HK40082496B

HK40082496B - 抗psma抗体-依喜替康类似物偶联物及其医药用途

Info

Publication number: HK40082496B
Application number: HK62023071231.2A
Authority: HK
Inventors: 应华; 张小敏; 杨筱莹; 陶维康
Original assignee: 江苏恒瑞医药股份有限公司; 上海恒瑞医药有限公司
Priority date: 2020-03-25
Filing date: 2021-03-25
Publication date: 2025-04-03

Description

抗PSMA抗体-依喜替康类似物偶联物及其医药用途

本申请要求2020年3月25日提交的中国专利申请(申请号CN202010218297.4)的优先权。

技术领域

本公开涉及抗PSMA抗体、抗PSMA抗体-依喜替康类似物偶联物，其制备方法，包含其的药物组合物，以及其用于制备治疗PSMA介导的疾病或病症的药物中的用途；尤其在用于制备抗癌药物中的用途。

背景技术

这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。

美国癌症协会2019年统计数据显示，美国男性新增癌症病例中前列腺癌排名第一，为174650例(CA CANCER J CLIN 2019；69：7-34)。对于临床局部疾病，通常选择手术和放射治疗。对于局部晚期或转移性疾病，通常先采用手术或化学方式剥夺雄激素(ADT)治疗。对于去势抵抗(CRPC)初期可选用Sipuleucel-T细胞免疫疗法，对于转移性去势抵抗阶段(mCRPC)病人，可根据情况选用雄激素抑制剂、雄激素受体拮抗剂、针对骨转移的放疗药物以及作用于微管的化疗药物等药物治疗。但每种治疗式都只能延长几个月的存活期，需要寻求有效的治疗方式(European Urology，66(6)，1190-1193；Journal of NuclearMedicine，59(2)，177-182.)。

前列腺特异性膜抗原(PSMA)除了由前列腺上皮细胞表达以外，还可以由非前列腺组织表达，例如小肠，近端肾小管和唾液腺，但其水平远低于前列腺组织。而PSMA在前列腺癌细胞中高表达，特别是在转移性疾病、激素难治性疾病和高级别病变中的表达最高。另外，PSMA还高表达于所有实体瘤的新生血管的内皮细胞中，但其在正常血管中没有表达，所以它也被作为实体瘤治疗的靶点(Clinical Cancer Research，Vol.3，81-85，January1997；Urologic Oncology：Seminars and Original Investigations，1(1)，18-28.；ClinCancer Res.2010 November 15；16(22)：5414-5423.)。雄激素剥夺或雄激素受体拮抗剂治疗均可上调前列腺特异膜抗原(PSMA)的表达(J Nucl Med 2017；58：81-84)，这为靶向疗法与传统激素疗法联合治疗提供依据。

PSMA属于谷氨酸II型羧肽酶(Glutamate carboxypeptidase II，GCPII)，它在神经系统中作为NAALDase，酶解NAAG得到谷氨酸，与谷氨酸的神经传递相关。在小肠中作为FOLH1，分解叶酸-聚-γ-谷氨酸(folyl-poly-γ-glutamate，FPGn)得到叶酸，与叶酸代谢相关(Curr Med Chem.2012；19(6)：856-870.)。而在前列腺中作为PSMA，表达在上皮细胞上，与前列腺癌的发生有关。PSMA由750个氨基酸组成，胞内19个，跨膜24个，胞外707个。结晶结果显示胞外部分由3个结构域组成，分别为蛋白酶样结构域、顶端结构域和C末端结构域。三者都参与底物的结合，前两者直接与底物结合，C末端结构域在使PSMA形成二聚体中发挥作用(The EMBO Journal(2006)25，1375-1384)。谷氨酸II型羧肽酶(GCPII)及其剪接变体，旁系同源物的研究有限。以PSM’为代表的剪接变体大多存在于正常前列腺组织细胞的胞内。研究最深入的GCPII同源物GCPIII或NAALADase II作为自身有效的药物靶标，可以弥补正常的GCPII酶促活性的不足，其与GCPII有68％序列相似性(Current MedicinalChemistry，2012，19，1316-1322；Frontiers in Bioscience，Landmark，24，648-687，March1，2019)。

抗体-药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)把单克隆抗体或者抗体片段通过接头化合物与具有生物活性的细胞毒素相连，充分利用了抗体对正常细胞和肿瘤细胞表面抗原结合的特异性和细胞毒性物质的高效性，同时又避免了抗体的疗效偏低和毒性物质毒副作用过大等缺陷。这也就意味着，与以往传统的化疗药物相比，抗体-药物偶联物能更精准地杀伤肿瘤细胞并降低将对正常细胞的影响。

目前已有多种ADC药物被用于临床或临床研究，如Kadcyla，是靶向Her2的曲妥珠单抗与DM1形成的ADC药物。同时，也有靶向PSMA的ADC药物的用于临床治疗研究。Cytogen公司的PSMA-ADC，处于二期临床阶段，MedImmune公司的MEDI-3726以及BZL Biologics Inc公司的MLN-2704在临床一期结束后因为药效不良停止了研究。采用不同策略开发新的ADC药物具有广阔的前景。

发明内容

本公开涉及抗PSMA抗体-ADC以及其用途，提供与抗PSMA抗体或抗原结合片段与细胞毒性物质依喜替康类似物偶联的ADC药物。

本公开提供了一种通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐：

其中：

Y选自-O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-、-O-CR¹R²-(CR^aR^b)_m-、-O-CR¹R²-、-NH-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-和-S-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-；

R^a和R^b相同或不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基、烷氧基、羟基、氨基、氰基、硝基、羟烷基、环烷基和杂环基；或者，R^a和R^b与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；

