HU193294B

HU193294B - Preparation influencing the digestion of ruminants advantageously

Info

Publication number: HU193294B
Application number: HU843084A
Authority: HU
Inventors: Istvan Ott; Janos Seregi; Sandor Szentmihalyi; Tibor Lang; Imre Moravcsik; Janos Dohy; Gyoergy Kiss
Original assignee: Gyogyszerkutato Intezet; Atk Takarmanyozasi Kutatointez
Priority date: 1984-08-15
Filing date: 1984-08-15
Publication date: 1987-09-28
Also published as: JPS6192539A; DE3529383A1; NO164152C; NL8502260A; FI853125A0; SU1625317A3; MX7713E; ATA236985A; FI853125L; DK370585A; GB2163650B; SE8503815L; IT8521933A0; FR2569085B1; IL76104A0; NZ213117A; FR2569085A1; GB2163650A; NO853212L; AU4619685A

Description

A találmány tárgya eljárás összetett gyomorral rendelkező állatok bendőjében adott tápanyagokon szaporodni és hosszú ideig fennmaradni, képes, az állatok emésztését előnyösen befolyásoló mikroorganizmus tenyészetek előállítására, s kívánt esetben e mikroorganizmus tenyészeteknek a haszonállatok bendőjébe juttatására. A találmány továbbá a fenti mikroorganizmus tenyészeteket tartalmazó készítményekre, valamint azok előállítására is vonatkozik.

Az összetett gyomrú állatok, mint a juh (Ovis aries aries), szarvasmarha (Bős primigenius taurus), kecske (Capra hircus), valamint vadon élő rokonaik (szarvas, őz, muflon stb.) mint növényevők nélkülözhetetlen szerepet játszanak a táplálkozási láncban. Gazdasági jelentőségük nagy, mivel olyan táplálékon is fejlődnek, amelyet más fajok hasznosítani nem tudnak. Ezek az állatok többüregü gyomrukkal és sajátos, nagyrészben mikroorganizmusok metabolizmusára alapozott sajátos emésztési folyamataikkal teljesértékű táplálékká alakítják át a növényi anyagokat. A bendőben anaerob körülmények között élő mikroorganizmusok, a bendőílóra, alkalmazkodik ahhoz az etetett takarmányhoz, amelyet az állat huzamosabb ideig kap. Amennyiben a fogyasztott takarmány minősége és összetétele változik, úgy változik a bendőílóra is. A bendőflóra változása azonban lassú a takarmányváltozást követően csak hetek múlva stabilizálódik. Ez károsan befolyásolja a hús- és tejtermelést, azonkívül az etetett takarmány egy része emésztetlenül vagy nem kellően feltárt alakban ürül. Gyors, kíméletlen takarmányváltáskor a hatás még erősebb, az állat elhullását, megbetegedését is okozhatja.

Továbbá ismeretes, hogy a kérődző állatok bendőjében milliliterenként több millió különböző baktérium szaporodik. A baktériumok anaerob körülmények között folyó metabolizmusa alapvető fontosságú az állat szabályos emésztése és táplálékfelvétele szempontjából. A bendőbe kerülő táplálékot az egysejtű mikroorganizmusok az állat számára felhasználható vegyületekké, pl. ecetsavvá, propionsavvá, vajsavvá stb. bontják, a bendőből továbbkerülő baktériumtömeg pedig az emésztőtraktus más helyein, például mint fehérjeforrás kerül felhasználásra.

A fentiek szerint a kérődzők bendőjében szaporodó mikroorganizmusoknak igen nagy jelentősége van az állat életében, és így meghatározók az összetett gyomrú haszonállatok termelésében. A bendő mikroorganizmus flórája a születést követően spontán alakul ki a felvett tápanyagokon, illetve ivóvízben jelen lévő egysejtűekből, majd a stabilizálódott bendőtlóra elvégzi feladatát. Korántsem bizonyos azonban, hogy a véletlenszerűen kialakult mikroorganizmus tenyészet a lehető leghatékonyabban működik. Igen előnyös lenne, ha rendelkezésre állna olyan eljárás, amellyel lehetségessé válna a kérődzők bendőjében élő 2 mikroorganizmus tenyészet gazdasági szempontból előnyös kialakítása és befolyásolása.

Ilyen eljárás napjainkig nem volt ismert. Ennek oka valószínűleg az, hogy igen bonyolult, nehezen kivitelezhető, költséges kísérletek kellenek ahhoz, hogy kiválaszthassuk azokata baktériumokat, amelyek egy adott takarmányon szaporodni képesek és metabolizmusuk előnyös, majd ezek után egyértelműen bizonyíthassuk, hogy a kiválasztott mikroorganizmusok hosszú időn át jelen vannak a bendőben és kifejtik hatásukat.

Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy a kérődző állatok takarmány hasznosítása hatékonysága a kérődző állatok bendőjében kedvező ecetsav: propionsav: vajsav arányt beállítani képes mikroorganizmusokat tartalmazó készítményekkel jelentős mértékben fokozható. Továbbá azt találtuk, hogy az ilyen mikroorganizmusok elkülönítésében eredményesen alkalmazhatók például a genetikai rekombinációs /génsebészeti/ módszerek.

Ezek a módszerek lehetővé teszik, hogy gyakorlatilag bármely mikroorganizmust olyan genetikai jelzéssel lássunk el, amelynek alapján az illető mikroorganizmus más mikroorganizmusok mellett szelektíven meghatározható. A genetikai jelzés lehet például egy antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó gén. A bendő mikroorganizmus tenyészetének az adagolt takarmánytól függő, előnyös kialakítása céljából összetett gyomorral rendelkező állatok bendőjéből mikroorganizmusokat izolálva, az egyes törzseket genetikailag megjelölve, majd tenyésztést követően visszajuttatva a bendőbe és az onnan vett mintákból szelektív körülmények között meghatározva jelenlétüket, azt találtuk, hogy az izolált, különböző állati tápanyagokon in vitro szaporodni képes és előnyös metabolizmussal rendelkező baktériumok egy része, meglepő módon, az állat bendőjében is szaporodni és hosszú ideig fennmaradni képes az adott tápanyagon, s így az állatok emésztését előnyösen befolyásolja. Kérődző állatok takarmányhasznosítása hatékonysága növelésére előnyösnek találtuk a Streptococcus, Sarcina, Rummococcus, Veillonella, Lactobacillus, Propionibacterium, Eubacterium, Bifidobacterium, Clostridium, Bacteroides, Succinivibrio, Lachnospira, Selenomonas, Anaerovibrio, Anaeroplasma, Borrelia, Butyrívibrio, Succinímónas és Peptostreptococcus nemzetséghez tartozó, továbbá különösen előnyösnek az MNG 00287 és/vagy 00288 és/va^y 00289 letéti számú mikroorganizmus tenyészet(ek)et tartalmazó készítményekét.

A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás összetett gyomorral rendelkező állatok bendőjében a kedvező ecetsav:propionsav:vajsav arányt beállítani, továbbá az adott állati tápanyagokon szaporodni és legalább 60 napig fennmaradni képes mikroorganizmus tenyészet(ek)et tartalmazó készítmény kérődzők bendőflórájának előnyös kialakítására, amely

-2193294 az állattenyésztésben és takarmányozásban szokásos vivőanyagok, hígító- és/vagy tartósítószerek mellett hatóanyagként legfeljebb 95 tömeg% mennyiségben egy vagy több a Streptococcus, Sarcina, Ruminococcus, Veillonella, Lactobacillus, Propionibacterium, Eubacterium, Bifidobacterium, Clostridium, Bacteroides, Succinivibrio, Lachnospira, Selenomonas, Anaerovibrio, Ánaeroplasma, Borfelia, Butyrivibrio, Succinimonas és Peptósíreptococcus nemzetséghez tartozó mikroorganizmus tenyészetet és/vagy az Országos Közegészségügyi Intézetnél a Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében MNG 00287, 00288 és 00289 számon letétbe helyezett törzs (ek) tenyészetét tartalmazza.

A találmány tárgya továbbá eljárás a fenti készítmény hatóanyagát képező mikroorganizmusok előállítására, amely abban áll, hogy adott takarmánnyal etetett állatok bendőjéből mintát veszünk, a mintából izolált mikroorganizmusok anyagcseréjét in vitro és/vagy in vivő megvizsgáljuk és az előnyösen metabolizáló mikroorganizmusokat az adott t-akarmányt szénvagy nitrogénforrásként tartalmazó táptalajon tenyésztjük, a növekvő sejtekbe szelekciót lehetővé tevő genetikai jelzést juttatunk, a genetikailag jelzett törzseket tenyésztjük, a tenyészeteket visszajuttatjuk az adott takarmányon tartott állatok bendőjébe, a bendőkből időközönként mintát veszünk és meghatározzuk a genetikailag jelzett mikroorganizmus sejtek számát, majd a legalább 60 napon át jelen lévő és az állat emésztését előnyösen befolyásoló törzseket elkülönít jüjk.

A találmány egy előnyös kiviteli módja szerint úgy járunk el, hogy szénával, abrakkal vagy melasszal etetett állatok bendőjéből az oda műtéttel beépített fisztulán át mintákat veszünk, és a bendőbaktériumokat tartalmazó tenyészeteket nitrogénforrást, szénforrást, szervetlen sókat, bendőfolyadékot és agart (Bryant és Burkey, J. Dairy Sci., 36, 205 (1953) ) tartalmazó szilárd halmazállapotú táptalajon szélesztjük. A tenyészeteket anaerob körülmények között inkubáljuk, majd az elkülönülten növekvő telepeket hasonló összetételű táptalajokon izoláljuk és tenyésztjük.

A kinőtt tenyészetekkel nitrogénforrást, szervetlen sókat,., bendőfolyadékot, továbbá szénforrásként szénát vagy cellulózt, illetve abrakot vagy melaszt tartalmazó folyékony halmazállapotú táptalajokat oltunk és anaerob körülmények között addig inkubálunk, míg a táptalajokban intenzív növekedés figyelhető meg.

A széna (cellulóz), abrak (keményítő), illetve melasz (szacharóz) széníorráson növekedni képes sejteket a fenti összetételű— szénforrásként cellulózt, illetve az abrak és melasz jelenlétében kinőtt sejtek esetén glükózt vagy szacharózt tartalmazó—szilárd halmazállapo4

1ú táptalajon izoláljuk szélesztést és tenyésztést követően.

