában és szabályos sárgatest kialakulásában nyilvánult meg. A petevezetők és az uterus méretben és súlyban is jelentősen növekedtek a kontrolihoz képest. A hormonnal kezelt 35 db infantilis patkányból öszszesen 4 db nem reagált a kezelésre.

A naponta 1 pg antranilsav(6)GnRH analógot kapó csoport a 4. napi kezelés után az njektálást követő 6 órával 5 pg resolving antanílsav(6)GnRH adagot kapott. Valamennyi kezelt állatnál a petefészek hiperstimulációja jól látható volt. A kétoldali petefészkeken 725 db corpus luteumot lehetett megszámo'ni. A vizuális képet a szövettani kép egyértelműen igazolta. A szövettan vizuálisan nem látható, nagy mennyiségű intrafakoIlikuláris luteinizációt is feltárt. Valamennyi kísérleti állatnál egyértelmű uterus-növekedést is tapasztaltunk, a kezelt állatok uterusa kb. 2-szerese volt a kezeletlen kontroliénak.

A fentiekhez hasonlóan (különböző dózisokkal és időintervallumokkal) kezelt kísérleti állatoknál a corpus luteumok száma 2 és 40 között változott, jellemzően 12-25 volt. Vizuális értékelésünket a szövettani vizsgálat igazolta.

A fenti eljárás igazolja, hogy az állatfajrak már infantilis egyedeiben megvalósítottuk a follikulogenézis stimulációját. A follikulusok fejlődése fiziológiás volt, amit a Gráf-tüszővé növekedés, az ovuláció és a normális luteinizáció bizonyított.

9. példa

Nyugalmi állapotban lévő kecsege hímek spermatogenézisének stimulálása antranilsav(6)Gln(8)GnRH analóggal 5 db 4°C-os vízben betelelt (átteleltett) kecsege hímet laboratóriumi körülmények 9

-9194913 között fokozatosan (4°C/nap) 17°C-ra melegítettünk. Ezután 15 napon át 17°C-on tartottuk a kísérleti állatokat. Ez idő alatt összesen 270 napfok hőösszeget kaptak.

Ezután az állatoknak 1 pg/db antranilsav(6)Gln(8)GnRH analógot adtunk 1 ml fiziológiás sóoldatban intraperitoneálisan. Ezt a kezelést 24 óra múlva megismételjük. A második injekciót követő 24 óra múlva a heréket aktíváltságuk szempontjából makroszkóposán és mikroszkóposán értékeltük.

Megállapítottuk, hogy valamennyi kezelt hal heréje jelentősen, a kontrollnak kb. 4-6-szorosára megnagyobbodott. A herék roppanó hanggal törhetők voltak, a herecsatornákra merőleges törésekből nagymennyiségű ondófolyadék ürült, s az így kinyert spermiumok a halak indukált mesterséges szaporításában használatos technikával 100%-os mértékben aktiválhatok voltak.

Ezzel a kezeléssel sikerült a kecsege hímek nyugalmi állapotban lévő, spermatogenézist egyáltalán nem produkáló heréit aktiválni. Az aktiválás után mesterséges termékenyítésre alkalmas mennyiségű és minőségű spermát kaptunk.

Claims (4)

1. Eljárás az (I) általános képletű, új

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X₁-X₂-X₃-Pro-X₄ (I) — amely képletben az aminosavak L-konfigurációjúak,

X, jelentése orto-amino-benzoesav- vagy meta-amino-benzoesav-csopórt,

X₂ jelentése leucil-, triptofil- vagy fenilalanil-csoport,

X₃ jelentése arginil-, leucil- vagy glutaminil-csoport,

X₄ jelentése glicil-amid- vagy etil-amid-csoport — nonapeptid etil-amid, illetőleg dekapeptid-amid, valamint e vegyületek savaddíciós sóinak az előállítására, azzal jellemezve, hogy a) a kívánt esetben védett aminosavakat kapcsoljuk a lépésenként! és/vagy a fragmens kondenzációt alkalmazva, és adott esetben a védőcsoportokat eltávolítjuk, vagy

b) a szilárd fázisú peptidszintézis módszerét alkalmazva valamely szilárd hordozóra a

5 megfelelő sorrendben lépésenként kondenzáljuk a kívánt esetben védett aminosavakat, és a végterméket savas vagy lúgos lehasítással távolítjuk el a szilárd hordozóról, és adott esetben a védőcsoportokat a gyantáról való

10 lehasítással egyidejűleg vagy azt megelőzően vagy követően távolítjuk el, és kívánt esetben az így kapott szabad bázist gyógyászatilag elfogadható savval savaddíciós, sóvá alakítjuk, vagy a savaddíciós só15 ból lúgos kezeléssel felszabadítjuk a szabad bázist.

2. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás, azzal jellemezve, hogy valamely (II) képletű

GIp-His-Trp-Ser-Tyr-N₃ (II)

20 védett pentapeptid-azidot valamely (III) általános képletű

X,-X₂-X₃-Pro-X₄ (III) tetra- vagy pentapeptiddel kondenzálunk, ahol X_b X₂, X₃ és X₄ jelentése az 1. igénypontban

25 megadott.

3. Eljárás luteinizáló és follikulusz-stimuláló hormonokat felszabadító tulajdonságú gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely az 1. igénypont sze30 rinti eljárással előállított, (I) általános képletű gonadoliberin-származékot — ahol X,, X₂, X₃ és X₄ jelentése az 1. igénypont szerinti — vagy annak .gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóját a gyógyszerkészítésben szoká35 sós hordozó és/vagy vivőanyagokkal összekeverjük és gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.

4. Eljárás szaporodásbiológiai célokra alkalmas kompozíciók előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely az 1. igénypont sze40 rinti eljárással előállított (I) általános képletű vegyületet — ahol X,, X₂, X₃ és X₄ jelentése az 1. igénypont tárgyi körében megadott — vagy annak savaddíciós sóját a gyógy szerkészítésben szokásos hordozó és/vagy

45 vivőanyagokkal összekeverjük, és gerincesek szaporítására alkalmas készítménnyé alakítjuk.