HRP20040282A2 - Interleukin-12 as a veterinary vaccine adjuvant - Google Patents

Description

U skladu sa 35 U.S.C. član 119(e), ova prijava štiti U.S. Provisional Application No. 60/322,840, podnešene 17. rujna 2001. Ova prethodna prijava je u cjelini ovdje uključena, kroz ovaj citat.

Ovaj izum se odnosi na novu kombinaciju koja se sastoji od imunomodulatora zajedno sa imunoadjuvantima, koja jača imunogenicitet ili fiziološku efikasnost veterinarskih cjepiva koje sadrže antigen, i na novu upotrebu ove kombinacije za značajno poboljšavanje imunološkog odgovora životinje na antigen, ukoliko se ordinira paralelno ili pomiješana s preparatom cjepiva.

Svi patenti i publikacije koji se citiraju u ovoj publikaciji su u cjelini ovdje priključeni kroz citat.

Utvrđena je etiologija mnogih iznurujućih i fatalnih bolesti. Na primjer, goveđi respiratorni sincitijalni virus (u nastavku će se označavati BRSV) je utvrđen kao značajan faktor u kompleksu goveđih respiratornih bolesti. Ovu bolest karakterizira brzo disanje, kašalj, gubitak apetita, curenje iz očiju i nosa, kao i povišena temperatura stoke. Kod akutnog izbijanja smrt nastupa za 48 h nakon prvih simptoma. BRSV se smatra najčešćim virusnim patogenom endemske pneumonije kod teladi, a povezan je sa pulmonarnim emfizemom kod teladi odbijenih od sisanja.

Između bolesti velikih životinja, gušenje izaziva bakterijska infekcija sa Streptococcus equi. Gušenje, poznato isto tako i kao štenećak ili stajska groznica, je vrlo zarazna bolest gornjeg respiratornog trakta konja, koju karakterizira prisustvo lokalnih i rastresenih apscesa.

Poznati su razni etiološki agensi koji izazivaju bolesti kod malih životinja. Na primjer, otkriveno je da se bolest pasa povezana sa Ehrlichia canis, psećim parvovirusom (CPV), psećim virusom parainfluence (CPI), psećim adenovirusom tipa II (CAV-II), psećim adenovirusom (CDV), psećim koronavirusom (CCV), s Leptospira icterohemorrhagiae (LI), Leptospira canicola (LC), Leptospira grippotyphosa (LG), Leptospira pomona (LP) i slično. Slično, bolesti kod mačaka izazivaju prenosivi virusi, kao što su, između ostalih, virus mačje imunodeficijencije i virus mačje leukemije, pa bakterije kao što je mačja Chlamydia psittaci itd.

Postoji realna potreba za efikasnom zaštitom protiv ovih vrsta etioloških agenasa koji izazivaju vrlo zarazne, iscrpljujuće i smrtonosne bolesti kod životinja. Međutim, veterinarska cjepiva obično imaju slabe imunogenicitetne odgovore, zbog slabih antigenskih djelovanja nekih etioloških agenasa, ili zbog bioloških varijacija od jedne do druge životinjske vrste. Snižena fiziološka efikasnost problem je isto tako i u bilo kojem pokušaju da se dobiju pravi humoralni imuno odgovori kod životinja. Stvaranje adekvatnog sadržaja serumskih antitijela, koje odražava pravu zaštitu od bolesti preko pratećeg stanično posredovanog imuniteta, teško se postiže. Uz to, fizičke i kemijske kompatibilnosti antigenskih supstanci sa svakom dodatnom kombinacijom aditiva moraju se rješavati preko značajnog testiranja da bi se spriječilo inaktiviranje osjetljivih antigena. Otežavajući sporedni efekti ili potencijalna toksičnost unutar uske margine sigurnosti pružaju još jedan izazov za razvijanje korisnog veterinarskog programa cijepljenja. Uspostavljanje zaštitnog imuniteta nije jednostavna stvar. Dakle, istraživanje je usmjereno na pronalaženje pouzdanog, netoksičnog adjuvanta, koji je kompatibilan s antigenom i u stanju da ojača imunogenicitet i efikasnost životinjskih cjepiva, bez povećane brige u pogledu toksičnosti.

Ispitani su brojni imunoadjuvanti i mnogi posjeduju obećavajuća svojstva za poboljšanje stanično posredovanih i humoralnih imuno odgovora na razne antigene koji kao nedostatak maju slab imunogenicitet (vidjeti diskusiju u R. Rabinovich, ”Vaccine Technologies: View to the Future”, Science,1994, 265, 1401-1404, i F. Audibert, ”Adjuvants: Current Status, Clinical Perspectives and Future Prospects”, Immunology Today, 1993, 14(6), 281-284). Stipsa (aluminij-kalijum-sulfat) koja se nalazi u cjepivima za difteriju, tetanus i hepatitis B, stimulira humoralni imuno odgovor, aili ne i stanično posredovan imunitet. Rezultat toga je da ova sol nije efikasna kod svih imunogena. Soli aluminija imaju nedostatak što ne dozvoljavaju da se same ili u cjepivima podvrgnu liofilizaciji ili zamrzavanju. Zbog ograničenja ovih soli aluminija, istraživanje se okrenulo prema mnogim drugim imunoadjuvantima, kao što su saponini, surfaktanti ne-ionskih blok polimera, monofosoril lipid A, muramil dipeptidi (skvalensko ulje) ili tripeptidi, i citokini. Međutim, izbor pogodnog imunoadjuvantskog sustava nije jednostavan i zahtjeva znatno eksperimentiranje da bi se otkrilo da li će taj sustav ojačati stanično posredovane i humoralne imuno odgovore na razne imunogene kod promatrane vrste životinja. Održavanje stabilnosti i efikasnosti imunogena su slijedeći značajni faktori koji mogu utjecati na postupak selekcije, u traženju hoće li imunoadjuvantski sustav funkcionirati kako je poželjno kod te životinje.

Interleukin-1 (IL-1) je prvi citokin za kojeg je nađeno da je koristan adjuvant za jačanje sekundarnog odgovora antitijela na albumin goveđeg seruma, stanično posredovanim imunitetom preko povećanja stvaranja interleukina-2 (IL-2). Ranija ispitivanja su pokazala da je rekombinantni goveđi IL-1β koristan imunomodulator goveđih imuno odgovora na vurusne infekcije (videti, Reddy et al., ”Adjuvanticity of Recombinant Bovine Interleukin-1β: Influence on Immunity, Infection and Latency in Bovine Herpes Virus-1 Infection”, Lymphokine Res. 1990, 9, 295-300). U ovim ispitivanjima, tretman teladi s r-BoIL-1β povećao je stvaranje antitijela protiv virusa-1 goveđeg herpesa (BHV-1), goveđeg virusa dijareje (BVD) i virusa parainfluence-3 (PI-3), povećao je citotoksične odgovore na stanice MDBK inficirane virusom, umanjio virusno pokrivanje BHV-1 poslije zaražavanja i imao je manji recidiv BHV-1 nakon injekcija deksametazona. Ovi izvještaji ukazuju da rekombinantni goveđi interleukin-1β može pojačati aktivnost antigena, kada se ordinira potkožno u vodenoj otopini.

Klinička ispitivanja su obavljena da se provjeri sposobnost citokina, kao što je interferon α (IFN-α) i interferon γ (IFN-γ), da pojačaju imunogenicitet cjepiva za hepatitis B, kod subjekata bez odgovora.

Naknadna ispitivanja u imunologiji su istraživala značaj aktivnosti drugih citokina, kao što je na primjer interleukin-12 (vidjeti, na primjer, Y.-W. Tang et al., ”Interleukin-12 Treatment during Immunization Elicits a T Helper Cell Type 1-like Immune Response in Mice Challenged with Respiratory Syncital Virus and Improves Vaccine Immunogenicity”, J. Infectious Diseases, 1995, 172, 734-738; S. Morris et al., ”Effects of IL-12 on in Vivo Cytokine Gene Exprijession and Ig Isotype Selection”, J. Immunology, 1994, str.1047-056; J. Orange et al., ”Effects of IL-12 on the Response and Susceptibility to Experimental Viral Infections”, J. Immunology, 1994, str. 1253-1264; G. Trinchieri, ”Interelukin-12 and its Role in the Generation of TH1 Cells”, Immunology Today, 1993, 14(7), 335-338; R. Gazzinelli et al., ”Interleukin-12 is Required for the T-lymphocyte-indpendent Induction of Interferon γ by an Intracellular Parasite and Induces Resistance in T-cell-defficient Hosts”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 6115-6119; R. Locksley, ”Commentary: Interleukin-12 in Host Defense Against Microbial Pathogens”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 5879-5880; B. Graham et al., ”Priming Immunization Determines T Helper Cytokine mRNA Exprijession Patterns in Lungs of Mice Challenged with Respiratory Syncytial Virus”, J. Immunology, 1993, 151, 2032-2040; J. Sypek et al., ”Resolution of Cutaneous Leishmaniasis: Interleukin 12 Initiates a Protective T Helper Type 1 Immune Response”, J. Exp. Med., 1993, 177, 1797-1802; F. Heinzel et al., ”Recombinant Interleukin 12 Cures Mice Infected with Leishmania major”, J. Exp. Med.1993, 177, 1505-1509; C. Tripp et al., ”Interleukin 12 and Tumor Necrosis Factor α are Costimulators of Interferon γ Production by Natural Killer Cells in Severe Combined Immunodeficiency Mice with Listeriosis, and Interleukin 10 is a Physiologic Antagonist”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 3725-3729; R. Manetti et al., ”Natural Killer Cell Stimullatory Factor (Interleukin 12 [IL-12]) Induces T Helper Type 1 (Th1)-specific Immune Responses and Inhibits its Development of Il-4producing Th Cells”, J. Exp. Med., 1993, 177, 1199-1204; C.-S. Hsieh et al., ”Development of TH1 CD4* T Cells Through IL-12 Produced by Listeria-induced Macrofages”, Science, 1993, 260, 547-548; P. Scott, ”IL-12: Initiation Cytokine for Cell-mediated Immunity”, Science, 1993, 260, 496-497; M. Gately et al., ”Regulation of Human Cytolitic Lymphocite Responses by Interleukin 12”, Cellular Immunology, 1992, 143, 127-142; A. D’Andrea et al., ”Production of Natural Killer Cell Stimulatory Factor (Interleukin 12) by Peripherial Blood Mononuclear Cells”, J. Exp. Med. 1992, 176, 1387-1398, B. Naume et al., ”A Comparative Study of IL-12 (Cytotoxic Lymphocyte Maturation Factor)-, IL-12-, and IL-7-iduced Effects on Immunomagnetically Purified CD56 NK Cells”, J. Immunoloogy, 1992, 148, 2429-2436; S. Chan et al., ”Induction of Interferon γ Production by Natural Killer Cell Stimulatory Factor: Characterization of the Responder Cell and Synergy with Other Inducers”, J. Exp. Med., 1991, 173, 869-879; i M. Kobayashi et al., ”Identification and Purification of Natriral Killer Cell Stimulatory Factor (NKSF), a Cytokine with Multiple Biologic Effects on Human Lymphocites”, J. Exp. Med. 1989, 170, 827-845).

