HU180746B - Process for preparing the antibiotic a-21978 - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás az A—21978 antibiotikumok előállítására.

Bár nagyon sok baktériumellenes hatású vegyületet ismerünk, az előzőeknél jobb tulajdonságú antibiotikumok iránt igény van. Az antibiotikumok különböznek egymástól abban, hogy mennyire hatásosak a betegséget okozó mikroorganizmusokkal szemben, továbbá folyamatosan jönnek létre azok a mikroorganizmus törzsek, amelyek rezisztensek a napjainkban használt antibiotikumokkal szemben. Ezenfelül egyes betegek gyakran nem képesek szedni egyes antibiotikumokat • hiperérzékenységük és/vagy toxikus hatásaik miatt.

J* Ezért fennáll az igény jobb hatású új antibiotikumokkal szemben.

Az A—21978C antibiotikumok közeli rokon vegyüleí tei a savas peptid antibiotikumoknak. Az előzőleg ismert és az ebbe az osztályba tartozó antibiotikumok például a krisztallomicin, amfomicin, zaomicin, aszpartocin és a glumamicin (lásd Korzybski, Kowszyk-Gindifer és Kurylowicz, „Antibiotics Origin, Natúré and Properties” 1. kötet, Pergamon Press, New York, Ν. Y.

1967., 397—401. és 404—408. oldal); tsushimícin (Shoji és munkatársai, J. Antibiotics, 27, 439—443., 1968); laspartomicin (Naganawa és munkatársai, J. Antibiotics, 27, 55, 1968); brevistin (Shoji és Kató, J. Antibiotics, 29, 380—389., 1976); cerexin A (Shoji és munkatársai, J. Antibiotics, 29, 1268—1274., 1976) és cerixin B (Shoji és Kató (J. Antibiotics, 29, 1275—

1280., 1976). Ezek az antibiotikumok a brévistin, cerixin A és a Cérixin B az előzőleg ismert antibiotikumok közül azok, amelyek legközelebb állnak szerkezetileg az új A—21978C antibiotikumokhoz.

A találmány tárgya eljárás antibiotikumok előállítására. Részletesebben a találmány több komponensből 5 álló antibiotikum-keverék előállítására vonatkozik. Az A—21978 antibiotikum-keverék major (nagy mennyiségben jelen levő) komponensként tartalmazza a C, A, B, D és E komponenseket. Az A—21978C komponens maga is szerkezetileg rokon komponensek keveréke, 10 tartalmazza az A—21978C keverék a C_o, C,, C₂, C₃, C₄ és C₅ sója is.

A „keverék kifejezést a fermentációs iparban használt értelemben használjuk, együtt keletkező antibiotikum komponensek keverékére utal. Az antibiotikumok 15 fermentációs előállítását ismerő szakemberek számára világos, hogy az egyes komponensek számának és arányának jelenléte az antibiotikum-keverékben a használt fermentációs körülményektől függ. Az A—21978C keverékben a C|, C₂ és C₃ nagy mennyiségben van jelen 20 (major komponens), míg a C_o, C₄ és C₅ komponens kis mennyiségben van jelen (minor komponensek).

A találmány szerinti eljárással előállított antibiotikumokat A—21978 antibiotikumoknak neveztük el. A rövidség kedvéért az A—21978C keveréket, az 25 A—21978C keveréket, az A—21978C komponenseket, a C_o, C|, C₂, C₃, C₄ és C₅ vegyületeket és ezek gyógyszerészeti szempontból elfogadható sóit A—21978 antibiotikumoknak fogjuk nevezni.

Részletesebben a találmány tárgya eljárás az A—21978 30 antibiotikum-keverék előállítására a Streptomyces ro-1180746 seosporus NRRL 11379 mikroorganizmus vagy ennek egy A—21978-at termelő mutánsának süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények közötti tenyésztésével.

A találmány tárgya továbbá eljárás az A—21978 antibiotikum-keverék és keverék-komponenseinek, a C_o, C_p C₂, C₃, C₄ és C₅ előállítására.

A találmány értelmében az A—21978 antibiotikumkeverék előállítására a Streptomyces roseoporus NRRL 11379 törzset vagy ennek egy A—21978 antibiotikumot termelő mutánsát felhasználható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon süllyesztett és levegőztetett fermentációs körülmények között addig tenyésztjük, míg jelentős mennyiségű antibiotikum keletkezik.

Amikor jelentős mennyiségű antibiotikum keletkezett, az A—21978 keveréket oly módon különítjük el, hogy szűrjük a fermentlevet, a szűrlet pH-ját 3-ra csökkentjük, megvárjuk, míg a keverék kicsapódik, amit azután szűréssel elkülönítünk. Az elkülönített keveréket adott esetben extrakcióval tovább tisztítjuk. Az A—21978C keverék és ennek egyes komponenseinek izolálására kromatográfiás elkülönítést használunk.

A találmány szerinti eljárással előállított A—21978 antibiotikumok gátolják a betegséget okozó mikroorganizmusok növekedését, különösen a Gram-pozitív baktériumokét.

Az A—21978C antibiotikumok nátrium-sójának KBr tablettában vizsgált infravörös abszorpciós spektrumát a mellékelt ábrákon adjuk meg a következők szerint:

1. ábra: A—21978C keverék.

2. ábra: A—21978C C₍ komponens.

3. ábra: A—21978C C₂ komponens.

4. ábra: A—21978C C₃ komponens.

5. ábra: A—21978C C_o komponens.

6. ábra: A—21978C C₄ komponens.

7. ábra: A—21978C C₅ komponens.

A találmány szerinti A—21978C komponensek szorosan rokon pepiid antibiotikumok. Nem kevesebb mint hat antibiotikum komponenst kaptunk a fermentléből keverékként, és ez A—21978C keverék. Az alábbiakban megadjuk a C_o, C,, C₂, C₃, C₄ és C₅ komponensek egymástól való elkülönítését.

Az A—21978C komponensek egymással szorosan rokon savas, ciklusos polipeptid típusú antibiotikumok, amelyek a terminális aminocsoporton egy zsírsav acilcsoportját hordozzák. Hidrolízist követően mindegyik komponens a következő aminosavakra esik szét:

Aminosav	Mólok száma
Aszparaginsav*	4
Glicin	2
Alanin	1
Szerin	1
Treonin	1
Triptofán	1
Ornitin	1
Kinurenin	1
3-metil-glutaminsav**	1

* Egyike aszparagin lehet.

·* 3-metil-glutaminból keletkezhet.

Az A—21978C komponensek mindegyike zsírsavat tartalmaz. Az 1. táblázatban összefoglaljuk a zsírsavak szénatom-tartalmát és ahol ismert, megadjuk magát a zsírsavat, amely az egyes A—21978C komponensekben 5 van jelen.

1. táblázat

Zsírsav

A—2Í978C komponens	Szénatomszám	Meghatározás
C,	11	8-metil-dekánsav
c2	1.2	10-metil-undekánsav
C3	13	10-metil-dodekánsav
Co	10	—
C4	12	—
C5	13	—

Az Edman-degradáció során kapott eredmények azt jelzik, hogy az N-terminális aminosav triptofán és a következő szomszédos aminosav aszparaginsav.

Gázkromatográfiás tömegspektrum mérések szerint az A—21978C C₂ komponens az alábbiakban megadott 25 két szerkezet közül az egyiknek megfelelő szerkezetű (az Asx aszparaginsavat vagy aszparagint, a MeGlx 3-metil-glutaminsavat vagy 3-metil-glutamint jelent):

O

1. C||H₂₃C-N-H-Trp-Asx-Thr-Gly-Orn-Asx-Ala-Asx-Gly-Ser-MeGlx-Kyn.

O

2. C| _tH₂₃C-C-N-H-Trp-Asx-Thr-Gly-Orn-Asx-Ala35 -Asx-Asx-Gly-Ser-MeGlx-Kyn.

Az A—21978C C₂ komponens karboxi-peptidáz Y enzimmel végzett hidrolízise szerint a kinurenin a C-terminális aminosav és a C-terminális karboxilcsoport észterezheti a treonin csoport hidroxilcsoportját.

Az előző vizsgálatok szerint az A—21978C antibiotikumok lehetséges szerkezete az I képleten megadott, ahol 3 MG L-threo-3-glutaminsav és az R különleges zsírsav, amely az egyes komponenseknél a következő:

45 A—21978C komponens	R •
C(	8-metil-dekanoiIcsoport
50 C2	10-metil-undekanoilcsoport
c3	10-metil-dodekanoilcsoport	*
Co	C I0-alkanoilcsoport*
C4	C12-alkanoilcsoport*
Cj	Cl3-alkanoilcsoport*

* Nincs meghatározva.

Az A—21978C keverék és egyes komponensei nátrium-sóként vízben, savas és alkalikus oldatokban old60 hatók, kivéve akkor, ha a pH 3,5-nél kisebb. Oldódnak rövidszénláncú alkoholokban, például metanolban, etanolban, propanolban vagy butanolban, továbbá dimetil-formamidban, dimetil-szulfoxidban, dioxánban és tetrahidrofuránban. Gyengén oldódnak vagy oldhatat65 lanok acetonban, kloroformban, dietil-éterben, benzol-2180746 bán, etil-acetátban és szénhidrogénekben. Az A—21978C keverék és az egyes komponensek sóként oldódnak vízben, metanolban, dimetil-formamidban és dimetil-szulfoxidban; oldhatatlanok oldószerekben, például etanolban, butanolban és dioxánban. A 2. táblázatban megadjuk az A—21978C komponensek nátrium-sójának közelítő százalékos elem-összetételét.

2. táblázat

A—21978C komponens

	Elem	Co	ct	c2
számított	mért	számított	mért	számított	mért
Á	c	52,61	52,07	52,89	52,47	53,17	51,87
	H	6,07	5,95	6,14	5,93	6,21	6,05
	N	13,63	12,73	13,52	13,38	13,41	13,66
r	O	26,28	25,84	26,06	26,19	25,84	25,86
	Na*	1,40	3,41	1,39	2,03	1,38	2,56
	Elem	c4	c3	C5
		mért	számított	mért		mért
	c		52,73	53,44	54,18		52,76
	H		5,99	6,28	6,35		6,71
	N		14,07	13,29	13,34		13,97
	O		25,81	25,63	25,06		25,60
	Na*		1,40	1,36	1,07		0,96

* A különbség alapján.

Az A—21978C keverék és egyes komponenseinek (nátrium-sók) kálium-bromid tablettában vizsgált infravörös abszorpciós spektrumát az 1—7. ábrán adjuk meg (lásd: melléklet!).

A 3. táblázatban megadjuk a fentiek legjelentősebb abszorpciós maximumait.