R¹选自卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基和杂芳基；R²选自氢原子、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基和杂芳基；或者，R¹和R²与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；

或者，R^a和R²与其相连的碳原子一起形成环烷基或杂环基；

m为0至4的整数；非限制性实例如m选自0、1、2、3和4；

n为1至10，n是小数或整数；优选地，n为1-8，更优选为3-8，最优选为3-7，更优选为6-7。

L为接头单元；

Pc为抗PSMA抗体或其抗原结合片段，优选地，所述抗PSMA抗体或其抗原结合片段特异性结合PSMA胞外结构域。

在一些实施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含与如SEQ ID NO：1所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些实施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些实施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述抗PSMA抗体是鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

在一些实施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示或与其有至少90％-100％的序列同一性，包括但不限于至少91％、至少92％、至少93％、至少94％，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的序列同一性；和所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示或与其有至少90％-100％的序列同一性，包括但不限于至少91％、至少92％、至少93％、至少94％，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的序列同一性。

在一些实施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述抗PSMA抗体或其抗原结合片段，包含序列如SEQ ID NO：1所示的重链可变区和序列如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述抗PSMA抗体包含抗体重链恒定区和轻链恒定区；优选地，所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定区及其常规变体，所述轻链恒定区选自人抗体κ和λ链的恒定区及其常规变体。

在一些实施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述抗PSMA抗体，包含如SEQ ID NO：9所示的重链和如SEQ ID NO：10所示的轻链。

在一些实施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中n为1至8，优选为3-8，更优选3-7，n是小数或整数。

在一些实施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，

其中：

Y为-O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-；

R^a和R^b相同或不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素和C_1-6烷基；

R¹为卤代烷基或C_3-6环烷基；

R²选自氢原子、卤代烷基和C_3-6环烷基；

或者，R¹和R²与其相连接的碳原子一起形成C_3-6环烷基；

m为0或1。

在一些实施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中Y选自：

其中Y的O端与接头单元L相连。

在一些实施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中接头单元-L-为-L¹-L²-L³-L⁴-，

L¹选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH₂-C(O)-NR³-W-C(O)-或-C(O)-W-C(O)-，其中W选自C_1-8烷基、C_1-8烷基-环烷基和1至8个原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自N、O和S的杂原子，其中所述的C_1-8亚烷基、C_1-8烷基-环烷基和直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；

L²选自-NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂CH₂C(O)-、-NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂C(O)-、-S(CH₂)p²C(O)-和化学键，其中p¹为1至20的整数；

L³为由2至7个氨基酸残基构成的肽残基，其中所述的氨基酸选自苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、赖氨酸(K)、瓜氨酸、丝氨酸(S)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)中的氨基酸形成的氨基酸残基，并任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基中的一个或多个取代基所取代；

L⁴选自-NR⁵(CR⁶R⁷)_t-、-C(O)NR⁵、-C(O)NR⁵(CH₂)_t-和化学键，其中t为1至6的整数；

R³、R⁴和R⁵相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；

R⁶和R⁷相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基。

L¹为s¹为2至8的整数；

L²为化学键；

L³为四肽残基；优选地，L³为GGFG(SEQ ID NO：13)(甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸)的四肽残基；

L⁴为-NR⁵(CR6R⁷)t-，R⁵、R⁶或R⁷相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基，t为1或2；

其中所述的L¹端与Pc相连，L⁴端与Y相连。

在一些实施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中-L-为：

在一些实施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中-L-Y-任选自：

在一些实施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其为通式(Pc-L_a-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐：

其中：

W、L²、L³、R⁵、R⁶、R⁷如前所述接头单元-L-中所定义；

Pc、n、R¹、R²、m如通式(Pc-L-Y-D)中所定义；

具体的，Pc为抗PSMA抗体或其抗原结合片段；

m为0至4的整数；非限制性实例如m选自0、1、2、3和4；

n为1至10，n是小数或整数；优选地，n为1-8，更优选为3-8，最优选为3-7，更优选为6-7；

W选自C_1-8烷基、C_1-8烷基-环烷基或1至8个原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自N、O或S的杂原子，其中所述的C_1-8烷基、环烷基和直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；

L²选自-NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂CH₂C(O)-、-NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂C(O)-、-S(CH₂)p¹C(O)-和化学键，其中p¹为1至20的整数；

L³为由2至7个氨基酸残基构成的肽残基，其中所述的氨基酸残基选自苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、赖氨酸(K)、瓜氨酸、丝氨酸(S)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)中的氨基酸形成的氨基酸残基，并任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基中的一个或多个取代基所取代；

R⁵选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；

在一些实施方案中，如前任一项所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其为通式(Pc-L_b-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐：

其中：

s¹为2至8的整数；

Pc、R¹、R²、R⁵、R⁶、R⁷、m和n如通式(Pc-L_a-Y-D)所中所定义。

在一些实施方案中，如前任一项所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，所述抗体-药物偶联物选自：

其中Pc和n如通式(Pc-L-Y-D)中所定义，具体地，Pc为抗PSMA抗体或其抗原结合片段，或如前任一项所述的抗PSMA抗体；

n为1至10，n是小数或整数；优选地，n为1-8，更优选为3-8，最优选为3-7；最优选为6-7。

在一些实施方案中，如前任一项所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，所述抗体-药物偶联物为：

其中：

n为1至8，优选为3-8，n是小数或整数；

PM为抗PSMA抗体，其包含如SEQ ID NO：9所示的重链和如SEQ ID NO：10所示的轻链。

本公开进一步提供一种制备如通式(Pc-L_a-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐的方法，其包括以下步骤：