Az így kapott tenyészeteket genetikailag jelezzük. Jelzésként használhatunk bármely olyan öröklődő genetikai markert, amely lehetővé teszi a jelölt mikroorganizmus kimutatását más egysejtűek között.

A találmány egy előnyös kiviteli módja szerint antibiotikum rezisztenciát meghatározó géneket juttatunk be a kiválasztott sejtekbe. Ha a bendőben élő baktériumok egy adott antibiotikumra érzékenyek és az adott antibiotikumra rezisztenseket juttatunk közéjük, ez utóbbi mikroorganizmusok szaporodását és pusztulását könnyen nyomon követjük úgy, hogy a mintákat az adott antibiotikumot tartalmazó táptalajon szélesztjük. Ebben az esetben csak a rezisztens sejtek fognak növekedni.

A kiválasztott, cellulózon, abrakon, illetve melaszon növekedni képes tenyészetekbe transzformációval (Bergmans és munkatársai, J. Bacteriol., 146, 564 (1981)) bejuttatjuk a kana'micin és kloramfenikol antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó géneket hordozó plOll jelű plazmidot (Simon és munkatársai, Proc. oí the 8th Nort American Rhizobium Conference, Winnipeg, Canada, Univ. of Manitobe Press, (1983)). A plazmid DNS-t Escherichia coli sejtékből izoláltuk (Bimbóim és Doly, Nucl. Acids Rés., 7, 1513 (1979)). A törzs MNG 262 sorszámon van letétbe helyezve az Országos Közegészségügyi Intézetnél a Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében.

Az antibiotikum rezisztenciát meghatározó géneket hordozó DNS transzformációját követően az előzőekben megadott összetételű, de kanamicinnel kiegészített szilárd halmazállapotú táptalajon szelektáljuk az új genetikai információt stabilan tartalmazó és kifejező sejteket. A rezisztens törzseket tároljuk.

Az izolált és tárolt tenyészetekkel nitrogénforrást, szervetlen sókat, bendőfolyadékot és félszílárd konzisztenciát biztosító mennyiségű agart, továbbá szénforrásként cellulózt, illetve glükózt tartalmazó táptalajt oltunk, majd anaerob körülmények között inkubálunk kettő-hat napon át. A kinőtt tenyészeteket előzőleg egy napon át éheztetett juhok takarmányához keverjük, és az állatokkal megetetjük. Etetés előtt, majd azt követően naponként miritát veszünk a bendőből, a mintákat az előzőekben megadott összetételű és kanamicinnel kiegészített szilárd halmazállapotú táptalajokon szélesztjük és meghatározzuk a bendőben élő, antibiotikum érzékeny és rezisztens mikroorganizmus sejtek számát. Meghatározzuk továbbá a mikroorganizmusok metabolitikus folyamatai során a bendőben keletkező illózsírsavak minőségét és mennyiségét. Ismeretes,, hogy ezek egymáshoz viszonyított aránya befolyásolja a kérődző állatok takarmányhasznosítását (Eskeland és munkatársai, J. An. Sci., 33, 282 (1971) és Church és munkatársai, 3

-3193294

Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants, 2. kötet, 622-625. oldal (1971) ). A kívánatos ecetsav propionsav arány hizlalás esetén 1,5-2:1, tejtermeléskor 3:1, létfenntartás, illetve vemhesség esetén 4:1 (Kaufmann, W., Rohr, K: Dér Einfluss des Futters auí die bakteriellen Fermentation in Vormögen, Handbuch dér Tierernahrung, 263. oldal, 1969. Parey, Hamburg; Berlin),

A találmány egy előnyös kiviteli módja szerint ezen meghatározásokat úgy végezzük, hogy bendőből vett mintából baktériumoka) izolálunk, majd vizsgáljuk az egyes izolátumok illózsírsav bioszintetizáló képességét. Az adott takarmánnyal kiegészített, bendőtolyadékot tartalmazó komplett táptalajon, anaerob körülmények között tenyésztjük a mikroorganizmust, majd gázkromatográfiás analízissel meghatározzuk a tenyészet ecetsav, propionsav és vajsav koncentrációját. A fenti szerves savakat előnyös arányban termelő mikroorganizmus sejteket genetikailag megjelöljük, majd vizsgáljuk szaporodásukat a kérődző állatok bendőjében.

Azokat a törzseket, amelyek legalább 60 napon át képesek osztódni az adott takarmánynyal etetett állat bendőjében és kedvezően befolyásolják a takarmány szénhidrát tartalmának ecetsavvá, propionsavvá és vajsavvá való lebontását, kiválasztjuk, tenyésztjük, elkülönítjük, fenntartjuk, tároljuk és tenyészeteiket kívánt esetben, állattenyésztési szempontból elfogadható alakká formulázva a bendőflóra előnyös kialakítására vagy befolyásolására kérődző állatoknak orálisan adagoljuk.

Három, sorrendben szénával, abrakkal, illetve melasszal etetett állat bendőjében szaporodni és hosszú ideig fennmaradni képes, az emésztést előnyösen befolyásoló Hh-GYOKI-1 -123Sz, Hb-GYOKI-2-14Ab, illetve Hh-GYOKI-3-81Me jellel jelölt törzset MNG 00287, MNG 00288, illetve MNG 00289 sorszámon letétbe helyeztünk az Országos Közegészségügyi Intézetnél a Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében.

A bendőből származó mikroorganizmusok tenyésztését a találmány értelmében szén- és nitrogénforrást, szervetlen sókat, a táptalaj megfelelő redukált állapotát biztosító sókat és a sejtek osztódásához ismeretlen okok miatt esetenként nélkülözhetetlen bendőfolyadékot tartalmazó táptalajokon anaerob körülmények között, az oxigén kizárásával, előnyösen 32°C és 37°C közötti hőmérsékleten végezzük. Szénforrásként előnyösen például glükózt, cellulózt vagy ezekre metabolizálódó más adalékanyagokat, például szénát, abrakot, vagy melaszt használhatunk. Nitrogénforrásként szervetlen sókat vagy szerves készítményeket, például élesztőkívonatot, kazeint vagy más hasonlót adagolhatunk a táptalajhoz.

A találmány szerinti eljárás lényeges pontja, hogy a kérődzők bendőílórájának befolyásolására olyan egysejtűeket használunk, amelyek egy adott takarmányt előnyösen képesek 4 metabolizálni és hosszú ideig életképesek maradnak a bendő körülményei között. Ilyen baktériumok kiválasztására az előzőekben megadottak értelmében szelekcióra alkalmas genetikai jelzéseket használunk fel. Ilyen genetikai jelzés lehet például egy antibiotikummal szembeni rezisztenciát kódoló gén, de lehet más, például bármely enzim vagy biológiailag nem aktív, de valamely reakcióval kimutatható fehérjét meghatározó gén is. Használhatunk továbbá auxotróf sejteket is.

A genetikai jelzést a sejtbe egy vektor DNS molekula segítségével, például plazmiddal vagy tággal juttathatjuk be, de spontán szelekcióval is kiválaszthatunk egy adott szelektálható tulajdonságot, például antibiotikum rezisztenciát.

A kiválasztott, egy adott kérődző bendőjében előnyösen metaboiizáló és ott hosszú időn át fennmaradó tenyészetet a bendőflóra születés utáni kialakítására vagy a már kialakult bendőflórával rendelkező állat bendőjében élő mikroorganizmus tömeg összetételének előnyös befolyásolására valamely célszerű készítmény formájában, orálisan adagoljuk az állatnak. Az adagolást célszerűen a takarmánnyal vagy az ivóvízzel együtt végezzük.

Az adagolandó tenyészet előállítására a kiválasztott mikroorganizmust szerves széníorrást és szerves vagy szervetlen nitrogénforrást és szerves vagy szervetlen sókat tartalmazó táptalajon tenyésztjük, majd adagolásra, illetve szállításra alkalmas alakban elkülönítjük és kívánt esetben szilárd, vagy folyékony halmazállapotú hordozó anyagokkal és adott esetben egyéb adalékkal összekeverve formulázzuk. Az így kapott készítmények az állatok takarmányához vagy ivóvízéhez keverhetők vagy önállóan is adagolhatok.

A fermentáció után kapott tenyészléből ismert módon, például centrifugálással vagy szűréssel elkülönítjük a mikroorganizmus sejteket. Az elkülönített sejtekből készíthetünk többek között mikroorganizmus-pasztákat, fagyasztva szárított készítményeket, spórákat vagy vegetatív alakot tartalmazó szuszpenziókat stb., amikhez hozzáadjuk az állattenyésztési és állattakarmányozási szempontból elfogadható adalékanyagokat. A készítményekhez a mikroorganizmusok életképességét megőrző kiegészítő adalékanyagokat is tehetünk, például fehérjéket, aminosavakat vagy például glicerint. A kérődzők bendőílórájának kialakítására vagy befolyásolására használható, találmány szerinti készítményekhez adagolhatunk fentieken kívül a gyakorlatban használt és kérődzőknek adagolt anyagokat is, például antibiotikumokat, így monenzint, nigericint, szaiinomicint stb., de adagolhatunk olyan vegyületeket, például antibiotikumokat is, amelyek elősegítik az adagolt mikroorganizmus fennmaradását a bendőben.

A találmány szerinti eljárással előállított mikroorganizmus tenyészetek tehát lehetővé teszik, hogy segítségükkel a kérődzők bendő-4193294 jében az állatok emésztését előnyösen befolyásoló élő mikroorganizmus tenyészetet alakíthassunk ki, illetve a már meglévőt előnyösen megváltoztathassuk.

Szoptatáskor a kérődzők bendőjében nincs bármiféle takarmányt metabolizálni képes mikroorganizmus, az spontán alakul ki, véletlenszerűen és egyáltalán nem bizonyos, hogy előnyösen. Előre meghatározott baktériumok célszerű etetésével a bendőflóra lassú, spom tán kialakulása helyett gyorsan és előnyös összetételben, az adagolt takarmány és/vagy a molekuláris nitrogén optimális hasznosítására azonnal kész mikroílóra alakítható ki.

A találmány szerinti eljárás előnye, hogy a leírás szerinti módon előállított mikroorganizmusokkal (például az MNG 00287, MNG 00288 és MNG 00289 jelű törzsekkel) elősegíthetjük a takarmányváltáskor vagy a szoptatást követően a bendőflóra gyors alkalmazkodását, illetve kialakulását mégpedig olymódon, hogy a bendőben a takarmány optimális lebontására képes mikroorganizmusok szaporodjanak.