3. táblázat

Az A—21978C keverék és komponensek infravörös abszorpciós maximumai (cm^-1)

-	Keverék	Co	c,	c2	c3	c4	c5
	3310	3300	3300	3310	3310	3320	3300
	3050	3050	3040	3050	3040	3050	3045
	2910	2910	2910	2910	2910	2920	2910
	2840	2840	2840	2840	2835	2850	2840
	1655	1650	1650	1665	1650	1655	1650
	1540	1540	1535	1535	1535	1525	1525
	1450	1445	1450	1450	1450	1455	1455
	1395 1310	1395	1395	1400	1395	1395	1390
	1240	1215	1220	1225	1225	1220	1215
	1160	1155	1160	1160	1160	1160	1155
	1065	1060	1065	1065	1060	1065	1055
	745 645 555 518	745	745	745	745	740	735

Az A—21978C komponensek molekulasúlyát és , tapasztalati képletét a 4. táblázatban ismertetjük.

5	4. táblázat
A—21978C komponens	Molekulasúly	Képlet
	Co		1622	ύ72Η100Ν 16O27
10	C(		1636	C73H102N16O27
	c2		1650	C74H104N16O27
	C3		1664		= 75H106N|6O27
	C4		1650		-74^104^16^7
	C5		1664		-75H106N16°27
15
	Az 5. táblázatban megadjuk az A—21978C komponensek három major komponense (nátrium-só) ultraibolya abszorpciós spektrumának elnyelési maximumait. A vizsgálatot semleges etanolban végeztük.
20
			5. táblázat
	UV maximumok (etanol-semleges)
			cl% ^lcm
25	nm		c.	c2	c3
	223		307		303	300
	260		62		62	63
	280		39		41	42
30	290		35		36	38
	360		33		33	32

A 6. táblázatban megadjuk az A—21978C komponensek közül a három majorénak és az A—21978 keverék 35 (nátrium-só alakban) 66%-os vizes dimetil-formamidban vizsgált elektrometrikus titrálásának adatait.

6. táblázat

Titrálás (66%-os DMF)
40 A—21978C	pKa érték*
Komponens C“	5,7, 5,9; 7,2, 7,6
Komponens C2 X	5,8, 5,93; 7,6, 7,63
45 Komponens C™	5,73, 5,75; 7,54, 7,58
Keverek	5,62; 7,16
* Kevesebb csoport: 11,5—12-nél.
** Két meghatározás.
50

Az A—21978C komponensek (nátrium-só) optikai forgatásának (.)^, vízben kapott eredményeit a 7. táblázatban adjuk meg.

55	7. táblázat Optikai forgatás
A—21978C komponens	Forgatás
60	Co	+ 11,9° (k: 0,7, H2O)
	Ci	+16,9° (k: 0,7, H2O)
	C2	+ 18,6° (k: 0,9, H2O)
	c3	+20,9° (k: 0,4, H2O)
	C4	+ 14,8° (k: 0,7, H2O)
65	C5	+ 17,9° (k: 0,7, H2O)

-3180746

Az A—21978C komponenseket nagyfelbontású folyadékkromafögráfiával áz'alábbi'körülmények között elkülöníthetjük:

oszlop: üveg, 1x21 cm töltet: szilikagél, C₁₈ (Quantum LP—1);

oldószer: 0,'2% ecetsav és ó,2% piridint tartalmazó alábbi összetételű elegy: víz : metanol: acetonitril = =95:30:75;

detektor: UV, 285 nm;

nyomás: 8,5 atm.

Az A—21978C komponensek nátrium-sóinak retenciós idejét a 8. táblázatban adjuk meg.

' ' 8‘. táblázat ..

Nagyfelbontású folyadék-kromatográfiás retenciós idők

21978C komponens	Idő, (perc) >4 ’.l.r-.A'V'·*·’··'···*'	'·’*· (Micrococcus Blolóeiai mérés luteus)’· <··->·.·.···>ι ;/··’ . egység, (mg)
c0	6 · !·	966
Cj	8	1663
c4	9	1410
c2	13	T39Ö
C5	... 14	. 1246
C3	19	803

Az A—21978C keverék elválasztható és az A—21978 A, B, D és E komponensektől szilikagél vékonyrétegkromatográfiával megkülönböztethető. Oldószér-elegyként acetonitril és víz 3 : 1 arányú elegyét használjuk, a biológiailag aktív foltokat biológiai méréssel, Microcó'c&üS luteus mikroorganizmussal detektáljuk. A 9. táblázatban megadjuk az A—21978 komponensek nátriumsóinak R_f-értékéít.

9. táblázat

A—21978 komponens	Rf-érték
A	0,66
B	0,57
C keverék	0,31
D	0,51. _____
E	0,48

Az A—21978C keverék összetevőit elkülöníthetjük és egymástól megkülönböztethetjük reverz fázisú szilikagél (Quantum C₁₈) kromatográfiával. Oldószer elegyként víz, metanol és acetonitril 45 : 15 : 40 arányú elegyét használjuk, amely 0,2% piridint és 0,2% ecetsavat tartalmaz. A detektálást hosszú hullámú UV-fénnyel (365 nm) végezzük. Az A—21978C komponensek nátrium-sóinak R_f-értékeit a fenti rendszerben a 10. táblázatban adjuk meg.

Γ0' táblázat

A—21978C komponens R_f-érték

c0 ' ’ ' ’	0,71
Cj ' -	0,64
c2 · ·	’ 0,56
c3 -	0,47
Cl	0,63
c>	·- 0,53

Az A—2Í978C komponensek és az A—21978 keverék pH=2 és pH=9 közötti oldatokban Y C° és 25C° közötti hőmérsékleten legalább hét napon át stabil. pH = 11-en instabil (4 óra múlva teljesen inaktiválódik), 5 mind 5 C°-on, mind 25 C°-on,

Az A—21978, az A—21978C keverék és az A—2I9/8C komponensek, nevezetesen a C_o, C₍, C₂; C₃j C₄ és C₅ sókat képeznek. A sókat a keverékek elkülönítésére és tisztítására és az egyes komponensek elkülönítésére 10 használjuk. Ezenfelül különösen előnyös tulajdonságokkal rendelkeznek a gyógyszerészeti szempontból, elfogadható sók. A „gyógyszerészeti szempontból elfogadható” sók azok a sók, amelyek toxicitása a melegvérű állatokkal szemben nem nagyobb mint a nem só alaké. 15 Az A—21978 antibiotikumoknak^ öt szabad, sóképzésre alkalmas karboxilcsőpörtja van. így a találmány oltalmi köréhez részleges, kevert és teljes sók is tartoznak. A sók előállítására olyan körülményeket választunk, ahol a reakc'ióelegy pH-ja nem nagyobb mint 10, 20 mivel ezen a ρΗ-értéken az antibiotikumok bomlanak.

Az A—21978 antibiotikumoknak két szabad aminocsoportja van, ily módon mono- vagy di-savaddíciós sókat képeznek.

Különösen előnyös tulajdonságúak a gyógyszerészeti 25 szempontból elfogadható alkálifém-, alkáli-földfém- és amin-sók, és továbbá a. savaddiciós sók. Az A—21978 antibiotikumok előnyös alkálifém- és alkáli-földfém-sói közül megemlítjük a nátrium-, kálium-, lítium-, cézium-, rubídium-, bárium-, kalcium- és magnézium-sókat. 30 Az A—21978 antibiotikumok előnyös amin-sói például az ammónium-sók, a primer, szekunder és tercier 1— 4 szénatomos alkil-ammónium- és hidroxi-(2—4 szénatomos)-ammóniumsók. Az amin-sók közé tartoznak azok, amelyek egy A—21978 antibiotikumnak az am35 mónium-hidroxiddal, metil-aminnal, szekunder-butil-aminnal, izopropil-aminnal, dietil-aminnal, di-izo-propil-aminnal, etanol-aminnal, trietil-aminnal, 3-ámino-l-propanollal és hasonlókkal való reakciókor keletkeznek.

Az A—21978 antibiotikumok alkálifém- és alkáli-földfém-kationos sóit a kationos sók általános előállítási szabályaik szerint kapjuk meg. Például úgy járunk el, hogy az A—21978C Cj komponens szabad savas alakját előnyös oldószerben, például meleg metanolban 45 vagy vízben oldjuk; az oldathoz olyan vizes metanolt adunk, amely sztöchiometrikus mennyiségű kiválasztott szervetlen bázist tartalmaz. A képződő sót ismert módszerekkel, például szűréssel vagy az oldószer desztillációval való eltávolításával különítjük el.

Hasonló módon állítjuk elő a szerves aminokkal képzett sókat. Például úgy járunk el, hogy az A—21978C Cj komponenst megfelelő oldószerben, például acetonban oldjuk, majd az oldathoz gáz alakú vagy vizes amint adunk. Az oldószert és a fölös mennyiségű amint desz55 tillációval eltávolítjuk.

Az A—21978 antibiotikumok előnyös savaddiciós sói azok a sók, amelyek szerves vagy szervetlen savakkal, például hidrogén-kloriddal, kénsavval, foszforsavval, ecetsavval, borostyánkősavval, citromsavval, tejsavval, 60 almasavval, fumársavval, palmitinsavval, kolsjjvval, pamoénsavval, D-glutaminsavval, d-kámforsavval, glutársavval, ftálsawal, borkősavval, laurinsavval, sztearinsavval, szalicilsavval, metán-szulfonsavval, benzol-szulfonsavval, pikrinsavval, benzoesawal, fahéjsavval 65 és más hasonló savakkal képződtek.

-4180746

Az állatgyógyászok között ismeretes, hogy az állatok antibiotikummal való kezelésekor nem lényeges, hogy az antibiotikumot milyen alakban adagoljuk. A legtöbb esetben az állati szervezetben a gyógyszer más alakúvá alakul át, mint ahogy adagoljuk. Ezért nem lényeges, hogy milyen sót adagolunk. A kiválasztott sónak olyan igényeknek kell eleget tennie, mint a gazdaságosság, kényelmes adagolhatóság és kezelhetőség, továbbá toxicitás.

A továbbiakban ismertetjük a mikroorganizmust, amellyel a találmány szerinti vegyületet előállítjuk.

A találmány szerinti eljárás során használt mikroorganizmust Mertz és Kastner tanulmányozta a Lilly Research Laboratories laboratóriumaiban.

Az A—21978C antibiotikumok előállítására használt új mikroorganizmust Törökországban, az Ararát hegyen gyűjtött földmintából izoláltuk. A mikroorganizmus új és a Streptomyces roseosporus (Falcao de Morias és Balia Maia, 1961) nevet kapta. A mikroorganizmus rendszertani tanulmányozását ismert leírásokkal összehasonlítva végeztük (Buchanan és Gibbons, Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, The Williams és Wilkins Company, 8. kiadás, 1974; továbbá Shirling és Gottlieb, Cooperative Description of Type Strains of Streptomyces, Intern., Journal Of Systematic Bacteriol., 25 808—809., 1972).

