HK40104269A

HK40104269A - 微生物组用於评估和治疗肥胖症和2型糖尿病的用途

Info

Publication number: HK40104269A
Application number: HK62024092017.8A
Authority: HK
Inventors: 黄秀娟; 陈家亮; 徐之璐
Original assignee: 香港中文大学
Priority date: 2021-04-01
Filing date: 2022-03-31
Publication date: 2024-07-19

Description

微生物组用于评估和治疗肥胖症和2型糖尿病的用途

相关申请

本申请要求2021年4月1日提交的美国临时专利申请第63/169,481号的优先权，所述美国临时专利申请的内容出于所有目的在此通过引用以其整体并入。

发明背景

随着全球的生活水平在不断提高，超重甚或至肥胖的个体的数量也在迅速增加。由于体重过重与严重健康风险直接相关，这种一般人群中超重人群比例不断增加的趋势导致许多疾病(包括糖尿病、心脏病、高血压和中风)的发病率显著提高。例如，世界卫生组织(WHO)估计，到2030年，患有糖尿病的人数将在全世界超过3.5亿。由于肥胖症相关疾病的发病率上升，其严重的健康影响以及其深刻的经济后果，因此迫切需要新的且有效的手段来确定个体发展肥胖症和2型糖尿病(T2D)的风险，从而让被认为肥胖症和T2D风险增加的个体进行预防和早期治疗以至最终降低或消除他们以后罹患与糖尿病、高血压、心血管疾病等相关的严重病况的风险。本发明通过提供新的方法和组合物来实现这种和其它相关的需求，所述方法和组合物可以有效地评估患者患肥胖症或T2D的风险。

发明概述

本发明涉及新方法和组合物，其用于评估对象的肥胖症和T2D的风险以及用于评估人的肥胖症和T2D的性质-患病状态是否是肠微生物组依赖性的。特别地，本申请的发明人已经发现某些微生物物种，特别是某些细菌，根据个体是否处于发生肥胖症和T2D的增加的风险中，以明显不同的水平存在于个体的胃肠道(GI)中。因此，在第一方面，本发明提供了用于降低对象的肥胖症和2型糖尿病(T2D)的风险或治疗对象的肥胖症和T2D的方法。所述方法包括将有效量的一种或多种细菌物种引入所述对象的胃肠道的步骤，所述细菌物种选自普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzi)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、霍氏真杆菌(Eubacterium halli)、两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)、肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)、毛螺菌科细菌_5_1_63FAA(Lachnospiraceae bacterium_5_1_63FAA)、凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)和人罗斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)。在一些实施方案中，所述细菌物种不包括双歧杆菌物种中的任一种。在一些实施方案中，所述细菌物种包括不超过一种的双歧杆菌物种。在一些实施方案中，所述引入步骤包括向所述对象口服施用包含有效量的所述一种或多种细菌物种的组合物。在一些实施方案中，所述引入步骤包括将包含有效量的所述一种或多种细菌物种的组合物递送至所述对象的小肠、回肠或大肠。在一些实施方案中，所述引入步骤包括粪便微生物群移植(FMT)，例如通过向所述对象施用包含经加工的供体粪便材料的组合物。在一些实施方案中，经加工的供体粪便材料是包含取自至少两个，可能更多的瘦的供体，例如BMI<23kg/m²的那些瘦的供体的粪便材料的混合物。在一些实施方案中，所述方法中使用的组合物不包含可检测量的表2或4中示出的任何物种，例如，通过常规检测方法如通过核酸杂交或通过聚合酶链式反应(PCR)不可检测到这些特定细菌物种。在一些实施方案中，口服施用所述组合物。在一些实施方案中，所述组合物直接沉积到所述对象的胃肠道。在一些实施方案中，在所述引入步骤之前从所述对象获得的第一粪便样品和在所述引入步骤之后从所述对象获得的第二粪便样品中确定所述一种或多种细菌物种的水平或相对丰度，例如通过聚合酶链式反应(PCR)，优选定量聚合酶链式反应(qPCR)。

在第二方面，本发明提供了通过分析某些肠道细菌物种的分布来评估个体中肥胖症和T2D的风险的新方法。所述方法包括以下这些步骤：(1)确定来自所述对象的粪便样品中的表1-5所示的一种或多种细菌物种的水平或相对丰度；(2)确定来自参考群组的粪便样品中相同细菌物种的水平或相对丰度，所述参考群组包括患有肥胖症和T2D的对象以及不患有肥胖症和T2D的对象；(3)使用从步骤(2)获得的数据通过随机森林模型生成决策树，并沿着所述决策树运行来自步骤(1)的一种或多种细菌物种的水平或者相对丰度以生成评分；以及(4)将评分大于0.5的对象确定为具有增加的肥胖症和T2D的风险，并且将评分不大于0.5的对象确定为没有增加的肥胖症和T2D的风险。

在一些实施方案中，所述一种或多种细菌物种包括表1-5中所示的任何一种、任何两种或三种细菌物种。例如，细菌物种包括(i)巴勒特梭菌(Clostridium bartlettii)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(ii)巴勒特梭菌或(iii)副流感嗜血杆菌或(iv)大肠杆菌或(v)毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(vi)凸腹真杆菌或(vii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(viii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、凸腹真杆菌或(ix)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(x)巴勒特梭菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xi)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xii)巴勒特梭菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xiii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(xiv)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(xv)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌或(xvi)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌。在一些实施方案中，对象未被诊断患有肥胖症。在一些实施方案中，对象未被诊断患有T2D。在一些实施方案中，步骤(1)和(2)中的每一个都包括宏基因组测序或聚合酶链式反应(PCR)，如定量PCR。

在第三方面，本发明提供了用于评估对象是否患有微生物组依赖性肥胖症和T2D的方法。所述方法包括以下这些步骤：(1)确定来自所述对象的粪便样品中的表1-5所示的一种或多种细菌物种的水平或相对丰度；(2)确定来自参考群组的粪便样品中相同细菌物种的水平或相对丰度，所述参考群组包括患有肥胖症和T2D的对象以及不患有肥胖症和T2D的对象；(3)使用从步骤(2)获得的数据通过随机森林模型生成决策树，并沿着所述决策树运行来自步骤(1)的一种或多种细菌物种的水平或者相对丰度以生成评分；以及(4)将评分大于0.5的对象确定为患有微生物组依赖性肥胖症和T2D，并且将评分不大于0.5的对象确定为患有微生物组非依赖性肥胖症和T2D。

在一些实施方案中，所述一种或多种细菌物种包括表5中所示的任何一种、任何两种或三种细菌物种。例如，细菌物种包括(i)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(ii)巴勒特梭菌或(iii)副流感嗜血杆菌或(iv)大肠杆菌或(v)毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(vi)凸腹真杆菌或(vii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(viii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、凸腹真杆菌或(ix)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(x)巴勒特梭菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xi)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xii)巴勒特梭菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xiii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(xiv)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(xv)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌或(xvi)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌。在一些实施方案中，对象已经被诊断患有肥胖症。在一些实施方案中，对象已经被诊断患有T2D。在一些实施方案中，步骤(1)和(2)中的每一个都包括宏基因组测序或聚合酶链式反应(PCR)，如定量PCR。

在第四方面，本发明提供了用于评估对象的肥胖症和2型糖尿病(T2D)的风险或用于评估对象是否患有微生物组依赖性肥胖症和T2D的试剂盒。所述试剂盒包含用于检测表1-5中所示的一种或多种细菌物种的试剂。例如，所述细菌物种包括(i)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(ii)巴勒特梭菌或(iii)副流感嗜血杆菌或(iv)大肠杆菌或(v)毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(vi)凸腹真杆菌或(vii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(viii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、凸腹真杆菌或(ix)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(x)巴勒特梭菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xi)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xii)巴勒特梭菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xiii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(xiv)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(xv)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌或(xvi)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌。在一些实施方案中，所述试剂盒包含两个或更多个容器，每个容器含有组合物，所述组合物包含用于检测细菌物种的用于聚合酶链式反应(PCR)，如定量PCR的试剂，如引物和/或探针，其通常含有与来自细菌物种的多核苷酸序列同源或互补的核苷酸序列。