Pc’为还原后的Pc，与通式(L_a-Y-D)所示的化合物进行偶联反应，得到通式(Pc-L_a-Y-D)所示的化合物；

其中：

Pc为抗PSMA抗体或其抗原结合片段；

n、m、W、L²、L³、R¹、R²、R⁵、R⁶和R⁷如前述通式(Pc-L_a-Y-D)中所定义。

本公开进一步提供一种制备如通式(Pc-L’-D)所示的抗体药物偶联物的方法，其包括以下步骤：

上述反应中，Pc’与式(L’-D)所示的化合物进行偶联反应，得到通式(Pc-L’-D)所示的化合物；其中：

Pc为如前所述的抗PSMA抗体或其抗原结合片段；Pc’为经还原后的Pc，

n如通式(Pc-L-Y-D)中所定义。

本公开进一步提供一种制备如PM-9-A所示的抗体药物偶联物的方法，其包括以下步骤：

PM’与式9-A所示的化合物进行偶联反应，得到通式(PM-9-A)所示的化合物；其中：

n为1至8，优选3-8，n是小数或整数；

PM为抗PSMA抗体，其包含序列如SEQ ID NO：9所示的重链和序列如SEQ ID NO：10所示的轻链；

PM’为经PM还原后得到。

在一些实施方案中，n代表抗体-药物偶联物的载药量，也可称为DAR值，其可用常规方法如UV/可见光光谱法、质谱、ELISA试验和HPLC测定；在一些是方案中，n为0-10，优选1-10，更优选1-8，或2-8，或2-7，或2-4，或3-8，或3-7，或3-6，或4-7，或4-6，或4-5的平均值；在一些实施方案中，n为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10的平均值。

另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含根据本公开所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。在一些实施方案中，所述单位剂量的药物组合物中含有0.1mg-3000mg或1mg-1000mg如前所述的抗PSMA抗体或如前所述的抗体药物偶联物。

另一方面，本公开提供了根据本公开所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或包含其的药物组合物作为药物的用途。

另一方面，本公开提供了根据本公开所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或包含其的药物组合物在制备用于治疗PSMA介导的疾病或病症的药物中的用途，其中所述PSMA介导的疾病或病症优选为PSMA高表达癌症，中表达癌症或低表达癌症。

另一方面，本公开提供根据本公开所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或包含其的药物组合物在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途，其中所述癌症优选头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、库肯勃氏瘤、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、尿路上皮癌和梅克尔细胞癌，优选前列腺癌；更优选的，所述淋巴瘤选自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤，所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌，所述白血病选自：慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病。

另一方面，本公开进一步涉及一种用于治疗和/或预防肿瘤的方法，该方法包括向需要其的受试者施用治疗有效剂量的根据本公开所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的盐或包含其的药物组合物；优选其中所述的肿瘤为与PSMA高表达相关的癌症，中表达癌症或低表达癌症。

另一方面，本公开进一步涉及一种用于治疗或预防肿瘤或癌症的方法，该方法包括向需要其的受试者施用治疗有效剂量的根据本公开所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或包含其的药物组合物；其中所述肿瘤和癌症优选头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、库肯勃氏瘤、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、尿路上皮癌和梅克尔细胞癌；优选前列腺癌；更优选的，所述淋巴瘤选自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤，所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌，所述白血病选自：慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病。

另一方面，本公开进一步提供前述的抗PSMA抗体或其抗体-药物偶联物作为药物，优选作为治疗癌症或肿瘤的药物，更优选作为治疗PSMA介导的癌症的药物。

可将活性化合物(例如根据本公开所述的配体-药物偶联物、或其药学上可接受的盐)制成适合于通过任何适当途径给药的形式，活性化合物优选是以单位剂量的方式，或者是以受试者能够以单剂进行自我给药的方式。本公开所述的活性化合物或组合物的单位剂量的方式可以是片剂、胶囊、扁囊剂、瓶装药水、药粉、颗粒剂、锭剂、栓剂、再生药粉或液体制剂。

本公开治疗方法中所用活性化合物或组合物的施用剂量通常将随疾病的严重性、受试者的体重和活性化合物的相对功效而改变。作为一般性指导，合适的单位剂量可以是0.1mg～1000mg。

本公开的药物组合物除活性化合物外，可含有一种或多种辅料，所述辅料选自以下成分：填充剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂或赋形剂等。根据给药方法的不同，组合物可含有0.1至99重量％的活性化合物。

本公开提供的PSMA抗体及抗体药物偶联物具有与细胞表面抗原良好的亲和力，良好的细胞内吞效率和很强的肿瘤抑制效率，并且具有更宽的药物应用窗口，更高的抑瘤效果和治疗活性，更好的安全性、药物代谢动力学特性和成药性(如稳定性)，更适于临床的药物应用。

