HU191310B

HU191310B - Improved process for the cleavage of peptides containing thiol groups with bromcyanide

Info

Publication number: HU191310B
Application number: HU841747A
Authority: HU
Inventors: Richard D Dimarchi
Original assignee: Eli Lilly And Co,Us
Priority date: 1983-08-01
Filing date: 1984-05-04
Publication date: 1987-02-27
Also published as: DK219684A; IE841089L; GB2144429A; IL71736A0; DE3473278D1; JPH0542439B2; CA1251899A; GR82069B; GB2144429B; EP0134070B1; DK171440B1; IL71736A; IE57353B1; HUT37441A; JPS6042395A; EP0134070A2; AU2764184A; EP0134070A3; GB8411367D0; AU575562B2

Description

(57) KIVONAT

A találmány tárgya javított eljárás tiolcsoporto(ka)t (—SH) tartalmazó peptidekben a metionin karboxilcsoportjánál levő peptidkötés cianobromiddal végzett hasítására.

Az eljárás során a hasítást a pepiidben levő tiolcsoport(ok)hoz képest feleslegben levő tioszulfát ion jelenlétében végezzük.

Ily módon gátolhatok a jelenlevő tiolcsoportok nicllékrcakciói.

191 310

A találmány olyan javított eljárás, amely a tiolcsoportot (—SH) tartalmazó peptidek cianobromidos hasításánál gátolja a nem-kívánatos tiol-reakciókal.

A rekombináns DNS metodika megjelenése magával hozta egész sereg eljárási paraméter fejlesztésének szükségességét a termék előállításában, visszanyerésében és tisztításában. A rekombináns DNS eljárásokkal kapott termékeket szokás szerint „génfúziós termékek”-ként nyerik, azaz olyan aminosav szekvenciákként, ^melyek egy vezető szekvenciát és/vagy egy követő szekvenciát tartalmaznak, mely a kívánt termék aminosav szekvenciájához kapcsolódik. Alapvetőnek mutatkozott, hogy a kívánt peptidnek bármely idegen pepiidtől való hasítására metodikát dolgozzanak ki. Ho és munkatársai [Syntlietic Coinm., 3, 317-320 (1973)] a cianobromidot (CNBr) használják egy pepiidben levő metionin karboxil-végénél levő peptidkötés hasítására. Amennyiben a metionin a kívánt termék amiiio-láncvégéhez kapcsolódik, és az idegen peptid karboxi-láncvégét képezi, ugyanakkor a kívánt termékben nincsenek hozzáférhető inctioninmaradékok, a cianobromidos hasítás igen hasznos módszer a rekombináns DNS eljárások termékének preparálásakor.

Mindemellett a cianobromid használata az említett hasítás kivitelezésére hátrányokkal is rendelkezik. Egy ilyen hátrány jelentkezik az olyan peptidek alkalmazása esetén, amelyeknek tioltartalmú aminosavmaradékaik vannak, ismeretes, hogy a cianobromid elősegíti a tiolok diszulfidokká való átalakulását, és ezáltal a cianobromidos hasítás során nem-kívánatos melléktermékekhez is vezet. Ho és munkatársai [Synthetic Communications, 3, 317-320 (1973)] írják le a cianobromid reakcióját alkil- és aril-nátrium-tiolátokkal, amelyek során a megfelelő diszulfidok keletkeznek. Abe és munkatársai [J. Org. Chem., 39, 253255 (1974)] homocisztin és 2-merkapto-etanol reakcióját írják le, melynek során homocisztcin és a liöinocisztein és 2-incrkapto-etanol vegyes diszulfidja keletkezik. A reakció cianobromid jelenlétében és távollétében egyaránt lejátszódik. A vegyes diszulfid menynyisége a cianobromid jelenlétében nagymértékben megnő, a homoclsztein mennyiségének arányos csökkenése mellett.

Sekita és munkatársai ]Keio J. Med., 24, 203-210 (1975)] az urcáz és a foszforiláz cianobromidos hasítását írják 1c. Vizsgálataikból kitűnik, hogy 2-nicrkapto-etanol hozzáadásával növelhető a hasítás hatásfoka; minden esetre azonban e hatás okára nézve nincs feltételezésük. Azt is leírják továbbá, hogy e hatás nem érhető el, ha ditiotreitet vagy tiodiglikolt használnak.