附图简述

图1：患有肥胖症和T2D(ObT2)的对象与瘦的对照之间的差异细菌物种。绿色柱条代表在瘦的对照中富含的物种，而红色柱条代表ObT2中富含的物种。

图2(A)：机器学习模型的接收者操作特性(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)。使用以下的随机森林模型的AUC：所有5种标志物(红色)-巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌。

图2(B)：机器学习模型的接收者操作特性(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)。使用以下单独标志物的随机森林模型的AUC：巴勒特梭菌(5-红色)、副流感嗜血杆菌(4-浅蓝色)、大肠杆菌(3-绿色)、毛螺菌科细菌5_1_63FAA(2-深蓝色)、凸腹真杆菌(1-橙色)。

图3：描绘了ObT2和瘦的对照中机器学习模型的标志物的相对丰度的箱形图。

图4(A)：与ObT2和瘦的对照相比的新的ObT2对象(新的对象)的风险评分。图4(B)：与ObT2和瘦的对照相比的新的瘦的对象(新的对象)的风险评分。

图5：不同FMT方案对肥胖对象体重减轻的影响。图5(A)研究示意图。在nFMT研究中，接受者接受4次每月一次的混合供体FMT。在基线、自第一次FMT输注后一个月、自最后一次FMT后一个月和自最后一次FMT后两至三个月收集接受者的粪便样品。在iFMT研究中，对象接受3天的抗生素制剂，随后每周接受连续5天的单一供体FMT(间隔2天)，持续4周。在两项研究中，对患者的临床参数进行随访直至第52周。图5(B)：FMT后的体重变化。通过重复测量ANOVA计算研究之间的显著性。

图6：密集FMT导致来源自瘦的供体的物种的数量增加并且类似于供体微生物组分布。图6(A)：患有肥胖症的对象中来源自供体的物种的比例。图6(B)：患有肥胖症的对象中来源自供体的物种的丰度。图6(C)：FMT后样品和相应基线样品中微生物群之间的布雷柯蒂斯距离(Bray Curtis distance)。图6(D)：接受者样品与相应供体中微生物群之间的布雷柯蒂斯距离。

图7：与单一供体密集FMT相比，混合供体FMT在诱导产丁酸细菌的增加方面更有效。图7(A)：描绘了产丁酸细菌的丰度的热图。图7(B)：描述了两个研究中产丁酸细菌的Chao1丰富度和香农多样性指数。图7(C)：描绘了两个研究中产丁酸细菌的聚集丰度。图7(D)：描绘了nFMT后产丁酸细菌的关联的网络图。图7(E)：描绘了两种FMT方案中的Chao1丰富度和香农多样性指数。通过Wilcoxon秩和检验计算研究之间的显著性。通过Wilcoxon符号秩检验计算同一研究内的显著性。

图8：FMT接受者中产丁酸细菌菌株的植入或替换。图8(A)：基于SNP单体型分布的不同菌株簇。图8(B)：在每个时间点FMT接受者中的菌株替换。菌株簇被定义在0.8的树高(80％相异)。

图9：nFMT后显著变化的细菌物种的LDA效应大小(LDA>2,p<0.05)。

图10：描述了供体以及FMT和iFMT后的接受者中产丁酸细菌的相对丰度的线图。丰度显示为对数转化之后的相对丰度(％)。

图11：在最后一次FMT输注之后1个月产丁酸细菌的丰度变化的相关性。

图12：在基线和最后一次FMT输注之后2～3个月存在的物种。

定义

如本文所用，术语“微生物组依赖性”描述生理状态(例如，人的体重)或医学病况(例如，肥胖症或2型糖尿病)的存在和/或状态与在预定环境(例如，人的胃肠道)中发现的微生物分布(在存在以及绝对或相对数量方面)之间的相关性。以相同的方式，术语“细菌组依赖性(bacteriome-dependent)”描述了人的生理/病理状况与存在于人(如人的胃肠道)中的细菌物种的分布之间的相关性。

“相对丰度百分比”，当在描述与同一环境中存在的所有细菌物种相关的特定细菌物种(例如，表1-5中任一个所示的那些中的任一种)存在的上下文中使用时，是指以百分比形式表示的所有细菌物种的量中的该细菌物种的相对量。例如，一种特定细菌物种的相对丰度百分比可以通过将一个给定样品中该物种特异的DNA的数量(例如通过定量聚合酶链式反应确定)与同一样品中的所有细菌DNA的数量(例如，通过定量聚合酶链式反应PCR和基于16s rRNA序列的测序确定)进行比较来确定。

“绝对丰度”，当在描述粪便中特定细菌物种(例如，表1-5中中所示的那些中的任一种)存在的上下文中使用时，是指粪便样品中所有DNA的量中来自细菌物种的DNA的量。例如，一种细菌的绝对丰度可以通过将一个给定样品中该细菌物种特异的DNA的数量(例如，通过定量PCR确定)与同一样品中所有粪便DNA的数量进行比较来确定。

如本文所用，粪便样品的“总细菌负荷”是指粪便样品中所有DNA的量中各自所有细菌DNA的量。例如，可以通过将一个给定样品中细菌特异性DNA(例如，通过定量PCR确定的16srRNA)的数量与同一样品中所有粪便DNA的数量进行比较来确定细菌的绝对丰度。

术语“超重”用于描述体重过重且体重指数(BMI)大于25(或在亚洲人群中23至24.9之间)的对象。该术语内涵盖“肥胖”或“肥胖症”，其描述其中患者具有大于30(或在亚洲人群中大于25)的BMI的病况。

本申请中使用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”描述了导致消除、减少、减轻、逆转、预防和/或延迟预定医学病况的任何症状的发作或复发的行为。换句话说，“治疗”病况涵盖针对该病况的治疗性和预防性干预，包括促进患者从病况中恢复。

术语“粪便微生物群移植(FMT)”或“粪便移植”是指这样的一种医疗程序，在该过程期间从健康个体获得的含有活的粪便微生物(细菌、真菌、病毒等)的粪便物质被转移到接受者的胃肠道中以恢复已被多种医学病况中的任一种，例如体重超重或肥胖症及其相关病症破坏或摧毁的健康肠道微生物区系。通常，来自健康供体的粪便物质首先被加工成适合用于移植的形式，所述移植可以通过直接递送到下胃肠道中，如通过结肠镜检查、或通过鼻插管，或通过口服摄入含有经加工的(例如，干燥的和冷冻的或冻干的)粪便物质的封装材料来实现。

如本文所用，术语“有效量”是指使用或施用物质(例如，抗菌剂)而产生期望效果(例如，对一种或多种不期望的细菌物种的生长或增殖的抑制或阻抑作用)的该物质的量。效果包括预防、抑制或延迟细菌增殖期间任何相关的生物过程至任何可检测出的程度。确切的量将取决于物质(活性剂)的性质、使用/施用的方式以及应用的目的，并且将由本领域技术人员使用已知的技术以及本文描述的那些技术来确定。在另一种环境下，当将“有效量”的一种或多种有益或期望的细菌物种人工引入旨在引入患者的胃肠道，例如待在FMT中使用的组合物时，这意味着所引入的相关细菌的量足以赋予接受者健康益处，如减少的恢复时间或对相关病症(如体重过重或肥胖症)的治疗干预的需要减少，包括但不限于药物(如食欲抑制剂)和多种治疗中的任一种，如行为和沟通治疗、教育治疗、家庭治疗、言语或物理治疗等。