Interleukin-12 (u nastavku će se označavati kao ”IL-12”) je pokazao adjuvantsku aktivnost u izazivanju stanično posredovanog imuniteta protiv lejšmanijoze kod miševa BALB/c (L. Afonso et al., ”The Adjuvant Effect of Interleukin-12 in a Vaccine Against Leishmania major”, Science, 1994, 263, 235-237). Spomenuta zaštita protiv L. major zasniva se na aktivnosti IL-12 da inducira razvijanje CD4+ TH1 (T-helper) stanica specifičnih prema lejšmaniozi. U U.S. Patent-u No 5,571,515 (Scott et al.) i srodnim odjeljcima u U.S. Patentima No. 5,723,127 i 5,976,539, opisana je upotreba IL-12 kao adjuvanta protiv lejšmanioze, pojačavanjem stanično posredovanog imuno odgovora na antigen koji sadrži protozoanski parazit. Na osnovu opisa upotrebe IL-12 kao adjuvanta na modelu lajšmanioze i kod cjepiva protiv raka, U.S. Patent No. 5,723,127 je usmjeren na antigenske preparate odabranih antigena i IL-12 i na postupak za povećavanje svojstva ovih preparata da izazovu stanično posredovane imuno odgovore domaćina prema odabranim antigenima. U.S. Patent No. 5,076,539 je usmjeren na preparat antigena koji se bira između stanica raka ili stanica raka transficiranih s odabranim antigenom i IL-12 i na postupak za njegovu upotrebu. Dalje povezani nastavak u ovom nizu, U.S. Patent No. 6,168,923 B1 (Scott et al.), štiti preparat koji sadrži antigen, a sastoji se od patogenog mikroorganizma i iIL-12, koji izaziva kod cijepljenog domaćina stanično posredovan imuno odgovor protiv mikroorganizma, i postupak ordiniranja IL-12 za jačanje sposobnosti imunogenog preparata da izazove kod cijepljenog domaćina stanično posredovan imuno odgovor.

U U.S. Patent-u No. 5,665,347 (Metzger et al.) opisuje se da, pored aktiviranja stanica TH1 (T pomagač), IL-12 inhibira funkcionalnu aktivnost B1 stanica, ali ne i B2 stanica, a B-1 stanice imaju receptor za IL-12. Vlasnici patenta ukazuju da IL-12 može naći upotrebu u tremanu poremećaja B1 stanica, kao što je kronična limfocitna leukemija, limfomi i infektivna mononukleoza.

U.S. Patent-u No. 5,817,637 (Weiner et al.) se odnosi na komplet za farmaceutsku imunizaciiju koji koristi genetski materijal kao agens za imunizaciju u dva odvojena inokulanta. Treći inokulant sadrži bupivacin, koji se može kombinirati s drugim agensima koji pojačavaju odgovor, kao što su transfekcioni, replikatorni i inflamatorni agensi, na primjer, lektini, faktori rasta, citokini (kao što je α-interferon, γ-interferon, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 itd.) i limfokini.

U.S. Patent No. 5,895,264 (Metzger et al.) bavi se postupkom za jačanje imuno odgovora na patogen kod novorođenog domaćina, koji se sastoji od ordiniranja IL-12 i antigena koji trebaju inducirati memoriju za zaštitne odgovore kad odraste. Novorođeni domaćin je sisavac, na primjer, humano biće, glodavac, mačka, pas, govedo ili svinja, a odnosi se na fetus kao i na novorođenče, do oko 2 godine poslije rođenja. Antigen se opisuje kao bakterija (npr. S. pneumoniae, N. menigiditis, H. influenza), virus (npr. hepatitisa, boginja, poliovirus, humane imunodeficijencije, influence, parainfluence, sincitialni respiratorni), parazit (npr. Leishmania, Schistosomes) i gljivice (npr. Candida, Aspergillus).

U U.S. Patent-u No. 5,744,132 (Warne et al.) opisuju se preparati i postupci za dobivanje koncentriranih preparata IL-12 u smrznutoj, tekućoj ili liofiliziranoj formulaciji proteina IL-12, polisorbata, kriozaštitnog agensa, agensa za obogaćenje mase i pufernih agenasa. U.S. Patent No. 5,853,714 (Deetz et al.) daje postupak za pročišćavanje IL-12 koji koristi kromatografiju na smoli za hidrofobnu interakciju, za dobivanje IL-12 bez kontaminanata, kao što su stanice proteina domaćina i virusi.

Uz prethodno navedeno stanje tehnike, postoji nekoliko patenata i publikacija u ovom prenatrpanom području koji opisuju upotrebu IL-12 sa nekim antigenima, na primjer, kao adjuvantima paramiksovirusnih cjepiva (U.S. Patent No. 6,071,893, Graham et al.), za jačanje oralne tolerancije i tretman autoimune bolesti (WO 98/16248), za tretiranje inflamacije (U.S. Patent No. 5,674,483, Tu et al.), kao adjuvant u cjepivima protiv Bordatella pertussis (WO 97/45139) ili kao ko-adjuvant sa IL-13, u cjepivima koje sadrže antigene, kao što s influenca A, HIV, toksoid tetanusa, itd. (WO 98/31384) i slično. Daljnja ispitivanja su dala niz životinjskih citokina i postupaka za njihovo dobivanje, na primjer, mačji IL-12 (C. Leutenegger et al., ”Immunization of Cats against Feline Immunodeficiency Virus (FIV) Infection by Using Minimalistic Immunogenic Defined Gene Exprijession Vector Vaccines Exprijessing FIV gp 140 Alone or with Feline Interleukin-12 (IL-12), IL-16, or CpG Motif”, J. Virology, 2000, 74(22), 10447-10457 i WO 01/04155 A2), ptičji IL-15 (WO 97/14433), ovčiji IL-5 ili IL-12 (WO 97/00321), da se navede samo nekoliko.

Drugo ispitivianje, uključujući neke od publikacija koje su spomenute gore, je usredotočeno na određene formulacije cjepiva i na postupke za njihovo dobivanje. Na primjer, U. S. Patent No. 5,242,686 (Chu et al.) je usmjeren na postupak za dobivanje preparata mačjeg cjepiva koja je korisno protiv infekcija sa klamidijom. Inaktivirane stanice sisavaca ili antigeni klamidije mogu se kombinirati sa imunogeno pogodnim adjuvantom i fiziološki prihvatljivim nosačem. Ovaj patent navodi kao adjuvante, na primjer, surfaktante, polianjone, polikatjone, peptide, taftsin, tetrapeptide, emulzije ulja, a kao imunomodulatore interleukin-1, interleukin-2 i interferone, kopolimere akrilne kiseline, kao što je kopolimer etilen/anhidird maleinske kiseline, kopolimere stirena sa smjesom akrilne i metakrilne kiseline i njihove kombinacije.

U.S. Patent No. 5,733,555 (Chu) i njegov nastavak U.S. Patent No. 5,958,423 odnose se na preparat cjepiva za imunizaciju životinje protiv infekcije izazvane goveđim respiratornim sincitijalnim virusom (”BRSV”), koji sadrži modificirani živi BRSV, sam ili u kombianciji s goveđim virusom IV rinotraheitisa, goveđim virusom virusne dijareje i virusom parainfluence 3, kao adjuvantom i farmaceutski prihvatljivim nosačem. Ovaj preparat izaziva zaštitni imunitet nakon samo jednog ordiniranja, preko stanično posredovanog imuniteta, imuniteta izlučenog imunoglobulina A i njihove kombinacije. Adjuvant može još sadržavati surfaktant, kao što je polioksietilen-sorbitan-monooleat. Ovaj patent navodi i druge adjuvante, kao što su skvalan, skvalen, blok polimeri, saponin, deterdženit, Quil A, minearlna ulja, biljna ulja, interleukini, kao što je Interleukin-1, interleukin-2 i interleukin-12, faktor nekroze tumora, interferoni, kombinacije kao što je saponin i aluminij-hidroksid, ili Quil A i aluminij-hidroksid, lipozomi, adjuvant iscom, sintetski glikopeptidi, kao što su muramil dipeptidi, dekstran, karboksipolimetilen, EMA®, emulzije akrilnog kopolimera, kao što je Neocryl® A640 ili njihove smjese.

Međutim, nije opisano ili dano kao primjer u stanju tehnike da IL-12 ili drugi imunomodulatori mogu učinkovito i primjetno jačati imunogenicitet slabih, imunosupresivnih ili potencijalno toksičnih antigena, ako se specifično ordiniraju paralelno sa imunoadjuvantima.

Stoga, značajan predmet ovog izuma je davanje veoma jedinstvenog cjepiva koje poseduje značajno poboljšan imunogenicitet kod sisavaca, ptica, a koja se sastoji od slabih ili imunosupresivnih antigena, ili antigena sa uskom marginom sigurnosti, zajedno s novom kombinacijom koja se sastoji od imunomodulatora i imunoadjuvanata iz ovog izuma.