A találmány szerinti eljárást például az alábbi, csak a jobb érthetőség kedvéért és nem korlátozó jelleggel megadott esetekben alkalmazhatjuk.

Szarvasmarháknál tejtermeléskor az évszakonkénti takarmányváltáskor, a tejtermelés különböző fázisaiban, a vemhesség végén az élettani takarmányváltásokkor, az üzemi takarmányváltozásnál stb. Hústermeléskor a hizlalás! módok változtatásakor, tömegtakarmányokra alapozott hizlaláskor vagy intenzívebb, abrak takarmányra alapozott tartáskor, legeltetés kezdetekor, legelő változtatáskor stb.

Juhok tenyésztésekor évszakonkénti takarmányváltáskor (őszi-téli-nyári-tavaszi takarmányozás), legeltetés kezdetekor, intenzív felneveléskor.

Hasonló a helyzet a Magyarországon kevésbé jelentős kecsketenyésztésben, de felhasználhatók a találmány szerinti eljárással előállított mikroorganizmus tenyészetek néhány speciális esetben, vadon élő kérődzőknél, a vadaskerti állattartásban, dámvad tenyésztésben is.

A találmány szerinti eljárást az alábbiakban példákkal szemléltetjük. Három alaptakarmányt, a cellulózt tartalmazó szénát, főként keményítőt tartalmazó abrakot és melaszt hasznosítani képes, a bendőben hosszú időn át fennmaradó mikroorganizmus előállítását és felhasználását juhok esetében részletesen megadjuk, a találmány oltalmi köre azonban érthetően kiterjed más takarmányokon növekedni képes mikroorganizmusok és készítmények előállítására és ezek alkalmazására más kérődzők bendőflórájának kialakítására vagy befolyásolására is.

1. példa

Szénával etetett állat bendőflórájának befolyásolása

A.) Szénán növekedni képes mikroorganizmus izolálása

Juhokat egy hónapon át szénával etetünk, majd a bendőbe műtéti úton bevezetett lezárható fisztulán mintát veszünk. A mintát közvetlenül a mintavételt követően az alábbi öszszetételű táptalajon szélesztjük, hígítást követően:

Sóoldat I. 7,5 ml dikálium-hidrogén-foszfát 0,6 g desztillált víz ad 100,0 g

Sóoldat 11.7,5 ml nátrium-klo-

rid	L2 g
diammóni- um-szulfát	L2 g
kálium-di- hidrogén- -foszfát	0,6 g
kalcium-klorid	0,12 g
magnézium- -szulfát-hep- tahidrát	0,25 g
desztillált víz ad	100,0 ml

ίχνοόα e> u ι 11ι,

0,1 %-os oldat 0,1 ml

Agár (Bacto)⁺ 2,5 g

Bendőfolyadék⁺⁺ 10,0 ml

Glükóz 0,05 g

Cellobióz 0,05 g

Cisztein-hidroklorid-monohidrát 0,05g

Nátrium-karbonát-, 8%-os oldat 5,0 ml

Desztillált víz ad 50,0 ml. Táptalaj jele: RGCA.

⁺Difco Laboratories, Detroit, USA.

⁺⁺A bendőből vett mintát laza gézszürőn szűrjük, majd a szürletet széndioxid alatt — 20°C hőmérsékleten tároljuk.

A táptalaj pH-ját 6,8-ra állítjuk be, majd sterilezzük. A sterilezést széndioxid gázfázisban végezzük. A sterilezést, táptalajkészítést és tenyésztést Bryant és Burkey szerint végezzük (J. Dairy Sci., 36, 205 /1953/).

A hígítást az alábbi összetételű steril eleggyel

végezzük:
Sóoldat I. (lásd. előbb) Sóoldat 11. (lásd előbb) Cisztein-hid roklorid-	7,5 ml 7,5 ml
-monohidrát	0,05 g
Nátrium-karbonát	0,3 g.
Reszazurin, 0,1 %-os oldat	0,1 ml
Desztillált víz	ad 100,0 ml. Az elegy jele:HB
A tenyészeteket 35°C hőmérsékleten ana-

erob körülmények között (lásd Atlas of Rumen Microbiology, Ogimoto és Imái, Japan Scienti-5193294 fic Societies Press, Tokyo, (1981)') tenyésztjük 120 órán át, majd az egyedi telepekről szénakivonatot tartalmazó alábbi összetételű táptalajt oltunk:

Sóoldat I. (lásd előbb) 15,0 %

Sóoldat II. (lásd előbb) 15,0 %

Reszazurin, 0,1 %-os oldat 0,1 %

Tripton L42 (Oxoid)⁺ 1,5 %

Élesztőkivonat (Oxoid)⁺ 0,5 %

Bendőfolyadék⁺⁺ 10,0 %

Nátrium-karbonát 0,4 %

Cisztein-hidroklorid-monohidrát 0,05 %

Szénakivonat⁺⁺⁺ 10,0 %

Jele: RGCF.

⁺ Oxoid Limited, London, Anglia.

^{+ +} Lásd előbb.

^{+ ++}A szénakivonat előállítására az apróra vágott növénydarabokat vízben szuszpendáljuk, majd forralást követően szűrjük. Á szűrési maradékot sterilezés előtt adagoljuk a táptalajhoz.

A táptalaj pH-ját hidrogén-klorid oldattal 6,5-re állítjuk be, majd sterilezzük.

A kémcsövekben sterilezett 5 ml térfogatú táptalajokat beoltjuk az RGCA szilárd halmazállapotú táptalajon kinőtt izolált telepekről nyert sejtszuszpenzióval, és 5 napon át, 35°C hőmérsékleten, anaerob körülmények között inkubáljuk a tenyészeteket. Mikroszkópos vizsgálattal ellenőrizzük a növekedést, majd az előzőekben megadott RGCA jelű szilárd halmazállapotú táptalajra szélesztjük a tenyészetet, azonban a táptalajba glükózt és cellobiózt nem adagolunk, ezek helyett 2,0% Bacto cellulózt mérünk be.

A tenyészeteket 35°C hőmérsékleten inkubáljuk 120 órán át, majd a cellulózt .hasznosítani képes sejtekből kifejlődött egyedi telepeket cellulózt tartalmazó RGCA táptalajokra izoláljuk.

így olyan, bendőből származó mikroorganizmusokhoz jutunk, amelyek szénán, illetve cellulózon növekedni képesek.

B.) Szénát bontó bendőbaktériumok genetikai jelölése

A genetikai jelölést a plOl 1 Escherichia coli plazmiddal (Simon és munkatársai, Proc. of the Eight North American Rhizobium Conference, Winnipeg, Canada: Univ. of Maniota Press, (1983)) végezzük, önmagában ismert módon.

Az E. coli tenyészetből Bimbóim és Doly szerint (Nucl. Acids Rés., 7, 1513 /1979/) izoláljuk a plazmid DNS-t, majd az alábbi elegyben oldjuk:

mM kalcium-klorid 5 mM magnézium-klorid 10 mM TRISZ-hidrogén-klorid puffer⁺ pH 7,5.

⁺ (Trisz- (hidroxi-metil) -amino-metán )-hidrogén-klorid

Az 1. példa A. pontjában megadottak szerint izolált, szénán növekedni képes mikro6 organizmusokat RGCF táptalajon (lásd az 1. példa A. pontját) tenyésztjük, majd centrifugálással széndioxid alatt elkülönítjük. A sejteket az alábbi elegyben szuszpendáljuk:

mM kalcium-klorid mM magnézium-klorid mM TRISZ-hidroklorid puífer pH 7,5 mM cisztein-hidroklorid-monohidrát mM nátrium-tioszulfát.

A szuszpenziók milliliterenként 5xl0⁹ sejtet tartalmaznak. A sejtszuszpenziókat 1:1 arányban hígítjuk a plOl 1 plazmid DNS-t tartalmazó (0,1 pg/ul) eleggyel, majd 4°C hőmérsékleten inkubálunk 60 percen át. Az inkubálást ezután két percen át 41°C hőmérsékleten folytatjuk, és ezt követően szénforrásként cellulózt tartalmazó szilárd halmazállapotú táptalajokra szélesztjük a tenyészetet, amely táptalajokhoz sterilezés előtt 500 pg/ml kanamicin B-t adagoltunk. 120 órán át 35°C hőmérsékleten, anaerob körülmények között inkubáljuk a tenyészeteket, majd vizsgáljuk az 500 pg' /ml kanamicin B jelenlétében növekedni képes telepeket.

A plOl 1 plazmid kanamicin és kloramfenikol rezisztenciát meghatározó géneket hordoz, tartalmaz továbbá E. coli sejtekben replikációt megengedő replikációs origót. Más baktériumba transzformálva, mivel nem rendelkezik megfelelő replikációs origóval, a plazmid DNS vagy eliminálódik, vagy pedig részben vagy egészben beépül a kromoszómába, genetikai rekombináció történik. A kromoszómába beépült gén szerencsés esetben kifejeződik és kanamicin (illetve kloramfenikol) rezisztenciát biztosít.

Kísérletünkben kaptunk kanamicin B-re rezisztens telepeket, a transzformációs frekvencia: 3xl0'⁵.

Néhány rezisztens telepet izoláltunk és meghatároztuk a kiindulási és a kanamicin B-re rezisztens (Km*) törzsek antibiotikum érzékenységét. Néhány törzzsel kapott eredményt az 1. táblázatban adunk meg.

1. táblázat

A bendőbaktériumok és a genetikailag jelzett, szénát bontó törzsek kanamicin B érzékenysége

Mikroorganizmus

Bendőtartalom Kiindulási törzsek Genetikailag jelzett, Km* törzsek Hh-GYOKI-1-8

-27 -91 -123 -142

Legkisebb növekedésgátló konc. Kanamicin ^B 9g/ ml 31

4,0 - 7,5

500

250

500

1000

500 így olyan, bendőből származó, szénát vagy cellulózt hasznosítani képes mikroorganizmusokhoz jutunk, amelyek jelentős mennvi-6193294 ségű kanamicin B jélenlétében növekedni képesck

A Hh-GYOKI-1-123 (Km*) jelű törzset cellulózt tartalmazó RGCA táptalajon szélesztjük, és a táptalajokhoz 1000, 5000, illetve 10000 pg/ml kanamicin B-t adagolunk. 168 órán át, 35°C hőmérsékleten, anaerob körülmények között inkubáljuk a tenyészeteket, majd izoláljuk a 10000 pg/ml antibiotikum jelenlétében növekvő törzseket. így a Hh-GYOKI-1-123 jelű törzsből spontán szelektálással kanamicin B-vel szemben igen nagymértékben rezisztens, spontán mutánshoz jutottunk. Az egyik törzset Hh-GYOKI-l-123Sz jellel jelöltük, és MNG 00287 sorszámmal letétbe helyeztük az Országos Közegészségügyi Intézetnél a Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében.