如本文所用的术语“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指对目标生物过程如目标基因的RNA/蛋白表达、目标蛋白的生物活性、细胞信号转导、细胞增殖等的任何可检测的负向作用。通常，抑制反映为当与对照相比时，目标过程(例如，某些种类的微生物，例如，表1中所示的一种或多种细菌的生长或增殖)，或者以上提及的下游参数中的任一个的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的减少。“抑制”还包括100％的减少，即目标生物过程或信号的完全的消除、预防或废除。其它相关术语，如“阻抑(suppressing)”、“阻抑(suppression)”、“减少(reducing)”、“减少(reduction)”、“降低(decrease)”、“降低(decreasing)”、“较低(lower)”和“较少(less)”在本公开中以类似的方式用于指不同水平的减少(例如，与对照水平(即抑制之前的水平)相比，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的减少)，直至完全清除目标生物过程或信号。另一方面，术语，如“激活(activate)”、“激活(activating)”、“激活(activation)”、“增加(increase)”、“增加(increasing)”、“促进(promote)”、“促进(promoting)”、“提高(enhance)”、“提高(enhancing)”、“提高(enhancement)”、“较高”和“更多”在本公开内容中用于涵盖目标过程或信号的不同水平的正向变化(例如，与对照水平(活化之前)，例如表1中所示的一种或多种细菌物种的对照水平相比，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更大，如3倍、5倍、8倍、10倍、20倍的增加)。相比之下，术语“基本上相同”或“基本上没有变化”表示从比较基础(如标准对照值)的量几乎没有变化，通常在比较基础的±10％内，或者在比较基础的±5％、4％、3％、2％、1％内，或甚至更少的变化。

术语“抗菌剂”是指能够抑制、阻抑或防止细菌物种，例如表2、4和5中所示的任一种的生长或增殖的任何物质。已知的具有抗菌活性的试剂包括通常阻抑广谱的细菌物种的增殖的各种抗生素以及能够抑制特定细菌物种的增殖的试剂，如反义寡核苷酸、小的抑制性RNA等。术语“抗菌剂”类似地被定义为涵盖具有杀死几乎所有细菌物种的广谱活性的试剂，以及特异性地阻抑靶细菌物种的增殖的试剂。这种特异性抗菌剂可以是天然的短的多核苷酸(例如，小的抑制性RNA、微RNA、miniRNA、lncRNA或反义寡核苷酸)，其能够破坏靶细菌物种的生命周期中关键基因的表达，因此能够仅特异性地阻抑或消除该物种而不会显著影响其它密切相关的细菌物种。

如本文所用，术语“约”表示值的范围，其为指定值的+/-10％。例如，“约10”表示9至11(10+/-1)的值范围。

发明详述

I.引言

本发明提供了新的方法和组合物，其用于评估个体，尤其是未被诊断患有肥胖症或2型糖尿病(T2D)的个体的肥胖症和T2D的风险，以及用于评估患有肥胖症和T2D的个体的病况是否与细菌组的某种分布或在其胃肠道中发现的相关细菌物种的分布相关并潜在地由所述细菌组的某种分布或在其胃肠道中发现的相关细菌物种的分布引起或加剧。在这种评估结束时，被认为具有增加的肥胖症或T2D风险的个体可接受治疗以预防性地降低或消除此类风险并预防或延迟病况的发作。类似地，已经患有肥胖症和/或T2D的个体在被确定为患有微生物组依赖性质的一种或多种病况时，可以接受适当的治疗以在严重性、程度和/或持续时间方面减轻其症状。例如，预防性或治疗性治疗方案可涉及人工改变人胃肠道中相关细菌物种的水平，如通过粪便微生物群移植(FMT)治疗增加“有益”细菌的量或水平或者抑制“有害”细菌的量或水平，以便为被测试和治疗的个体提供健康益处。

II.通过调节细菌水平的治疗方法

本申请发明人的发现揭示了诸如肥胖症和T2D的医学病况与患者肠道中的某些细菌物种(例如表1-5中所示的那些)的分布之间的直接相关性。该揭示内容能够实现用于预防和治疗肥胖症和T2D以及相关症状的不同方法，尤其是用于通过经由例如FMT程序向患者的胃肠道递送有效量的一种或多种“有益的”或期望的细菌物种，或者通过递送抗菌剂以抑制目标细菌物种来降低一种或多种“有害的”或不期望的细菌物种的水平来调整或调节患者胃肠道中这些细菌物种的水平来帮助具有肥胖症和T2D或肥胖/T2D患者的升高风险的个体受益于不同的治疗方案，如药物和/或各种疗法。在一些情况下，用于FMT输注的组合物来源于来自具有有益细菌物种的期望的胃肠道分布的至少两个供体(例如，来自两个瘦的供体)，而不是来自一个单一供体的粪便材料的混合物。

例如，可以将一种或多种期望的细菌物种，如表1或3中所示的一些，从外源性来源引入到准备用于FMT的材料中，使得转移材料中细菌物种的水平达到期望的水平(例如，达到材料中总细菌的至少约0.01％、0.02％、0.05％、0.10％、0.20％、0.40％、0.50％、0.60％、0.80％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、8.5％、9.0％或10％)，然后将其加工用于FMT以预防或治疗肥胖症和T2D，用于降低个体中的肥胖症/T2D风险或减轻个体中的肥胖症/T2D症状。在一些情况下，可以从细菌培养物中获得足够量的有益细菌物种，然后将其配制成合适的组合物以递送到接受者的肠道中。与FMT类似，可以通过口服施用、鼻施用或直肠施用将此种组合物引入到患者中。

另一方面，发现某些细菌物种(例如，表2、4和5中所示的一些)的相对丰度由于肥胖症/T2D的存在或肥胖症/T2D的升高风险而增加。因此，将肥胖症/T2D患者或处于肥胖症/T2D的升高风险的那些患者进行治疗以降低这些细菌物种的水平，以便改善患者的与病况相关的症状或预防/延迟/降低病况发作的可能性。有几种方案可降低这些细菌物种的水平：第一，可以给予患者特定的抗菌剂以特异性杀死或抑制目标细菌物种，从而降低这些细菌的水平。第二，可以首先给予患者抗菌剂，如广谱抗生素以杀死或抑制所有细菌物种或者特定的抗菌剂以特异性杀死或抑制目标细菌物种；然后可以将组合物施用至患者(例如通过FMT)以将良好平衡的混合细菌培养物导入患者的胃肠道中。

使用含有彼此处于适当比例范围内的相关细菌物种的一种单一组合物(如来自FMT供体的经加工的粪便材料)，让这些方案中的每一个都可以在一个组合步骤中进行，以实现第一和第二治疗方法目标，即增加某些细菌物种的水平和降低某些其它细菌物种的水平。

在完成将有效量的期望细菌物种导入患者的胃肠道中的步骤(例如，经由FMT程序)和/或抑制不期望的细菌水平的步骤后，可以立即通过每天或每周或每月为基础连续测试粪便样品中细菌物种的水平或相对丰度直至程序后6个月来进一步监测接受者，同时还监测正在治疗的肥胖症/T2D的临床症状以及患者的总体健康状况以便评估治疗结果和接受者胃肠道中相关细菌的相应水平：可以结合所获得的健康益处(如体重、血压、血糖、脂质和胆固醇水平的改善)的观察来监测细菌物种(表1-5中所示的那些中的一种或多种)的水平。

III.评估肥胖症/T2D风险和微生物组依赖性

本申请的发明人发现，在人的胃肠道中某些细菌物种的改变的分布可指示肥胖症/T2D的存在或风险，即使该人可能未被诊断患有肥胖症或T2D：当使用例如，如本文所述的某些特定的数学工具适当地计算时，已经揭示了某些细菌物种(如表1中所示的一种或多种物种)的水平或相对丰度指示对象以后发展肥胖症/T2D的升高的风险或对象的肥胖症/T2D与细菌物种的肠道分布相关(即“微生物组依赖性”)。

一旦进行了肥胖症/T2D风险评估，例如，认为个体患有微生物组依赖性肥胖症/T2D或处于以后发展肥胖症/T2D的增加的风险中，可以采取适当的治疗步骤作为解决个体的疾病或升高风险的措施。例如，可以给予个体药物，如降血糖药物、胰岛素敏化药物和/或食欲抑制药物，或者可以通过FMT或通过替代施用方法给予个体包含有效量的(1)一种或多种有益细菌物种或者(2)抑制有害细菌物种的抗菌物质的组合物，使得患者的胃肠道中的细菌分布被变更为有利于体重减轻和预防T2D或缓解T2D症状的结果的细菌分布。