Slijedeći predmet je davanje novog postupka za upotrebu kombinacije koja se sastoji od imunomodulatora i imunoadjuvanata, ili cjepiva koja sadrži ovu kombinaciju za suštinsko ojačanje imunogeniciteta cjepiva izazivanjem jače stimulacije stanično posredovanog imuniteta, uključujući T memoriju stanica, i pružanje dugotrajnijeg imuniteta, uslijed čega se zahtjevaju umanjene ili manje frekventne doze antigena tijkom vremena i smanjenje sporednih efekata ili potencijala toksičnosti.

Slijedeći predmet je davanje novog postupka za jačanje, ubrzavanje ili produžavanje imunološke aktivnosti antigena kod ptica i sisavaca..

Slijedeća svrha i predmeti ovog izuma će se dati u opisu koji slijedi.

Prethodni predmeti su ostvareni kroz davanje kombinacije imunomodulatora i imunoadjuvanata, i cjepiva u kojoj je imunomodulator zajednički formuliran s imunoadjuvantom i virusnim, bakterijskim, parazitskim ili gljivičnim antigenom. Proizvod ovog izuma izaziva veoma poboljšan imunološki odgovor na antigen, u usporedbi s klasičnim cjepivima i drugim kombinacijama, koje se sastoje samo od citokina. Osnova ovog izuma i njegovo odstupanje od stanja tehnike biti će dodatno opisani u nastavku.

Ovaj izum čini poboljšana formulacija cjepiva koje sadrži djelotvornu količinu imunizirajućeg antigena, imunomodulator i jedan ili više imunoadjuvanta, u kojoj je imunogenicitet, ili fiziološka djelotvornost cjepiva, značajno povećana. Ovaj izum čini nova kombinacija preparata koji sadrži imunomodulatore i imunoadjuvante koji primjetno poboljšavaju imunološki odgovor cijepljenog domaćina prema antigenu. Isto tako, ovaj izum se odnosi na novi postupak za jačanje, ubrzavanje ili produžavanje imunogeniciteta slabih, imunosupresivnih ili marginalno sigurnih antigena, koji se sastoji u ordiniranju ptičjim vrstama ili vrstama sisavaca farmakološki djelotvorne količine gore spomenutog kombiniranog preparata ili količine potrebne za učinkovito cijepljenje gore pomenutim preparatom cjepiva.

U skladu sa ovim izumom, novi preparat cjepiva sadrži količinu antigena za učinkovito imuniziranje, imunomodulator, jedan ili više imunoadjuvanata i farmaceutski prihvatljiv nosač. S iznenađenjem je ustanovljeno da ugradnja imunomodulatora i jednog ili više imunoadjuvanata u cjepiva, značajno ojačava imunogenicitet i fiziološku učinkovitost antigenske supstance. Ova jedinstvena kombinacija imunomodulatora i imunoadjuvanata ima blagotvornu biološku aktivnost prema brojnim antigenima.

Antigen obuhvaća široki niz infektivnih agenasa, što je jasno onima koji su uobičajeno verzirani u stanje tehnike farmacije ili veterine. Infektivni agens, po prirodi može biti, na primjer, virusni, bakterijski ili gljivični. Drugi infektivni agensi su, ali bez ograničavanja, paraziti, tumorski antigeni i antigeni drugih patoloških bolesti. Određeni antigen ili kombinacija antigena koji se koriste u ovom preparatu cjepiva zavisiti će od životinjske vrste koja se treba cijepiti i od rezultata koji se želi.

Antigen se ugrađuje, s imunomodulatorom i imunoadjuvantom, u promjenljivim količinama, u obično se kreće od oko 0,0001 mas% do oko 1,0 mas%. Primjeri tipičnih virusnih antigena su, ali bez ograničavanja istima, goveđi respiratorni sincitijalni virus, virus herpes simpleks tip 1 (HSV), goveđi virus dijareje (BVD), virus parainfluence-3 (PI), pseći parvovirus (CPV), pseći virus parainfluence (CPI), pseći adenovirus tip II (CAV-2), pseći adenovirus (CDV), pseći koronavirus (CCV), virus bjesnila (naročito, iako bez ograničavanja, pseće cjepiva bjesnila), mačji virus imunodeficijencije (FIV), mačji virus leukemije (FeLV), mačji koronavirus (etiološki agens mačjeg infektivnog peritonitisa (FIP)), virusni svinjski reproduktivni ili respiratorni sindrom (PRRS), virus kokošjeg herpesa (etiološki agens Marek-ov bolesti), itd. Tipični bakterisjki antigeni su , ali bez ograničavanja istima, Chlamydia, Ehrlichia, Pasteurella, Haemophilus, Salmonella, Staphylococcus, Borelia, Mycoplasma (na primjer bolest svinja Mycoplasma hyopneumoniae), itd. Tipični parazitski antigeni su, ali bez ograničavanja istima, Leptospira, Coccidia, Hemosporidia, Amoebida, Trypanosoma, Leishmania, Giardia, Histomonas, itd. Tipični glivični antigeni su, ali bez ograničavanja istima, Coccidioides, Histoplasma, Blastomycs, Aspergillus, Cryptococcus, itd.

U poboljšanom cjepivu iz ovog izuma imunomodulator je prisutan u promjenjivim količinama, a obično se kreće od oko 0,00001 mas% do oko 0,01 mas%. Primjeri pogodnih imunomodulatora su, ali ne i ograničeni istima, citokini, kao što su IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 itd., interferoni, kao što su α-interferon ili γ-interferon, faktor nekroze tumora, faktor trasformacije rasta, faktor stimulacije kolonija i slično, ili njihova kombinacija. Poželjno je da je imunomodulator neki citokin. U poželjnoj realizaciji, imunomodulator je interleukin-12, a najpoželjnije homologni životinjski interelukin-12, kao što se na primjer, pseći IL-12 koristi u psećim cjepivima; mačji IL-12 se koristi u mačjim cjepivima; konjski IL-12 se koristi u konjskim cjepivima, i tako dalje. Humani IL-12 ili glodarski IL-12, kao što je rekombinantni IL-12 (komercijalno dostupan iz firme Genetics Institute, Inc. Cambridge, MA), ili rekombinantni glodarski IL-12 (komercijalno dostupan od opskrbljivača virusima, na primjer, Research Diagnostics, Inc., Flanders, NJ, i Cambridge Bioscience, Cambridge, England; vidjeti isto tako D. Schoenhaut et al., ”Cloning and Exprijession of Murine IL-12”, J. Immunology, 1992, 248(1), 3433-3440) mogu se pogodno koristiti za razne životinjske vrste, mada efekt imunojačanja ne mora biti tako veliki, kao kod homolognog životinjskog IL-12, u nekim životinjskim cjepivima.

U poboljšanom cjepivu iz ovog izuma prisutan je jedan ili više imunoadjuvanata u promjenjivim količinama, koje se obično kreću od oko 0,05 mas% do oko 50 mas%. Primjeri pogodnih imunoadjuvanata su, ali bez ograničavanja istima, ulja biljnog ili životinjskog porijekla koja se mogu metabolizirati, kao što su skvalen (2,6,10,15,19,23-heksametil-2,6,10,14,18,22-tetrakozaheksen), ili poželjno skvalan (2,6,10,15,19,23-heksametil-tetrakozan); blok kopolimeri, na primjer, blok kopolimeri polioksipropilen-polioksietilen, kao što je Pluronic® (komercijalno dostupan iz firme BASF Corporation, Mount Olive, NJ); saponin, kao što je Quil A (komercijalni naziv pročišćenog oblika Quillaja saponaria, koji je dostupan iz firme Iscotec AB, Sweden i Superfos Bioester a/s, Vedbaek, Denmark); kopolimeri etilen/anhidrid maleinske kiseline, kao što je ENA-31® (linearni kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, koji ima približno iste količine etilena i anhidrida maleinske kiseline, i procjenjenu srednju molarnu masu od oko 75.000 do 100.000, komercijalno je dostupan iz firme Monsanto Co., St. Louis, MO); kopolimeri akrilne kiseline; emulzije kopolimera akrilne kiseline, kao što je Neocryl® (nekoalescirani kopolimer akrilne kiseline u vodi i metakrilne kiseline, pomješan sa stirenom, komercijalno dostupan iz firme Polyvinyl Chemicals, Inc., Wilmington, MA); emulzije mineranog ulja, kao što je MVP® (emulzija ulje-u vodi lakog mineralnog ulja, komercijalno dostupna iz firme Modern Veterinary Products, Omaha, NE), ili njihove smjese.

Poželjni blok kopolimeri polioksipropilen-polioksietilen-a iz ovog izuma imaju promjenljive količine polioksipropilena i polioksietilena. Poželjno je da ovaj blok kopolimer sadrži polioksietilen u sadržaju od oko 10-20 % od ukupnog molekula, a da polioksipropilen ima u prosjeku molarnu masu oko 3250 do 4000.

Kopolimeri etilen/anhidrid maleinske kiseline iz ovog izuma tipično su otopivi u vodi bijeli prahovi, koji slobodno teku, i imaju slijedeća svojstva: prava gustoća oko 1,54 g/mL, temperatura omekšavanja oko 170°C, temperatura taljenja oko 235°C, temperatura razgradnje oko 274°C, nasipna gustoća oko 0,32 g/mL i pH oko 2,3 (1% otopina).

Poželjna emulzija kopolimera akrilne kiseline iz ovog izuma je Neocryl® A640, koja sadrži kopolimer akrilne kiseline u vodi, ima pH 7,5, viskoznost 100 eps (Brookfield, 25°C), masu od 1,02 kg po L, u isporučenom stanju, sadrži 40 mas% čvrste supstance, ili 38 vol% čvrste supstance i kiselinski broj 48. Specifično, Neocryl® A640 je emulzija lateksa nekoalescirane akrilne kiseline u vodi kopolimera akrilne kiseline i metakrilne kiseline pomiješane sa stirenom. Drugi korisni proizvodi su, ali bez ograničavanja, Neocryl®A520 i A625, i slično.