A vizsgálatokat az International Streptomyces Project (Shirling és Gottlieb, Methodes of Characterization of Streptomyces Species Intern. Journal of Systematic Bacteriol., 16, 313—340., 1966) javaslatai alapján végeztük bizonyos kiegészítő vizsgálatokkal együtt.

A szénforrás hasznosítási spektrumot az ISP 9 alaptáptalajon határoztuk meg, amelyhez azonos végkoncentrációban 1,0% szénforrást adtunk. A szénforrást szűréssel sterilizáltuk, az alaptáptalajt pedig autoklávozással. A lemezeket 30 C° hőmérsékleten 14 napon át inkubáltuk. A sejtfalban levő cukrokat Lechevalier módszerének módosításával végeztük (Lechevalier, Chemical Methods as Criteria fór the Separation of Actinomycetes intő Genera, Workshop sponsored by the Subcomittee on Actinomycetes of the American Society of Microbiology, dr. Thomas G. Fridham, Convenor; Institute of Microbiology, Rutgers University, The State University of New Jersey, New Brunswick, New Jersey, 1971).

Az izomer diamino-pimelinsavat Becker és munkatársai szerint határoztuk meg (Becker és munkatársai, Rapid Differentation Norcardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole Cell Hydrolysates,

Appl. Microbiol., 11, 421—423, 1964). 50

Az aminosav-analízist mosott sejtfal fragmensekböl végeztük. A melanoid színanyagot ISP 1 (tripton-élesztőkivonat), ISP 6 (pepton-éles7tőkivonat-vas-agar), ISP 7 (tirozin-agar), ISP 7 (tirozin nélkül) és tirozin méréssel (Mikami és munkatársai, modified Arai and Mikami Melanin Formation Test of Streptomyces, Intern. Journal of Systematic Bacteriol., 27, 290, 1977) végeztük. A keményítő hidrolízist jóddal bizonyítottuk.

A hőmérséklet érzékenységet, a nátrium-klorid toleranciát, a pH-érzékenységet és az antibiotikum érzékenységet ISP 2 agaron vizsgáltuk. A vizsgált hőmérsékletek: 25 C°, 28 C°, 30 C°, 34 C°, 37 C°, 40 C°, 45 C°, 50 C° és 55 C^c. A nátrium-klorid toleranciát 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 és 12% nátrium-kloridot tartalmazó agaron vizsgáltuk. A tenyészeteket 30 C° hőmérsékleten inkubáltuk. A pH-érzékenységet úgy határoztuk meg, hogy az agar pH-ját kiöntés előtt 3,0-tól 11,0-ig növeltük 1,0 pH egységenként. Az antibiotikum érzékenységet 5 beoltott agar lemezeken határoztuk meg antibiotikumot tartalmazó korongokkal.

A tenyészetek színét az ISCC—NBS-módszer szerint adjuk meg (Kelly és Judd, The ISCC—NBS Methods 10 of Designating Colors and a Dictionary of Color Names, U.S. Department of Commerce Circ, 553, Washington, D.C., 1955).

A zárójelbe tett jelek Tresner és Backus színskáláját jelzik (Tresner és Backus, System of Color Wheels fór 15 Streptomyces Taxonomy, Appl. Microbiol., 11, 335— 338, 1956). A színeknek megfelelő betűket aláhúzzuk. A Maerz és Paul színeket szögletes zárójelben adjuk meg (Maerz és Paul, Dictionary of Color, McGraw-Hill Book Company, Inc., New York, N.Y., 1950).

2C Az alábbiakban megadjuk az A—21978 termelő törzs jellemzését.

Morfológia

Az A—21978 antibiotikumokat termelő tenyészet (A—21978.6) spóratartókat tartalmaz, amelyek RectusFlexibilis (RF) kategóriába tartoznak. A spóraláncok lánconként több mint tíz spórát tartalmaznak. A spórák felülete sima.

Az A—21978.6 tenyészet elsősorban piros ligmicélium spóratömeggel jellemezhető, vörösesbarna hátoldallal. Világosbarna vízben oldódó színanyag jelenléte kimutatható. Ezek a tulajdonságok a 14 vizsgált agar közül hárman megvannak (ISP 2, ISP 7, TPO). Ez a három 35 táptalaj az, amelyeken gazdag ligmicélium és vegetatív növekedés látható.

Két agaron, az ISP 4 és a glükóz-aszparagin-agaron fehér-szürke színű ligmicéliumos spóratömeg látható, a hátoldal színe sárga. Vízben oldódó színanyag nem ke40 letkezik. Ezen a két táptalajon jó, de nem gazdag a ligmicélium és a vegetatív növekedés.

További kilenc agar-táptalajt vizsgáltunk, de ezeken vagy nagyon szegényes a növekedés és a spórázás, vagy egyáltalán nem következik be. Ha a ligmicélium kifej4? lödik, ha szegényesen is, fehér-szürke színű.

Melanoid típusú színanyag nem keletkezik. A sejtfal az alábbi nagy mennyiségben jelenlevő vegyületeket tartalmazza: LL-diamino-pimelinsav, glicin, glükóz és ribóz. Ez I típusú sejtfalra utal, továbbá C típusú cukorképre (Buchanan és Gibbons, Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, The Williams and Wilkins Company, 8. kiadás, 1974, 658. oldal).

Az A—21978.6 tenyészetet a következő öt törzzsel hasonlítottuk össze:

5.5 Streptomyces albovinaceous ISP 5136; ATCC 15833; Streptomyces candidus ISP 5141; ATCC 19891; Streptomyces moderatus ISP 5529; ATCC 23443; Streptomyces roseosporus ISP 5122; ATCC 23958; Streptomyces setonii ISP 6395; ATCC 25497.

Ezek a tenyészetek a fehér és a vörös színsorozathoz tartoznak, spóratartó morfológiája RF-típusú, a spóráik felülete sima és az ISP leírásnak megfelelően melaninnegatívok és nem rendelkeznek pontosan leírható hátoldali színnel és vízben oldódó színanyagokkal. Ezek a 65 jellemzők a szénforrás hasznosítási spektrummal és má-5180746 sodlagos tulajdonságokkal együtt megfelelnek az A—21978.6 tenyészet tulajdonságainak.

Amikor ezt az öt törzset összehasonlítottuk a laboratóriumban az A -21978.6 törzzsel, négy különbözőnek látszott. Az S. candidus és az S. setonii sárga színű ligmicéliumot fejlesztett több táptalajon, azaz különbözött az A—21978.6 törzstől. Az S. albovinaceous és az S. moderatus sötét színű hátoldallal bír, vízben oldódó színanyagot termel melaniod típusú színanyagot szintetizál, mindezen tulajdonságok különböznek az A—21978.6 tenyészet tulajdonságaitól. Az TSP leírás szerint az S. moderatus vörösesbarna vagy kifejezetten barna hátoldallal rendelkezik, ez azonban nem jellemzi az S. albovinaceous-t. Egyik tenyészet sem melaninpozitív.

Az A—21978.6 törzset ezért a Streptomyces roseosporus Falcao de Morias és Dalia Maia 1961 faj egy törzsének határoztuk meg. Ez a meghatározás publikált leírásokkal való összehasonlításon és közvetlen labo5 ratóriumi vizsgálatokon alapszik. A közvetlen összehasonlítási vizsgálatokat az alábbiakban adjuk meg.

Tenyésztési tulajdonságok

Morfológia

A—21978.6 S. roseosporus

A spóratartók egyenesek, enyhén hajlítottak (RF), hurkok, horgok vagy spirálok nem látszanak rajtuk. A láncokban álló spórák száma több mint tíz. A spórák 15 felülete sima (elektromikroszkópos vizsgálat).

Spórák:

Átl. méret:

Tartomány:

Sárgarépaszelet:

Burgonyaszelet:

ISP 1 (tripton-élesztőkivonat-agar)

ISP 2 (élesztőkivonat-maláta-agar)

ISP 3 (zabpehely-agar)

ISP 4 (szervetlen sókeményítő-agar)

ISP 5 (glicerin-aszparagin-agar)

ISP 7 (tirozin-agar)

Bennett módosított agarja

Kalciummaláta-agar

Czapek-agar hosszúkású ovális

0,85 x 1,78 μιη

0,65—0,97x0,97—2,6 μηι jól fejlett légmicélium, színe szürke c rózsaszín ; a vegetatív micélium rendkívül jól fejlett, színe barna. Oldódó színanyag nincs, jól fejlett légmicélium, színe szürke c rózsaszín ; a vegetatív micélium rendkívül jól fejlett, színe barna, oldódó színanyag van, színe sötétbarna.

a légmicélium fejlett, színe fehér (W) a; a szubsztrátmicélium jól fejlett, színe halványsárga-zöld; oldódó színanyag nincs.

a légmicélium rendkívül jól fejlett, színe sárgás-rózsaszín, (R) 5eb gy; a vegetatív micélium rendkívül jól fejlett, színe vörösbarna [5D10J; világosbarna színű oldódó színanyag.

a légmicélium fejlett, színe fehér (W) a; a vegetatív micélium fejlett, színe halványsárga-rózsaszín [10A2]; világosbarna oldódó színanyag keletkezik.

a légmicélium fejlett, színe fehér (W) h; a szubsztrátmicélium jól fejlett, színe halvány sárga-zöld [lObl]; világosbarna oldódó színanyag keletkezik.

a légmicélium fejlett, színe pirosas fehér, (W) 13ba; a vegetatív micélium jól fejlett, színe szürkéssárga-rózsaszín [3B7J; szürkésrózsaszín oldódó színanyag látszik.

a légmicélium rendkívül jól fejlett, színe szürkéssárga-rózsaszín (R) 5cb; a vegetatív micélium rendkívül jól fejlett, színe közép vöröses barna [7L12]; sötétbarna oldódó színanyag látszik.

légmicélium nem fejlődik; a szubsztrátmicélium gyengén fejlett, színe halvány sárgabarna; oldódó színanyag nincs.

légmicélium nem fejlődik; a szubsztrát micélium fejlett, színe középvörös-barna [7L12]; világosbarna oldódó színanyag keletkezik.

a légmicélium gyengén fejlett, színe fehér (W) a; a szubsztrátmicélium gyengén fejlett, színe fehéres, oldódó színanyag nincs hosszúkás, hangeres

1,01 x 2,47 [im

0,97—1,3 x 1,63—3,25 um légmicélium nem fejlődik; a vegetatív növekedés jó; oldódó színanyag nincs.

légmicélium nincs, a vegetatív micélium fejlett. Oldódó színanyag nincs.

gyengén fejlett fehér színű (W) a légmicélium; a vegetatív micélium gyengén fejlett, színe halványsárga-zöld; oldódó színanyag nincs.

a légmicélium rendkívül jól fejlett, színe halvány narancssárga (R) 3ca; a szubsztrátmicélium rendkívül jól fejlett, színe világos olívabarna [12L7]; világosbarna oldódó színanyag keletkezik.

a légmicélium gyengén fejlett, színe fehér (W) a; a szubsztrátmicélium fejlett, színe halvány zöldes szürke; oldódó színanyag nincs.

jól fejlett légmicélium, színe halvány narancssárga (R) 302; a szubsztrátmicélium rendkívül jól fejlett, színe szürkéssárga [1115]; oldódó színanyag nem keletkezik, a légmicélium fejlett, színe fehér (W) b; jól fejlett légmicélium, színe szürkéssárga [10C2]; világosbarna oldódó színanyag keletkezik.

a légmicélium rendkívül jól fejlett, színe szürkéssárga-rózsaszín (R) 5cb; a vegetatív micélium rendkívül jól fejlett, színe sárgásbarna [11E5]; világosbarna színű oldódó színanyag látszik.

a légmicélium rendkívül jól fejlett, színe szürkéssárga-rózsaszín (R) 5cb; a szubsztrátmicélium rendkívül jól fejlett, színe szürkéssárga [11D4J; világosbarna oldódó színanyag látszik.

a légmicélium gyengén fejlett, színe fehér (W) a; a vegetatív micélium gyengén fejlett, színe halványsárga-zöld; halványsárga-zöld oldódó színanyag látszik.

légmicélium és szubsztrátmicélium nem fejlődik.