IV.试剂盒和组合物

本发明提供了可用于降低对象的肥胖症和2型糖尿病(T2D)的风险或用于治疗对象的肥胖症和T2D的试剂盒和组合物。所述试剂盒包括两个或更多个容器，每个容器含有不同组合物，所述组合物包含有效量的不同细菌物种或不同组合的细菌物种，所述细菌物种选自普氏栖粪杆菌、长双歧杆菌、霍氏真杆菌、两岐双岐杆菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、挑剔真杆菌、毛螺菌科细菌_5_1_63FAA、凸腹真杆菌和人罗斯拜瑞氏菌。将组合物配制成例如通过口服施用或通过使用栓剂直接递送而引入接受者的胃肠道中。除了上面指定的细菌物种之外，组合物还可以包含有效降低血糖、使胰岛素反应敏感以及抑制食欲以进一步促进管理T2D和肥胖症的风险的一种或多种治疗剂。

本发明还提供了新的试剂盒和组合物，其可用于评估患者以后发展肥胖症和T2D的可能性，或用于评估患者的肥胖症/T2D是否是微生物组依赖性的。通常，试剂盒包含用于检测表1-5中所示的一种或多种细菌物种的试剂。例如，提供了试剂盒，其包含(1)第一容器，所述第一容器含有包含用于检测表1-5中所示的细菌物种中的一种的第一试剂的第一组合物，以及(2)第二容器，所述第二容器含有包含用于检测表1-5中所示的细菌物种中的一种的第二且不同试剂。任选地，用于检测表1-5中的细菌物种的第三试剂可以包含在试剂盒中。当试剂盒旨在用于检测表1-5中的两种或更多种细菌物种时，在该试剂盒中可以包括含有另外试剂的另外组合物，以便允许使用者检测和测量多种细菌物种的存在和水平。在一些变型中，第一和第二(和任选地更多)试剂可以包含在一种单一组合物中。

在一些情况下，所述试剂包含一组寡核苷酸引物，其用于扩增来自表1-5中所示的任一种细菌物种的多核苷酸序列。例如，试剂可以是用于聚合酶链式反应(PCR)，如定量PCR作为扩增反应的引物和/或探针。通常，此类试剂可以包含针对来源于相关细菌物种的每一种(如选自表1-5的任何一种或多种细菌物种)并且优选是相关细菌物种的每一种特有的多核苷酸序列进行PCR的一组寡核苷酸引物。

作为替代方案，用于检测表1-5中所示的一种或多种细菌物种的手段是宏基因组测序，并且试剂盒包括组合物，所述组合物包含适于对预选细菌物种(表1-5中列出的一种或多种)进行宏基因组测序的一种或多种试剂。例如，试剂盒可以含有用于分析细菌物种的检测试剂，所述细菌物种包括：(i)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(ii)巴勒特梭菌或(iii)副流感嗜血杆菌或(iv)大肠杆菌或(v)毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(vi)凸腹真杆菌或(vii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(viii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、凸腹真杆菌或(ix)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(x)巴勒特梭菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xi)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xii)巴勒特梭菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xiii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(xiv)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(xv)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌或(xvi)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌。

实施例

以下实施例仅通过说明的方式，而不是通过限制的方式提供。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改多种非关键参数以产生基本相同或类似的结果。

背景

该研究的目的是确定人类肠道细菌组如何与肥胖症和2型糖尿病(T2D)相关。本发明的实际用途包括基于测试对象的胃肠道中某些细菌物种的存在和数量来评估与肥胖症和T2D相关的疾病风险，以及评估测试对象中肥胖症和T2D是否与肠道微生物组，尤其是细菌组相关。

实施例1：预测肥胖症和2型糖尿病的风险的机器学习模型

方法

群组描述和研究对象

研究共招募了123名中国成年人，包括同时患有肥胖症和2型糖尿病(ObT2)的68名对象(BMI>28kg/m²)以及55名健康的瘦对象(瘦对照，BMI<23kg/m²)。本研究由香港中文大学新界东医院联网临床研究伦理委员会(The Joint CUHK-NTEC CREC,CREC Ref.No:2016.607))批准。所有对象同意捐赠粪便样品和同意问卷调查，其中获得了书面知情同意。来自研究对象的粪便样品被储存在-80℃用于下游微生物组分析。

粪便DNA提取和DNA测序

通过使用经修改以提高DNA产量的RSC PureFood GMO andAuthentication Kit(Promega)提取粪便细菌DNA。预处理约100mg的每一粪便样品：将粪便样品悬浮在1ml ddH₂O中并通过以13,000×g离心1分钟沉淀。向洗涤的样品中加入800μlTE缓冲液(pH7.5),16μlβ-巯基乙醇和250U裂解酶，充分混合并在37℃下消化90分钟。通过以13,000×g离心3分钟沉淀。

在预处理之后，将沉淀物重悬于800μl CTAB缓冲液(RSC PureFoodGMO and Authentication Kit，按照制造商的说明书)中并充分混合。在将样品在95℃下加热5分钟并冷却之后，通过在2850rpm下用0.5mm和0.1mm珠粒涡旋15分钟从样品中释放核酸。然后，加入40ul蛋白酶K和20ul RNA酶A，并在70℃下消化核酸10分钟。最后，在13,000×g离心5分钟之后获得上清液，并置于RSC仪器中用于DNA提取。将提取的粪便DNA经由Ilumina Novaseq 6000(Novogene,Beijing,China)用于超深宏基因组测序。

原始序列的质量控制

首先用Trimmomatic¹(v0.38)修剪原始序列读取，然后将非人类读取与污染物宿主读取分离。有一些步骤可以获取干净读取：1)去除适配子；2)用4碱基宽的滑动窗口扫描读取，当每碱基的平均质量下降到20以下时，去除读取；3)将读取降低到长度为50个碱基以下。通过KneadData(v0.7.2)将修剪的序列读取映射到人类基因组(参考数据库：GRCh38p12)以去除源自宿主的读取。将配对末端的两个读取串接在一起。

细菌微生物组的分析

经由MetaPhlAn2(v2.7.5)²在宏基因组修剪的读取上进行细菌群落组成的分析。通过Bowtie2(v2.3.4.3)³将读数映射到进化枝特异性标志物基因和物种泛基因组(pangenomes)的注释。输出表含有从界到物种水平的不同水平的细菌物种及其相对丰度。使用tidyverse(v1.2.1)⁴,ggpubr(v0.2,网址:github.com/kassambara/ggpubr)和phyloseq(v1.24.2)⁵在R v3.6.1中分析所得数据。经由线性判别分析效应大小(LEfSe)分析⁶比较ObT2对象与瘦的对照之间的差异细菌物种。细菌分类注释的另一种方法被用作细菌微生物组的替代分析。在该方法中，使用Kraken2(v2.0.8-beta)生成物种水平的群落组成。参考细菌基因组于2019年11月5日从NCBI RefSeq下载，并且用默认参数建立数据库。此后，将每个查询分类为具有通过修剪与映射基因组相关的一般分类树匹配的k-mer的最高总命中的分类单元。使用多元关联线性模型(MaAsLin2)来鉴定临床元数据与微生物丰度之间的关联，同时控制混淆因子。