附图说明

图1A：本公开的ADC或抗体与细胞MDAPCa的体外结合能力。

图1B：本公开的ADC或抗体与细胞LNCaP的体外结合能力。

图1C：本公开的ADC或抗体与细胞22Rv1的体外结合能力。

图1D：本公开的ADC或抗体与细胞PC-3的体外结合能力。

图1E：本公开的ADC或抗体与细胞DU 145的体外结合能力。

图2A：抗体PM在LNCaP细胞中的体外内吞实验；2K细胞，10％U-L IgG FBS。

图2B：抗体PM在22Rv1细胞中的体外内吞实验；2K细胞，10％U-L IgG FBS。

图3A：本公开的不同ADC对LNCaP细胞杀伤作用，用2K细胞，4.5％FBS。

图3B：本公开中毒素(化合物2-B)对LNCaP细胞杀伤作用，用2K细胞，4.5％FBS。

图3C：本公开的不同ADC对22Rv1细胞杀伤作用，用4K细胞，4.5％FBS。

图3D：本公开中毒素(化合物2-B)对22Rv1细胞杀伤作用，用4K细胞，4.5％FBS。

图3E：本公开的不同ADC对PC-3细胞杀伤作用，用4K细胞，4.5％FBS。

图3F：本公开中毒素(化合物2-B)对PC-3细胞杀伤作用，用2K细胞，4.5％FBS。

图4A：本公开不同剂量的ADC对人前列腺癌细胞22Rv1裸小鼠移植瘤的抑制活性。

图4B：本公开不同剂量的ADC对人前列腺癌细胞22Rv1裸小鼠移植瘤的抑制活性测试中小鼠的体重变化。

图5A：本公开不同剂量的ADC对人前列腺癌细胞22Rv1裸小鼠移植瘤的抑制活性。

图5B：本公开不同剂量的ADC对人前列腺癌细胞22Rv1裸小鼠移植瘤的抑制活性测试中小鼠的体重变化。

图6A：本公开不同剂量的ADC对人前列腺癌细胞LNCap在SCID Beighe小鼠上的移植瘤的抑制活性。

图6B：本公开不同剂量的ADC对人前列腺癌细胞LNCap在SCID Beighe小鼠上的移植瘤的抑制活性测试中小鼠的体重变化。

图7：本公开ADC-2的药代稳定性，其中ADC的浓度为100μg/ml。

图8：本公开ADC-5的血浆稳定性，其中ADC的浓度为100μg/ml。

图9：给药ADC对荷瘤裸鼠22Rv1移植瘤的疗效。

具体实施方式

术语

除非另有限定，本文所用的所有技术和科学术语均与本公开所属领域普通技术人员的通常理解一致。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本公开，但本文描述了优选的方法和材料。描述和要求保护本公开时，依据以下定义使用下列术语。

当本公开中使用商品名时，旨在包括该商品名产品的制剂、该商品名产品的药物和活性药物部分。

除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。

术语“药物”或“毒素”是指细胞毒性药物，能在肿瘤细胞内具有较强破坏其正常生长的化学分子。细胞毒性药物原则上在足够高的浓度下都可以杀死细胞，但是由于缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会导致正常细胞的凋亡，导致严重的副作用。该术语包括如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素)，化疗药物，抗生素和核溶酶。

术语“接头单元”、“接头”、“连接单元”或“连接片段”是指一端与配体(本公开中为抗体)连接而另一端与药物相连的化学结构片段或键，也可以连接其他接头后再与配体或药物相连。

接头可以包含一种或多种接头元件。示例性的接头元件包括6-马来酰亚氨基己酰基(“MC”)、马来酰亚氨基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯(“SMCC”，在本文中也称作“MCC”)和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。接头可以包含以下的元件中的一个或多个、或其组合：延伸物、间隔物和氨基酸单元，可以通过本领域已知方法合成，诸如US2005-0238649A1中所记载的。接头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。

接头元件包括但不限于：

MC＝6-马来酰亚氨基己酰基，结构如下：

Val-Cit或“vc”＝缬氨酸-瓜氨酸(蛋白酶可切割接头中的示例二肽)；

瓜氨酸＝2-氨基-5-脲基戊酸；

PAB＝对氨基苄氧羰基(“自我牺牲”接头元件的示例)；

Me-Val-Cit＝N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(其中接头肽键已经修饰以防止其受到组织蛋白酶B的切割)；

MC(PEG)6-OH＝马来酰亚氨基己酰基-聚乙二醇(可附着于抗体半胱氨酸)；

SPP＝N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯；

SPDP＝N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯；

SMCC＝琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯；

IT＝亚氨基硫烷。

术语“抗体药物偶联物”指抗体通过连接单元与具有生物活性的药物相连。在本公开中“抗体药物偶联物”(antibody drug conjugate，ADC)，指将单克隆抗体或者抗体片段通过连接单元与具有生物活性的毒性药物相连。抗体可直接地或经接头地偶联至药物。n是每个抗体的平均药物模块数，可以是整数或小数，其范围可以是：例如每个抗体约0到约20个药物模块，在某些实施方案中是每个抗体1个到约10个药物模块，在某些实施方案中是每个抗体1个到约8个药物模块，如2、3、4、5、6、7、8个药物模块。本公开的抗体-药物偶联物的混合物的组合物，其中每个抗体的平均药物载荷是约1个至约10个，包括但不限于约3个至约7个，约3个至约6个，约3个至约5个，约1个至约9个，约7个或约4个。

本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

术语“抗体”指免疫球蛋白，完整抗体是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。

全长抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的框架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。

术语“完全人源抗体”、“完全人抗体”、“人抗体”或“全人抗体”，也称“全人源单克隆抗体”，其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。全人源抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体显示技术(phagedisplay)、转基因小鼠抗体制备技术(transgenic mouse)和单个B细胞抗体制备技术等。

术语“抗原结合片段”是指抗体的保持特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。“抗原结合片段”中包含的结合片段选自Fab、Fab′、F(ab′)2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)和包含CDR的肽的抗原结合片段，示例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段；(v)单结构域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

通常，Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(例如，切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链N端侧的部分和L链通过二硫键结合在一起。

通常，F(ab′)2是通过用酶胃蛋白酶消化IgG铰链区中二硫键的下方部分而获得的，分子量约为100,000并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。

通常，Fab′是通过切割上述F(ab′)2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50,000并具有抗原结合活性的抗体片段。

此外，可以通过将编码Fab′片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab′来生产所述Fab′。