-6180746

Emerson-agar légmicélium gyengén fejlett; a szubsztrátmicélium rendkívül jól fejlett, [13L6]: oldódó színanyag nincs.

Glükóz-aszparagin-agar

Glicerin-glicin-agar

Nutrient (táp)-agar

Paradicsompasztazabpehely-agar a légmicélium jól fejlett, színe fehér (W) b; a szubsztrátmicélium jól fejlett, színe szürkéssárga, [12B2]; oldódó színanyag nincs.

a légmicélium gyengén fejlett; a vegetatív micélium rendkívül jól fejlett, színe sötét szürkésbarna [BL12]; barna színű oldódó színanyag keletkezik.

légmicélium nem fejlődik; a vegetatív micélium gyengén fejlett, színe halványsárga-szürke; oldódó színanyag nincs, rendkívül jól fejlett légmicélium, színe szürkéssárga-rózsaszín (R) 5cb; a vegetatív micélium rendkívül jól fejlett; színe sötét szürkésbarna [0L12]; barna színű oldódó színanyag látszik.

a légmicélium rendkívül jól fejlett, színe szürkéssárga-rózsaszín (R) Seb; a vegetatív micélium rendkívül jól fejlett, színe szürkéssárga (1115]: világosbarna oldódó színanyag keletkezik.

a légmicélium fejlett, színe fehér (W) b;

a vegetatív micélium jól fejlett, színe halvány sárga-zöld ] 12B2]; oldódó színanyag nincs.

a légmicélium rendkívül jól fejlett, színe fehér, (W) b; rendkívül jól fejlett szubsztrátmicélium, színe világossárga, [10G3]; világosbarna oldódó színanyag látszik, fejlett légmicélium, színe fehér (W) b;

jól fejlett vegetatív micélium, színe halványsárga-szürke; oldódó színanyag nincs, rendkívül jól fejlett légmicélium, színe szürkéssárga-rózsaszín (R) 5cb; rendkívül jól fejlett sárga-barna színű [12L7] vegetatív micélium; barna színű oldódó színanyag látszik.

Szénforrás hasznosítás

Szubsztrát A-	-21978.6	S. roseosporus
L-Arabinóz	+		_i_
D-Fruktóz	+		—
D-Galaktóz	+
D-Glükóz	+		+
i-Inozit	—		-
D-Mannit	+		—
D-Raffinóz	-		—
L-Rhamnóz	+		4-
Szalicin	4”		4-
Szacharóz	—		—
D-Xylóz	+		+
Kulcs: + hasznosítás;
— nincs hasznosítás.
Vizsgált tulajdonság A-	-21978.6	S.	roseosporus

25	ISP 6 (pepton-élesztőkivonat-vas)
	ISP 7 (tirozin-agar) ISP 7 módosított (ISP 7 mínusz
30	tirozin)	—	—
	Tirozin mérés	—	—
	Zselatin elfolyósítás	+	+
	Aludttej vizsgálat	enyhe	enyhe
		hidrolízis	hidrolízis
35	Keményítő hidrolízis pH-érzékenység	+	+
	növekszik	5—11	5—11
	Hőmérséklet-
	tartomány	25—40 C°	25—40 C=
40	Nitrát-redukció Nátrium-klorid	—	4-
	tolerancia; növekszik	10%	6%

Melanoid színanyag ISP 1 (tripton-élesztőkivonat)

Az A—21978 antibiotikumokat termelő S. roseosporus NRRL 11379 törzs bizonyos tulajdonságai különböznek a S. roseosporus publikált tulajdonságaitól.

Antibiotikum érzékenység

Antibiotikum	Koncén tráció/korong	Osztály	A—21978.6	S. roseosporus
Eritromicin	15 με	makrói id	4-	+
Cefalotin	30 μg	β-laktám	+	+
Linkomicin	2 με	glükozid	—	-
Nisztatin	100 egység	polién	—	-
Polimixin B	300 egység	peptid	+	—
Sztreptomicin	ίο με	amino-glükozid	+	+
Tetraciklin	30 μg	tetraciklin	+	+
Vankomicin	30 με	glükopeptid	+	+

Kulcs: + érzékeny (gátlási zóna látszik).

- rezisztejis (gátlási zóna nem látszik).

-7180746

Az A—21978.6 tenyészet különbözik a leírt törzstől a spórák nagyságában, a sárgarépa és a burgonyaszeleten való növekedésben, a nátrium-klorid toleranciában és a nitrát-redukcióban.

Az A—21978 antibiotikumokat termelő Streptomyces 5 roseosporus tenyészetet letétbe helyeztük a Northern Régiónál Research Center (U.S. Department of Agrikulture, Agrikultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604) törzsgyűjteményébe, ahonnan az NRRL 11379 számon megrendelhető. 10

Ahogy az más mikroorganizmusok esetén is ismeretes, az A—21978 antibiotikumot termelő Streptomyces roseosporus NRRL 11379 tenyészet tulajdonságai variálnak. így például mesterséges variánsok és mutánsok állíthatók elő az NRRL 11379 törzsből különböző is- 15 mert mutagcn ágensekkel, például ultraibolya sugarakkal, Röntgen-sugarakkal, nagyfrekvenciájú hullámokkal, radioaktív sugarakkal és vegyszerekkel. A találmány szerinti eljárás során az A—21978 antibiotikumokat termelő Streptomyces roseosporus NRRL 11379 20 összes természetes és mesterséges variánsa és mutánsa használható.

A Streptomyces roseosporus NRRL 11379 növesztésére több táptalajt használhatunk. A termelő gazdaságossága, az optimális hozam és a termék könnyű izo- 25 lálása érdekében azonban előnyösen adott összetételű táptalajokat használunk. így például szénforrásként a nagytérfogatú fermentációkor előnyösen tápióka dextrint adagolunk, bár használható a glükóz, fruktóz, galaktóz, maltóz, mannóz, gyapotmag olaj, metil-oleát, 30 glicerin, finomított szójabab olaj és más hasonló vegyület is. Nitrogénforrásként előnyösen enzimesen hidrolizált kazeint, vagy oldódó húspeptont, szójabab lisztet, szójabab hidrolizátumot, szójadarát, élesztőt, aminosavat, például L-aszparagint vagy DL-Ieucint vagy más 35 hasonlókat használunk. A táptalajba adagolható szervetlen sók közül előnyösen használhatjuk az oldódó sókat, amelyek kálium-, ammónium-, klorid-, szulfát- vagy nitrát-ionokra vagy más hasonló ionokra disszociálnak.

Az antibiotikum termelést különösen a kálium-szulfát 40 segíti elő. Használhatunk melaszhamut, hamu dializátumot és szintetikus ásványi keveréket is.

Az A—21978 antibiotikumok termelésekor előnyösen desztillált vagy ionmentes vizet használunk a táptalaj készítésekor. Egyes, a csapvízben levő sók, például a 45 kalciumionok és a karbonáíionok megzavarják az antibiotikum termelést.

A mikroorganizmus növekedését és fejlődését elősegítő esszenciális nyomelemeket szintén be kell adnunk a táptalajba. Ezek a nyomelemek általában szennyező- 50 anyagként jelen vannak a táptalaj többi alkatrészében, mégpedig a mikroorganizmus igényének megfelelő mennyiségben.

A nagytérfogatú fermentációk táptalajába, ha a fellépő habzás problémát okoz, kis mennyiségű (például 55 literenként 0,2 ml) habzásgátló anyagot, például polipropilén-glikolt adunk.

Nagy mennyiségű A—21978 antibiotikum előállítására tankfermentációt végzünk süllyesztett, levegőztetett körülmények között. Kis mennyiségű A—21978 anti- 60 biotikumot előállíthatunk rázott tenyészetekben is. Az antibiotikum termelésben mutatkozó lag miatt a nagyméretű fermentort nem a mikroorganizmus spóráival, hanem vegetatív inokulumával oltjuk. A vegetatív inokulum előállítására kis térfogatú tenyésztő táptalajt a 65 friss, aktívan növő mikroorganizmus spóráival vagy micélium darabkáival oltjuk. A vegetatív inokulummal ezután beoltjuk a nagy térfogatú fermentort.

Az A—21978 antibiotikumokat termelő mikroorganizmus 20 C° és 30 C° közötti hőmérsékleten növekszik. A legtöbb A—21978C antibiotikum 30 C° és 32 C° közötti hőmérsékleten keletkezik.

Ahogy az a levegőztetett, süllyesztett fermentációnál szokásos, a táptalajon steril levegőt vezetünk át. A legtöbb A—21978 antibiotikum akkor keletkezik, ha a táptalaj levegő telítettsége 20% felett van, előnyösen 30% felett (30 C hőmérsékleten és 1 atm nyomáson).

A tankfermentációkkor a fermentációs táptalaj pHját előnyösen 6,5 és 7,0 közötti értéken tartjuk. Ezt megfelelő mennyiségű például nátrium-hidroxid (a fermentáció korai fázisában) és hidrogén-klorid (a későbbi fázisban) adagolásával érhetjük el.

Az A—21978 antibiotikumok termelését a fermentáció során kis minták analízisével követjük; a mintákat a fermentléből vagy a micélium tömeg extraktumából állítjuk eló az antibiotikumra érzékeny mikroorganizmussal szembeni antibiotikum aktivitás méréshez. Egy ilyen méréshez használható mikroorganizmus a Micrococcus luteus. A biológiai értékmérést előnyösen agar lemezeken papírkorongos módszerrel végezzük.