C.) A genetikailag jelzett mikroorganizmusok visszajuttatása a bendőbe A Hh-GYOKM-123 (Km*) jelű törzs

RGCA ferdeagaron -(-4^OC hőmérsékleten tárolt tenyészetével beoltjuk az alábbi összetételű RGCFa jelű steril táptalajt:

1. Dikálium-hidro-
gén-foszfát	0,3 % 45	ml oldat
2. Diammónium-
-szulfát	0,6 %
Nátrium-klo- rid	0,6 %
Magnézium- -szulfát-mo- nohidrát	0,06 %
Kalcium-klo- rid-dihidrát	0,06 %
Kálium-di- hidrogén- -foszfát	0,3 % 45	ml elegy
3 Bacto-cellulóz⁺	1,8 %

Minta ------------Antibiotikum nélkül

Agár (Bac-
to) ⁺	3,0	% 65 ml elegy
4. Élesztőki-
vonat	0,1	% 20 ml elegy
5. Cisztein-hid-
roklorid-
-monohidrát	0,1	% 20 ml oldat
6. Nátrium-tio-
szulíát	0,1	o/ ,/o
Nátrium-kar-
bonát	0,2	% 10 ml elegy
7. Bendőfolya-
dék⁺⁺		20 ml
⁺Difco Laboratories,	Detroit, USA

⁺⁺Lásd élőbb.

A hét külön elkészített elegy megadott mennyiségeit a megadott sorrendben mérjük össze.

A tenyésztést 500 ml térfogatú, 150 ml táptalajt tartalmazó lombikokban végezzük anaerob körülmények között. 48 óra múlva ellenőrizzük a növekedést, majd szénával etetett juh takarmányához keverjük a tenyészetet. Az adagolás előtt és az azt követő napokon a bendőbe nyúló fisztulán mintát veszünk, a minták térfogata 50-200 ml. A mintákat kanamicin B-t és antibiotikumot nem tartalmazó RGCA táptalajokra szélesztjük HB oldattal történő megfelelő hígítást követően. A tenyészeteket 72 órán át, 35°C hőmérsékleten, anaerob körülmények között inkubáljuk, majd meghatározzuk a kifejlődött baktériumtelepek számát. Az eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg.

táblá-Zcit

A Hh-GYOKI-í-123 (Km*) törzzsel kezelt állat bendőflórájának változása

Az állat 340 ml, milliliterenként 4,7xlO^ebaktériumot tartalmazó tenyészetet kapott, orális adagolással.

Sejtszám/ml

1000 jug/ml Kanamicin B jelenlétében

Adagolás előtt:	5 X	10®	0
Adagolás után: 1	nap	5,9 x	10®	2 x 10⁴
2.	nap	3,2 x	10’	4,1x 104
3,	nap	2,4 x	10*	3,1 X 10’
6.	nap	3,9 y	10’	1,8 K104
8.	nap	9,8 x	10^é	1,05x10^?
15.	nap	8,1 X	10⁵	3,1 *10⁴

A táblázat adataiból kiderül, hogy az adagolt mikroorganizmus a bendőben hosszú időn át jelen van és osztódik.

A 15. napon a fentiekben megadottak szerint eljárva tenyésztettük és adagoltuk az állatnak a Hh-GYOKl-l-123Sz jelű, 10000 pg/ /ml kanamicin B-re rezisztens mikroorganizmust. A minták előzőekben megadottak szerinti tenyésztése után kapott eredményeket a 3.

⁶⁵ táblázatban adjuk meg.

-7193294 táblázott

A Hh-GYOKl-l-123Sz (Km*) törzzsel kezelt állat ben döf tórájának változása

Minta

Az állat 140 ml, milliliterenként 2xl0⁸ sejtet tartalmazó tenyészetet kapott, orális adagolással.

___ ____§^eÍ£.szám_/ml________

Antibiotikum 8000 jug/ml nélkül Kanamicin B jelenlétében

Adagolás
előtt:		1,4 * 10⁶	0
Adagolás
után: 1.	nap	7,4 x 10*	3,2 x10⁴
2.	nap	1,7 x 10^f	1,3 x 10⁴
5.	nap	4 * 10^έ	9,1 x W⁵
7.	nap	1,1X10’	2 X 10⁴
14.	nap	8 x 10'	3,1 x 10⁴
21.	nap	7,1 x 10^!	6,2 X10⁴
28.	nap	8,2 x10^é	8,1 X10¹
35.	nap	8,7 >10^fi	1,8 X 10

A táblázat adataiból kitűnik, hogy az ada- 25 golt mikroorganizmus a bendőben jelentős mennyiségben van jelen és figyelembe véve, hogy a bendőből az emésztett tápanyag folyamatosan ürül, feltétlenül osztódik is. Az egyes mintákban mért baktérium-számokban mutat- __ kozó különbségek azzal magyarázhatók, hogy a bendőtartalom konzisztenciája mintavételenként igen változó volt, az egészen viszkózustól a hígan folyóig változott.

2. példa 3₅

Abrakkal etetett állat bendőflórájának befolyásolása

A. ) Abrakon növekedni képes mikroorganizmus izolálása

Az 1. példa A. pontjában megadottakat 40 ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a kiindulási mintát abrakkal etetett állat bendőjéből vesszük, az egyedi izolátumokat olyan RGCF jelű (lásd ott) táptalajra oltjuk, amely szénakivonat helyett dörzsmozsárban porított abrakot tartalmaz (2%), a folyékony halmaz- ^bállapotú RGCF táptalajon kinőtt tenyészeteket RGCA jelű szilárd halmazállapotú táptalajon szélesztjük és ilyen táptalajra izoláljuk az abrakot hasznosítani képes sejtekből _SQkifejlődött telepekét.

így bendőből származó olyan mikroorganizmusokhoz jutunk, amelyek abrakon, mint szénforráson növekedni képesek.

B. ) Abrakot bontó bendőbaktériumok geneti- gg kai markerezése

Az 1. példa B. pontjában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy az 1. példa A. pontjában megadottak szerint előállított mikroorganizmusok helyett a 2. példa θθ

A. pontjában megadottak szerint kapott törzseket használjuk a plOl 1 plazmid DNS-sel való transzformáláskor.

A transzformált és Km* sejtek közül néhánynak kanamicin B-vel szembeni rezisztenciáját a 4. táblázatban adjuk meg. ⁶⁵

4. táblázat

A bendőbaktériumok és a genetikailag jelzett, abrakot bontó törzsek kanamicin B érzékenysége

Mikroorganizmus

Bendőtartalom Kiindulási törzsek Genetikailag jelzett Km* törzsek Hh-GYOKI-2-4

-14Ab

Legkisebb növekedésgátló koncentráció Kanamicin B, pg/ml

1,8

250

125

A fentiek szerint eljárva tehát olyan, bendőből származó, abrakot szénforrásként hasznosítani képes mikroorganizmusokhoz jutunk, amelyek a bendőben jelen lévő baktériumokra számítva nyolcszor rezisztensebbek kanamicin B-re.

A Hh-GYOKI-2-14Ab jellel jelölt törzset

MNG 00288 sorszámon letétbe helyeztük az Országos Közegészségügyi Intézetnél a Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében.

C.) A genetikailag jelzett mikroorganizmusok visszajuttatása a bendőbe Az 1. példa C. pontjában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a Hh-GYOKI-2-14Ab jelű törzzsel 1,8% Bacto cellulóz helyett 1,8% oldódó keményítőt tartalmazó RGCFa jelű steril táptalajt oltunk, majd a tenyészetet abrakon tartott állat takarmányához keverjük és adagolás előtt, majd ezután naponként fisztulán át mintát veszünk. A mintákban lévő Km* sejtek számát a következő táblázatban adjuk meg.

-8193294 táblázat

A Hh-GYOKI-2-14Ab (Km^ft) törzzsel kezelt állat bendőflórájának változása

Az állat 310 ml, összesen 7,1 x 10⁵ baktériumot tartalmazó tenyészetet kapott, orális adagolással.

Sejtszám/ml

Minta --------------------------------Antibiotikum 250 jug/ml nélkül Kanamicin B j elenlétében

Adagolás
előtt:		4,3 x	10⁶	1,4 X10*
Adagolás
után: 1 .	nap	4,1 X	10⁶	1,8 X10^$
2.	nap	3,2 x	10⁶	2,1 x 10 ³
3.	nap	8 >	10’	1 ,1 X 10 ³
6.	nap	9,1 x	10⁶	7,1 X 10¹
8.	nap	8 x	10⁶	8,1 x 1 o⁴
15.	nap	6,8 x	10⁶	8,7 y 10 ⁴
22.	nap	5 X	10*	9,8 * 10³
29.	nap	8 ^v	10⁶	1,1 yio*
36.	nap	9,1 y	10*	7 X 10’
43.	nap	7 y	10⁴	7,9 x 10’
60.	nap	6,1 y	10*	7 X 10’

A táblázatból világosan kiderül, hogy az adagolt mikroorganizmus hosszú időn át jelen van a bendőben és osztódik. 35

3. példa

Melasszal etetett állat bendőflórájának befolyásolása

A. ) Melaszon növekedni képes mikroorganiz- ⁴⁰ mus izolálása

Az 1. példa A. pontjában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a kiindulási mintát melasszal etetett állat bendőjéből vesszük, az egyedi izolátumokat olyan 45 RGCF jelű táptalajra oltjuk, amely szénakivonat helyett glükózt tartalmaz, a folyékony táptalajon kinőtt tenyészeteket RGCA jelű táptalajon szélesztjük és ilyen táptalajra oltjuk a melaszt hasznosítani képes sejtekből 60 kifejlődött telepeket.