术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或VH)和抗体轻链可变结构域(或VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-VL-接头-VH-COOH或NH₂-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-4个重复的变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用于本公开的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。通常，每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDRI、LCDR2、LCDR3)。可以使用各种公知方案中的任何一种来确定CDR的氨基酸序列边界，包括“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD)、“Chothia”编号规则(参见Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(Lefranc M.P.，Immunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)等。例如，对于经典格式，遵循Kabat规则，所述重链可变域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia规则，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过组合Kabat和Chothia两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)构成。遵循IMGT规则，VH中的CDR氨基酸残基编号大致为26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号大致为27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。遵循IMGT规则，抗体的CDR区可以使用程序IMGT/DomainGapAlign确定。除非特别说明，本公开中所述6个CDR均按照Kabat编号规则获得。((Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242))。按照Kabat规则，所述重链可变域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。本领域其他的编号规则Chothia、IMGT等。

术语“抗体框架区”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。

术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上被免疫球蛋白或抗体结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，GE.Morris，Ed.(1996)。

术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体或抗原结合片段对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体或抗原结合片段以大约小于10^-7M，例如大约小于10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(KD)结合。

术语“KD”是指抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本公开的抗体或抗原结合片段以小于大约10^-7M，例如小于大约10^-8M或10^-9M的解离平衡常数(KD)结合PSMA或其表位，例如，在本公开中抗体与细胞表面抗原的亲和力采用FACS法测定KD值。

术语“核酸分子”是指DNA分子或RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。

氨基酸序列“序列同一性”指比对氨基酸序列过程中，在必要时引入间隙，以达成最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分，第一序列中与第二序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为测定氨基酸序列同一性百分比的目的，比对可以通过属于本领域技术的范围内的多种方式来实现，例如使用公开可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。

术语“表达载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。

术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括微生物(如细菌)、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。

本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或GSepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用PH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。

术语“肽”是指由2个或2个以上氨基酸分子通过肽键相互连接而成的分子，是蛋白质的结构与功能片段。

术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12个)个碳原子的烷基，更优选含有1至10个碳原子的烷基，最优选含有1至6个碳原子(包含1个、2个、3个、4个、5个或6个碳原子)的烷基。非限制性示例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、2，2-二甲基戊基、3，3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2，3-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、2，2-二甲基己基、3，3-二甲基己基、4，4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2，2-二乙基戊基、正癸基、3，3-二乙基己基、2，2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的低级烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基。

术语“杂烷基”指含有一个或多个选自N、O或S的杂原子的烷基，其中烷基如上所定义。

术语“亚烷基”指饱和的直链或支链脂肪族烃基，其具有2个从母体烷的相同碳原子或两个不同的碳原子上除去两个氢原子所衍生的残基，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12个)碳原子，更优选含有1至6个碳原子(包含1个、2个、3个、4个、5个或6个碳原子)的亚烷基。亚烷基的非限制性示例包括但不限于亚甲基(-CH₂-)、1，1-亚乙基(-CH(CH₃)-)、1，2-亚乙基(-CH₂CH₂)-、1，1-亚丙基(-CH(CH₂CH₃)-)、1，2-亚丙基(-CH₂CH(CH₃)-)、1，3-亚丙基(-CH₂CH₂CH₂-)、1，4-亚丁基(-CH₂CH₂CH₂CH₂-)和1，5-亚丁基(-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-)等。亚烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基中的一个或多个取代基所取代。

术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的环烷基)，其中烷基或环烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性示例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基和杂环烷硫基。

术语“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包含3至20个碳原子，优选包含3至12个碳原子，优选包含3至8个碳原子，更优选包含3至6个碳原子。单环环烷基的非限制性示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。

所述环烷基环包括如上所述的环烷基(包括单环、螺环、稠环和桥环)稠合于芳基、杂芳基或杂环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为环烷基，非限制性实例包括茚满基、四氢萘基和苯并环庚烷基等；优选苯基并环戊基和四氢萘基。

环烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自氢原子、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代。

术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包含3至20个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)_P(其中p是整数0至2)的杂原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分，其余环原子为碳。优选包含3至12个环原子，其中1～4个是杂原子；更优选包含3至8个环原子，其中1-3是杂原子；更优选包含3至6个环原子，其中1-3个是杂原子；最优选包含5或6个环原子，其中1-3个是杂原子。单环杂环基的非限制性示例包括吡咯烷基、四氢吡喃基、1，2.3.6-四氢吡啶基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基和高哌嗪基等。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基。

所述杂环基环包括如上所述的杂环基(包括单环、螺杂环、稠杂环和桥杂环)稠合于芳基、杂芳基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂环基，其非限制性示例包括：

杂环基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自氢原子、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代。

术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的6至14元全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，优选为6至10元，例如苯基和萘基。所述芳基环包括如上所述的芳基环稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环，其非限制性示例包括：

芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自氢原子、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代。

术语“杂芳基”指包含1至4个杂原子、5至14个环原子的杂芳族体系，其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基优选为5至10元，更优选为5元或6元，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基等。所述杂芳基环包括如上述的杂芳基稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，其非限制性示例包括：

杂芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自氢原子、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代。

术语“卤代烷基”指烷基上的氢被一个或多个卤素取代，其中烷基如上所定义。

术语“氘代烷基”指烷基上的氢被一个或多个氘原子取代，其中烷基如上所定义。

术语“羟烷基”指烷基上的氢被一个或多个羟基取代，其中烷基如上所定义。

术语“羟基”指-OH基团。

术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。

术语“氨基”指-NH₂。

术语“硝基”指-NO₂。

术语“氰基”指-CN。

“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。

“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1个、2个或3个氢原子彼此独立地被取代基取代。取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯)键的碳原子结合时可能是不稳定的。