Azt találtuk, hogy a cianobromid által okozott nem-kívánatos diszulfid átalakulás és az irreverzibilis cisztein módosulás a rekombináns DNS eljárás során nyert, fermentációs termékekben csökkenthető vagy kiküszöbölhető, ha a reakcióelegynek cianobromidos hasítást megelőzően csekély mennyiségű tioszulfát iont adunk. A tiol-tartalmú peptidek rekombináns DNS eljárásokkal való előállítása rendszerint a rekombináns szervezetek fermentációját, a fermentléből a szilárd anyagok kinyerését, a génfúziós termék cianobromidos hasítását és a hasított termék szulfitolizisét 2 öleli fel. így olyan S-szulfonált pepiidet nyerünk, amely egy függetlenül nyert S-szulfonált peptiddel kombinálható vagy önmagával kapcsolva adja a kívánt diszulfid tartalmú terméket. A termékek így nyert keverékének szulfitolizise során megfigyeltük, hogy a cianobromid hatása a tiol-tartalmú anyagokra olyan jelentős mennyiségű irreverzibilisen módosított származékok keletkezéséhez vezet, ami bonyolítja a kromatográfiás tisztítás műveleteit és csökkenti a .kitermelést. Ily módon mind termékveszteség, mind pedig kromatográfiásan hasonló szennyezések állnak elő. E hátrányok közül — felismerésünk szerint — mindkettő számottevően csökkenthető vagy kiküszöbölhető a tioszulfát ion jelenlétével.

Azt találtuk továbbá, hogy a tioszulfát ion használata tiolcsoportokat tartalmazó peptidek cianobromidos hasításánál további előnyökkel is jár. Az eljárás során egy közbenső termék, feltehetően a szulfenil-Sszulfonát keletkezik, amely megkönnyíti a szokás szerint soron következő szulfitolízis-reakciót. A szulfitolízis hagyományosan abból áll, hogy a tiol-tartalmú pepiidet nátrium-szulfittal kezeljük oxidálószer jelenlétében, amelyek közül a legelőnyösebbnek a nátriumtetrationát mutatkozott. A cianobromidos hasitás alatt a tioszulfát jelenléte következtében keletkező közbenső termék a költséges nátrium-tetrationát nélkül is könnyen szulfitolizált termékké alakítható nátrium-sziilfitos kezeléssel.

Ily módon jelen találmány tárgya egy olyan hasítási eljárás, amelynek során a tiolcsoportot (—SH) tartalmazó peptidek cianobromidos metionil-hasítását tioszulfát ion jelenlétében végezzük.

A találmány szerinti reakcióelegy egy peptidet, cianobromidot és tioszulfát iont tartalmaz. A peptid legalább egy cianobromiddal megtámadható és karboxil-végénél hasítandó metionint és legalább egy tiolcsoportot tartalmazó aminosavat tartalmaz. Azokra a peptidekre, amelyek fentebbi követelményeknek eleget lesznek, példaként szolgálnak; a növekedési hormonok, a proinzuliiiok, az inzulin A-lánca és az inzulin B-lánca.

A találmány szerinti hasítási reakciót vizes-savas oldószerben vitelezzük ki. A használható jellegzetes savak: trifluor-ecetsav, ecetsav, sósav, kénsav, foszforsav, hangyasav és hasonlók. A hangyasav használata különösen előnyös. Bár más, nem vizes és nem savas oldószereket is tartalmazhat az oldószer-elegy, különösen előnyös, ha a sav arányát a vízhez gondosan ellenőrizzük. Akár tartalmaz az oldószer-elegy nemsavas, nem-vizes alkotórészeket, akár nem, célszerűen a jelenlevő sav a vízhez képest mólfeleslegben van. A hangyasav esetében az előnyös sav-víz elegy a 67,5%-os (térfogat) hangyasav-tartalmú oldat.

A cianobromidból az elegyben célszerűen olyan mennyiség van jelen, ami legalább 1—1 mólnyit biztosít a peptid kiindulóanyagban levő minden metioninmaradékra vonatkozóan. A cianobromidból nagy felesleg minden káros kihatás nélkül alkalmazható; ezért általában a cianobromid a pepiidben levő összes iiictloitil-iuurndékhoz képest 6—10-szcrcs mólarányban kerül alkalmazásra. Amennyiben cianobromidból nem használnánk annyit, amennyi normális körülmények között fölöslegnek számítana, e találmány értel-23

191 310 méhen további olyan mennyiségű cianobromidot kell az elegyhez adni, amely az elegyben levő tioszulfát ionhoz képest az egyenlő mólarányt biztosítja. Mindenesetre legalább annyi cianobromidot kell alkalmazni, hogy a metionin-maradékra és a tioszulfátra vonatkoztatva ezek mólösszegét jóval meghaladó i felesleget alkalmazunk.