Poželjne kombinacije imunomodulatora i imunoadjuvanata su smjesa homolognog životinjskog IL-12, skvalana i blok kopolimera polioksipropilen-polioksietilen; smjese homolognog životinjskog IL-12 i saponina; i smjesa homolognog životinjskog IL-12, EMA-31® i Neocryl®A640, sa ili bez emulzije mineralnog ulja. Umjesto homolognog životinjskog IL-12 može se zamijeniti rekombinantni humani ili glodarski IL-12, iako se može očekivati djelomičan efekt imuno ojačanja. Pod nekim okolnostima, efikasnost ili snaga se mogu lako odrediti rutinskim testovima, a zatim se doza aktivnog sastojka može na odgovarajući način titrirati, kod pacijenta ili životinje kojoj je to potrebno.

Farmaceutski prihvatljiv nosač je isto tako prisutan u promjenljivim količinama u preparatu cjepiva iz ovog izuma. Količina netoksičnog, inertnog nosača zavisiti će, naravno, od odabranih količina drugih sastojaka, željene koncentracije aktivne antigenske supstance, izbora fiole, štrcaljke ili veličine, druge konvencionalne pomoćne otopine, itd. Nosač se može dodati cjepivu u bilo koje pogodno vrijeme. U slučaju liofiliziranog cjepiva, nosač se može, na primjer, dodati neposredno prije ordiniranja. Alternativno, konačni proizvod se može proizvoditi s nosačem. Primjeri odgovarajućih nosača su, ali ne i ograničeni njima, sterilna voda, slana otopina, puferi, puferska fosfatna slana otopina, puferirani natrij-klorid, biljna ulja, minimalni esencijalni medij (MEM), MEM sa HEPES puferom, itd.

Opcijski, ovaj preparat može sadržavati konvencionalne, sekundarne adjuvante u promjenjivim količinama, zavisno od adjuvanta i željenog rezultata. Uobičajena količina se kreće od oko 0,02 mas% do oko 20 mas%, ili predstavlja od oko 1 µg do oko 50 µg po dozi, zavisno od drugih sastojaka i željenog efekta. Primjeri pogodnih sekundarnih adjuvanata su, ali ne i ograničeni njima, stabilizatori, emulgatori, aluminij-hidroksid, aluminij-fosfat, podešavači pH, kao što je natrij-hidroksid, klorovodonična kiselina, itd.; surfaktanti, kao što je Tween® 80 (polisorbat 80, komerijalno dostupan iz firme Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); lipozomi; adjuvant iscom; sintetski glikopeptidi, kao što su muramil dipeptidi; punila, kao što je dekstran ili kombinacije dekstrana, na primjer, sa aluminij-fosfatom; karboksipolimetilen; zidovi stanica bakterija, kao što je ekstrakt zida mikobakterijskih stanica; njihovi derivati, kao što je Corynebacterium parvum; Propionbacterium acne; Mycobaterium bovis, na primjer Bovine Calmede Guern (BCG); cjepivo ili životinjski proteini virusa malih boginja; subvirusne čestice adjuvanata kao što je orbivirus; toksin kolere; N,N-dioktadecil-N’,N’-bis(2-hidroksietil)-propandiamin (avridin); monofosforil lipid A; dimetil-dioktadecilamonijum-bromid (DDA, komercijalno dostupan iz firme Kodak, Rochester, NY); sintetike i njihove smjese. Poželjno je da se pomiješa aluminij-hidroksid s drugim sekundarnim adjuvantom ili imunoadjuvantom, kao što je Quil A. Primjeri pogodnih stabilizatora su, ali bez ograničavanja, saharoza, želatina, pepton, ekstrakti digestiraih proteina, kao što je NZ-amin ili NZ-amin AS. Primjeri emulgatora su, ali bez ograničavanja, mineralno ulje, kikirikijevo ulje i druga standardna, netoksična, probavljiva ulja, koja su korisna za cjepiva koja se ubrizgavaju ili za intranazalna cjepiva.

Za svrhe ovog izuma, adjuvanti koji se ovdje identificiraju kao ”sekundarni”, samo radi razlike od gore-spomenutih imunoadjuvanata, su bitni sastojak cjepiva, zbog njihovih učinaka da u kombinaciji sa imunomodulatorom značajno povećaju humoralni imuno odgovor sisavca ili ptice prema antigenskoj supstanci. Sekundarni adjuvanti su prvenstveno dodani u formulacije cjepiva kao sredstva za procesiranje, iako neki adjuvanti zaista imaju svojstva jačanja imuniteta do neke mjere, i imaju dvostruku svrhu.

Po potrebi, u cjepivo se mogu dodati konvencionalni prezervativi u efikasnim količinama, koje se kreću od oko 0,0001 mas% do 0,1 mas%. Zavisno koji se prezervativ koristi u ovoj formulaciji, količine ispod ili iznad ovog opsega mogu biti od koristi. Tipično prezervativi su, na primjer, kalij-sorbat, natrij-metabisulfit, fenol, metilparaben, propilparaben, timerosal, itd.

Izbor inaktivirane, modificirane ili druge vrste cjepiva i postupka za dobivanje poboljšane formulacije cjepiva iz ovog izuma, je poznat ili ga lako određuje onaj tko je uobičajeno verziran u stanje tehnike. Kao ilustracija dobivanja inaktiviranih cjepiva, pomiješa se na primjer, imunomodulator, poželjno homologni životinjski IL-12, sa jednim ili više antigena, jednim ili više imunoadjuvanata i opcijski, s jednim ili više sekundarnih adjuvanata. Antigeni mogu biti inaktivirani FIV, FeLV, E. canis, CCV, vrste Leptospira itd. Kao slijedeća ilustracija, imunomodulator, se pomiješa, poželjno homologni životinjski IL-12, s antigenima, u prisustvu ili u odsustvu imunoadjuvanata ili sekundranih adjuvanata, za dobivanje modificiranog cjepiva. Antigeni u ovom slučaju mogu biti BRSV, I. equi, CPV, CAV-2, CDV, CPI, itd. Podrazumjeva se, međutim, da se cjepiva iz ovog izuma mogu pripraviti i raznim standardnim tehnikama, koje su dobro poznate u stanju tehnike formulacija, i nisu ograničene ilustracijama koje su ovdje opisane.

Kombinacija koja se sastoji od imunomodulatora i imunoadjuvanata može se dobiti i ordinirati kao odvojeni proizvod. Farmakološki efikasna količina ovog preparata za jačanje imunogeniciteta može se davati, na primjer, parenteralno, oralno ili drugačije, sisavcu ili ptici, prije, paralelno, sekvencijalno ili kratko poslije ordiniranja slabog, imunosupresivnog ili marginalno sigurnog antigena, sa ciljem da se pojača, ubrza ili produži imunogenicitet tog antigena. Tipično, preparat za jačanje imunogeniciteta će se ordinirati manje od 24 h prije početka procesa cijepljenja, a poželjno 4 h prije, ili paralelno sa cijepljenjem. Ukoliko cijepljenje zahtijeva više od jedne doze antigenske supstance, tada se preparat za jačanje imunogeniciteta može ordinirati sekvencijalno sa ordiniranjem toga cjepiva. Mada je manje efikasan, preparat za jačanje imunogeniciteta se može davati poslije cjepiva, da bi se podigao imunitet protiv antigena, ali rijetko poslije 24 h.

Kada se daje odvojeno od cjepiva, ovaj preparat može još sadržavati farmaceutski prihvatljiv nosač i opcijski, sekundarne adjuvante, koji su ovdje opisani. I imunomodulator i imunoadjuvant mogu biti prisutni u promjenjivim količinama, tipično u pakiranju jedinične doze. Iako doziranje ove kombinacije zavisi od antigena, vrste životinje, tjelesne mase cijepljenog domaćina itd., doza farmakološki efikasne količine imunomodulatora će se obično kretati od oko 0,1 µg do oko 100 µg po dozi, a poželjno od oko 5 µg do oko 50 µg po dozi. Imunoadjuvant će se tipično kretati u opsegu od oko 1 µg do oko 25 µg po dozi. Mada će prisustvo i količina određeog imunomodulatora u ovoj kombinaciji utjecati na količinu imunomodulatora potrebnu za poboljšavanje imuno odgovora, podrazumjeva se da onaj tko je operativac može lako podesiti efikasnu količinu doze imunomodulatora, preko rutinskog testiranja, kako bi se udovoljilo određenim okolnostima.

Kada se koristi homologni životinjski IL-12, količina imunomodulatora u cjepivu se može značajno smanjiti, zahvaljujući njenoj snazi. Za male životinje, kao što su psi, mačke itd., poželjno je da se koristi opseg od oko 0,02 µg do oko 2 µg po dozi životinjskog IL-12, a poželjnije je 0,5 µg po dozi da se koristi u kombiniranom preparatu iz ovog izuma. Za velike životinje, kao što su konji, stoka, svinje itd., tipično se koristi obujam od oko 0,1 µg do oko 5 µg po dozi životinjskog IL-12, a poželjno je da se koristi oko 0,5 µg do oko 2,5 µg po dozi. Podrazumjeva se da količine ispod i iznad ovih oopsega mogu naći njihove respektivne upotrebe, kod manjih ptica i kod ekstremno velikih životinja. Da bi se zadržala biološka aktivnost, preporučuje se isto tako da se cjepivu doda životinjski IL-12 ili jedinični oblik doze, neposredno pred upotrebu.

Kao primjer koji ne ograničava, pogodna pseće cjepivo može sadržavati Ebony soj E. canis, u koncentracija/doza od 1×105 TCID50; B. burgdorferi B-31 u koncentracija/doza od 5×108; 5 vol.% emulzigena SA; 1 vol.% EMA-31®; 3 vol.% Neocryl® A640; koncentraciju 1:20.000 timerosala (5%); pogodnu količinu 1× MEM razrijeđivača i pseći IL-12, u koncentraciji od približno 0,5 µg po dozi, ili humani IL-12 u koncentraciji od približno 10 µg po dozi.

Ovaj izum obuhvaća još i novi postupak za jačanje, ubrzavanje ili produžavanje imunogeniciteta slabih, imunosupresivnih ili marginalno sigurnuh antigena, koji se sastoji od ordiniranja pticama ili sisavcima farmakološki efikasne količine preparata za jačanje imunogeniciteta, ili efikasne količine za cijepljenje ili imunizaciju formulacije cjepiva koja je ovdje opisana. Jačanje imunogeniciteta slabog, imunosupresivnog ili marginalno sigurnog antigena obuhvaća poboljšanje snage antigena. Ubrzavanje imunogeniciteta odnosi se na ubrzavanje početka djelovanja. Produžavanje imunogeniciteta znači produženo trajanje djelovanja.