术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

术语“药学上可接受的盐”或“可药用盐”是指本公开抗体药物偶联物的盐，这类盐用于受试者体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性，本公开抗体药物偶联物至少含有一个氨基，因此可以与酸形成盐，可药用盐的非限制性示例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、草酸盐、硝酸盐、梨酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。

“载药量”或“平均药物载荷”也称药物抗体比例(Drug-to-Antibody Ratio，DAR)，即ADC中每个抗体所偶联的药物的平均数量。其可在例如每个抗体偶联约1至约10个药物的范围内，并且在某些实施例中，在每个抗体偶联约1至约8个药物的范围内，优选自2-8，2-7，2-6，2-5，2-4，3-4，3-5，5-6，5-7，5-8和6-8的范围。示例性的，载药量可以为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10的平均值。本披露的ADC通式包括与前述一定载药量范围内的抗体药物偶联物的集合。在本公开的实施方案中，载药量表示为n，也可称为DAR值，示例性的为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的均值。可用常规方法如UV/可见光光谱法、质谱、ELISA试验和HPLC测定载药量。

可以用以下非限制性方法控制配体药物偶联物的载量，包括：

(1)控制连接试剂和单抗的摩尔比，

(2)控制反应时间和温度，

(3)选择不同的反应试剂。

常规的药物组合物的制备见中国药典。

术语“载体”用于本公开的药物，是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。药物载体释放和靶向系统能够减少药物降解及损失，降低副作用，提高生物利用度。如可作为载体的高分子表面活性剂由于其独特的两亲性结构，可以进行自组装，形成各种形式的聚集体，优选的示例如胶束、微乳液、凝胶、液晶、囊泡等。这些聚集体具有包载药物分子的能力，同时又对膜有良好的渗透性，可以作为优良的药物载体。

术语“赋形剂”是在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。

术语“稀释剂”又称填充剂，其主要用途是增加片剂的重量和体积。稀释剂的加入不仅保证一定的体积大小，而且减少主要成分的剂量偏差，改善药物的压缩成型性等。当片剂的药物含有油性组分时，需加入吸收剂吸收油性物，使保持“干燥”状态，以利于制成片剂。如淀粉、乳糖、钙的无机盐、微晶纤维素等。

药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。可在使用的可接受的溶媒和溶剂中有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。无菌注射制剂可以是其中活性成分溶于油相的无菌注射水包油微乳。例如将活性成分溶于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后将油溶液加入水和甘油的混合物中处理形成微乳。可通过局部大量注射，将注射液或微乳注入受试者的血流中。或者，最好按可保持本公开化合物恒定循环浓度的方式给予溶液和微乳。为保持这种恒定浓度，可使用连续静脉内递药装置。这种装置的示例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型静脉注射泵。

药物组合物可以是用于肌内和皮下给药的无菌注射水或油混悬液的形式。可按已知技术，用上述那些适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制该混悬液。无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中制备的无菌注射溶液或混悬液，例如1，3-丁二醇中制备的溶液。此外，可方便地用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用包括合成甘油单或二酯在内的任何调和固定油。此外，脂肪酸例如油酸也可以制备注射剂。

合成方法

为了完成合成目的，采用如下的合成技术方案：

通式(PM-9-A)所示的化合物的制备方法，其包括如下步骤：

PM还原后得到PM’，PM’与通式(9-A)偶联反应，得到通式(PM-9-A)所示的化合物；还原剂优选TCEP，特别地，优选还原抗体上的二硫键；

其中：

PM为抗PSMA抗体或其抗原结合片段；

n为1至10，n是小数或整数。

在以上说明书中提出了本公开一种或多种实施方案的细节。虽然可使用与本文所述类似或相同的任何方法和材料来实施或测试本公开，但是以下描述优选的方法和材料。通过说明书和权利要求书，本公开的其他特点、目的和优点将是显而易见的。在说明书和权利要求书中，除非上下文中有清楚的另外指明，单数形式包括复数指代物的情况。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本公开所属领域普通技术人员所理解的一般含义。说明书中引用的所有专利和出版物都通过引用纳入。提出以下实施例是为了更全面地说明本公开的优选实施方案。这些实施例不应以任何方式理解为限制本公开的范围，本公开的范围由权利要求书限定。

本公开实施例或测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。参见Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室；当代分子生物学方法，Ausubel等著，Greene出版协会，Wiley Interscience，NY。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1.抗体的制备

(一)PSMA抗体制备

1.1抗体序列

本公开的抗体参照WO2003034903A2制备，其中AB-PG1-XG1-006可变区的氨基酸序列如下：

AB-PG1-XG1-006重链可变区：

AB-PG1-XG1-006轻链可变区：

注：下划线部分为依照Kabat编号规则确定的CDR区。

表1 AB-PG1-XG1-006抗体的CDR区

抗体	AB-PG1-XG1-006
		重链CDR1	RYGMH(SEQ ID NO：3)
重链CDR2	VIWYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：4)
		重链CDR3	GGDFLYYYYYGMDV(SEQ ID NO：5)
轻链CDR1	RASQGISNYLA(SEQ ID NO：6)
		轻链CDR2	EASTLQS(SEQ ID NO：7)
轻链CDR3	QNYNSAPFT(SEQ ID NO：8)

1.2全长抗体的构建

根据以上序列，设计引物PCR搭建得到VH/VK基因片段，获得可变区。

抗体可变区再与恒定区基因(CH1-Fc/CL)片段进行同源重组，构建完整抗体VH-CH1-Fc/VK-CL。

构建的完整全长抗体PM序列如下：

重链(IgG1)氨基酸序列：

轻链(Kappa)氨基酸序列：

1.3全长抗体的表达与纯化

将分别表达抗体轻、重链的质粒例转染HEK293E细胞，6天后收集表达上清，高速离心去除杂质，用Protein A柱进行纯化。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用pH3.0-pH3.5的酸性洗脱液洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。洗脱样品适当浓缩后，利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，以去除聚体，收集单体峰，分装备用。