机器学习模型

使用粪便微生物(由于其具有利用二元特征进行分类的优越性能)，选择随机森林(RF)来建立评估模型。随机森林⁷是宏基因组数据分析中最流行的方法之一，以鉴定区别特征和构建预测模型。作为广泛使用的集成学习算法，随机森林由一系列分类和回归树(CART)组成，以形成强的分类器。从具有替换的原始数据集中随机抽样的数据的子集被称为自助抽样，用于构建树。当通过自助法绘制当前树的训练数据集时，从总体数据集中省略观察结果。在无穷大的N的情况下，有36.8％的数据未出现在称为袋外(OOB)观察结果的训练样品中，这些数据将不会用于构造树。另外，当每个决策树基于从总体特征中选择的特征的随机子集分割节点时，将额外的随机性引入到随机森林。将具有最小基尼(基尼用于评价节点的纯度)的特征用于在每次迭代中分割节点以生成树。对于不同的数据和特征子集，该算法能够训练不同的树并通过对来自树模型的结果进行平均处理来获得最终分类。除了预测模型之外，随机森林还具有评估变量重要性的能力⁸。OOB观察结果用于估计森林中每个树的分类误差。为了测量给定变量的重要性，随机改变OOB数据中变量的值，然后利用改变的OOB数据生成新的预测。将改变的与原始的OOB观察结果之间的误差率之差除以标准误差计算为变量的重要性。为了对新样品进行分类，将样品的特征向下传递到每个树以估计分类的概率。随机森林使用所有树的平均概率来确定分类的最终结果。

通过递归特征消除来评价每个物种对分类模型的重要值。如果其与模型中任何已经存在的探针的皮尔森相关值<0.7，根据递减的重要值，将所选物种逐个添加到随机森林模型中。每次向模型添加新特征时，使用10倍交叉验证重新评价模型的性能。这些模型根据二元分类器与接收者操作特性(ROC)曲线中的曲线下面积(AUC)进行比较。当达到最佳精度和kappa时选择最终模型。使用R包randomForest v4.6-14⁷和pROC v1.15.3⁹进行这些分析。

结果

瘦的对象与ObT2对象之间的肠道细菌分布不同

使用MetaPhlAn2和LEfSe分析，发现与ObT2对象相比，在瘦的对照中，细菌物种普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、长双歧杆菌、霍氏真杆菌(Eubacteriumhallii)、两岐双岐杆菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、挑剔真杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌、人罗斯拜瑞氏菌、巴勒特梭菌、Anaerostipes hadrus、Gordonibacter pamelaeae、小韦荣球菌(Veillonella parvula)、副流感嗜血杆菌、毛螺菌科细菌8_1_57FAA、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、南方链球菌(Streptococcus australis)和婴儿链球菌(Streptococcus infantis)(图1，表1)显示出更高的相对丰度。相比之下，与瘦的对照相比，在ObT2对象中富集大肠杆菌、狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)、粪便拟杆菌(Bacteroides stercoris)、毛螺菌科细菌1_4_56FAA、梭菌目细菌1_7_47FAA(Clostridiales bacterium 1_7_47FAA)、融合魏斯氏菌(Weissella confusa)和格雷文尼茨放线菌(Actinomyces graevenitzii)物种(图1，表2)。

表1：与ObT2对象相比，瘦的对照中富集的细菌物种(经由MetaPhlAn2方法)。

按照在健康的瘦对象中的平均相对丰度排列

表2：与瘦的对照相比，在ObT2对象中富集的细菌物种(经由MetaPhlAn2方法)

按照在健康的瘦对象中的平均相对丰度排列

使用Kraken2来注释细菌组分类学的替代方法，发现与ObT2对象相比，一系列物种在瘦的对照中显示出较高的相对丰度(表3)，同时与瘦的对照相比，一些物种在ObT2对象中显示出较高的相对丰度(表4)。

表3：与ObT2对象相比，在瘦的对照中富含的细菌物种(经由Kraken2方法)

按照在健康的瘦对象中的平均相对丰度排列

表4：与瘦的对照相比，在ObT2对象中富集的细菌物种(经由Kraken2方法)

按照在健康的瘦对象中的平均相对丰度排列

表1、2、3和4中列出的细菌可以以不同的组合使用以确定肥胖症和T2D的风险。例如，可以使用qPCR引物组或通过宏基因组测序确定相对丰度以计算风险。

此外，可以将表1和3中所列的细菌施用至患有肥胖症和T2D或处于发生肥胖症和T2D的风险中的对象，以改善肥胖症和T2D的症状或降低以后发生肥胖症和T2D的风险。相反，表2和4中所列的细菌可针对患有肥胖症和T2D或有发生肥胖症和T2D风险的对象进行抑制，以改善肥胖症和T2D的症状或降低以后发生肥胖症和T2D的风险。

用于预测ObT2的机器学习模型

在机器学习模型中使用五种细菌标志物，包括巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌_5_1_63FAA和凸腹真杆菌(表5)。最终模型在接收者操作特性(ROC)曲线中具有90.3％的曲线下面积(AUC)(图2A)。在ObT2和瘦的对照中这些细菌的相对丰度显示在图3中。

表5：用于评估ObT2的机器学习模型中包含的细菌物种

细菌物种	NCBI:txid
		巴勒特梭菌	261299
副流感嗜血杆菌	729
		大肠杆菌	562
毛螺菌科细菌_5_1_63FAA	658089
		凸腹真杆菌	39496

表6：在ObT2对象(n＝68)和健康对照(n＝55)中表5中所列物种的相对丰度

表7：新的对象中表2中所列物种的相对丰度

该机器学习模型可用于(1)预测在测试时不是肥胖的或未患有2型糖尿病(T2DM)的对象中的ObT2的风险，以及(2)评估对象的ObT2在已经肥胖或患有T2DM的对象中是否是微生物组依赖性的。

将进行以下步骤：

1.通过测定患2型糖尿病的肥胖(ObT2)对象与瘦对照的群组中选自表4的物种的相对丰度来获得一组训练数据。选自表5的物种应当包括：巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌(所有5种物种；AUC:90.3％；图2A)或(ii)巴勒特梭菌(AUC：71.2％；图2B(红色))或(iii)副流感嗜血杆菌(AUC:73.3％；图2B(浅蓝色))或(iv)大肠杆菌(AUC:74.4％；图2B(绿色))或(v)毛螺菌科细菌5_1_63FAA(AUC:41.9％；图2B(深蓝色))或(vi)凸腹真杆菌(AUC:66.5.2％；图2B(橙色))或(vii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA(AUC:87.7％)或(viii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、凸腹真杆菌(AUC:86.9％)或(ix)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌(AUC:86.2％)或(x)巴勒特梭菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌(AUC:88.8％)或(xi)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌(AUC:85.0％)或(xii)巴勒特梭菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌(AUC:86.7％)或(xiii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA(AUC:85.0％)或(xiv)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA(AUC:84.1％)或(xv)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌(AUC:86.4％)或(xvi)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌(AUC:85.6％)。

2.为了确定不肥胖的或未患有T2DM的对象中的ObT2的风险，或者为了确定对象的已存在的ObT2是否是微生物组相关的，确定这些物种的相对丰度。

3.使用随机森林模型将对象中这些物种的相对丰度与训练数据进行比较。

4.决策树将由训练数据通过随机森林生成。相对丰度将沿着决策树运行并生成风险评分。如果模型中超过50％的树认为对象类似于ObT2组，则结果将是“认为对象具有ObT2的增加的风险”或“对象的现有ObT2是微生物组依赖性的”。如果模型中少于50％的树认为对象类似于ObT2组，则结果将是“对象被认为具有ObT2的低的风险”或“对象的现有ObT2不太可能是微生物组依赖性的”。

研究1：

通过宏基因组测序和如方法中所述指定的分类学来确定在ObT2对象(n＝68)和健康对照(n＝55)中表5中所列的5种物种的相对丰度(表6中所列的相对丰度)。决策树由表6中的数据由随机森林产生，参数：树＝801,mtry＝3。

确定在50岁男性对象(FB002)中患ObT2的风险。通过宏基因组测序和如方法中所述指定的分类学来确定该对象的粪便样品中表5中所列的5种物种的相对丰度。在该对象中5种物种的相对丰度显示在表7中。相对丰度沿决策树运行，并使用表6中的相对丰度作为训练数据来生成风险评分。对象的评分是0.997(图4A)，因此认为对象可能是ObT2。该对象具有41.7的BMI，并且被诊断患有T2DM。