; A találmány szerinti eljárás lényege a tioszulfát ion hozzáadása. A tioszulfátot jellegzetesen szervetlen sójának alakjában adagoljuk, általában alkálifémsó, például nátrium-tioszulfát, kálium-tioszulfát és hasonlók formájában. Előnyös a nátrium-tioszulfát.

A használt tioszulfát mennyisége közvetlenül az elegyben levő tiol mennyiségének függvénye. Legalább egy mól tioszulfátot kell egy mól tioíra alkalmazni, és amennyiben a reakcióelegyben nukleofil i vegyűletek is jelen vannak, további megfelelő lio' szulfát mennyiség szükséges ezek miatt és semlegesítésükre. Ezért célszerűen tioszulfát felesleg alkalmazható például a tiol-tartalomra vonatkoztatva egészen a tízszeres mennyiségig, káros hatás nélkül. Noha az eljárásban alkalmazható tioszulfát mennyiségnek nincs felső határa, mégis — miután a tioszulfát cianobromidot fogyaszt — túlzott feleslege a normál feltételek melletti cianobroinid szükségletet messze nieghaladó mennyiséget igényel. A tioszulfát mennyiségét ezért előnyösen úgy választjuk meg, hogy a cianoi bromid felesleges felhasználását elkerüljük.

I A találmány szerinti eljárással a hasítási reakciót 15 °C-tól a cianobroinid forráspontjáig (35 °C körül) terjedő hőmérsékleten vitelezzük ki. A reakciót előnyösen 15 °C és 30 °C közötti, és leginkább előnyösen • 20 C és 25 °C közötti hőmérsékleten vitelezzük ki.

A reakciót a hasítás tökéletes végrehajtásáig szükséges ideig végezzük, általában 12 óráig terjedően. Normális körülmények között a reakció 6 óra elteltével tökéletesen lezajlik.

A hasítás teljes lezajlása után a reakcióelegyet általában 25 °C körüli hőmérsékleten, csökkentett nyomáson csaknem szárazra pároljuk. A maradékot vízben oldjuk az eredeti töménység kétszeresének mértékéig, és az oldatot liofilizáljuk. Λ liofilizált nyers, : szilárd maradék szulfitolízisét általában 50 g/l termék 7 mól karbamid oldatban való oldása esetén 0,1 mól nátrium-szulfit, 1 mmól cisztein és 0,1 mól etiléndiamin jelenlétében 8,5 pH-értéken, 22 °C-on, 8 órán keresztül végezzük.

A következő példák arra hivatottak, hogy a találmány szerinti eljárást szemléltessék. Mindezek a találmány széles terjedelmet nem szándékoznak korlátozni.

A példákban használt kiindulási anyagok minden esetben egy változó hosszúságú peptid-láncot tartalmaznak, melynek C-terminális aminosava Met. A metionin karboxilcsoportjához kapcsolódik peptidköléssel a kívánt peptid-szckvencia, mely a következő:

' Inzulin A-lánc:

Gly-lle-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Uc-Cys-Ser-LcuTyr-Gln-Leu-Gln-Asn-Tyr-Cys-Asn

Inzlin B-lánc:

NHj-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-LeuVal-Gln-Ala-Leii-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Gln-Arg-GlyPhe-Phc-Try-Thr-Pro-Lys-Thr

Humán proinzulin:

Inzulin B lánc (1—30) -Arg-Arg-Glu-Ala-GJu Asp-LeuGln-V al-Gly-Gln-V al-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly Pro-Gly-AlaGly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-GlnLys-Arg-Inzulin A-lánc.

1. példa

Inzulin A-kínca hasított gén fúziós termékének előállítására

Az inzulin A-lánc liofilizált fermentlé [előállítását lásd: Goeddel és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76, 106-110 (1979)] 500 mg-jához 10 ml

67,5 %-os (tf/tf) hangyasavat adunk. Ehhez 15 perces keverés után 15 mg (3%-ot súly/súly arányban a liofilizált fermentlére számítva) nátrium-tioszulfát-pentahidrátot adunk. A nátrium-tioszulfát feloldódását követően 0,05 mól (53 mg) koncentrációig cianobromidot adunk hozzá. A reakció 22 °C-on 12 óra alatt teljesen lezajlott. Az anyagot vákuumban bepároljuk, eredeti töménységéhez képest kétszeres mennyiségű vízzel okijuk és liofilizáljuk.