Így bendőből származó olyan mikroorganizmusokhoz jutunk, amelyek a melaszt metabolizálni képesek.

B. ) Melaszt hasznosító baktériumok genetikai 65 jelölése

Az 1. példa B. pontjában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy az 1. példa A. pontjában megadottak szerint kapott mikroorganizmusok helyett a 3. példa θθ A. pontja szerint előállított sejteket transzformáljuk a plöll plazmid DNS-sel.

A Km^s sejtek közül néhánynak a kanamicin B-vel szembeni rezisztenciáját a 6. táblázatban adjuk meg.

6. táblázat

A bendőbaktériumok és a genetikailag jelzett, melaszt bontó törzsek kanamicin B érzékenysége

Mikroorganizmus

Bendőtartalom Kiindulási törzsek Genetikailag jelzett Km^R törzsek Hh-GYOKI-3-2

-81Me

-132

Legkisebb növekedésgátló koncentráció Kanamicin B, pg/ml

7,5

250

500

250

500

A fentiek szerint eljárva melaszt hasznosító, kanamicin B-re nagymértékben rezisztens izolátumokhoz jutunk.

A Hh-GYOKI-3-81Me jelű törzset MNG 00289 sorszámon letétbe helyeztük az Országos Közegészségügyi Intézetnél a Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében.

C.) A genetikailag jelzett sejtek visszajuttatása a bendőbe

Az 1. példa C. pontjában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a Hb-GYOKI-3-81Me jelű törzzsel 1,8% cellulóz helyett 1,8% glükózt tartalmazó RGCFa jelű

-9193294 táptalajt oltunk, majd a tenyészetet melaszon tartott állat táplálékához keverjük. Az etetés előtt és arzt követően naponként a bendőbe bevezetett fisztulán át mintát veszünk. A mintákban lévő Km* sejtek számát a 7. táblázat- 5 bán adjuk meg.

7. táblázat

A Hh-GYOKI-3-8lMe (Km*) sejtekkel kezelt állat bendőflórájának változása

Az állat 380 ml, milliliterenként l,6xl0⁷sejtet tartalmazó tenyészetet kapott, orálisan adagolva.

Sejtszám/ml

Minta Antibiotikum 500 jig/ml nélkül Kanamicin B jelenlétében

Adagolás
előtt:		5 x 10⁶	0
Adagolás
után: 1.	nap	1,1 x 10⁵	1,9 v 10^f
2,	nap	1,8 x 10?	2,5 y 10^s
3.	nap	6,2 x 10^é	6,1 x10^s
6.	nap	8,1 / 10^€	8,7 X 10*
8.	nap	6,2 x 10^c	9,1 x 10^s
15.	nap⁺	1,3 x 103	1,3 x10²
22.	nap	3 *10‘	3,1 X10^s
29.	nap	1,1X 10^e	7 X 10^?
36.	nap	8 X 10*	9,1 x 10<
43.	nap	6,1 x 10^é	8,1 X10*
60.	nap	6,8 > 10⁶	6,4 X 10*

⁺Hibás mintavétel

A táblázat adataiból kiderül, hogy az adagolt mikroorganizmus hosszú időn át jelen van a melasszal etetett állat bendőjében.

4. példa

A bendőben termelt illózsírsavak arányának változtatása baktériumok adagolásával

Komplett takarmányon (széna és juhtáp keveréke) tartunk két juhot, majd 14 nap múlva fisztulán át mintát veszünk bendőjükből. 2. liter bendőlevet több rétegű gézen szűrünk, a szűrletet elkülönítjük. A gézen maradó darabos anyagot 1 liter fiziológiás pufferben szuszpendáljuk, majd keverés után az előbbi módon szűrjük. A két szűrletet egyesítjük, állni hagyjuk, majd 1 óra múlva a felszínen elkülönülő szilárd halmazállapotú anyagot eltávolítjuk és a folyadékot használjuk fel vizsgálatainkhoz.

A fiziológiás puffer összetétele a következő: Dinátrium-hidrogén-foszfát 0,316 g/1 Kálium-dihidrogén-foszfát 0,152 g/1 Nátrium-hidrogén-karbonát 2,260 g/1

Kálium-klorid 0,375 g/1

Nátrium-klorid 0,375 g/1

Magnézium-szulfát 0,112 g/1

Kalcium-diklorid-dihidrát 0,050 g/1

Vas- (II) -szulf át-heptahidrát 0,008 g/1

Mangán-szulfát-monohidrát0,004 g/1 Cink-szulfát-heptahidrát 0,004 g/1

Réz-szulfát-pentabidrát 0,002 g/1

Kobalt-diklorid-hexahidrát 0,001 g/1 10 ₃₅ Az elegy pH-ját ellenőrizzük, szükség esetén hidrogén-klorid vagy nátrium-hidroxid híg vizes oldatával 7,2-re állítjuk be (Cheng és mti.: J. Dairy Sci., 38, 1225, (1955».

A fentiek szerint előállított elegyet a fenti ₄Q fiziológiás pufferral 1:1 arányban hígítjuk és 1 literéhez az állatnak adagolt takarmány-keverékből 4 g-ot mérünk. Az így kapott szuszpenzió 30-30 ml-ét 100 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokba töltjük, majd kétszáz adag így előkészített táptalajt sterilezünk, kétszázat pedig nem.

A steril és az élő bendőbaktériumokat tartalmazó táptalajokat beoltjuk az ecetsav, propionsav, vajsav stb. termelés szempontjából ₅₀ vizsgálandó baktériumokkal.

Azokat a baktériumokat vizsgáljuk, amelyekről bebizonyosodott, hogy in vitro tenyésztést követően is hosszú időn át megmaradnak a bendőben. Vizsgáljuk továbbá a komplett vagy bármilyen takarmányon tartott állat jjendőfolyadékából az 1. példa A., B és C. pontjában megadottak szerint izolált baktérium törzseket.

A vizsgálandó baktériumokat az alábbi θθ Összetételű RGCA-HCG jelű táptalajon tenyésztjük 37°C hőmérsékleten, anaerob körülmények között, 48 órán át:

Sóoldat I (lásd 1. példa A. pontja) 15 %

Sóoldat II (lásd 1. példa A. pontja) 15 %

Nyomelem oldat 0,3 % ⁶⁵ Élesztőkivonat (Oxoid)⁺' 0,5 %

-10193294

Szűrt bendőfolyadék 10,0 %

Nátrium-karbonát 0,4 %

Cisztein-hidroklorid-monohidrát 0,05 %

Nátrium-tioszulfát 0,008 %

Cellulóz (Bacto)⁺ 0,3 %

Glükóz 2,0 % ⁺Lásd előbb.

A nyomelem oldat összetétele a következő:

Cink-diklorid 40 mg

Réz-diklorid-dihidrát 10 mg

Dinátrium-tetraborát-dekahidrát 10 mg

Ammónium-molibdenát-tetrahidrát 10 mg

Vas-triklorid-hexahidrát 200 mg

Mangán-diklorid-tetrahidrát 10 mg

Ionmentes víz ad 1000 ml.

A tenyészetekkel beoltjuk a fentiek szerint készített, Erlenmeyer-lombikokban levő előkészített táptalajokat, az oltást 2 ml tenyészet/50 ml táptalaj arányban végezzük, egy párhuzamost használva és a nem sterilezett tenyészetet is oltva.

Oltást követően 40 órán át anaerob körülmények között tenyésztünk, majd 10% tömény hangyasavval leállítjuk a szaporodást és megvizsgáljuk a tenyészetek illózsírsav tartalmát.

A tenyészeteket gézlapon szűrjük, majd percenként 4000-et forduló rotorban 15 percen át centrifugáljuk. Ismét szűrjük az elegyet, majd Carlo Erba GI-452 típusú lángionizációs detektorral felszerelt gázkromatográf elválasztó oszlopára juttatjuk a C₂-C₅ szénatomszámú zsírsavak meghatározására.

Oszlop hőmérséklet: 150°C

Elválasztó oszlop: 2 m hosszú, 4 mm belső átmérőjű üvegcső, töltete: 10% e t i 1 éπ - g 1 i ko 1 - a d i p á t + 2 % O-foszforsav, szilánozott szilikagél hordozón (0,2-0,3 mm).

Injektor hőmérséklete: 190°C.

N₂ áramlási sebesség: 50 ml/perc.

H₂ áramlási sebesség: 50 ml/perc.

Levegő áramlási sebesség: 200 ml/perc. Papírsebesség: 160 cm/óra.

Kromatografálási idő: 20 perc. Mintamennyiség: 1 pl.

Minden mintából négy párhuzamos mérést végzünk. A standard oldat ecetsavat, propíonsavat, i-vajsavat, vajsavat, i-valeriánsavat és valeriánsavat tartalmaz.

A komplett takarmányon tartott állat bendőjéből izolált, illetve a genetikailag jelzett baktériumok közül több mint kilencvenet vizsgáltunk, a pozitív eredményeket adókat többször. A reprezentatív eredményeket az alábbi, 8. táblázatban adjuk meg.

A táblázatban használt jelek jelentése a következő:

+ S: sterilezés után oltva;

NS: élő bendőflórát tartalmazó tenyészet oltva

a. ny: nyomnyi mennyiség

b. negatív kontroll — a kísérletekhez használt bendőfolyadékból, fiziológiás pufferből és takarmányból a fentiek szerint előállított táptalaj illózsírsav tartalma (12 mérés átlaga)

c. pozitív kontroll — a bendőfolyadékból, fiziológiás pufferből és takarmányból a fentiek szerint előállított, az eredeti bendőbaktériumokat tartalmazó és inkubált tenyészet illózsírsav tartalma (12 mérés átlaga)

d. mint c, de a táptalajhoz 5 ppm monenzint (Na-só) (Eli Lilly, Indianapolis 46206, USA) adagoltunk (6 mérés átlaga)

e. mint c, de a táptalajt 10 ppm monenzinnel (Na-só) egészítettük ki (6 mérés átlaga).