(二)对照抗体Lmab制备

对照抗体labetuzumab(简称Lmab)参照WHO Drug Information Vol.30，No.1，2016制备，其中重链和轻链氨基酸序列如下：

＞抗体重链序列Lmab-HC

＞抗体轻链序列Lmab-LC

实施例2.化合物的制备

本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或质谱(MS)来确定的。NMR的测定是用BrukerAVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDCl₃)、氘代甲醇(CD₃OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)，化学位移是以10^-6(ppm)作为单位给出。

MS的测定用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪(生产商：Thermo，型号：Finnigan LCQadvantage MAX)。

UPLC的测定用Waters Acquity UPLC SQD液质联用仪。

HPLC的测定使用安捷伦1200DAD高压液相色谱仪(Sunfire C18 150×4.6mm色谱柱)和Waters 2695-2996高压液相色谱仪(Gimini C18 150×4.6mm色谱柱)。

UV-HPLC的测定使用Thermo nanodrop2000紫外分光光度计。

增殖抑制率及IC₅₀值的测定用PHERA starFS酶标仪(德国BMG公司)。

薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm硅胶板。

柱层析一般使用烟台黄海200～300目硅胶为载体。

本公开的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自ABCR GmbH&Co.KG，Acros Organnics，Aldrich Chemical Company，韶远化学科技(AccelaChemBio Inc)、达瑞化学品等公司。

实施例中如无特殊说明，反应均在氩气氛或氮气氛下进行。

氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气或氮气气球。

氢气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氢气气球。

加压氢化反应使用Parr 3916EKX型氢化仪和清蓝QL-500型氢气发生器或HC2-SS型氢化仪。

氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。

微波反应使用CEM Discover-S 908860型微波反应器。

实施例中如无特殊说明，反应中的溶液是指水溶液。

实施例中如无特殊说明，反应的温度为室温。

室温为最适宜的反应温度，温度范围是20℃～30℃。

实施例中pH＝6.5的PBS缓冲液的配制：取KH₂PO₄8.5g，K₂HPO₄.3H₂O 8.56g，NaCl5.85g，EDTA 1.5g置于瓶中，定容至2L，超声波使其全部溶解，摇匀即得。

纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂的体系包括：A：二氯甲烷和异丙醇体系，B：二氯甲烷和甲醇体系，C：石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和酸性或碱性试剂等进行调节。

本公开部分化合物是通过Q-TOF LC/MS来表征的。Q-TOF LC/MS使用安捷伦6530精确质量数四级杆-飞行时间质谱仪和安捷伦1290-Infinity超高效液相色谱仪(安捷伦Poroshell 300SB-C85μm，2.1×75mm色谱柱)。

本公开抗体药物偶联物的Y-D药物部分参见PCT/CN2019/107873，相关的化合物合成及测试引用至本专利。其中的非限制性实施例合成引用如下：

实施例2-1

N-((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)-1-羟基环丙烷-1-甲酰胺1

向依喜替康甲磺酸盐1b(2.0mg，3.76μmol，采用专利申请“EP0737686A1”公开的方法制备而得)中添加1mL N，N-二甲基甲酰胺，冰水浴冷却至0-5℃，滴加一滴三乙胺，搅拌至反应液变澄清。向反应液中依次加入1-羟基环丙基甲酸1a(1.4mg，3.7μmol，采用公知的方法“Tetrahedron Letters，25(12)，1269-72；1984”制备而得)和4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(3.8mg，13.7μmol)，加毕，在0-5℃搅拌反应2小时。向反应液中加入5mL水淬灭反应，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取反应液，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(5mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液减压浓缩，用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物1(1.6mg，产率：82.1％)。

MS m/z(ESI)：520.2[M+1]

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ7.90-7.84(m，1H)，7.80-7.68(m，1H)，5.80-5.70(m，1H)，5.62-5.54(m，2H)，5.44-5.32(m，2H)，5.28-5.10(m，2H)，3.40-3.15(m，3H)，2.44(s，3H)，2.23(t，1H)，2.06-1.75(m，2H)，1.68-1.56(m，1H)，1.22-1.18(m，2H)，1.04-0.98(m，2H)，0.89(t，3H).

实施例2-2

(S)-2-环丙基-N-((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)-2-羟基乙酰胺2-A(R)-2-环丙基-N-((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)-2-羟基乙酰胺2-B

向1b(4mg，7.53μmol)中加入2mL乙醇和0.4mL N，N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴冷却至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基吗啉，搅拌至反应液变澄清。向反应液中依次加入2-环丙基-2-羟基乙酸2a(2.3mg，19.8μmol，采用专利申请“WO2013106717”公开的方法制备而得)、1-羟基苯并三唑(3mg，22.4μmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(4.3mg，22.4μmol)，加毕，在0-5℃搅拌反应1小时。撤去冰水浴，加热至30℃搅拌2小时。反应液减压浓缩，所得到的粗品化合物2用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridgePrep C18 OBD 5μm 19*250mm；流动相：A-水(10mmol NH₄OAc)，B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/分钟)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物(2-A：1.5mg，2-B：1.5mg)。

MS m/z(ESI)：534.0[M+1]。

单一构型化合物2-B(较短保留时间)