研究2：

确定在45岁男性对象(H45)中患ObT2的风险。通过宏基因组测序和如方法中所述指定的分类学来确定该对象的粪便样品中表5中所列的5种物种的相对丰度。在该对象中5种物种的相对丰度显示在表7中。相对丰度沿决策树运行，并使用表6中的相对丰度作为训练数据来生成风险评分。对象的评分是0.137(图4B)，因此认为对象具有ObT2的低风险。该对象具有21.09的BMI，并且不患有T2DM。

实施例2：混合供体FMT诱导产丁酸细菌的丰度和多样性增加

背景

方法

研究对象和研究设计

进行了两项FMT研究，即非密集的FMT随机对照试验(nFMT)和密集FMT研究(iFMT)，并进行了比较。在两项研究中，从中国香港的三级转诊中心招募了年龄为18-70岁、体重指数≥28kg/m²且≤45kg/m²的肥胖对象(ClinicalTrials.gov NCT03789461,NCT03127696)。排除在过去一年中使用减肥药物的患者，以及患有免疫缺陷综合征、食道-胃-十二指肠镜检查(OGD)禁忌症、食物过敏病史、严重器官衰竭包括如代偿不全之肝硬化、炎性肠病、肾衰竭、癫痫、在最近2年已知的恶性肿瘤和活动性脓毒病(active sepsis)的患者。还排除在12周的筛选内服用抗生素或益生菌的对象，或者在随机化时服用钠-葡萄糖共转运蛋白-2抑制剂、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂或质子泵抑制剂的对象。在研究期间禁止服用抗生素、益生菌或益生元。在研究期间，患者保持相同剂量的口服降血糖药物和降血脂药物。所有患者提供书面知情同意书。香港中文大学新界东医院联网临床研究伦理委员会批准了这项研究(2016.136-T和2018.444)。

FMT方案

在nFMT研究中，接受者每月接受一次非密集的FMT输注，持续4个月(总共4次FMT)。FMT输注物来源于至少两个瘦供体的混合物。在iFMT研究中，每个对象接受3天的抗生素制剂(万古霉素、甲硝唑和阿莫西林，各500mg，每日3次)，随后每周连续5天的单供体FMT，持续4周(总共20个FMT)。在四个时间点(基线、第一次FMT之后一个月、最后一次FMT之后一个月和最后一次FMT之后2-3个月)从所有接受者收集系列粪便样品(图5A)。

FMT供体

根据如先前所述的一组严格标准¹⁰，FMT溶液来源于BMI<23kg/m²的瘦供体。在排便4小时内收集合格供体的粪便样品，目视检查适合性(成形的粪便、无血液或粘液)。将供体粪便用等渗盐水和甘油均质化，过滤，然后储存在-80℃。在清醒镇静下，经由食道-胃-十二指肠镜检查(OGD)将来自单一供体或供体粪便汇集的FMT溶液(在100-200ml盐水中的50gm粪便)输注到远端十二指肠中。

鸟枪法宏基因组测序和粪便微生物群分析

根据制造商的说明书，使用RSC PureFood GMO and AuthenticationKit分离细菌宏基因组测序的粪便DNA。通过末端修复、纯化和PCR扩增的过程构建DNA文库，并利用配对末端的150bp测序策略通过Illumina Novaseq 6000(Novogene,Beijing,China)进行测序，每个样品生成9350±1520万(平均值±标准差，SD)个原始读取。使用Trimmomatic¹¹(v0.38)对宏基因组读取进行质量过滤和修剪，并通过Kneaddata(v0.7.2,网址：bitbucket.org/biobakery/kneaddata/wiki/Home)针对人类基因组(参考：hg38)进行净化。使用MetaPhlAn2¹²(v2.6.0)产生物种水平的宏基因组分析。使用StrainPhlAn¹³(v3)产生菌株水平的宏基因组分析。在R v3.6.0和tidyverse¹⁴(v1.2.1)、ggpubr¹⁵(v0.2)和phyloseq¹⁶(v1.24.2)R包中处理所得丰度表。原始测序数据可在NCBI上在Bio projectPRJNA644456和RJNA633456下获得。

细菌物种的相关变异

如前所述¹⁷鉴定FMT之后细菌物种的相关变异。简而言之，细菌物种的相对变化计算为每个FMT后样品与基线样品之间的相对丰度的差异。然后将每个FMT后时间点的细菌物种的相对变化的相关性制表。当在最后一次FMT之后一个月和最后一次FMT之后2-3个月时相关性显著(p<0.05，皮尔逊相关性)时，认为是相关变异。

统计分析

连续变量以平均值±SD或中位数(第25至第75个百分位数，P25-P75)(视情况而定)表示，而分类变量以数字(百分比)表示。应用重复测量ANOVA(对偏斜变量进行对数转换)用于组间比较。使用Wilcoxon秩和检验研究组间比较的显著差异。使用Wilcoxon符号秩检验比较同一治疗中不同时间点之间的数据。使用线性判别分析效应大小¹⁸(LEfSe)确定两组之间的分类群。通过中心对数比转化¹⁹之后的布雷柯蒂斯距离(bray curtis distance)来评估FMT前和FMT后样品之间的差异。所有的统计检验都是双侧的。统计学显著性被认为是P<0.05。

结果

研究对象

在nFMT研究中，BMI范围为28.0至44.9kg/m²的总共38名肥胖对象接受来自2-5个瘦供体的粪便输注。在iFMT研究中，BMI范围为31.9至41.5kg/m²的9个肥胖对象接受来自一个单一瘦供体的粪便输注。接受者基线特征总结在表8中。

表8：每项研究中的对象基线特征

数据表示为对象的数目(％)或中位数(P25-P75)。缩写：BMI，体重指数；LDL，低密度脂蛋白；HDL，高密度脂蛋白；ALT，丙氨酸转氨酶。

密集对比非密集FMT对肥胖对象体重减轻的影响

在FMT干预之后，与基线相比，两项研究中的肥胖接受者均显示出异质性体重减轻(nFMT 3.1％±4.8％对比iFMT 4.8％±1.7％，平均值±sd，在52周的随访期间的最大体重减轻)。与nFMT相比，在接受iFMT的对象中没有观察到体重减轻的显著改善(重复测量ANOVA，p＝0.403，图5B)。接受iFMT的9个对象中没有一个达到≥10％的体重减轻，而接受nFMT的13.2％(38个中有5个)对象达到≥10％的体重减轻(在52周的随访期间的最大体重减轻，图5B)。

密集的FMT导致数量增加的瘦供体来源的物种，并且类似于供体微生物组分布

与接受nFMT的肥胖对象相比，接受iFMT的肥胖对象在第一次FMT之后的一个月和最后一次FMT输注之后的2-3个月具有显著更多来源自供体的细菌物种(p＝0.03和p<0.01，Wilcoxon秩和检验，图6A)。在接受iFMT的对象中，在第一次FMT之后一个月，来源自供体的细菌物种的聚集丰度显著高于接受nFMT的对象(p＝0.02，Wilcoxon秩和检验，图6B)。接受iFMT的对象中的基线与FMT后样品之间的布雷柯蒂斯距离显著大于接受nFMT的对象中的布雷柯蒂斯距离，表明iFMT赋予了总体细菌组成的更多变化(p<0.001，Wilcoxon秩和检验，图6C)。在最后一次FMT之后的一个月，iFMT接受者的FMT后样品与相应供体的样品之间的布雷柯蒂斯距离显著小于nFMT接受者(p＝0.06，Wilcoxon秩和检验，图6D)，表明与nFMT之后的细菌组分布相比，iFMT之后的细菌组分布显示出与其相应供体的细菌组分布更相似。