A termelés befejeződése után az A—21978 antibiotikumokat a fermentációs iparban ismert módszerekkel elkülönítjük a fermentléből. Az A—21978-at termelő mikroorganizmus által bioszintetizált antibiotikum általában a fermentlé folyadék fázisában található. Az A—21978 antibiotikumok maximális kinyerése érdekében ezért a micélium tömeg eltávolítására először szűrjük a fermentlevet. A szűrt levet az A—21978 keverék előállítására ezt követően különböző módszerekkel tisztítjuk. Előnyös módszer például az extrakció és az A—21978 keverék kicsapása.

Az A—21978C keverék és az egyes A—21978 komponensek további tisztítását és elkülönítését adszorpciós és extrakciós lépésekkel végezzük. Az A—21978C keverék és az egyes komponensek tisztítására használható adszorptív anyagok például a következők:

1. Anioncserélő gyanták

a) erősen bázikusak; polisztirol, Bio-Rad AG1 és 2, Bio-Rex, Dowex 1 és 2, Amberlite IRA 400, 401,410;

bj közepesen bázikus; cpoxi-poliamin, Bio-Rcx 5, Duolite A30B;

c) enyhén bázikus; polisztirol vagy fenolos poliamin Bio-Rad AG3, Duolite A—6, A—7, Amberlite IRA 68, IR—45, IR—4B;

2. Szilikagél;

3. Florosil;

4. Polimer adszorbensek (XAD—2 és —4);

5. erősen porózus polimer (Diaion HP—20);

6. Sepbadex G—10, G—25, G—50; Bio-Gel P—2 ésP—10;

7. fordított fázisú gyanták, szilikagél/C_l8 és szilikagél/C₈;

8. aktív szén;

9. DEAE cellulóz, DEAE Sephadex;

10. poliamid;

11. alumíniumoxid;

12. mikrocellulóz.

A fenti anyagokat a következő cégek árusítják: BioRad és Bio-Gel gyanták: Bio Rád Laboratories Rich-8180746 mond, Kalifornia; Amberlite és XAD gyanták: Rohm and Haas Company, Philadelphia, Pa.: Duolite gyanták: Diamond Shamrock Chemical Company, Redwood City, Kalifornia; Sephadex gyanták: Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Svédország; Dowex gyanták: Dow Chemical Company, Midland, Mich.; Diaion: Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokyo, Japán; XAD gyanták, szilikagél/C_]8 és szilikagél/C_s: Merek, Darmstadt, NSZK.

Eljárhatunk oly módon is, hogy a táptalaj-összetevőket és a micéliumot tartalmazó szilárd halmazállapotú részeket extrakció vagy elkülönítés nélkül, előnyösen a víz eltávolítása után használjuk fel az A—21978 anti biotikumok forrásaként. Például úgy járunk el, hogy miután az A—21978 antibiotikumok szintézise befejeződött a tenyészetet fagyasztva szárítjuk vagy közvetlenül összekeverjük a takarmány premixszel.

A jelen leírásban ismertetett vizsgálatok során mind az A—21978C keverék, mind az egyes A—21978C komponensek nátrium-sóját használjuk fel.

Az A—21978 antibiotikum, az A—21978C keverék és az egyes A—21978C antibiotikum komponensek, nevelő zetesen a C_o, C|, C₂, C₃, C₄ és C₅ komponensek baktériumok növekedését gátolják. A következőkben a 11. táblázatban megadjuk azt a legkisebb növekedésgátló koncentrációt, amely koncentrációban az

11. táblázat

Mikroorganizmus (aerob)	Legkisebb növekedésgátlókoncentráció, μδ/ιηΐ
Keverék	Co	c,	c2	C3	c4	c5
Staphylococcus aureus 3055	0,13	l,o	0,5	0,13	0,06	0,25	0,13
Group D Streptococcus 282	0,25	2,0	1,0	0,25	0,13	1,0	0,13
Streptococcus pyogenes C203	0,13	0,25	0,13	0,13	0,25	0,13	0,06
Streptococcus pneumoniae Park I	0,13	0,5	0,13	0,25	0,13	0,5 .	0,06
Viridans Streptococcus 9943	0,5	1,0	0,5	l,o	0,5	1,0	0,13
Neisseria gonorrhoeae 111076—4	0,8	NT*	16,0	4,0	4,0	NT	NT

* NT nincs vizsgálva.

12. táblázat

Mikroorganizmus (aerob)

Staphylococcus aureus 3055

Group D Streptococcus 282

Streptococcus pyogenes C2O3

Streptococcus pneumoniae Park I

Viridans Streptococcus 9943

Legkisebb növekedésgátló koncentráció, jxg/ml

Keverék	Ci	c2	c3
0,25	1,0	0,5	0,13
0,25	2,0	1,0	0,13
0,13	0,5	0,25	0,13
0,5	2,0	1,0	0,5
8,0	32,0	16,0	32,0

A—21978C komponensek és az A—21978C keverék gátolja a kiválasztott baktériumok növekedését.

A 12. táblázatban megadjuk az ismert folyékony táp35 talaj hígításos vizsgálattal kapott legkisebb növekedésgátló koncentrációkat, amelyek mellett a kiválasztott baktériumok növekedését az A—21978C keverék és az A—21978C komponensek gátolják.

Fontos, hogy az A—21978C antibiotikumok gátolják más antibiotikumokra rezisztens mikroorganizmusok növekedését. A 13. táblázatban összefoglaljuk az A—21978C komponensek, a C_o, C,, C₂, C₃, C₄ és C₅ legkisebb növekedésgátló koncentrációit (agar-hígításos módszerrel mérve, ICS technika) egyes mikroorganizmusokkal szemben.

13. táblázat

Az A—21978C komponensek hatásossága klinikai izolátumokkal szemben

Vizsgált mikroorganizmus*	Legkisebb növekedésgátló koncentráció, μg/ml*·
A—21978CO	A—2I978C1
Staphylococcus aureus (10) Staphylococcus epidermidis (12) Streptococcus pyogenes (7) Group D Streptococcus (9) Streptococcus pneumoniae (8) Viridans Streptococcus (2) Neisseria gonorrhoae (11)	1,0 [10] 1—2 [12] 0,25—5 [5], 32, >32 2—4 [8], >32 0,13—1,0 [7], 4 1-4 [2] * *	0,5 [10] 0,13—0,25 [9] 0,12 [5], 8,16 1—2 [8], >16 0,12—1 [7], 8 0,5, 8 16— >128 [11]
	A—21978C2	A—21978C3
Staphylococcus aureus (10) Staphylococcus epidermidis (12)	0,12—0,25 [10] 0,13—0,25 [9], 0,5	0,06—0,12 [10] 0,06—0,25 [11], 1

-9180746

Vizsgált mikroorganizmus	Legkisebb növekedésgátló koncentráció, gg/ml
A—21978C2	A—21978C3
Streptococcus pyogenes (7) Group D Streptococcus (9) Streptococcus pneumiae (8) Viridans Streptococcus (2) Neisseria gonorrhoeae (11)	0,06-0,12 [5], 4,8 0,25—0,5 [8], 8 0,12 [5], 0,5, 4 [2] 0,5,4 4— >128 [11]	0,06—0,25 [6], 8 0,12—0,5 [8], 4 0,06—0,25 [7], 4 0,5 [2] 4— >128 [9]
	A—21978C4	A—21978C5
Staphylococcus aureaus (10) Staphylococcus epidermidis (12) Streptococcus pyogenes (7) Group D Streptococcus (9) Streptococcus pneumoniae (8) Viridans Streptococcus (2) Neisseria gonorrhoeae (11)	0,25—0,5 [10] 0,25—1,0 [12] 0,13 [5], 16, 32 0,5-1,0 [8], 32 0,5 [7], 2 1-2 [2] J^JJ***	0,06—0,25 [10] 0,13—0,5 [12] 0,06 [5], 4,16 0,13—0,25 [8], >32 0,06 [7], 2 0,13—0,25 [2] NT

* A zárójelben levő számok a vizsgált izolátumok számát jelzik.

** A szögletes zárójelekben levő szám megadja azoknak az izolátumoknak a számát, amelyek a megadott legkisebb növekedésgátló koncentrációval gátolhatok. Ahol nincs zárójel közötti szám, ott csak egy izolátum rendelkezett a megadott értékkel.

*** Nem vizsgáltuk.

Az A—21978C antibiotikumok bizonyos anaerob baktériumok növekedését is gátolják. A 14. táblázatban megadjuk a standard agar-hígításos módszerrel mért A—21978 keverék és az A—21978C komponensek (C|,C₂ és C₃, C_o, C₄, C₅) aktivitását egyes anaerob baktériumokkal szemben.

Az A—21978C komponensek in vivő aktívak kísérleti bakteriális fertőzésekkel szemben. A vizsgált vegyületet két dózisban adagoljuk jellemző fertőzések leküzdésére egereknek és az aktivitást ED₅₀-értékben adjuk meg. Az ED₅₀ (hatásos vagy effektív dózis) testsúlykilogrammban adja meg azt a koncentrációt, amely a kísérleti álla-

14. táblázat

Vizsgált mikroorganizmus*

Actinomyces israelii Clostridium perfringens Clostridium septicum Eubacterium aerofaciens Peptococcus asaccharolyticus Peptococcus prevoti Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus intermedius Propionibacterium acnes Bacteroides fragilis Fusobacterium symbiosum Fusobacterium necrophorum

Actinomyces israelii Clostridium perfringens Clostridium septicum Eubacterium aerofaciens Peptococcus assaccharolyticus Peptococcus prevoti Peptostreptococcus anaerobius Peptococcus intermedius Propionibacterium acnes Bacteriodes fragilis Fusobacterium symbiosum Fusobacterium necrophorum

	Legkisebb növekedésgátló koncentráció, μβ/ιηΐ
Co	Cí	c2	c3
	2	4	1,0	1,0
	2	16	8	8
	4	4	1,0	1,0
	4	16	8	4
	4	4	2	1,0
	4	2	1,0	<0,5
	0,25	2	1,0	1,0
	2	4	1,0	<0,5
	1	8	2	1,0
	>128	>128	>128	>128
	4	>128	>128	16
	2	64	64	32
	c4	c	5	Keverék
	1,0	0,5	1,0
	1,0	0,5	8
	1,0	0,5	1,0
	2	0,5	8
	1,0	0,5	1,0
	2	0,5	<0,5
	0,25	0,25	1,0
	1,0	0,25	1,0
	0,5	0,25	2
	>128	>128	>128
	4	2	>128
	4	0,5	>128

-1018Q746 tok 50%-át védi meg a fertőzéstől (lásd Wick és munkatársai, J. Bacteriol., 81, 233—235, 1961). Az A—21978C keverék és az A—21978C C_b C₂, C₃, C_o, C₄ és C₅ komponensek ED_J0-értékeit a 15. táblázatban adjuk meg.