Kao opće pravilo, pogodno je da se cjepivo iz ovog izuma ordinira parenteralno (subkutano, intramuskularno, intravenozno, intradermalno ili intraperitonealno), intrabukalno, intranazalno, transdermalno ili oralno. Put ordiniranja koji se podrazumjeva ovim izumom će zavisiti od antigenske supstance i ko-formulanata. Na primjer, ukoliko cjepivo sadrži saponine, iako su oralno ili intranazalno netoksični, mora se paziti da se sapogenin glikozidi ne ordiniraju u krvotok, zato što djeluju kao jaki hemolitici. Isto tako, mnogi antigeni neće biti efikasni, ukoliko se uzimaju oralno. Poželjno je da se ovo cjepivo ordinira subkutano, intramuskularno ili, u slučaju S. equi i drugih, intranazalno.

Doza cjepiva će zavisiti od odabranog antigena, puta ordiniranja, vrste životinje, tjelesne mase i drugih standardnih faktora. Smatra se da osoba koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike može za svaki antigen lako i jednostavno titrirati odgovarajuće doziranje za imunogeni odgovor, kako bi se došlo do efikasne količine za imuniziranje i postupka ordiniranja.

Pogodno je koristiti u formulaciji cjepiva antigen i imunomodulator, kao što je citokin, poželjno homologni životinjski IL-12, u kombinaciji sa imunoadjuvantima, zato što je ova poboljšano cjepivo visoko antigenska, i izražava jače stimuliranje T memorijskih stanica, nego što se to moglo postići u prošlosti. Serumski titri antitijela na antigenske supstance, poslije cijepljenja s formulacijom iz ovog izuma, mnogo su viši nego titri inducirani s istom formulacijom u odsustvu imunomodulatora. Na primjer, ranije ispitivanje je pokazalo da su titri serumskog antitijela na BRSV, 14 dana poslije cijepljenja sa BRSV, u kojoj je adjuvant smjesa skvalana i blok kopolimera polioksopropilen-polioksietilena, bili 1:125. Iznenađuje da su titri antitijela na BRSV, 14 dana poslije cijepljenja sa BRSV, pomješane sa skvalanom, blok kopolimerom polioksipropilen-polioksietilen i rekombinantnim humanim IL-12, bili izrazito viši, oko 1:395, a uočljivo još viši poslije 28 dana, oko 1:366. Značajno pojačan imunogenicitet, ubrzani početak djelovanja i produženo trajanje imuniteta su dokazani povišenim titrima serumskih antitijela (tj. humoralnim imunoodgovorom) i jačom stimulacijom T memorijskih stanica. Suštinsko poboljšanje efikasnosti ovog cjepiva iz ovog selektivnog izuma predstavlja potpun otklon od postojećeg stanja tehnike.

Kako se ovdje koristi, skraćenica ”CFU” označava jedinice koje formiraju kolonije. Na primjer, ”infektivna jedinica” BRSV se definira kao TCDI50, a ”TCDI50” ili 50% infektivna doza kulture tkiva se definira kao doza koja inficira 50% kulture tkiva. Na primjer, kada se otopina koja sadrži antigen, razrijedi 1:100, 1 infektivna jedinica je jednaka količini koja zarazi 50% kulture tkiva. U slučaju BRSV, TCID50 je količina virusa neophodna da inficira ili ubije 50% stanica u kulturi tkiva. Naziv ”stanični posredovan imunitet” obuhvaća stimulaciju T-pomagača stanica, T-ubica stanica i T-odlagača hiperosetljivosti stanica, kao i stimulaciju makrofaga, monocita i drugih limfokina i stvaranje interferona. Prisustvo stanično posredovanog imuniteta se može odrediti konvencionalnim testovima in vivo i in vitro. Lokalni imunitet, kao izlučeni IgA, može se odrediti konvencionalnim ELISA ili IFA testovima, koji pokazuju titar serumskih neutraliziranih antitijela od 1 ili 2, ili veći. Stanično posredovani ili lokalni imunitet koji se izražava u skladu s ovim izumom je specifičan za, ili povezan direktno sa antigenom. Naziv ”sisavac” odnosi se na humana bića, stoku, krave, ovce, jelene, konje, svinje, koze, pse, mačke i slično. Naziv ”ptičji” se odnosi na životinje, kao što su kokoši ili pure i druge vrste domaćih ili divljih ptica. Iako je poželjna veterinarska upotreba na životinjama, podrazumjeva se da jačanje imunogeniciteta i preparati cjepiva koji su ovdje opisani, mogu naći i blagotvornu medicinsku upotrebu.

Daljnje razumjevanje ovog izuma se može dobiti iz slijedećih primjera koji ga ne ograničavaju. Međutim, ovi primjeri se iznose samo na ilustracije nekih aspekata ovog izuma, i ne trebaju se shvatiti kao ograničenje istih. Podrazumjeva se da smisao ovih primjera nije da su u potpunosti konačni kao stanje i obim ovog izuma. Podrazumjeva se nadalje, da kada se daju tipični reakcioni uvjeti (npr. temperatura, vrijeme reakcije itd.) uvjeti i iznad i ispod naznačenih opsega mogu se isto tako koristiti iako obično manje pogodno. Slijedeća eksperimentalna ispitivanja koriste rekombinantni humani IL-12, dobijen iz Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA, koji je potpuno u subsidijarnom vlasništvu Wyeth, Madison, NJ. Ukoliko se drugačije ne kaže, primjeri su obavljeni na sobnoj temperaturi (oko 23°C do oko 28°C), na atmosferskom tlaku, a svi udjeli i postoci su maseni i sve temperature su iskazane u stupnjevimama Celzijusa.

Primjer 1

Efekt adjuvanta na imunogenicitet konjskog cjepiva

Ispitivanje je obavljeno da se odredi efekt nekih adjuvanata na imunogenicitet inaktivirane cjepiva Streptococcus equi. Za dobivanje adjuvanata koriste se polazne otopine rekombinantnog humanog IL-12 (4,45 mg/mL), saponin, stabilizator za modificiranje živog cjepiva (SGGK-3, 25 vol.%) i medijum za rast bakterija (modificirana Todd Hewitt-ova juha, MTHB). Napravljene su tri mješavine adjuvanta sa približno 10 µg IL-12 po dozi, 50 µg IL-12 po dozi i 10 µg IL-12 po dozi, plus 5 mg saponina po dozi.

Za pripremanje smjese adjuvanta koja sadrži oko 10 µg IL-12 po dozi, pripremi se razrjeđivač za dehidrataciju, dodavanjem oko 0,056 mL IL-12 u oko 49,719 mL dovoljne količine vode da bude ukupno 50 mL. Podešavanje razrijeđivača se zatim obavlja dodavanjem oko 0,056 mL IL-12 u oko 12,5 mL SGGK-3 (25 vol.%), pomiješanog sa oko 37,444 mL MTHB.

Za pripravu smjese adjuvanta koja sadrži oko 50 µg IL-12 po dozi, pripremi se razrjeđivač za dehidrataciju, dodavanjem oko 0,281 mL IL-12 u oko 49,719 mL dovoljne količine vode da bude ukupno 50 mL. Podešavanje razrjeđivača se zatim obavlja dodavanjem oko 0,281 mL IL-12 u oko 12,5 mL SGGK-3 (25 vol.%), pomješanog sa oko 37,219 mL MTHB.

Za pripravu smjese adjuvanta koja sadrži oko 10 µg IL-12 plus 5 mg saponina po dozi, pripremi se razrijeđivač za dehidrataciju, dodavanjem oko 0,056 mL IL-12 u oko 0,625 mL saponina, a ova smjesa u oko 49,319 mL dovoljne količine vode da bude ukupno 50 mL. Podešavanje razrijeđivača se zatim obavlja dodavanjem oko 0,056 mL IL-12 u oko 0,526 mL saponina, a ta smjesa u oko 12,5 mL SGGK-3 (25 vol.%), pomješanog sa oko 37,819 mL MTHB.

Za pripravu svakog cjepiva, rehidrira se jedna fiola Pinnacle® I.N. (intranazalna konjsko Strangles cjepivo, komercijalno dostupno iz Fort Dodge Animal Health, Inc, veterinarski ogranak Wyeth, Madison NJ), sa oko 2,5 mL razrijeđivača za rehidrataciju. Za svaku grupu pripremi se deset doza cjepiva, oko 0,467 mL rehidriranog cjepiva se doda u oko 19,533 mL podešenog razrijeđivača, tako da se dobije količina od približno 1×107 CFU po dozi.

Svi konji koji se podvrgavaju testiranju cjepiva cijepe se dva puta sa razmakom od tri tjedna između cjepljenja. Cjepivo se ordinira intranazalno, s injekcijom, povezanom s kateterom dužine oko 14 cm. Prvo cijepljenje se obavlja u lijevu nozdrvu, a drugo cijepljenje se obavlja u desnu nozdrvu. Svi konji u kontrolnoj grupi cijepe se sa komercijalno dostupnim cjepivom Streptococcus equi (Stepguard® sa Havlogen®-om, i adjuvantom koji se sastoji od karboksipolimetilena, proizvedenim u firmi Bayer Animal Health, Inc., poljoprivredni ogranak Bayer Corpration) i prime dva cijepljenja s razmakom od tri tjedna. Komercijalno cjepivo se ordinira intramuskularno, u skladu s preporukama proizvođača.