-11193294

Μ > tí

eö

O 1

rx

in

co

CT

rx.

l<t

<r

ΓΧ

Γχ(<Τ

•r—

Ol

<D

Oá

Ol

(T

ΓΧ

m

o

Ol

co

r—

co

ω

•r-l 1

cr

rx

<O

<

04

xt

1°

00

v£>

x.x

tn

<r

00

o

00

T-—

rx

o

<T

m

Ol

m

r—

CT

rx

4-1

(X 1

aj

o i

o

CO

lói

t—

”-|O

o

m

Ol

04

Ol

T—

Ol

m

00

o

a

C 1

w

PU 1 1

bO r-l > te ce > M

I

Cd 'flj r—1

H g P *χ<U ÓD ín tí tí ín >Ί * tí tí O >n tí i

’ o | in I , c o ín tí ín tí tí ín a

í>!

tí

00	m	m
•<r	T—	x—
*	ín ^λ	ín *
o	tí O	tí o

ín tí o

rx o

ín * tí o

ΐ>

Ln

o

m

Ol

1 ,<T

r->

Γχ|Ο4

xt

in

<©

m

XT

Γχ

<r

rx

T—

<T

o

Ol

m

éti »—i

1

CO

m

CO

m

CO

m

co, co

CO

co

CO

co

Ol

CO

co

04

co

in

m

co ö

1

n

r.

*

*s

ín _Λ

4-11

•r-i —

1

o

c

c'o

o

olo

o

T—

etil

NI 'etil i—1| rOl 'etil 4-»l

I •I

001 éti 00 >

>

cd

Cfl r-l 6 cd ·-> bO

CCCCCCCCCCCCCCCC >

cd co

C r-l

1

|

o e

1

rx

o

00

<D

|x

τ— <t

τ—

00

•—‘Ο

00

<o

rx

o

x—

00

Γχ

o

rx

m

o

O

<r

•r-í x-»

1

co

<O

m

CO

<0

00 rx

<τ

Ο

CTl<O

C0

m

O

*4-

Γχ

m

rx

<o

\D

00

CT

co

<o

q- öO

1

*Ί *

2

1 1

Ol

o

ο

olo 1

ο

Ο —

í^J

Ol

o

(X,

1 1

1

f>

1 1

1

éti

1

ω r-i

1

o

00

m

X—

τ— Ιτ—

00

<τ

5—

<3·

co

Γχ

04

o

oo

<T

rx

T—

Ol

CT

Ol

<o

co

4-1 g

1

rx

o

co

<r

04

00 ιτ»

<Ο <0

<0 01

Ol

xt

rx

CO

o

•X—

t—

co

rx

co

o

<Tc

m

co

Φ x^.

1

*1 -

Ί -

υ

00 1

Ol

o T-

04

04 |x-

x— τ—'

X— v—

ί— 04 04 04 04 i—

T—

Ol

04 Ol O

w

1 1

Λ!

|

Ο

4J

1

ι—1 Cd

|

ín

1

l

γ-4 ι—1

co

1

ο 'cd

1

ω

+

1

5-ι bO

• 1—)

1

4-1 W

ÖŰ

w

C N

1

jí

'Φ

1

w

CO

CO 1

Ο -H

I

co

CO

C/3

CO

w

CO

g

N

1 1

co

2

co

2

CO

1

w >

CO

co

2

CO

cn

2

CO

íz;

co

2

CO

2

CO

1 I

1

2

1 tí

tí

éti

co

04

<T

kO

1

00

o

X—

m

T—

04

o

Ol

1

l<r

m

in

m

γ

Y

3

1

H

N

M

Jw

1-1

w

1-1

l-l

1-4

1-1

l-t

Ή

w

W

g

-s

ωΐ

A

w

Ϊ2

S4

52

%

54

μι

o

C0

o

Λ |f

^iio

o

< >

o

O

o

O

-aj

ω

1

ín

CJ

!>·

ín

ΣΓι·⁰

a nj

φ !>-!

ín

>·

ín

4-1

N

1

o

O

T—

05

001

e

0

C,0

O

Ü

c

O

2

μι

1

1 1 1

1 1

l 1

1

éti

:O

1

-C

04

JS

φι

Ιλ

x:

2

PQ

4J

re

1

SŰ

1

|Etí

2

-12193294

A táblázat adataiból kitűnik, hogy a találmány szerinti mikroorganizmus tenyészetek adagolásával a bendőflóra metabolikus tevékenysége révén keletkező illózsírsavak aránya a bendőtartalomban széles határok között változtatható. A Hh-GYOKI-48a jelű törzsből készített tenyészettel például jelentősen fokozható a propionsav termelés, ugyanakkor például a Hh-GYOKl-109b mikroorganizmus tenyészetével az ecetsav termelése növelhető. Az egyes zsírsavak termelésének fokozódása megfigyelhető más élő mikroorganizmust nem tartalmazó táptalajon (S) és megfigyelhető a szokásos bendőbaktériumok jelenlétében is (NS). Kísérleti rendszerünkben a monenzin-Na-sóval egy-két tizeddel csökkent az ecetsav/propionsav arány (d, e).

A példa szerinti eljárással kiválasztott mikroorganizmusokat az 1. példa B. pontjában megadottakat megismételve genetikailag jelezzük, bendős állatoknak adagoljuk, vizsgáljuk szaporodásukat és fentmaradásukat a bendőben. A bendőben hosszú időn át szaporodó és kedvező metabolizmussal rendelkező törzset megfelelő alakban adagoljuk az illózsírsav termelés szabályozására.

5. példa

Állatoknak adagolható baktériumkészítmény előállítása

Az adagolandó baktériumot a 4. példában megadott összetételű, RGCA+CG jelű táptalajon tenyésztjük anaerob körülmények között, ismert módon. A tenyésztés után a sejteket ismert módon elkülönítjük, például szűréssel vagy centrifugálással. Az elkülönített sejteket fiziológiás pufferban (lásd 4. példa) szuszpendáljuk és fagyasztva szárítjuk. A liofilezett baktériumkészítményt tároljuk és adott esetben, megfelelően formulázva állatoknak adagoljuk.

A mikroorganizmusok tenyésztését végezhetjük más, a szakemberek körében jól ismert táptalajokon is, például szénforrásként glükózt, keményítőt stb., nitrogénforráskénl szervetlen sókat tartalmazó táptalajon is.

Adagolhatjuk a készítményt a takarmányhoz keverve, de adagolhatjuk az ivóvízzel is, önmagában vagy más biológiailag aktív anyagokkal, mint például antibiotikumokkal, vitaminokkal együtt.

A liofilezett készítményen kívül előállíthatunk más termékeket is. Adagolhatjuk a mikroorganizmust a centrifugálás vagy szűrés után kapott baktériumtömeg megfelelő vivőanyagokkal vagy hígítóanyagokkal — például különböző alumíhium-szilikátokkal (zeolitokkal, bentonitokkal vagy attapulgíttal) vagy például kalcium-karbonáttal, abrakkal, premix-szel vagy más takarmánnyal — való keverése után is.

A használt takarmánytól és a termelési iránytól függően állapítjuk meg, hogy a találmány szerinti eljárással előállított, a bendőFlórát előnyösen befolyásoló mikroorganizmusok közül melyiket adagoljuk, és milyen menynyiségben. Ha az ecetsav-propionsav hányadost csökkenteni kívánjuk, úgy például a Hh-GYOKÍ-48a törzsből készített tenyészetet, ha növelni kívánjuk, úgy például a Hh-GYOKl-3-81Me mikroorganizmus tenyészetét adagoljuk. A kívánt hatás eléréséhez szükséges mikroorganizmus sejtszám megállapítása szakember számára nem jelent nehézséget. A sejteket általában olyan mennyiségben adagoljuk, hogy a bendőtartalom egy milliliterében eiőnyösen 5xl0²-5xl0^z közötti számú adagolt mikroorganizmus sejt legyen jelen.

6. példa

A Hh-GYOKl-48a és a Hh-GYOKl-l-123Sz mikroorganizmusok adagolása juhoknak

A 4. példában megadott összetételű RGCA+CG jelű táptalajt 121°C hőmérsékleten sterilezzük 20 percen át. A sterilezés előtt 15-15 milliliterenként kémcsövekbe kitöltött táptalajt beoltjuk a Hh-GYOKI-48a illetve a Hh-GYOKI -1- 123Sz mikroorganizmusok RGCA jelüű táptalajról (összetételét lásd az 1. példában) készített szuszpenziójával, majd 37 + hőmérsékleten 36 órán át inkubáljuk a tenyészeteket anaerob körülmények között. A tenyészet ellenőrzése után 30 ml inokulummal 5 liter hasznos térfogatú fermentorban sterilezett RGCA+CG jelű táptalajt oltunk, majd 37+ hőmérsékleten anaerob körülmények között tenyésztünk 40 órán át. A tenyészet ellenőrzése után elkülönítjük a fermentlébői a mikroorganizmus sejteket.

A sejtek izolálását percenként 5000-et forduló centrifugarotorban végezzük, amikor is a Hh-GYOKI-48a mikroorganizmussal oltott fermentorból 58 g, a 123Sz mikroorganizmussal oltottból pedig 53 g baktériumtömeget kapunk. Az így előállított terméket 2x800 g kukoricadarával gondosan összekeverjük, majd 8-8 részre osztjuk.

merinoi juhot három csoportra osztunk, majd ad libitum réti szénával (600-900 g/nap) etetünk. A takarmányhoz 100 g/nap mennyiségben ásványi sókat és vitaminokat tartalmazó premixet adunk (a premix kukoricadara vivőanyagot tartalmaz). Négy napon át tartjuk az állatokat, majd egy napon át éheztetjük és ezután az 1-7. sorszámú állatnak a fentieken kívül 100 g kukoricadarát, a 8-15. sorszámú állatnak a Hh-GYOKI-l-123Sz baktériumot, a 16-23. sorszámú állatnak pedig a Hh-GYOKI-48a jelű mikroorganizmust tartalmazó készítményt adjuk, amit a kiéhezett állatok gyorsan elfogyasztanak. Az etetést ezután a fentiek szerint folytatjuk 5 héten keresztül, és hetenként meghatározzuk az állatok súlyát.

A következő, 10. táblázatban megadott eredményeket kaptuk.