15. táblázat

Az in vitro és in vivő aktivitás összehasonlítása

Antibiotikum	Staphylococcus aureus	Streptococcus pyogenes
MIC'	ed50 2	MIC	ed50 !	ed50-
A—21978C|	0,5	0,22	0,13	0,064	93
A—21978C2	0,13	0,16	0,13	0,032	59
A—21978C3	0,06	0,08	0,06	0,032	66
A—21978CO			0,25	0,16
A- 2Í978C4			0,13	0,10
A—21978C5			0,06	0,053
A—21978
keverék	0,13	0,18	<0,03	0,043
Eritromicin	0,13	0,5	0,13	0,64

	Streptococcus pneumoniae
	MIC	EDg
A—21978C|	0,13	0,3
A—21978C2	0,13	0,14
A—21978C3	0,03	0,09
A—21978CO	0,5	0,88
A—21978C4	0,5	0,36
A—21978C5	0,06	0,17
A—21978 keverék	0,13	0,1
Eritromicin	0,5	7,3

¹ MIC=legkisebb agar-hígítással mért és ixg/ml-ben megadott növekedésgátló koncentráció.

² Subkután adva.

³ Orálisan adva.

A találmány fontos eredménye, hogy az A—21978C komponensek és az A—21978C keverék hatásos a pielonefritisz kezelésekor. Például a patkányokban kiváltott kísérleti polinefritisz fertőzést az A—21978C komponensek a vankomicinnél hatásosabban kivédik. A vizsgálat során baktériumtenyészetként Streptococcus faecalis-t (Guze) használtunk. A tenyészetet Tryticase szója-agaron (BBL) növesztjük, majd a sejteket infúziós táptalajba (BBL; brain heart infúziós táptalaj) szuszpendáljuk, a szuszpenziót 0,2 ml-es adagokra osztjuk és folyékony nitrogénban fagyasztjuk. A patkányok oltására naponta úgy készítünk baktérium szuszpenziót, hogy egy fagyasztott ampullából 50 ml Trypticase szójás, folyékony halmazállapotú táptalajt oltunk és a tenyészetet rázógépen, 37 C° hőmérsékleten egy éjszakán át növesztjük. Ezután hígítással milliliterenként 5 x 10⁸ telepképző egységet tartalmazó szuszpenziót készítünk a S. faecalis tenyészetből. A vizsgált vegyületeket naponta egyszer, szubkután adagoljuk, hét napon át. A vizsgált vegyületeket 0,125%-os karboxi-metil-cellulóz készítményben szuszpendáljuk.

Á patkányok kísérleti fertőzését az alábbi eljárás sze rint végeztük. Hím, véletlenszerűen kiválasztott albínó (Cox-Wistar), 190—210 g súlyú patkányokat 12 mg szükség szerint kiegészített nátrium-metoxi-hexitál intraperitoneális injekcióval elaltatjuk. A kísérleti pielonefritiszt Guze és Beesőn szerint úgy váltottuk ki, hogy a bal oldali urétert 20 percen át lezártuk, majd a femorális vénába 0,5 ml, tesztorganizmust tartalmazó szuszpenziót injektáltunk. Az antimikrobális terápiát a fertőzést követő 4—5. órában kezdjük. Az utolsó kezelést követő

4. órában leöljük az állatokat, a bal oldali vesét eltávolítjuk és 9 ml fiziológiás sóoldatot tartalmazó Duall homogénizálóban homogenizáljuk. Ez a veseszövet 10“¹ hígítást jelenti. További tízszeres hígítást végzünk a sóoldattal, mivel a szövethomogenizátumban ennek megfelelő mennyiségű baktériumsejt rázható. Végül további hígítások után petricsészébe kiöntött agaron párhuzamos szélesztéseket végzünk, a tenyészeteket pedig egy éjszakán át 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk. A terápiás hatást kétféleképpen adjuk meg:

1. azoknak a patkányoknak a %-ban megadott száma, amelyek veséjében 1 g-ra számítva kevesebb mint 100 baktérium van; ezek a „kúrált” állatok;

2. azoknak a patkányoknak a %-ban megadott száma, amelyek veséjében a fertőzött kontrolihoz képest a baktériumliter legalább log_i0 4-szeresére csökkent. A kontroll állatokat csak 0,125%-os karboxi-metil-cellulózzal kezeljük. A kontroll patkányok 1 g-nyi veseszövet homogenizátumában 1,2 xlO⁸—4,6xl0⁸ S. faecalis van.

A vizsgálatok eredményeit a 16. táblázatban adjuk meg.

16. táblázat

Streptococcus faecalis mikroorganizmus okozta patkány pielonefritisz vizsgálat

Vizsgált antibiotikum	MIC’ gg/ml	Patkány dózis’ mg/kg X 7	lóg 4 litercsökkenést mutató patkányok, %-a	A kúrált patkányok, %-a
Vankomicin	1,0	12,0	55	33
A—21978C,	1,0	1,0	50	50
A 21978C2	0,25	1,0	100	89
A—21978C3	0,13	1,0	78	78
A—21978C
komplex	0,25	1,0	89	89

¹ A S. faecalis Guze törzs in vitro érzékenysége.

² Szubkután adagolva.

A 17. táblázatban összefoglaljuk a major A—21978C komponensek és az A—21978C keverék toxieitási adatait.

17. táblázat

Az A—21978C toxieitása

LD₅₀ (mg/kg)

A—21978C	Egér	Patkány 'IV. '
IV.	Se.
C[ komponens	>250	>365	479 ±32
C2 komponens	150—250	175	204 ± 17
C3 komportens	<50	70—75,	<160
Keverék	150	175 190	1.69 ± 10

-11180746

Az Α“=21978Ό keveréket vagy egy A—21978C komponenst baktériumellenes szerként orálisan vagy parenterálisan adagolható. Ahogy a szakemberek számára ismeretes, az A—21978C keveréket vagy ennek egy komponensét általában gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivő- vagy hígítóanyaggal együtt adagoljuk. Az adagolt A—21978C keverék vagy komponens mennyisége attól függ, hogy például a kezelendő fertőzés milyen természetű vagy milyen súlyos. A témában jártas szakember előtt nyilvánvaló, hogy az adagolandó dózishatárokat vagy dózisegységeket a legkisebb növekedésgátló koncentráció és ED₅₀-érték és a toxicitási adatok fogják meghatározni egyéb tényezőkkel együtt, mint például a beteg vagy a gazda és a fertőző mikroorganizmus.

A találmány szerint A—21978 antibiotikumokat az állatok növekedésének fokozására is használhatjuk. Az A—21978C keverék például fokozza a csirkék súlynövekedését és a takarmány hasznosítását is. A 18. táblázat5 bán összefoglaljuk a két aktivitást bizonyító kísérlet eredményeit. A vizsgálat során az A—21978C keveréket 25 g/tonna takarmány mennyiségben adagoltuk az állatoknak. Az antibiotikumot 4x8 állatnak adtuk két kísérletben (összesen 8x8, azaz 64 állatnak). A vizsgálati 10 időszak 21 napig tartott, az állatok 7—28 napos korában kezdődött. A növekedési adatokat (súlynövekedés, takarmányfogyasztás és takarmányhasznosítás) 40 kontroll állat adataival hasonlítottuk össze.

18. táblázat

Kísérlet 'f	.ii x.i 'Kézelés	Koncentráció, ' g/t	Súlynövekedés, g	zó fokozás1	Takarmány koncentráció, g	Takarmány/ súlynövekedés	fokozás
·: 1: '	. ?;- .·>. ' Kontroll . ·.		414		734	1,773
	A 21978C .	= .· 25 ..	431	4,10	750	1,741	1,80
; .·: 2. ..-ut:·	Kontroll >.> .<		423	_	704	1,665	—
	A 21978C	25	432.	2,12	683	1,582	4,99

i x 100=% fokozódás kezelt átlaga kontroll átl.

A találmány szerinti antibiotikumok fokozzák a baromfiak növekedését, ha az állat takarmányával együtt adjuk 1 t takarmányra számítva 1 g és 100 g A—21978 antibiotikum mennyiségben.

A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal részletesen szemléltetjük. 1. példa

A) Az A—21978C előállítása rázott lombikban

1—2 ml steril vízben feloldunk egy liofilezett Streptomyces roseosporus NRRL 11379 törzset. A készítménynyel az alábbi összetételű ferde-agart oltjuk:

Glükóz 0,5%

Élesztőkivonat 0,2%

CaCO₃ 0,3%

Agár 2,0%

Növényi kivonat* 20,0%

Ionmentes víz

A táptalaj pH-ja 6,1; autoklávozás után 5,9.

* V/8 juice, Campell Soup Co.

A beoltott ferdeagart 30 C° hőmérsékleten inkubáljuk 7—10 napon át. Az érett tenyészethez 10 ml steril desztillált vizet adunk és a spórák felszabadítására steril pipettával kaparjuk a felszípét. 1 ml így előállított spóraszuszpenzióval 50 ml vegetatív táptalajt oltunk, amelynek összetétele a következő:

Triticase szója* (folyékony) 3,0%

Dextrin · 2,5%

Ionmentes víz * Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, Md.

A beoltott vegetatív táptalajt 250 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokban, síkrázógépen (250 percenkénti fordulatszám, kitérés 4,5 cm) inkubáljuk 30 C° hőmérsékleten 48 órán át.

A fentiek szerint előállított vegetatív tenyészet

0,5 ml-ével 50 ml alábbi összetételű termelő táptalajt oltunk:

Glükóz 0,75%

Tápióka dextrin* 3,0%

Enzimatikusan hidrolizált kazein** 0,5%

Enzim hidrolizált kazein*** 0,5%

K₂SO₄ 0,74%

L-aszparagin, vízmentes 0,132%

Ionmentes viz * Stadex 11, Staley, Co., Decatur, JII.

*’ NZ-Amíne-A, Sheffield Chemical Co., Norwick, N. Y.

*** Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisconsin.

A beoltott termelő táptalajt 250 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokban inkubáljuk 30 C° hőmérsékleten, 6—7 napon át olyan síkrázógépen, amely percenként 250-et fordul és 4,5 cm kitérése van.

B) Az A—21978C előállítása tankfermentorban

Nagy mennyiségű inokulum előállítására 400 ml második, a fentivel azonos összetételű táptalajt oltunk, 60 10 ml, a fentiek szerint előállított inkubált vegetatív tenyészettel. Ezt a második tenyészetet 2 1 térfogatú lombikban inkubáljuk 30 C° hőmérsékleten és 48 órán át olyan síkrázógépen, amely percenként 250-et fordul és kitérése 4,5 cm.

Az inkubált második vegetatív tenyészet 800 ml-ével

-12180746

100 1 steril, az előbb megadottal azonos összetételű termelő táptalajt oltunk. A beoltott termelő táptalajt 165 1-es tankfermentorban tenyésztjük 6—8 napon át 30 C° hőmérsékleten. A táptalajt 1 atmoszféranyomáson steril levegővel levegőztetjük oly módon, hogy a táptalaj levegő-telítettsége 30% felett legyen; a keverést percenként 200—300-at forduló konvencionális keverővei végezzük.