Pet konja nije cijepljeno, nego inokulirano sa 1 mL (približno 5×108 CFU/mL) S. equi, vrsta C-32, u svaku nozdrvu, 5 dana prije zaražavanja kontaktom. Za inokulaciju ovih konja korištena je injekcija s kateterom dužine oko 14 cm. Ovih pet konja je svakodnevno promatrano, od dva dana prije zaražavanja, pa do pet dana poslije zaražavanja, na kliničke znakove i rektalnu temperaturu. Poslije zaražavanja, prikupljani su brisevi nosa svakodnevno, kako bi se pratilo curenje uslijed S. equi. Dvadestejedan dan poslije drugog cijepljenja svi cijepljeni konji su izmiješani sa pet direktno zaraženih konja. Ove životinje su promatrane svakodnevno, počevši od –2 dana do 0 dana poslije zaražavanja (DPC), da bi se uspostavilo osnovno stanje i od 1 do 28 dana DPC, na razne kliničke znakove.. Životinje su dodatno promatrane 30., 33. i 36. dana poslije zaražavanja.

Tabela 1 niže, pokazuje da su adjuvanti IL-12 (približno 50 µg IL-12/doza) i kombinacija IL-12 sa saponinon relativno bolji imunomodulatori, u usporedbi sa ostalim adjuvantima koji su upotrebljeni u ovom ispitivanju, što pokazuje prosječna klinička slika, javljanje lokalnih apscesa limfnih čvorova, S. equi curenje i razbacivanjem apscesa. Konji u ove dve grupe pokazuju oko 35% do oko 40% smanjenje javljanja razbacivanjem apscesa i oko 23% do oko 40% smanjenje prosečne kliničke slike, u poređenju s grupom koja je primila cjepivo bez IL-12 ili kombinaciju IL-12 i saponina.

TABELA 1. REZULTATI ISPITIVANJA S. Equi

[image] 1 Postotak smanjenja rastresenih apscesa i prosječna klinička slika se mjere za svaku grupu, u uspoređuju sa Bayer-ovom grupom

2 ”DDA” označava dimetildioktadcilamonijum-bromid,a ”DRAE Dex” je dietilaminoetil-dekstran

Primjer 2

Efekt adjuvanta na imunogenicitet stočna cjepiva

Ispitivanje je obavljeno da se odredi efekt nekih adjuvanata na imunogenicitet modificiranog živog cjepiva BRSV (goveđi respiratorni sincitialni virus). Za pripremanje adjuvanta koriste se polazna otopina adjuvanta SP ulja (5 vol.%) i rekombinantni humani IL-12 (oko 1.260 µg/mL).

SP ulje se dobiva miješanjem 20 mL Pluronic® L121 (blok kopolimer polioksipropilen-polioksietilen, komercijalno dostupan iz BASF Corproration, Mount Olive, NJ), 40 mL skvalana, 3,2 mL polisorbata 80 i 936,8 mL puferovanog slane otopine, pa homogeniziranjem smjese dok se ne formira stabilna masa ili emulzija. Prije homogeniziranja sastojci ili smjesa se tretiraju u autoklavu. Emulzija se još sterilizira filtriranjem. Dodaju se formalin i timerosal do konačne koncentracije 0,2% i razrijeđenja 1:10.000 respektivno.

Smjesa adjuvanta, koja sadrži oko 5 vol.% SP ulja i oko 10 µg IL-12 po dozi, pravi se dodavanjem oko 0,278 mL IL-12 u oko 69,722 mL 5 vol.% SP ulja, tako da se dobije oko 70 mL oko 5 vol.% SP ulja i oko 10 µg/doza adjuvanta IL-12.

Za dobivanje cjepiva uzgaja se BRSV u MDBK stanicama (Madin-Darby stanice goveđeg bubrega; MDBK vrsta stanica se izdvaja iz bubrega normalnog odraslog vola), pa se sakupi 6 dana poslije inokulacije. Kolač cjepiva se izmješa, sa titrom BRSV od oko 105,7 TCID50 po dozi, sa MEM, pa se zatim liofilizira. Liofilizirani kolač cjepiva se zatim rehidratizuje sa gore opisanim IL-12, koji sadrži razrijeđivač adjuvanta, pa se dobije konačni preparat cjepiva.

Devetero teladi, starosti oko 6 mjeseci, se cijepi subkutano sa cjepivom BRSV, a sedmero teladi se ostavi u kontrolnoj grupi. Odgovor na antitijela seruma se mjeri detektiranjem specifičnog antitijela za BRSV. Efikasnost cjepiva je pokazana zaražavanjem cijepljenih i kontrolnih grla s virulentnim BRSV, 28 dana nakon cijepljenja.

Modificirana živa cjepiva BRSV, adjuvantirane sa SP uljem i IL-12, izazivaju vrlo visok titar antitijela (oko 1:366 28. dana poslije cijepljenja) kao odgovor na BRSV. Poslije zaražavanja s virulentnim BRSV, oštrina bolesti se umanjila kod cijepljene grupe, u usporedbi sa kontrolnom grupom (smanjenje od oko 53%). Ovo ukazuje da je adjuvant SP ulje + IL-12, korišten u ovom ispitivanju, kompatibilan s modificiranim cjepivom virusa BRSV i da se može značajno pojačati efikasnost modificiranog cjepiva virusa BRSV.

Tabela 2, niže, pokazuje odgovor antitijela na BRSV teladi cijepljenog s modificiranom živom BRSV i adjuvantom koji sadrži IL-12.

TABELA 2. ODGOVOR ANTITIJELA NA BRSV

[image]

Tabela 3 dolje, pokazuje smanjenje bolesti teladi cijepljenih s modficiranom živom BRSV i adjuvantom koji sadrži IL-12, poslije zaražavanja virulentnim BRSV.

TABELA 3. SMANJENJE BOLESTI

[image] (1) Smanjenje bolesti je postotak teladi koja ne pokazuju bolest poslije zaražavanja, u usporedbi sa kontrolnim.

Primjer 3

Efekt adjuvanta na efikasnost psećeg cjepiva

Ispitivanje je obavljeno da bi se odredio efekt adjuvanta na imunogenicitet monovalentnog cjepiva, umrtvljenog bakterina, Ehrlichia canis. Za dobivanje adjuvanta, koriste se polazne otopine rekombinantnog humanog IL-12 (4,45 mg/mL), EMA-31® (1 vol.%, linearni kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline s približno jednakim količinama etilena i anhidrida maleinske kiseline, prosječne molarne mase od oko 75.000 do 100.000, komercijalno dostupan iz firme Monsanto Co., St. Louis, MO) i Neocryl® A64 (3 vol.%, emulzija lateksa nekoalesciranog kopolimera akrilne kiseline u vodi i metakrilne kiseline pomiješane sa stirenom, koja ima pH 7,5, viskoznost 100 eps (Brookfield, 25°C), masu po litri od 1,02 kg, dobiva se tako što sadrži 40 mas% čvrste supstance, 38 vol% čvrste supstance i kiselinski broj 48, komercijalno dostupan iz firme Polyivinyl Chemicals, Inc. Wilmington, MA). Radna otopina IL-12 se dobiva u puferu za razrijeđivanje, koji se sastoji od puferovanog fosfatnog slanog otapala, bez magnezija i kalcija. Doda se 45 µL polaznoe otopine IL-12 u 9,955 µL pufera za razrijeđenje. Konačna koncentracija razrijeđene radne otopine IL-12 je 20 µg/mL.

Za dobivanje cjepiva, pomješa se 1×104 ili 1×105 TCID50 inaktiviranog Ebony soja E. canis, s 1 vol.% EMA-31® i 3 vol.% Neocryl®-a. Doda se 2% timerosal u cjepivo, u sadržaju 1:20.000, kao prezervativ. Razrijeđena otopina IL-12 u sadržaju od 500 µL po dozi, pomiješa se sa cjepivom pred injektiranje. Cjepivo za 4 grupe, kao što je pokazano u Tabeli 4, pomješa se sa 100 µg/doza bakterina Bovine Calmede Guern (BCG).

Nasumce se rasporedi 35 pasa u šest grupa, koje obuhvaćaju četiri grupe za cijepljenje i dvije kontrolne grupe. Cijepljeni se cijepe sa monovalentnim Ebony vrstom E. canis cjepiva, sa dva sadržaja antigena. Kao što pokazuje Tabela 4, niže, grupa 2 je cijepljena sa sadržajem antigena od približno 1×104 TCID50, a ostatak je cijepljen sa sadržajem antigena od približno 1×105 TCID50. Grupe 2, 3 i 5 su cijepljene sa cjepivom koja je pomješana s 10 µg IL-12 po dozi. Grupa 4 je cijepljena sa cjepivom koje sadrži BCG kao adjuvant. Dvije doze svake cjepiva se daju u 20. tjednu starosti i u 23. tjednu starosti, respektivno. Da se pokaže mogućnost ukrštene zaštite, grupe 5 i 6 su heterogeno zaražene s vrstom Broadford E. canis, a druge su zaražene homogeno s Ebony vrstom E. canis.

Tabela 4, niže, pokazuje da su dva od 5 pasa (40%) u grupi 3, i dva od 6 pasa (33%), u grupi 4 bez trombocitopenije, ako su cijepljeni psi homogeno zaraženi sa Eboni vrstom E. canis. Sto posto kontrolnih (grupa 1) i psi cijepljeni sa nižom dozom cjepiva (grupa 2) imaju jaku trombocitopeniju sve do završetka ispitivanja. U pogledu mortaliteta, pet od šest (83%) kontrolnih je umrlo ili eutanizirano tokom perioda promatranja. Psi cijepljeni s nižom dozom cjepiva s adjuvantom IL-12 (grupa 2) i psi cijepljeni s cjepivom s adjuvantom BCG (Grupa 4) imali su mortalitet od 33%. Na bazi mortaliteta i podataka o umiranju, cjepivo E.canis s adjuvantom IL-12 ima značajno povećan zaštitni imunitet u odnosu na zaražavanje homogenim E. canis.

Kada se usporedi s kontrolama, dodatak IL-12 u kombinaciji sa EMA-31® i Neocryl®, jako povećava efikasnost monovalentnog cjepiva E. canis, a značajno snižava mortalitet. Zaštita inducirana s kombinacijom IL-12, kao što je pokazano u grupama 2 i 3, zavisi od doze antigena. Uz to, u usporedbi sa BCG, odgovori adjuvanta, indukovanog sa kombinacijom IL-12, igraju kritičnu ulogu u smanjenju cijepljenih pasa od letalnog zaražavanja s E. canis.