-13193294

10. táblázat

Kontroll csoport, n=7

Az állat	testsúly (kg)	súlygyara-
							pGtlclS J lltí L
	0 hét	1 hét	2 hét	3 hét	4 hét	5 hét	alatt
1.	29,0	29,5	30,0	29,5	29,5	29,5	0,5
2.	27,0	27,5	28,5	27,5	26,5	28,0	1,0
3.	28,5	27,0	27,0	27,5	26,5	26,5	-2,0
4.	30,0	30,5	30,0	30,5	30,0	29,0	-1,0
5.	29,5	30,0	29,0	30,5	29,5	30,0	0,5
6.	25,0	25,5	26,5	26,0	26,0	27,5	2,5
7.	27,0	27,0	27,5	28,0	28,0	28,0	1,0
Összesen:	196,0	197,0	190,5	199,0	196,0	198,5	2,5
Átlag:	28,00	28,14	28,36	28,43	28,00	28,36	0,36
Kísérleti	csoport,	Hh-GYOKI	-1-123Sz	jelű baktériummal kezelt, n =	8.
Az állat			testsúly (kg)			súlygyarapo-
_ _____/ _
							aas _> net
	0. hét	1. hét	2. hét	3. hét	4. hét	5 hét	alatt
8	29,5	32,0	32,5	33,0	33,5	34,0	4,5
9	25,5	26,5	27,0	28,5	29,5	29,0	3,5
10	25,0	25,5	25,0	28,0	29,0	28,5	3,5
1 1	25,5	24,5	25,5	27,5	27,0	28,0	2,5
12	29,0	28,0	29,0	28,0	29,0	30,0	1,0
13	29,5	30,0	30,5	29,0	29,5	30,5	1,0
14	29,5	28,5	29,5	30,0	30,5	31,0	1,5
15	28,5	29,0	30,5	30,0	30,5	32,0	3,5
összesen:	222	224	229,5	234	238,5	243	21 ,0
Átlag:	27,75	28,00	28,69	29,25	29,81	30,37	2,62
Kísérleti	csoport	Hh-QYOKI-	48a jelű	baktériummal etetett,	n = 8.
16	29,5	30,0	30,5	31,0	32,0	33,5	4,0
17	26,5	25,0	26,5	27,0	29,0	30,0	3,5
18	27,0	27,5	28,5	29,5	30,5	31,0	4,0
19	26,0	26,0	27,0	28,0	29,0	30,5	4,5
20	29,5	30,5	31,0	31,5	32,5	33,0	3,5
21	28,0	28,0	28,0	29,0	29,0	30,0	2,0
22	29,0	30,5	33,5	30,0	32,5	33,5	4,5
23	27,0	26,0	27,5	29,0	31,0	32,0	5,0
Összesen:	222,5	223,5	232,5	235	245,5	253,5	31,0
Átlag:	27,81	27,94	29,06	29,37	30,69	31,69	3,875

Az alábbiakban megadjuk a szignifikancia számítások eredményeit.

Szignifikancia számítások

123Sz és kontroll között	48a és kontroll között	123Sz és 48a között
S = - 1,432	S = ± 1,246	S = ± 1,142
Δ = 2,268	A = 3,518	Δ = 1,25
t = 4,471	t = 5,455	t = 2,188
DF = 13	DF = 13	DF = 14
p < 0,01	p < 0,01	p z. 0,05
erősen szignifikáns	erősen szignifikáns	szignifikáns

-14193294

A táblázat adataiból kiderül, hogy a kontroll csoportban 0,36 kg, a 123Sz baktériummal etetett csoportban egy állatra számítva 2,62 kg illetve 3,87 kg súlygyarapodás következett be a szegényes takarmányon, 35 nap alatt. Az eredmények szignifikánsak.

7. példa

A Hh-GYOKl-48a jelű mikroorganizmus súly- ¹θ növelő hatása negatív és pozitív kontrollal összehasonlítva

A 6. példában megadott módon tenyésztjük a Hh-GYOKI-48a jelű mikroorganizmust, azzal a különbséggel, hogy a táptalajba nem adagolunk bendőfolyadékot. 41 g centrifuganedves baktériumpasztát 1,2 kg kukoricadarával keverünk, majd 12 egyenlő részre osztjuk a készítményt.

A továbbiakban mindenben a 6. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy három csoportba összesén 36 állatot osztunk és a pozitív kontroll csoportba osztott állatoknak, a premixen és az ad libitum adagolt szénán kívül, naponta 100 g abrakot adagolunk.

Az eredményeket all. táblázatban adjuk meg.

Negatív kontroll At állat sorszáma	11. csoport, n=12. Testsúly	táblázat
(kg)	Súlygyarapodá (kg) 4 hét al;
0. hét	1 . hét	2. hét	4 hét
1	32,8	31,0	33,2	34,1	1,3
2	34,8	33,0	35,4	37,0	2,2
3	26,7	27,4	28,5	30,1	3,4
4	32,5	35,4	36,3	35,7	3,2
5	32,6	30,6	32,0	34,0	1,4
6	35,0	35,1	34,9	35,2	0,2
7	34,7	36,6	36,4	37,7	3,0
8	35,8	36,8	37,5	38,1	2,3
9	32,0	32,7	34,0	. 35,0	3,0
10	30,0	30,3	32,0	34,2	4,2
11	34,0	33,9	35,5	36,6	2,6
12	35,8	35,0	36,1	38,0	2,2
Összesen:	396,7	397,8	411,8	425,7	29,0
Átlag:	33,06	33,15	34,3	35,475	2,4

Pozitív kontroll csoport, n=12

Az állat sorszáma	Testsúly (kg)	Súlygyarapodás 4 hét alatt
0. hét	1 . hét	2. hét	4, hét
13	35,2	37,6	38,0	39,0	3,8
14	31,6	32,7	33,4	35,3	3,7
15	33,3	34,6	36,3	37,0	3,7
16	33,2	34,0	35,6	36,0	2,8
17	34,5	36,8	39,0	39,6	5,1
18	27,3	29,5	31,4	32,4	5,1
19	34,5	36,0	37,4	37,7	3,2
20	31,7	31,6	34,0	35,0	3,3
21	31,0	36,8	38,0	38,7	7,7
22	35,5	37,0	38,9	39,8	4,3
23	34,4	35,5	37,7	38,8	4,4
24	34,0	34,9	37,2	37,9	3,9
Összesen:	396,2	417,0	436,9	447,2	51 ,0
Átlag:	33,0	34,75	36,40	37,266	4,3

-15193294

Kísérleti csoport, n = 12.

Az állat sorszáma	0. hét	Testsúly (kg) 1. hét 2. hét	Súlygyarapodás (kg) --------- 4 hét alatt 4. hét
25	33,2	35,9	37,4	38,1	4,9
26	33,6	35,7	37,0	37,9	4,3
27	34,7	36,4	37,4	38,0	3,3
28	33,5	35,0	36,8	37,3	3,8
29	28,8	32,0	33,2	34,2	5,4
30	27,6	31,9	33,4	35,0	7,4
31	32,0	32,5	35,5	36,1	4,1
32	30,5	35,6	35,9	38,0	7,5
33	33,4	33,7	34,5	35,3	1,9
34	31,3	36,0	37,3	38,9	7,6
35	34,7	33,5	34,1	36,8	2,1
36	31,6	34,8	36,1	37,2	5,4
Összesen:	384,9	413,0	428,6	442,8	57,7
Átlag:	32,075	34,42	35,7	36,98	4,8

A matematikai analízis eredményei:

Negatív és pozitív Pozitív kontroll Negatív kontroll kontroll cs. között és kísérleti cs. és kísérleti csoport

S = - 1,236	S = 1,664	S = ¹ 1,613
Δ = 1,9	Δ= 0,5	Δ = 2,4
t = 3,766	t = 0,736	t = 3,645
p <0,01	P 0,5	p <0,05
erősen szignifikáns	gyengén szignifikáns	szignifikáns

A kísérleti eredményekből kiderül, hogy a mikroorganizmussal kezelt csoportba tartozó állatok testsúlya egy állatra számítva 28 nap alatt 2,4 kg-mal haladta meg a kontroll állat testsúlyát. A pozitív kontrollba tartozó állat súlygyarapodása átlagosan 4,3 kg, ez 0,5 kgmal kevesebb, mint a kezelt csoportba tartozó 50 állat átlagos súlygyarapodása. Ez jelentheti azt, hogy a találmány szerinti készítményt az adott mennyiségben bárányoknak adagolva legalább napi 100 g drága abrak takarítható meg állatonként, azonos súlygyarapodás mel- 55 lett.

8. példa

A 6. példában megadottak szerint eljárva tenyésztjük a Hh-GYOKI-l-123Sz íKm*) θθ 10.000 pg/mt kanamicin B-re rezisztens mikroorganizmus pasztát 4 kg kukoricadarával keverjük és szarvasmarhával etetjük.

Az állat bendőjéből műtéti úton bejuttatott fisztulárr át hetente mintát veszünk és a továb- θθ biakban az 1. példában megadottak szerint 16 eljárva 42 napon át meghatározzuk a bendőben jelenlevő genetikailag jelzett, adagolt mikroorganizmusok számát.

Az eredmények szerint a propionsavat termelő, általunk izolált mikroorganizmus legalább negyven napon át osztódik és jelen van a bendőben.

9. példa

Illózsírsavat termelő mikroorganizmusok adagolása kérődzőknek

A 4. példában megadott összetételű RGCA -(-CG jelű táptalajon a 6. példában megadott módon tenyésztjük a Streptococcus bovis, Sarcina ventriculi, Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus albus, Veillonella alcalescens, Lactobacillus vitulinus, Lactobacillus acídophilus, Propionibacterium acnes, Eubacterium ruminantium, Eubacterium ceilulosolvens, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium thermophilum, Borrelia sp., Bacteroides amylophilus, Bacteroides ruminocola, Bacteroides succinogenes, Succinivibrio dextrinosol-16193294 vens, Lahnospira multiparis, Selenomonas ruminantium, Selenomonas lactilytica, Butyrivibrio sp., Anaeroyibrio lipolitica, Anaeroplasma bactoclasticum, Anaeroplasma abactoclasticum, Suceinimonas amylolytica, Peptostreptococcus elsdenii, Clostridium clostridiiforme, Clostridium lochheadii és Clostridium longisporum mindegyikét. A 6. példában megadottak szerint izolált centrifuga nedves baktérium tömeget kukorica darával keverjük, majd ugyancsak a 6. példában megadottak szerint eljárva állatetetési kísérleteket végzünk, és meghatározzuk a kísérleti állatok testtömeg gyarapodását.

10. példa

A mikroorganizmust tartalmazó készítmények előállítása

A készítmények előállítását részletesen a Hh-GYOKI-48a mikroorganizmust tartalmazó készítmények előállítása kapcsán mutatjuk be.