混合供体FMT与肥胖对象中产丁酸细菌的丰度和多样性增加相关

在其中每个对象接受来自2-5个瘦供体的粪便输注的nFMT研究中，观察到产丁酸细菌的显著增加，所述产丁酸细菌包括真细菌物种、人罗斯拜瑞氏菌、Anaerostipeshadrus²⁰、普氏栖粪杆菌²¹和柯林斯氏菌物种(Collinsella species)²²(图7A，图9，LDA>2，p<0.05)。与基线样品相比，FMT后的样品中Chao1丰富度和香农多样性以及产丁酸物种的聚集丰度显著更高(p<0.01和p<0.05，Wilcoxon符号秩检验，图7B，C)。相比之下，在其中接受者接受单供体FMT的iFMT研究中，Chao1丰富度、香农多样性或产丁酸物种的聚集丰度没有显著增加(图7A-C，图10)。两岐双岐杆菌(已经显示其通过互养相互作用²³与产丁酸细菌相互作用)的丰度在nFMT后的样品中显著增加，但在iFMT后的样品中没有显著增加(图9，LDA>2，p<0.05)。主要产丁酸物种的变化在最后一次FMT之后的一个月和2-3个月始终相关(图7D，图11)，表明尽管在FMT后受到大量干扰，但这些物种仍保持相关变异。在第一次FMT之后的一个月和最后一次FMT之后的2-3个月，nFMT接受者中的总体细菌组的丰富度也显著增加(p<0.01和p<0.05，Wilcoxon符号秩检验，图7E)¹⁰，而在iFMT接受者中没有观察到显著变化。这些结果表明，混合供体FMT，而不是单一供体FMT，与肥胖对象中产丁酸细菌的增加的丰度和多样性相关。

与非密集的FMT相比，密集的FMT导致产丁酸细菌菌株的替换增加

然后，本申请的发明人在主要产丁酸细菌的接受者中寻找菌株植入或替换。在超过50％的FMT接受者中存在霍氏真杆菌、普氏栖粪杆菌和Anaerostipes hadrus，并基于SNP单体型分布形成不同的簇(图8A，图12)。与在第二次随访时接受非密集FMT的对象相比，接受强化FMT的对象具有更高比例的菌株植入或替换(霍氏真杆菌：77.8％对比26.3％，普氏栖粪杆菌：66.7％对比57.9，Anaerostipes hadrus:88.9％对比52.6％，密集对比非密集的FMT，图8B)。这表明密集的FMT在用供体来源的菌株替换原始菌株方面更有效。

讨论

本研究旨在探讨密集的FMT是否能够改善供体植入并诱导体重减轻，以及评价影响肥胖对象中FMT结果的因素。发现与混合供体每月FMT相比，密集的FMT不会诱导更多的体重减轻。尽管密集的FMT诱导了显著较高数量的瘦供体来源的物种，但与混合供体每月FMT相比，供体来源的物种的聚集丰度仅短暂增加。相反，混合供体每月的FMT在诱导产丁酸细菌的增加方面更有效，并且在肥胖接受者的亚组中诱导显著的体重减轻(≥10％)。在所有基线因素中，接受者的基线微生物组组成在预测体重变化方面显示最强的能力。高基线多雷拟杆菌(B.dorei)与FMT之后更多的体重减轻相关。

混合供体密集的FMT在诸如溃疡性结肠炎²⁴的疾病中显示出增加FMT功效。比较单一供体密集的FMT或混合供体每月FMT后肥胖患者的微生物组分布的变化。假设是抗生素制剂，随后是FMT的频繁的强化的过程，可以增强微生物群改变和改善肥胖对象的临床结果。如所预期的，与混合供体FMT相比，密集的FMT导致供体来源的物种的数量增加。然而，与混合供体FMT相比，供体来源物种的聚集丰度仅自第一次FMT起一个月显示出显著差异，但在随访拜访期间没有显示出的显著差异。类似地，在接受密集FMT的对象中，总体组成变化和与供体微生物组分布的相似性在FMT期间和自最后一次FMT起一个月达到峰值，但自最后一次FMT输注起两至三个月降低至与混合供体FMT类似的水平。这些数据表明与混合供体每月FMT相比，单一供体密集的FMT仅导致微生物组分布的短暂改善。

产丁酸细菌是一组共生细菌，其能够将不易消化的碳水化合物转化为丁酸盐²⁵，后者显示出降低循环胆固醇的水平^26,27。在混合供体每月FMT之后，观察到多种产丁酸物种的广泛增加，如通过增加的丰度和增加的多样性所示的。在接受密集的单一供体FMT的对象中，产丁酸物种的增加显示出高的人与人之间的变异性。这与先前的单一供体FMT研究，其中仅观察到少数产丁酸物种的增加^28-30。先前的研究报道了甘草西定A(licorisoflavanA)、吡咯和对甲酚硫酸盐的关联，并且这些代谢物的水平与普氏栖粪杆菌菌株转移显著相关³¹。然而，没有观察到产丁酸菌株与临床结果的显著关联，这可能与诸如有限的样品大小或不足以影响临床表现的菌株变化的因素有关。通过解释接受者粪便微生物群中的相关变异模式，本申请的发明人显示了几种产丁酸物种充当共变单元，其在FMT后彼此保持正相关。尽管选择标准相同，但瘦供体的微生物组分布在产丁酸物种的存在和丰度方面变化很大。因此，通过汇集来自多个供体的粪便样品共灌输产丁酸物种可以增加产丁酸物种在接受者的肠道中的定植。

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参考文献列表

1.Bolger AM,Lohse M,Usadel B.Trimmomatic:a flexible trimmer forIllumina sequence data.Bioinformatics 2014；30:2114-20.

2.Truong DT,Franzosa EA,Tickle TL,et al.MetaPhlAn2 for enhancedmetagenomic taxonomic profiling.Nat Methods 2015；12:902-3.

3.Langmead B,Salzberg SL.Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.NatMethods 2012；9:357-9.

4.Hadley W,Mara A,Jennifer B,et al.Welcome to the Tidyverse.Journalof Open Source Software 2019；4:1686.

5.McMurdie PJ,Holmes S.phyloseq:an R package for reproducibleinteractive analysis and graphics of microbiome census data.PLoS One 2013；8:e61217.

6.Segata N,Izard J,Waldron L,et al.Metagenomic biomarker discoveryand explanation.Genome Biol 2011；12:R60.

7.Breiman L.Random Forests.Machine Learning 2001；45:5-32.

8.Cutler DR,Edwards Jr TC,Beard KH,et al.Random forests forclassification in ecology.Ecology 2007；88:2783-2792.

9.Robin X,Turck N,Hainard A,et al.pROC:an open-source package for Rand S+to analyze and compare ROC curves.BMC Bioinformatics 2011；12:77.

10.Ng SC,Xu Z,Mak JWY,et al.Microbiota engraftment after faecalmicrobiota transplantation in obese subjects with type 2diabetes:a 24-week,double-blind,randomised controlled trial.Gut 2021.

11.Bolger AM,Lohse M,Usadel B.Trimmomatic:a flexible trimmer forIllumina sequence data.Bioinformatics 2014；30:2114-20.

12.Truong DT,Franzosa EA,Tickle TL,et al.MetaPhlAn2 for enhancedmetagenomic taxonomic profiling.Nat Methods 2015；12:902-3.

13.Beghini F,McIver LJ,Blanco-Miguez A,et al.Integrating taxonomic,functional,and strain-level profiling of diverse microbial communities withbioBakery 3.Elife 2021；10.

14.Wickham H AM,Bryan J,et al.“Welcome to the tidyverse.”.ournal ofOpen Source Software 2019；4(43),1686.

15.Wickham H.ggpubr:‘ggplot2’Based Publication Ready Plots.

16.McMurdie PJ,Holmes S.Phyloseq:a bioconductor package for handlingand analysis of high-throughput phylogenetic sequence data.Pac Symp Biocomput2012:235-46.

17.Raman AS,Gehrig JL,Venkatesh S,et al.A sparse covarying unit thatdescribes healthy and impaired human gut microbiota development.Science 2019；365:eaau4735.

18.Segata N,Izard J,Waldron L,et al.Metagenomic biomarker discoveryand explanation.Genome Biol 2011；12:R60.