Tabela 4, niže, pokazuje rezultate prethodnog isitivanja imunogeneciteta monovalentne cjepiva E.canis sa adjuvantom koji sadrži rekombinantni humani IL-12.

TABELA 4. ISPITIVANJE PRIJE-IMUNOGENICITETA

[image] 1 Odnos predstavlja broj pasa s trombocitopenijom prema ukupnom broju testiranih pasa

2 Odnos predstavlja broj pasa koji su imali povišenu rektalnu temperaturu prema ukupnom broju pasa u grupi.

Primjer 4

Vrednovanje humoralnog imuno odgovora za pseće cjepivo

Ispitivanje je obavljeno da se odredi efekat adjuvanta na imunogenicitet modificiranih živih i umrtvljenih virusa i umrtvljenog bakterina cjepiva Canine Duramune® 10 (sačinjene od liofilizovanog, živog, prigušenog psećeg parvovirusa (CPV), virusa pseće parainfluence (CPI), psećeg adonovirusa tip II (CAV-2), psećeg adenovirusa (CDV) i razrijeđivača koji sadrži pseći koronavirus (CCV), Leptospira icterohemorrhagiae (LI), Leptospira canicola (LC), Leptospira grippotyphosa (LG) i Leptospira pomona (LP), umrtvljenog virusa i bakterijskih frakcija, koja je komercijalno dostupna iz firme Fort Dodge Animal Health, Inc., veterinarski ogranak Wyeth, Madison, NJ). Za pripravu adjuvanta koriste se polazna otopina rekombinantnog humanog IL-12 (4,45 mg/mL), Duramune® 10 imunogenicitetno cjepivo , EMA-31®, Neocryl® A640 i timerosal (2 vol.%).

Za dobivanje testiranog cjepiva, početno pripremanje adjuvanta se obavlja mješanjem Neocryl®-a i EMA-31® do konačnih koncentracija oko 3% i oko 1%, respektivno. Doda se timerosal u koncentraciji oko 1:20.000, kao prezervativ.

Za pripravu razrijeđivača s adjuvantom IL-12, prvo se miješa razrijeđeni dio cjepiva Duramune® 10 s gornjim početnim adjuvantom u odnosu 1:10, jedan dio razrijeđivača Duramune® 10 i 9 dijelova početnog adjuvanta, koji sadrži Neocryl® i EMA-31®. Zatim se doda rekombinantni humani IL-12, tako da konačna koncentracija bude 10 µg ili 40 µg po dozi.

Prije upotrebe, jedan do liofiliziranog dijela cjepiva Duramune® 10 se rehidrira u 9 dijelova razrijeđivača sa adjuvantom IL-12. Prema tome, frakcije cjepiva Duramune® 10 koje se koriste u ovom ispitivanju su oko 10-struko manje od konvencionalne imunogenicitetnog cjepiva. Drugim riječima, cjepivo koje se testira u ovom ispitivanju sadrži nedovoljnu količinu antigena (subpotencijalna), u usporedbi s regularnim cjepivima, koja su kreirana za komercijalnu upotrebu.

Ukupno 15 pasa se nasumice podijeli u tri grupe od po 5 pasa, pa se cijepe subkutano dva puta, u starosti od 10 tjedana i 13 tjedana. Prva grupa je cijepljena sa cjepivom koje sadrži oko 10 µg IL-12. Druga grupa je cijepljena sa cjepivom koje sadrži oko 40 µg IL-12. Treća grupa je placebo, cijepljena sa 1:10 razrijeđenom Duramune® 10, bez IL-12.

Psima je uzeta krv za serum 0. dana poslije provog cijepljenja (0 DPV1) i 0. dana poslije drugog cijepljenja (0 DPV2), pa 7, 14, 21 i 28 DPV2. Titri antitijela Leptospiras su određivani testom mikroaglutinacije (MAT).

Rezultati su dani u Tabelama 5-8. Značajna razlika između glavnih grupa i placebo grupe opažena je u frakcijama LP i LG. Za frakcije LP, navedene u Tabeli 5, značajna razlika je opažena 0. DPV2 (grupa cijepljena sa oko 10 µg IL-12) i 21. DPV2 (ista grupa). Za frakciju LG, navedenu u Tabeli 6, značajna razlika je opažena 0. DPV2 (grupa cijepljena sa oko 40 µg IL-12), 7, 14 i 21 DPV2 (obje grupe, sa 10 i 40 µg). Nije opažena značajna razlika u druge dvije frakcije (Tabele 7 i 8). Prema tome, dodatak IL-12 u smjesu EMA-31® i Neocryl®-a pokazano je da pojačava humoralne imuno odgovore na dvije Leptospira-e, LP i LG.

TABELA 5. REZULTATI TESTA MAT NA L. Pomona

[image] 1 Brojka je signifikantna, kada se usporedi sa placebo grupom

TABELA 6. REZULTATI TESTA MAT NA L. Grippo

[image] 1 Titar jednog psa bio je 1024 na 0. DPV1, pa je isključen iz analize.

2 Brojka je signifikantna, kada se usporedi s placebo grupom.

TABELA 7. REZULTATI TESTA MAT NA L. Ictero

[image]

TABELA 8. REZULTATI TESTA MAT NA L. Canicola

[image] 1 Titar jednog psa bio je 1024 na 0. DPV1, pa je isključen iz analize.

2 Brojka je signifikantna, kada se usporedi s placebo grupom.

Primjer 5

Efekt adjuvanta na imunogenicitet mačjeg cjepiva

Da bi se odredilo da li rekombinantni humani IL-12 može pojačati imunogenicitet cjepiva FIV-FeLV, IL-12 se pomiješa sa inaktiviranim virusom mačjeg imunodeficiteta (FIV) i mačjim virusom leukemije (FeLV), dodaju se cjepivu 5 µg po dozi EMA-31®, Neocryl®-a A640 i MVP® (emulzija ulje u vodi lakog mineralnog ulja, komercijalno dostupnog iz firme Modern Veterinary Products, Omaha, NE). Put zaražavanja je ordiniranjem ovog cjepiva intraperitonealno. Jedna grupa od 20 mačaka, starih 8 tjedana, cijepi se dva puta sa cjepivom FIV-FelV, druga grupa od 20 mačaka iste starosti cijepi se istim cjepivom, uz dodatak IL-12. Tri tjedna nakon obavljenog cijepljenja, sve cijepljene mačke se zaraze sa virulentnim FeLV, zajedno sa 9 kontrolnih mačaka iste starosti. Zaražene mačke se promatraju jednom tjedno u pogledu viremije, tokom 15 tjedana. Da bi se pratile zaražene mačke u pogledu viremije FeLV, uzorci seruma su testirani jednom tjedno na prisustvo antigena p27 FeLV, koristeći komplet IDEXX za antigen FeLV. Mačka se smatra trajno inficiranom s FeLV ukoliko se FeLV p27 detektira u tri uzastopna uzorka, u periodu od 3 do 12 tjedana poslije izlaganja zarazi. Svih devet kontrola je nađeno da su trajno inficirane s FeLV. Kod cijepljenih sa cjepivom FIV-FeLV nađeno je da je 5 od 20 bilo trajno inficirano sa FeLV, dok je samo jedna od 20 cijepljenih, koje su primile cjepivo FIV-FeLV sa dodatkom IL-12, postala trajno inficirana sa FeLV. Ovaj rezultat pokazuje da se IL-12 u kombinacija sa EMA-31®, Neocryl® i MVP® može koristiti za jačanje imunogeniciteta cjepiva FeLV.

U prethodnom tekstu dan je detaljan opis određenih realizacija ovog izuma u svrhu ilustriranja, a ne ograničavanja. Podrazumijeva se da su sve druge modifikacije, grananja i ekvivalenti na osnovi ovog opisa, koji su očigledni onima koji su verzirani u stanje tehnike, uključeni u obim ovog izuma i zahtjeve.

Claims (51)

1. Preparat za jačanje imunogeniciteta veterinarskog cjepiva, naznačen time, što sadrži farmakološki efikasnu količinu imunomodulatora i imunoadjuvanta.

2. Preparat za jačanje imunogeniciteta prema Zahtjevu 1, naznačen time, što se spomenuti imunomodulator bira iz grupe koju čine citokin, neki od interferona, faktor nekroze tumora, faktor transformiranja rasta, faktor stimulacije kolonija i njihova kombinacija.

3. Preparat za jačanje imunogeniciteta prema Zahtjevu 2, naznačen time, što imunomodulator prjedstavlja citokin.

4. Preparat za jačanje imunogeniciteta prjema Zahtjevu 3, naznačen time, što imunomodulator predstavlja interleukin-12.

5. Preparat za jačanje imunogeniciteta prema Zahtjevu 4, naznačen time, što imunomodulator predstavlja homologni životinjski, rekombinantni humani, ili rekombinantni glodarski interleukin-12.

6. Preparat za jačanje imunogeniciteta prema Zahtjevu 5, naznačen time, što se imunoadjuvant bira iz grupe koju čine saponin, ulje koje se može metabolizirati, blok kopolimer, etilen/maleinski kopolimer, kopolimer akrilne kiseline, emulzija kopolimera akrilne kiseline, emulzija mineralnog ulja i njihove smjese.

7. Preparat za jačanje imunogeniciteta prema Zahtjevu 6, naznačen time, što imunoadjuvant predstavlja saponin.

8. Preparat za jačanje imunogeniciteta prema Zahtjevu 6, naznačen time, što ulje koje se može metabolizirati predstavljaju skvalen ili skvalan.

9. Preparat za jačanje imunogeniciteta prema Zahtjevu 8, naznačen time, što ulje koje se može metabolizirati predstavlja skvalan.

10. Preparat za jačanje imunogeniciteta prema Zahtjevu 6, naznačen time, što blok kopolimer predstavlja blok kopolimer polioksipropilen/polioksietilen.

11. Preparat za jačanje imunogeniciteta prema Zahtjevu 6, naznačen time, što je etilen/maleinski kopolimer linearni kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline koji ima približno jednake količine etilena i anhidrida maleinske kiseline i procjenjenu molarnu masu oko 75.000 do 100.000.