2. példa

Az A—2I978C antibiotikum keverék elkülönítése . Az 1. példában megadottak szerint kapott kb. 6500 liter teljes fermentlevet 3% szűrési segédanyag (Celite 545, Johns—Manville Products Corp.), hozzáadása után szűrőprésen szűrjük. A szűrési maradékot vízzel mosz suk, amiután összesen 4100 liter 230 egység/ml aktivitású szűrletet kapunk. A szűrlet pH-ját hidrogén-kloriddal 3,5-re állítjuk be, majd az aktív komponensek kicsapására 16 órán át állni hagyjuk. A szuszpenzióhoz 0,75% Celite 545 szűrési segédanyagot adunk, majd szűréssel elkülönítjük a csapadékot. A szűrési maradékot 2x450 liter metanollal extraháljuk, szűrés előtt minden esetben 1 órán át keverjük. A 720 liter össztérfogatú egyesített metanolos extraktum 0,1 térfogat (72 liter) vizet adunk. Az oldat pH-ját nátrium-hidroxiddal 6,5— 7,0-ra állítjuk be. Az oldal térfogatát csökkentett nyomáson eredeti térfogatának ^l/2o~^ara csökkentjük (30 liter) a metanol eltávolítására. A koncentrálás közben szükség szerint desztillált vizet adagolunk. Keverés közben ³/4 térfogat (22 1) n-butanolt adagolunk. A kapott oldat pH-ját 3,0-ra állítjuk be hidrogén-kloriddal. Elkülönítjük a fázisokat, az n-butanolos fázist, amelyben az antibiotikum van, csökkentett nyomáson töményítjük. A desztillációs maradékot a lehető legkevesebb metanolban oldjuk, a metanolos oldatot 30-szoros menynyiségű acetonhoz öntjük az A—21978C keverék nagy részének kicsapására. A csapadékot szűréssel elkülönítjük és szárítjuk, amiután 247 g nyers A—21978C keveréket kapunk, amelynek biológiai aktivitása 780 egység/mg.

Az A—21978 keverék további részét (A és B komponensek), tartalmazó metanol-acetonos szűrletet desztilláljuk. A desztillációs maradékot tercier-butanol és viz • 5:1 arányú elegyében oldjuk, az oldatot fagyasztva szárítjuk, amiután 169 g A—21978 keveréket kapunk.

. 3. példa

A) Az A -21978C keverék tisztítása

734 g, a 2. példában megadottak szerint előállított nyers A—21978C keveréket 25 1 vízben szuszpendálunk. A szuszpenzió pH-ját 5N nátrium-hidroxiddal 6,5-re állítjuk be az anyag teljes feloldására. Az oldatot 21 7 acetát-ciklusú IRA 68 ioncserélő gyantát (Rohn és Haas Co.), tartalmazó oszlopra öntjük. 4 oszlopnyi térfogatú (108 1) vízzel mossuk a gyantát, majd 5 oszlopnyi térfogatú (135 1) 0,lN ecetsavval. Az aktív anyagot 0,5N ecetsavval eluáljuk, miközben körülbelül 120 1 térfogatú frakciókat gyűjtünk. Mindegyik frakció biológiai aktivitását meghatározzuk.

A leginkább aktív frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk, amiután 278 g barna színű A—21978C keveréket kapunk, amelynek biológiai aktivitása 1100 egység/mg. A kisebb aktivitású frakciókat összegyűjtjük, 5 amiután 880 egység/mg biológiai aktivitású barna színű, 238 g súlyú A—21978C keveréket kapunk.

B) Az A—21978C keverék további tisztítása

150 g az IRA—68 gyantáról eluált aktívabb A—

21978C keveréket 600 ml vízben szuszpendálunk, a szuszpenzió pH-ját oldat készítésére 6,5-re állítjuk be. A vizes oldat adszorpciójára nagy mennyiségű száraz szilikagélt (Grace, Grade 62) adunk az oldathoz. Ezt a l:i nedves szilikagélt 30 1 szilikagélt (Grace 62) tartalmazó 10 x 375 cm méretű acetonitrillel kiegyensúlyozott oszlopra töltjük. A szilikagélt előzőleg a finom szemcsék eltávolítására vízzel mossuk, ezután vízben szuszpendált szilikagéllel töltjük az oszlopot és 30 1 acetonitrillel 20 mossuk. Az aktív anyag oszlopra juttatását követően 15 1 acetonitrillel mossuk a gyantát, majd acetonitril és víz 4 : 1 arányú elegyével eluálunk, miközben 4 1 térfogatú frakciókat gyűjtünk. Az elúciót biológiai értékméréssel követjük, az értékmérést szilikagél vékonyré25 teggel végezzük bioautográfiával, a futtató elegy összetétele acetonitril és víz—3 : 1. Az A—21978C keveréket tartalmazó 43—60. frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson desztilláljuk és a desztillációs maradékot fagyasztva szárítjuk, amikor 1160 egység/mg aktivitású 30 sárga-borostyánkő színű, tisztított A—21978C komplexet kapunk. A termék súlya 86,2 g. A D és C faktorokat tartalmazó 21—29. frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk, amiután 13 g sárga színű, por alakú, alacsony biológiai aktivitású terméket kapunk.

A fentiek szerint előállított 30 g tisztított A—21978C keveréket színmentesítés céljából a lehető legkevesebb mennyiségű vízben szuszpendáljuk, a szuszpenzióhoz az anyag adszorbeálására kevés szilikagélt (Typé LP—1, 40 10—20 mikron, Quantum Industries, 341 Káplán Drive, Fairfield, Ν. Y., 07006) keverünk. A nedves szilikagél keveréket acetonitril és metanol 4: 1 arányú elegyében szuszpendáljuk és 4 x 30 cm méretű üvegoszlopot töltünk meg vele, amely 6,5 x 82 cm méretű, 2,8 1 szilika45 géllel Quantum LP—1) van töltve és acetonitril és metanol 4 : 2 arányú elegyével van kiegyensúlyozva. A szilikagélt előzőleg vízzel, majd ezt követően acetonitril és metanol 4 : 1 arányú elegyével mostuk és az oszlopot acetonitril és metanol 4 : 1 arányú elegyében levő szili50 kagéllel töltöttük 4,2—4,5 atm nyomáson. Az előoszlopot és a főoszlopot 3 1 acetonitril és metanol 4: 1 arányú elegyével mossuk 4,2—4,5 atm nyomáson. Az aktív vegyületet acetonitril, metanol cs víz 55 : 2 : 25 arányú elegyével eluáljuk, miközben 300 ml térfogatú frakció55 kát gyűjtünk. Az eluálást biológiai értékméréssel ellenőrizzük, a mérést Micrococcus luteus mikroorganizmussal végezzük. A 14—25. frakciók tartalmazzák a hatóanyag nagy részét, ezeket egyesítjük, töményitjük és fagyasztva szárítjuk, amiután világos sárga színű termék60 ként 24 g tiszta A—21978C keveréket kapunk nátriumsóként. A termék 1250 egység/mg biológiai aktivitású. A 26—32. frakciók kevésbé aktívak, ezeket is összegyűjtjük,.töményitjük és fagyasztva szárítjuk. Ily módon

1,6 g kevésbé tiszta 780 egység/mg aktivitású A— 65 21978C keveréket kapunk.

-13180746

4. példa

Az A—21978C komponensek elkülönítése

A 3. példában megadottak szerint előállított tisztított A—21978C keverék 2 g-ját 40 ml vízben oldjuk és 4,2 atm nyomáson FM1 LÁB pumpával (Fluid Metering, Inc., 48 Summit St., Oyster Bay, N. Y., 11771) 4,1 x 60 cm méretű reverz fázisú szilikagél oszlopra töltjük (Quantum LP—1 szilikagél/C_]8), az oszlopot víz, metanol és acetonitril 100 : 15 : 85 arányú, 0,15% ecetsavat és 0,15% piridint tartalmazó elegyével egyensúlyozzuk ki. Az oszlopot körülbelül 4,6 atm nyomáson ezzel az oldószerrel eluáljuk és 25 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A komponensek eluálódást 280 nm-en végzett ultraibolya fotometrálással és biológiai értékméréssel követjük. Az egyes frakciókat a komponensek tisztaságának vizsgálatára analitikai oszlopon mérjük. Jellemző szeparációs kép a következő: a 33—37. frakciók a C_o komponenst, a 45—53. frakciók a Cj komponenst, a 75—92. frakciók a C₂ komponenst, a 112—134. frakciók a C₃ komponenst, az 54—74. frakciók a C_p a C₂ és C₄ komponenseket, végül a 93—111. frakciók a C₂, C₃ és C₅ komponenseket tartalmazzák. A több faktort tartalmazó frakciókat újra visszavezetjük az oszlopra, további tiszta C₍, C₂, C₃, C₄ és C₅ előállítására. Az egyetlen komponenst tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, csökkentett nyomáson töményítjük és fagyasztva szárítjuk, amiután világos sárga színű, por alakú termékként megkapjuk az egyes komponensek nátrium-sóit. 60 g keverékből az alábbi mennyiségű komponenseket kapjuk: Cj = 5,55 g; C₂= 10 g; C₃ komponens =6,61 g. A több komponenst tartalmazó frakciókat reverz fázisú gyantaoszlopon recirkuláltatjuk, amiután a következő mennyiségű anyagokat kapjuk: C_o=55O mg; C|=l,29 g; C₂=l,99 g; C₃ =443 mg; C₄=512 mg és C₅ komponens = 384 mg.

5. példa

Az A—21978C komponensek elkülönítése és tisztítása nagy méretben

Nagy méretekben a komponenseket reverz fázisú oszlopk romát ográfiával különítjük el. 6 g, a 3. példában megadottak szerint előállított A—21978C keveréket 80 ml vízben oldjuk. Az oldat pH-ját ecetsavval 4,4-re állítjuk be, majd 20 ml tetrahidrofuránt adunk hozzá. Az oldatot alacsony nyomáson szivattyúval (Lapp Pump) 4,8 x 100 cm méretű acéloszlopra juttatjuk, az oszlop 1,77 1 szilikagél/C|₈ gyantát (Quantum LP—1, 10—20 mikron, okta-decil-triklór-szilánnal szililált) tartalmaz és víz és tetrahidrofurán 4 ; 1 arányú elegyével van kiegyensúlyozva. Az oszlopot 8,5 atm nyomáson 150 ml, víz és tetrahidrofurán 4: 1 arányú elegyével mossuk. Az eluáíást víz, metanol, acetonitril 47,5 : 15 : 37,5 arányú, 0,2% piridint és 0,2% ecetsavat tartalmazó elegyével végezzük, az eluálás sebessége 35 ml/perc.