19.Gloor GB,Macklaim JM,Pawlowsky-Glahn V,et al.Microbiome DatasetsAre Compositional:And This Is Not Optional.Front Microbiol 2017；8:2224.

20.Kant R,Rasinkangas P,Satokari R,et al.Genome Sequence of theButyrate-Producing Anaerobic Bacterium Anaerostipes hadrus PEL85.Microbiology Resource Announcements 2015；3.

21.Vital M,Karch A,Pieper DH.Colonic Butyrate-Producing Communitiesin Humans:an Overview Using Omics Data.mSystems 2017；2:e00130-17,/msystems/2/6/msys.00130-17.atom.

22.Qin PP,Zou YQ,Dai Y,et al.Characterization a Novel Butyric Acid-Producing Bacterium Collinsella aerofaciens Subsp.ShenzhenensisSubsp.Nov.Microorganisms 2019；7.

23.Rivière A,Selak M,Lantin D,et al.Bifidobacteria and Butyrate-Producing Colon Bacteria:Importance and Strategies for Their Stimulation inthe Human Gut.Frontiers in Microbiology 2016；7.

24.Paramsothy S,Kamm MA,Kaakoush NO,et al.Multidonor intensive faecalmicrobiota transplantation for active ulcerative colitis:a randomisedplacebo-controlled trial.The Lancet 2017；389:1218-1228.25.Fu X,Liu Z,Zhu C,etal.Nondigestible carbohydrates,butyrate,and butyrate-producing bacteria.CritRev Food Sci Nutr 2019；59:S130-S152.

26.Canfora EE,Jocken JW,Blaak EE.Short-chain fatty acids in controlof body weight and insulin sensitivity.Nat Rev Endocrinol 2015；11:577-91.

27.Kenny DJ,Plichta DR,Shungin D,et al.Cholesterol Metabolism byUncultured Human Gut Bacteria Influences Host Cholesterol Level.Cell HostMicrobe 2020；28:245-257 e6.

28.Kootte RS,Levin E,J,et al.Improvement of InsulinSensitivity after Lean Donor Feces in Metabolic Syndrome Is Driven byBaseline Intestinal Microbiota Composition.Cell Metabolism 2017；26:611-619.e6.

29.Dao MC,Everard A,Aron-Wisnewsky J,et al.Akkermansia muciniphilaand improved metabolic health during a dietary intervention in obesity:relationship with gut microbiome richness and ecology.Gut 2016；65:426-436.

30.Forslund K,Hildebrand F,Nielsen T,et al.Disentangling type 2diabetes and metformin treatment signatures in the human gutmicrobiota.Nature 2015；528:262-+.

31.Chen L,Wang D,Garmaeva S,et al.The long-term genetic stability andindividual specificity of the human gut microbiome.Cell 2021；184:2302-2315e12.

Claims

1.用于降低对象的肥胖症和2型糖尿病(T2D)的风险或治疗对象的肥胖症和T2D的方法，其包括将有效量的一种或多种细菌物种引入所述对象的胃肠道，所述细菌物种选自普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzi)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、霍氏真杆菌(Eubacterium halli)、两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)、肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)、毛螺菌科细菌_5_1_63FAA(Lachnospiraceae bacterium_5_1_63FAA)、凸腹真杆菌(Eubacteriumventriosum)和人罗斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述引入步骤包括向所述对象口服施用包含有效量的所述一种或多种细菌物种的组合物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述引入步骤包括将包含有效量的所述一种或多种细菌物种的组合物递送至所述对象的小肠、回肠或大肠。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述引入步骤包括粪便微生物群移植(FMT)。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述FMT包括向所述对象施用包含经加工的供体粪便材料的组合物。

6.根据权利要求5中任一项所述的方法，其中所述经加工的供体粪便材料来自至少两个瘦的供体。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述组合物不包含可检测量的表2或4中的任何物种。

8.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物经口服施用。

9.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物直接递送到所述对象的胃肠道。

10.根据权利要求1所述的方法，其中在所述引入步骤之前从所述对象获得的第一粪便样品和在所述引入步骤之后从所述对象获得的第二粪便样品中确定所述一种或多种细菌物种的水平或相对丰度。

11.根据权利要求10所述的方法，其中通过聚合酶链式反应(PCR)，优选定量聚合酶链式反应(qPCR)确定所述一种或多种细菌物种的水平。

12.用于评估对象的肥胖症和2型糖尿病(T2D)的风险的方法，其包括：

(1)确定来自所述对象的粪便样品中的表1-5所示的一种或多种细菌物种的水平或相对丰度；

(2)确定来自参考群组的粪便样品中相同细菌物种的水平或相对丰度，所述参考群组包括患有肥胖症和T2D的对象和不患有肥胖症和T2D的对象；

(3)使用从步骤(2)获得的数据通过随机森林模型生成决策树，并沿着所述决策树运行来自步骤(1)的一种或多种细菌物种的水平或者相对丰度以生成评分；以及

(4)将评分大于0.5的对象确定为具有增加的肥胖症和T2D的风险，并且将评分不大于0.5的对象确定为没有增加的肥胖症和T2D的风险。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种细菌物种包括表1-5中所示的任何两种或三种细菌物种。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述对象未被诊断患有肥胖症。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述对象未被诊断患有T2D。

16.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(1)和(2)中的每一个都包括宏基因组测序。

17.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(1)和(2)中的每一个都包括聚合酶链式反应(PCR)。

18.权利要求17的方法，其中所述PCR是定量PCR。

19.根据权利要求12所述的方法，其中所述细菌物种是(i)巴勒特梭菌(Clostridiumbartlettii)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(ii)巴勒特梭菌或(iii)副流感嗜血杆菌或(iv)大肠杆菌或(v)毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(vi)凸腹真杆菌或(vii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(viii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、凸腹真杆菌或(ix)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(x)巴勒特梭菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xi)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xii)巴勒特梭菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xiii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(xiv)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(xv)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌或(xvi)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌。

20.用于评估对象是否患有微生物组依赖性肥胖症和T2D的方法，其包括：

(4)将评分大于0.5的对象确定为患有微生物组依赖性肥胖症和T2D，并且将评分不大于0.5的对象确定为患有微生物组非依赖性肥胖症和T2D。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述对象已经被诊断患有肥胖症。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述对象已经被诊断患有T2D。

23.根据权利要求20所述的方法，其中步骤(1)和(2)中的每一个都包括宏基因组测序。

24.根据权利要求20所述的方法，其中步骤(1)和(2)中的每一个都包括聚合酶链式反应(PCR)。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述PCR是定量PCR(qPCR)。

26.根据权利要求20所述的方法，其中所述细菌物种是(i)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(ii)巴勒特梭菌或(iii)副流感嗜血杆菌或(iv)大肠杆菌或(v)毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(vi)凸腹真杆菌或(vii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(viii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、凸腹真杆菌或(ix)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(x)巴勒特梭菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xi)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xii)巴勒特梭菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xiii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(xiv)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(xv)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌或(xvi)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌。

27.用于评估对象的肥胖症和2型糖尿病(T2D)的风险或用于评估对象是否患有微生物组依赖性肥胖症和T2D的试剂盒，其包含用于检测表1-5中所示的一种或多种细菌物种的试剂。

28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述试剂包含一组寡核苷酸引物，其用于扩增来自表1-5中所示的任一种细菌物种的多核苷酸序列。

29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述扩增是PCR。

30.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述PCR是定量PCR。

31.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述细菌物种是(i)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(ii)巴勒特梭菌或(iii)副流感嗜血杆菌或(iv)大肠杆菌或(v)毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(vi)凸腹真杆菌或(vii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(viii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、凸腹真杆菌或(ix)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(x)巴勒特梭菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xi)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xii)巴勒特梭菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA、凸腹真杆菌或(xiii)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(xiv)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、毛螺菌科细菌5_1_63FAA或(xv)巴勒特梭菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌或(xvi)副流感嗜血杆菌、大肠杆菌。