2. példa

Inzulin B-lánca hasított génfiiziós termékének előállítása

A B-lánc (előállítását lásd a fenti cikkben) liofillzált fermentlé 900 mg-jához 67,5 %-os (tf/tf) hangyasavat adunk. Ehhez 15 perces keverés után 27 mg (3% súly/súly arányban a szilárd fermentlére számítva) nátriuni-tioszulfát-pcntahidrátot adunk. A nátriumtioszulfát feloldódását követően 0,10 mól koncentrációig (106 mg) cianobromidot adunk hozzá. A reakció 22 °C-on 12 óra leforgása alatt tökéletesen lejátszódott. A mintát vákuumban bepároljuk, vizzel eredeti töménységének kétszeresére hígítjuk és liofilizáljuk.

3. példa

Proinzulin hasított génfúziós termék előállítása

A proinzulin liofilizált fermentlé (előállítását lásd a 4 430 266 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban) 1 g-jához 10 ml 67,5%-os (tf/tf) hangyasavat adunk. 15 perces keverés után 30 mg (a nyers szilárd fermentlé 3 súly/súly%-a) nátriumtioszulfát-pentahidrátot adunk hozzá. A nátriumtioszulfát feloldódása után 0,10 mól koncentrációig (106 mg) cianobromidot adunk hozzá. A reakció

191 310 °C-on 12 óra alatt tökéletesen lezajlott. A mintát vákuumban bepároljuk, vízzel eredeti koncentrációjának kétszeresére hígítjuk és liofilizáljuk.

4. példa

Hasított génfúziós termékek szulfitolizise

Az ,1-3. példák szerint nyert hasított génfúziós W termékeket a következő eljárás szerinti szulfitolízisnek vetünk alá:

500 mg éianobromiddal hasított fcrmcnlációs anyagot pH 8,5 értéknél 10 ml 0,1 mól etilén-diainiii'7 mól ionmentesitett karbamid oldatban oldjuk ts 0,1 mól koncentrációig nátrium-szulfátot és 1 m.iól koncentrációig cisztelnt adunk hozzá. A feloldódást követően a reakció 22 °C-on 8 óra alatt tökéletesen lejátszódik.

Az 1-3. példákban leírt termékek szulfítolízisét összehasonlítottuk olyan anyag szulfitolizisével, melyet cianobromiddal azonban nátrium-tioszulfát nélkül hasítottunk. Amint azt a következő táblázat bemutatja, a nátrium-tioszulfát jelenléte a cianobromidos hasításban lényegesen megnöveli a szulfitolízishez rendelkezésre álló termék mennyiségét és a szulfitolízis eredményezte termék arányát a szilárd maradék százalékában.

Táblázat

A szulfitolízis kiinduló anyaga	Na₂SSO, a cianobromid hasításban	Na₂S„O₆a szulfitolízisben	Kitermelés, mg/g szilárd anyag a reakció lefutásának adott órájában
2	6	24
Inzulin A-lánc	nem	nem	1,8	5,0	_
Inzulin A-lánc	igen	nem	7.1	6,8	-
Inzulin A-lánc	nem	igen	6,5	-	-
Inzulin B-lánc	nem	nem	8,4	9,6	—
Inzulin B-lánc	igen	nem	11,5	12,4	—
Inzulin B-lánc	nem	igen	9,4	-	-
Proinzulin	nem	nem	0.8	3,0	4,1
Proinzulin	igen	nem	7.8	9,4	9,1
Proinzulin	nem	igen	5,4	—	—

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás tiol-csoporlo(ka)t tartalmazó peptidekben a metionin karboxilcsoportjánál levő peptidkötés cianobromiddal végzett hasítására, azzal jellemezve, hogy a hasítást a pepiidben levő tiolcsoport(ok)hoz képest feleslegben levő tioszulfát ion jelenlétében végezzük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hasítási reakcióelegyben a tioszulfát iont alkálifémsójaként alkalmazzuk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkálifémsóként nátrium-tioszulfátot alkalmazunk.

40
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hasítást 15 °C és 35 C közötti hőmérsékleten végezzük.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hasítást 20 °C és 25 °C közötti hőmérsékleten

45 végezzük.

Rajz nélkül

Kiadja az Országos Találmányi Hivatni A kiadásért felel: Himer Zoltán osztályvezető Megjelent a Műszaki Könyvkiadó gondozásában

COPYLUX Nyomdaipari és Sokszorosító Kisszövetkezet