A. Fagyasztva szárított készítmény előállítása

A 6. példában megadott szerint előállított 100 g súlyú centrifuganedves baktérium pasztát OE-950 (Labor MIM, Magyarország) liofilező készüléken liofilezünk, majd a kapott 54 g súlyú terméket 486 g búzakorpával gondosan elkeverjük és a baktérium védelmét biztosító (baktériumok számára áthatolhatatlan) zsákba vagy tartályba csomagoljuk. így 10% hatóanyagot tartalmazó készítményt kapunk.

B. Vivöanyagként búzakorpát tartalmazó készítmény előállítása

A 6. példában megadottak szerint előállított 100 g súlyú centrifuganedves mikroorga32 nizmus pasztát 900 g búzakorpával egyenletesen elkeverjük, majd a baktérium védelmét biztosító zsákba vagy tartályba csomagoljuk, így 1θ% hatóanyagot tartalmazó készítményt kapunk.

C. Bentonit vívőanyagot tartalmazó készítmény előállítása

100 kg „Veegum neutral márkajelü bentonit-port (forgalomba hozza: Lehmann and Vass Co., Hamburg, NSZK) 160°C hőmérsékleten 2 órán át sterilezünk, majd szobahőmérsékletre hütve Lödige FM 130 típusú keverőbe (gyártja: Gebrüder Lödige Maschinenbau ¹⁵ GmbH, Paderborn, NSZK) helyezünk. A keverőt működésbe hozzuk, és annak folyadékadagoló feltétén keresztül 10 kg, a 6. példában megadottak szerint előállított, permetezhető

2θ halmazállapotú mikroorganizmus szuszpenziót permetezünk a bentonithoz.

A kapott diszperziót 30°C-on 6-8% nedvességtartalom eléréséig szárítjuk és a termék bakteriális védelmét biztosító zsákokba (tar25 tályokba) csomagoljuk.

A termék 5-5 g-ját 4°C hőmérsékleten, szobahőn illetve 37°C hőmérsékleten tároljuk, és a 0., 20., 51. és 72. napon mintát veszünk, a készítményt steril, az 1. példában megadott öszszetételű HB elegyben szuszpendáljuk, és az ugyanott ismertetett RGCA jelű agarra szélesztjük megfelelő hígítást követően. A tenyésztést ana'erob körülmények között végezzük 46 órán át, majd meghatározzuk a kinőtt telepek számát.

Az eredményeket a 12. táblázatban adjuk meg.

12. táblázat

A bentonit vívőanyagot tartalmazó termék stabilitása

Baktériumok száma/g termék

Hőmérséklet -----------------------------------------------0. nap 20. nap 51. nap 72. nap

4*C szobahőmérséklet 2x 10⁸37° C

4,3 > 10⁷ 2,5 x 10⁸ 8 x10⁸

6/10⁷ 9 x 10⁶ 8 G0’ x 10⁷ 9 x 10^s 5 x 10⁶

A táblázat adataiból kiderül, hogy a bento- gg nitot tartalmazó termék baktériumtartalma a mérés szórását figyelembe véve kevéssé változik.

D. Attapulgit vivőanyagot tartalmazó készítmény előállítása

100 kg Pharmasorb HVM jelzésű kolloidális eloszlású attapulgitot (forgalomba hozza: Chemie-Mineralien KG, Bremen, NSZK) 160°C-on 2 órán át sterilezünk, majd szobahőmérsékletre hűtve Diosna P-250-A típusú keverőbe (gyártja: Dierks Söhne Maschinenfabrik, Osnabrück, NSZK) helyezünk.

A keverőt működésbe hozzuk, és annak folyadékadagoló feltétén keresztül 10 kg, a 6. példában megadottak szerint előállított, permetezhető halmazállapotú mikroorganizmus szuszpenziót permetezünk az attapulgithoz.

A kapott diszperziót 30°C-on 6% nedvességtartalom eléréséig szárítjuk és a termék bakteriális védelmét biztosító zsákokba (tar65 tályokba) csomagoljuk.

-17,93294

34

A termék 5-5 g-ját 4°C hőmérsékleten, szc£ bahőn illetve 37°C hőmérsékleten tároljuk, és a 0., 20., 51. és 72. napon mintát veszünk, a készítményt steril, az 1. példában megadott őszszetételű HB elegyben szuszpendáljuk, és az ugyanott ismertetett RGCA jelű agarra szélesztjük megfelelő hígítást követően. A tenyésztést anaerob körülmények között végezzük 46 órán át, majd meghatározzuk a kinőtt telepek számát.

Az eredményeket a 13. táblázatban adjuk meg.

13. táblázat

Az attapulgit vivőanyagot tartalmazó termék stabilitása

Baktériumok száma/g termék

Hőmérséklet		—
	0. nap	20.	nap	51 .	nap	72.	nap
4° C		2 x	10^ő	1 ,5 x	10⁷	3 x	10⁷
szobahőmérséklet	9 x 10⁷	3 x	10*	9 x	10⁷	5 x	10®
37°C		2 x	10⁸	9 x	10⁷	8 x	10^s

A táblázat adataiból kiderül, hogy az attapulgitot tartalmazó termék baktériumtartalma, a mérés szórását figyelembe véve, kevéssé változik.

A 10. példa A-D. pontja szerint, és ezekhez hasonlóan előállított termékeket kiegészíthetjük más vívőanyagokkal, például lucernaliszttel, darált kukoricacsutkával, őrölt kalcium-karbonáttal, dikalcium-foszfáttal vagy más, a premixek és más termékek készítésekor a takarmányozásban szokásosan használt és elfogadott anyagokkal. A készítményt adagolás előtt premixekbe, takarmányba vagy az állatok ivóvízébe keverve adagoljuk hatásos mennyiségben.

Claims

1.) összetett gyomorral rendelkező állatok bendőjében a kedvező ecetsav: propionsav: vajsav arányt beállítani, továbbá az adott állati tápanyagokon szaporodni és legalább 60 napig fennmaradni képes mikroorganizmus tenyészet (ek)et tartalmazó készítmény kérődzők bendőflórájának előnyös kialakítására, azzal jellemezve, hogy az állattenyésztésben és takarmányozásban szokásos vivőanyagok, hígító és/vagy tartósítószerek mellett hatóanyagként legfeljebb 95 tömeg% mennyiségben egy vagy több, a Streptococcus, Sarcina, Ruminococcus, Veilonella, Lactobacillus, Propionibacterium, Eubacterium, Bifidobacterium, Clostridium, Bacteroides, Succinivibrio, Lachnospira, Selenomonas, Anaerovibrio, Ánaeroplasma, Borrelia, Butyrivibrio, Succinimonas és Peptostreptococcus nemzetséghez tartozó, mikroorganizmus tenyészetet és/vagy az Országos Közegészségügyi Intézetnél a Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében MNG 00287, 00288 és 00289 számon letétbe helyezett mikroorganizmus törzs (ek) tenyészetét tartalmazza.

2. ) Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmus tenyé²⁵ széfként az Országos Közegészségügyi

Intézetnél a Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében MNG 00287 és/vagy 00288 és/vagy 00289 számon letétbe helyezett mikroorganizmus törzs(ek) tenyésze30 tét tartalmazza.

3. ) Eljárás az 1. igénypont szerinti készítmény hatóanyagát képező mikroorganizmus tenyészetek előállítására, azzal jellemezve, hogy adott takarmánnyal etetett kérődző

35 állatok bendőjéből mintát veszünk, a mintából izolált mikroorganizmusok anyagcseréjét in vitro és/vagy in vivő megvizsgáljuk és az előnyös anyagcseréjű mikroorganizmusokat az adott takarmányt

40 szén- vagy nitrogénforrásként tartalmazó táptalajon tenyésztjük, a növekvő mikroorganizmus sejtekbe szelekciót lehetővé tevő genetikai jelzést juttatunk,

45 a genetikailag jelzett törzseket tenyésztjük, a tenyészeteket visszajuttatjuk az adott takarmányon tartott állatok bendőjébe, a bendőkből mintát veszünk, és meghatá50 rozzuk a genetikailag jelzett mikroorganizmus sejtek számát, majd a legalább 60 napon át jelen lévő és az állat emésztését előnyösen befolyásoló törzseket elkülönítjük.

55 , ,

4. ) A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy genetikai jelzésként antibiotikum rezisztenciát használunk.

5. ) A 3. vagy 4. igénypont bármelyike szerinti βθ eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmusokat cellulózt tartalmazó, előnyösen szénával, keményítőt tartalmazó, előnyösen abrakkal vagy mono- és/vagy diszacharidokat tartalmazó, előnyösen melasszal etetett állatok bendőjéből izoláljuk, ⁶⁵ majd a genetikailag jelzett törzseket vizs-18193294 gálát céljából a fenti takarmányok valamelyikével etetett állat bendőjébe juttatjuk vissza, és a megfelelő mikroorganizmus sejteket tenyésztést követően elkülönítjük.

6. ) A 3-5. igénypontok bármelyike szerinti el- 5 járás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmus sejteket liofilezett alakban különítjük el.

7. ) Állattenyésztési eljárás összetett gyomor- io ral rendelkező állatok bendőjében kedvező ecetsav: propionsav: vajsav arány kialakítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti készítményeket orálisan juhoknak, szarvasmarháknak, kecskéknek, 15 szarvasoknak, őzeknek vagy más vadon élő kérődzőknek adagoljuk.

8. ) Eljárás összetett gyomorral rendelkező állatok bendőjében a kedvező ecetsav:pro36 pionsav:vajsav arányt beállítani, továbbá az adott állati tápanyagokon szaporodni és legalább 60 napig fennmaradni képes mikroorganizmus tenyészet(ek)et tartalmazó készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a 3-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított mikroorganizmus tenyészeteket önmagukban, vagy adott esetben az állattenyésztésben és takarmányozásban szokásos vívőanyagokkal, hígító- és tartósítószerekkel összekeverve orális készítménnyé formulázzuk.

9.) A 8. igénypont szerinti eljárás,azzal jellemezve, hogy mikroorganizmus tenyészetként az Országos Közegészségügyi Intézetnél, a Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében 00287 és/vagy 00288 és/vagy 00289 számon letétbe helyezett mikroorganizmus törzs tenyészetét alkalmazzuk.