175 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. Az eluáíást folyamatosan ellenőrizzük ultraibolya detektorral 280 nm hullámhosszon. Az egyes komponenseket tartalmazó frakciókat analitikai reverz fázisú gyantaoszlopon még egyszer ellenőrizzük. Az egyetlen komponenst tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és fagyasztva szárítjuk. Jellemző feldolgozás a következő eredményeket adja: a 12—16. frakciók a C_o komponenst tartalmazzák: a 20—26. frakciók a C₍; a 38—50. frakciók a C₂; a 63— 78. frakciók a C₃ komponenst tartalmazzák. A Cj és C₄ komponenseket tartalmazó 27—37. és a C₂ és C₅ komponenseket tartalmazó 51—62. frakciókat tiszta C₄ és C₅ komponensek előállítására visszavezetjük az oszlopra. Az oszlop 6—12 g anyag elválasztására képes. 84 g A—21978C keverékből 1,9 g C_o, 3,27 g C_p 4,97 g C₂ és 1,94 g C₃ komponenst kapunk. Az egyes komponenseket jobb kitermeléssel kapjuk meg, ha megfelelő nagynyomású folyadék-kromatográfiás oldószerelegyet használva recirkuláltatjuk a több komponenst tartalmazó frakciókat. A választott oldószerelegy az egyes kísérletektől, a reverz fázisú gyantától és az oszloptól függően változhat.

Az A—21978C komponensek elválasztására az alábbi oldószerelegyeket használjuk:

A) Analitikai rendszerek

Víz, metanol és acetonitril 50 : 15 : 35 arányú, 0,2% ecetsavat tartalmazó elegye, amelynek a pH-ját piridinnel 5,5-re állítjuk be.

Víz, metanol és acetonitril 50 : 15 : 35 arányú elegye, amely 0,2% ecetsavat és 0,2% piridint tartalmaz.

Víz, metanol és acetonitril 50 : 15 : 35 arányú elegye, amely 0,75% ammónium-formiátot tartalmaz.

Víz, metanol és acetonitril 95 : 30 : 75 arányú elegye, amely 0,2% ecetsavat és 0,2% piridint tartalmaz.

Víz, metanol és acetonitril 105 : 15 : 80 arányú elegye, amely 0,2% ecetsavat és 0,2% piridint tartalmaz.

Víz, metanol és tetrahidrofurán 59 : 15 : 25 arányú elegye, amely 0,5% ecetsavat és 0,5% piridint tartalmaz.

Víz, metanol és tetrahidrofurán 60: 15 : 25 arányú elegye, amely 0,5% ammónium-formiátot tartalmaz.

B) Preparaíiv rendszerek

Víz, metanol és acetonitril 95 : 20: 85 arányú elegye, amely 0,5% ecetsavat és 0,15% piridint tartalmaz.

Víz, metanol és acetonitril 100: 15 : 85 arányú elegye, amely 0,15% ecetsavat és 0,15% piridint tartalmaz.

Víz, metanol és acetonitril 50 : 10 : 40 arányú elegye, amely 0,1% ecetsavat és 0,1% piridint tartalmaz.

Víz, metanol és acetonitril 50: 15 : 35 arányú elegye, amely 0,75% ammónium-formiátot tartalmaz.

Víz, metanol és acetonitril 55 : 10 : 35 arányú elegye, amely 0,2% ecetsavat és 0,8% piridint tartalmaz.

Víz, metanol és tetrahidrofurán 52,5 : 15 : 32,5 arányú elegye, amely 0,6% ammónium-formiátot tartalmaz.

Víz, metanol és tetrahidrofurán 50: 15 : 35 arányú elegye, amely 0,6% ammónium-formiátot tartalmaz.

Az ecetsav-piridin elegy előnye az ammónium-formiátot tartalmazó eleggyel szemben az, hogy az előzőt a fagyasztva szárítás közben eltávolíthatjuk, míg az ammónium-formiátot Sephadex G—25 gyantával kivitelezett oszlopkromatográfiával kell eltávolítani.

-14180746

6. példa

Az A—21978C keverék izolálása (másik módszer)

1 teljes fermentlevet, amit az 1. példában megadottak szerint állítottunk elő, 4% Hyflo Super—Cél szűrési segédanyag jelenlétében szujrünk, a kapott 80 1 térfogatú szűrlefet 2 órán át 21 nem ionos makroporózus sztirol és divinil-benzol kopolimerjével (Diaion HP—20 gyanta, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japán) keverjük. A felülúszót dekantáljuk, a gyantát 8 1 vízzel mossuk, majd ezt követően dekantáljuk a vizet. 8 1 acetonitril és víz 15 : 85 arányú elegyét adjuk a gyantához, majd 15 percen át keverjük. Az oldószert szűréssel elkülönítjük. Ezután az A—21978C keveréket eluáljuk a gyantáról oly módon, hogy egy órán át 8 1 acetonitril és víz 2 : 3 arányú elegyével keverjük, majd szűrjük. Ezt az összes A—21978C keverék eltávolítására megismételjük. Egyesítjük a két szűrletet és csökkentett nyomáson olajos desztillációs maradékig töményitjük. Az olajat a lehető legkevesebb vízben oldjuk, melegítés közben 2 térfogat metanolt adunk hozzá, majd az A—21978C keverék kicsapására 30 térfogat acetont adagolunk. A csapadékot szűréssel elkülönítjük és csökkentett nyomású térben szárítjuk, amiután 13,6 g 570 egység/mg biológiai aktivitású nyers A—21978C keveréket kapunk.

Az A—21978C nyers keverékét szilikagél oszlopkromatográfiával tisztítjuk. 1 g keveréket a lehető legkisebb mennyiségű vízben oldunk, majd a víz adszorbeálására szilikagélt (Gracc 62) adunk az oldathoz. Az adszorbenst acetonitrilben szuszpendáljuk. Ezt a szuszpenziót 1,5 x40 cm méretű szilikagélből (Grace, Grade 62) készült és acetonitrillel kiegyensúlyozott oszlopra töltjük. Acetonitrillel mossuk az oszlopot. Az antibiotikumokat acetonitril és víz 4 : 1 arányú elegyével eluáljuk, az eluáció közben 25 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A frakciókat a 3. példában megadott módon vizsgáljuk. A 21— 46. frakciók tartalmazzák az A—21978C keverék nagy részét, így ezeket egyesítjük, csökkentett nyomáson kis térfogatúra töményitjük és fagyasztva szárítjuk, amiután 605 mg tisztított, 900 egység/mg biológiai aktivitású A—21978C keveréket kapunk nátrium-sóként.

7. példa

Az A—21978C keverék előállítása (savas alak)

A 6. példában megadottak szerint előállított A— 21978C keverék nátrium-sójának 7 g-ját 150 ml vízben oldjuk, majd 150 ml n-butanolt adunk az oldathoz. Az oldat pH-ját 2N h.idrogén-klorid oldattal 3,4-re állítjuk be, miközben egy órán át keverjük. Elkülönítjük az n-butanolos fázist és csökkentett nyomáson desztilláljuk. A desztillációs maradékot vízben oldjuk és fagyasztva szárítjuk, amiután 6 g savas alakban létező A—21978C keveréket kapunk. Az egyes A—21978C komponenseket a megfelelő savas alakká szintén a fentiek szerint alakítjuk át.

8. példa

Az A—21978C keverék nátrium-sójának előállítása az A—21978C keverék savas alakjából

A 7. példában megadottak szerint előállított savas alakú A—21978C keverék 50 mg-ját meleg, vízmentes etanolban (5 ml) oldjuk. Cscppenként addig adunk IN nátrium-hidroxidot az oldathoz, míg pH-ja 9,4 lesz. A kapott oldatot egy éjszakán át szobahőmérsékleten tartjuk. A kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük és csökkentett nyomású térben szárítjuk, ami után 32 mg A—21978C keverék nátrium-sót kapunk. A só az atomabszorpciós vizsgálat szerint 8% nátriumot tartalmaz.

9. példa

A 8. példában megadottak szerint eljárva, de a savas alakú A—21978C keverék etanolos oldatához etanolos kalcium-kloridot adva előállítjuk az A—21978C keverék kalcium-sóját.

10. példa

Az A—21978 fermentlé és az elkülönítés során kapott minták mikrobiológiai értékmérése.

Az A—21978 aktivitásának mennyiségi meghatározását fermentlevek és a feldolgozás során kapott minták esetén papírkorong agardiffúziós módszerrel határozzuk meg Micrococcus luteus mikroorganizmussal.

A beoltott agardiffúziós lemezeket a megfelelő koncentrációjú mérőorganizmussal beoltott Nutrient agárral készítjük, oly módon, hogy 20 x 100 mm méretű műanyag Petri-csészébe 8 ml agart öntünk.

A méréskor standardként A—21978C keveréket használunk. Ezt a készítményt 1000 egységnek vesszük. A nagymértékben tisztított A—21978C keverék 1250 egységet tartalmaz milligrammonként. A standard dózis-válaszgörbét 150—75—40—20—10 egység/ml-es oldatokkal készítjük el. A standard és a minták hígításához 0,1 mólos 6,0 pH-jú foszfát puffért használunk.

A minták és a standard oldatait 12,7 mm átmérőjű papírkorongokra juttatjuk automatikus pipettával. Az inkubációt 30 C° hőmérsékleten 16—18 órán át végezzük. A gátlási zónákat módosított Fischer—Lilly Antibiotic Zone Reader mérőműszerrel határozzuk meg.

Claims (8)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás az A—21978 antibiotikum keverék, illetve a C_o, C_b C₂, C₃, C₄ és C₅ komponensek és ezek sóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces roseosporus NRRL 11379 mikroorganizmust vagy ennek egy A—21978-at termelő mutánsát felhasználható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között tenyésztjük, majd kívánt esetben az A—21978 antibiotikum keveréket vagy ennek egy sóját elkülönítjük a fermentléből és kívánt esetben ebből önmagában ismert módon elválasztjuk az egyes komponenseket vagy ezek sóit.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az izolált A—21978 antibiotikum keverékből elkülönítjük az A—21978C antibiotikum keveréket vagy ennek egy sóját.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az izolált N—281978 C antibiotikum keverékből elkülönítjük az A—21978C₀ komponenst vagy ennek egy sóját.

   -15180746
4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az izolált A—21978C antibiotikum keverékből elkülönítjük az A—21978C] komponenst vagy ennek egy sóját.
5. 5. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az izolált A—21978C antibiotikum keverékből elkülönítjük az A—21978C₂ komponenst vagy ennek egy sóját.
6. 6. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az izolált A—21978C anti biotikum keverékből elkülönítjük az A—21978C₃ komponenst vagy ennek egy sóját.
7. 7. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az izolált A—21978C anti-

   5 biotikum keverékből elkülönítjük az A—21978C₄ komponenst vagy ennek egy sóját.
8. 8. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az izolált A—21978C antibiotikum keverékből elkülönítjük az A—21978C₅ komponenst vagy ennek egy sóját.