12. Preparat za jačanje imunogeniciteta prema Zahtjevu 6, naznačen time, što je kopolimer akrilne kiseline smjesa stirena i nekoalescirane akrilne kiseline u vodi kopolimera akrilne kiseline i metakrilne kiseline.

13. Preparat za jačanje imunogeniciteta prema Zahtjevu 12, naznačen time, što se spomenuta smjesa emulgira.

14. Preparat za jačanje imunogeniciteta prema Zahtjevu 6, naznačen time, što emulziju mineralnog ulja predstavlja emulzija ulje-u-vodi lakog mineralnog ulja.

15. Preparat za jačanje imunogeniciteta prema Zahtjevu 6, naznačen time, što je imunoadjuvant smjesa kopolimera polioksipropilen/polioksietilen-a i skvalana.

16. Preparat za jačanje imunogeniciteta prema Zahtjevu 6, naznačen time, što je imunoadjuvant smjesa linearnog kopolimera etilen/anhidrid maleinske kiseline, koji ima približno jednake količine etilena i anhidrida maleinske kiseline i procijenjenu molarnu masu od oko 75.000 do oko 100.000, i emulzije kopolimera akrilne kiseline koja se sastoji od emulgirane smjese stirena i nekoalescirane akrilne kiseline u vodi kopolimera akrilna kiselina metakrilna kiselina.

17. Preparat za jačanje imunogeniciteta prema Zahtjevu 6, naznačen time, što je imunoadjuvant smjesa linearnog kopolimera etilen/anhidrid maleinske kiseline, koji ima približno jednake količine etilena i anhidrida maleinske kiseline i procenjenu molarnu masu od oko 75.000 do oko 100.000, emulzije kopolimera akrilne kiseline koja se sastoji od emulzirane smjese stirena i nekoalescirane akrilne kiseline u vodi kopolimera akrilna kiselina metakrilna kiselina, i emulzije mineralnog ulja.

18. Poboljšan preparat veterinarskog cjepiva, naznačen time, što sadrži imuno efikasnu količinu antigena, imunomodulator, imunoadjuvant i farmaceutski prihvatljiv nosač.

19. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 18, naznačen time, što se imunomodulator bira iz grupe koju čine citokin, neki od interferona, faktor nekroze tumora, faktor transformiranja rasta, faktor stimulacije kolonija i njihova kombinacija.

20. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 19, naznačen time, što imunomodulator predstavlja citokin.

21. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 20, naznačen time, što imunomodulator predstavlja interleukin-12.

22. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 21, naznačen time, što imunomodulator predstavlja homologni životinjski, rekombinantni humani, ili rekombinantni glodarski interleukin-12.

23. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 22, naznačen time, što se imunoadjuvant bira iz grupe koju čine saponin, ulje koje se može metabolirati, blok kopolimer, etilen/maleinski kopolimer, kopolimer akrilne kiseline, emulzija kopolimera akrilne kiseline, emulzija mineralnog ulja i njihove smjese.

24. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 23, naznačen time, što imunoadjuvant predstavlja saponin.

25. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 23, naznačen time, što ulje koje se može metabolizirati predstavljaju skvalen ili skvalan.

26. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 25, naznačen time, što ulje koje se može metabolizirati predstavlja skvalan.

27. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 23, naznačen time, što blok kopolimer predstavlja blok kopolimer polioksipropilen/polioksietilen.

28. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 23, naznačen time, što je etilen/maleinski kopolimer linearni kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline koji ima približno jednake količine etilena i anhidrida maleinske kiseline i procijenjenu molarnu masu oko 75.000 do 100.000.

29. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 23, naznačen time, što je kopolimer akrilne kiseline smjesa stirena i nekoalescirane akrilne kiseline u vodi kopolimera akrilne kiseline i metakrilne kiseline.

30. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 29, naznačen time, što se spomenuta smjesa emulgira.

31. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 23, naznačen time, što emulziju mineralnog ulja predstavlja emulzija ulje-u-vodi lakog mineralnog ulja.

32. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 27, naznačen time, što je imunoadjuvant smjesa blok kopolimera polioksipropilen/polioksietilen i ulja koje se može metabolizirati.

33. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 32, naznačen time, što ulje koje se može metabolizirati predstavlja skvalan.

34. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 23, naznačen time, što je imunoadjuvant smjesa kopolimera etilen/anhidrid maleinske kiseline i emulzije kopolimera akrilne kiseline.

35. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 34, naznačen time, što imunoadjuvant sadrži još i emuziju mineralnog ulja.

36. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 23, naznačen time, što se antigen bira iz grupe koju čine goveđi respiratorni sincitialni virus, virus herpes simpleks tip 1, goveđi virus dijareje, virus parainfluence-3, pseći parvovirus, pseći virus influence, pseći adenovirus tip II, pseći adenovirus, pseći koronavirus, virus bjesnoće, mačji virus imunodeficijencije, mačji virus leukemije, mačji koronavirus, virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRS), virus kokošjeg herpesa, Chlamydia, Ehrlichia, Pasteurella, Haemophilus, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Mycoplasma, Borrelia, Leptospira, Coccidia, Hemosporidia, Amoebida, Trypanosoma, Leishmania, Giardia, Histomonas, Coccidioides, Histoplasma, Blastomyces, Aspergillus, Cryptococcus i njihova kombinacija.

37. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 36, naznačen time, što antigen predstavlja Streptococcus equi, a imunoadjuvant je saponin.

38. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 36, naznačen time, što antigen predstavlja goveđi respiratorni sincitijalni virus, a imunoadjuvant je smjesa blok kopolimera i ulja koje se može metabolizirati.

39. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 36, naznačen time, što antigen predstavlja Ehrlichia canis, a imunoadjuvant je smjesa etilen/maleinskog kopolimera i emulzije kopolimera akrilne kiseline.

40. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 36, naznačen time, što antigen predstavlja kombinacija psećeg parvovirusa, psećeg virusa parainfluence, psećeg adenovirusa tip II, psećeg adenovirusa, psećeg koronavirusa, Leptospira icterohemorrhagiae, Leptospira canicola, Leptospira gippotyphosa i Leptospira pomona, a aimunoadjuvant je smjesa etilen/maleinskog kopolimera i emulzije kopolimera akrilne kiseline.

41. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 36, naznačen time, što antigen predstavlja kombinacija mačjeg virusa imunodefocitarnosti i mačjeg virusa leukemije, a imunoadjuvant je smjesa etilen/maleinskog kopolimera, emulzije kopolimera akrilne kiseline i emulzije mineralnog ulja.

42. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 18, naznačen time, što sadrži još i prezervativ.

43. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 18, naznačen time, što sadrži još i sekundarni adjuvant.

44. Preparat cjepiva prema Zahtjevu 43, naznačen time, što se sekundarni adjuvant bira iz grupe koju čine stabilizator, emulgator, aluminij-hidroksid, aluminij-fosfat, podešavač pH, surfaktant, lipozom, adjuvant iscom, sintetski glikopeptid, punilo, karboksipolimetilen, zid bakterijske stanice, derivat zida bakterijske stanice, cijepljenje protein virusa malih boginja, adjuvant subvirusne čestice, toksin kolere, N,N-dioktadecil-N’,N’-bis(2-hidroksietil)propandiamin, monofosforil lipid A, dimetildioktadecilamonijum-bromid i njihova smjesa.

45. Postupak za jačanje, ubrzavanje ili produžavanje imunogeniciteta slabog, imunosupresivnog ili marginalno sigurnog antigena, naznačen time, što se ptičjoj ili sisavcima, ordinira farmakološki efikasna količina preparata za jačanje imunogeniciteta prema Zahtjevu 1, prije, paralelno, sekvencijalno, ili poslije ordiniranja slabog, imunosupresivnog ili marginalno sigurnog antigena.

46. Postupak za jačanje, ubrzavanje ili produžavanje imunogeniciteta slabog, imunosupresivnog ili marginalno sigurnog antigena, naznačen time, što se pticama ili sisavcima ordinira efikasna količina preparata cjepiva za imunizaciju prema Zahtjevu 18.

47. Postupak prema Zahtjevu 45 ili Zahtjevu 46, naznačen time, što se jačanje imunogeniciteta ili preparat cjepiva ordinira subkutano, intramuskularno, intradermalno, intraperiotonealno, intranazalno, intrabukalno, transdermalno ili oralno.

48. Postupak prema Zahtjevu 45 ili Zahtjevu 46, naznačen time, što se ordinira jačanje imunogeniciteta ili preparat cjepiva koji sadrži imunomodulator koji se bira iz grupe koju čine citokin, interferon, faktor nekroze tumora, faktor transformisanog rasta, faktor stimulacije kolonija i njihova kombinacija.

49. Postupak prema Zahtjevu 48, naznačen time, što se ordinira jačanje imunogeniciteta ili preparat cjepiva koji sadrži citokin, koga čini homologni životinjski, rekombinantni humani ili rekombinantni glodarski interleukin-12.

50. Postupak prema Zahtjevu 49, naznačen time, što se ordinira jačanje imunogeniciteta ili preparat cjepiva koji sadrži imunoadjuvant koji se bira iz grupe koju čine saponin, ulje koje se može metabolizirati, blok kopolimer, etilen/maleinski kopolimer, kopolimer akrilne kiseline, emulzija kopolimera akrilne kiseline, emulzija mineralnog ulja i njihova smjesa.

51. Postupak prema Zahtjevu 50, naznačen time, što se ordinira cjepivo koje sadrži antigen koji se bira iz grupe koju čine goveđi respiratorni sincitialni virus, virus herpes simpleks tip 1, goveđi virus dijareje, virus parainfluence-3, pseći parvovirus, pseći virus influence, pseći adenovirus tip II, pseći adenovirus, pseći koronavirus, virus bjesnoće, mačji virus imunodeficijencije, mačji virus leukemije, mačji koronavirus, virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRS), virus kokošjeg herpesa, Chlamydia, Ehrlichia, Pasteurella, Haemophilus, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Mycoplasma, Borrelia, Leptospira, Coccidia, Hemosporidia, Amoebida, Trypanosoma, Leishmania, Giardia, Histomonas, Coccidioides, Histoplasma, Blastomyces, Aspergillus, Cryptococcus i njihova kombinacija.