UPLC分析：保留时间1.06分钟，纯度：88％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH₄OAc)，B-乙腈)。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ8.37(d，1H)，7.76(d，1H)，7.30(s，1H)，6.51(s，1H)，5.58-5.56(m，1H)，5.48(d，1H)，5.41(s，2H)，5.32-5.29(m，2H)，3.60(t，1H)，3.19-3.13(m，1H)，2.38(s，3H)，2.20-2.14(m，1H)，1.98(q，2H)，1.87-1.83(m，1H)，1.50-1.40(m，1H)，1.34-1.28(m，1H)，0.86(t，3H)，0.50-0.39(m，4H)。

单一构型化合物2-A(较长保留时间)

UPLC分析：保留时间1.10分钟，纯度：86％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH₄OAc)，B-乙腈)。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ8.35(d，1H)，7.78(d，1H)，7.31(s，1H)，6.52(s，1H)，5.58-5.53(m，1H)，5.42(s，2H)，5.37(d，1H)，5.32(t，1H)，3.62(t，1H)，3.20-3.15(m，2H)，2.40(s，3H)，2.25-2.16(m，1H)，1.98(q，2H)，1.87-1.82(m，1H)，1.50-1.40(m，1H)，1.21-1.14(m，1H)，0.87(t，3H)，0.47-0.35(m，4H)。

实施例2-3

(S)-N-((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)-3，3，3-三氟-2-羟基丙酰胺3-A

(R)-N-((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)-3，3，3-三氟-2-羟基丙酰胺3-B

向1b(5.0mg，9.41μmol)中添加2mL乙醇和0.4mL N，N-二甲基甲酰胺，冰水浴冷却至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基吗啡啉，搅拌至反应液变澄清。向反应液中依次加入3，3，3-三氟-2-羟基丙酸3a(4.1mg，28.4μmol，供应商Alfa)、1-羟基苯并三唑(3.8mg，28.1μmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(5.4mg，28.2μmol)，加毕，在0-5℃搅拌反应10分钟。撤去冰水浴，加热至30℃搅拌8小时。反应液减压浓缩，所得到的粗品化合物3用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流动相：A-水(10mmol NH₄OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/分钟)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物(1.5mg，1.5mg)。

MS m/z(ESI)：561.9[M+1]。

单一构型化合物(较短保留时间)

UPLC分析：保留时间1.11分钟，纯度：88％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH₄OAc)，B-乙腈)。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ8.94(d，1H)，7.80(d，1H)，7.32(s，1H)，7.20(d，1H)，6.53(s，1H)，5.61-5.55(m，1H)，5.45-5.23(m，3H)，5.15-5.06(m，1H)，4.66-4.57(m，1H)，3.18-3.12(m，1H)，2.40(s，3H)，2.26-2.20(m，1H)，2.16-2.08(m，1H)，2.02-1.94(m，1H)，1.89-1.82(m，1H)，1.50-1.40(m，1H)，0.87(t，3H)。

单一构型化合物(较长保留时间)

UPLC分析：保留时间1.19分钟，纯度：90％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH₄OAc)，B-乙腈)。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ8.97(d，1H)，7.80(d，1H)，7.31(s，1H)，7.16(d，1H)，6.53(s，1H)，5.63-5.55(m，1H)，5.45-5.20(m，3H)，5.16-5.07(m，1H)，4.66-4.57(m，1H)，3.18-3.12(m，1H)，2.40(s，3H)，2.22-2.14(m，1H)，2.04-1.95(m，2H)，1.89-1.82(m，1H)，1.50-1.40(m，1H)，0.87(t，3H)。

实施例2-4

N-((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)-1-羟基环戊烷-1-甲酰胺4

向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加1mL N，N-二甲基甲酰胺，冰水浴冷却至0-5℃，滴加一滴三乙胺，搅拌至反应液变澄清。向反应液中依次加入1-羟基-环戊烷甲酸4a(2.2mg，16.9μmol，采用专利申请“WO2013106717”公开的方法制备而得)和4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(4.7mg，16.9μmol)，加毕，在0-5℃搅拌反应1小时。向反应液中加入5mL水淬灭反应，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取反应液，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(5mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液减压浓缩，用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物4(2.5mg，产率：80.9％)。

MS m/z(ESI)：548.0[M+1]。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ7.73-7.62(m，2H)，5.75-5.62(m，1H)，5.46-5.32(m，2H)，5.26-5.10(m，1H)，3.30-3.10(m，1H)，2.43(s，3H)，2.28-2.20(m，2H)，2.08-1.84(m，8H)，1.69-1.58(m，2H)，1.04-1.00(m，2H)，0.89(t，3H)。

实施例2-5

N-((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)-1-(羟甲基)环丙烷-1-甲酰胺5

向1b(2.0mg，3.76μmol)中添加1mL N，N-二甲基甲酰胺，冰水浴冷却至0-5℃，滴加一滴三乙胺，搅拌至反应液变澄清。向反应液中依次加入1-(羟甲基)-环戊烷甲酸5a(0.87mg，7.5μmol，采用专利申请“WO201396771”公开的方法制备而得)和4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(2mg，7.24μmol)，加毕，在0-5℃搅拌反应2小时。向反应液中加入5mL水淬灭反应，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取反应液，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(5mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液减压浓缩，用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物5(1.0mg，产率：50％)。

MS m/z(ESI)：533.9[M+1]。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ8.07(s，1H)，7.23-7.18(m，2H)，6.71-6.64(m，1H)，6.55-6.51(m，1H)，5.36-5.27(m，2H)，4.67-4.61(m，2H)，3.53-3.48(m，1H)，3.30-3.22(m，2H)，3.18-3.13(m，1H)，2.71-2.61(m，2H)，2.35-2.28(m，1H)，2.04-1.91(m，4H)，1.53-1.40(m，3H)，0.91-0.75(m，4H)。

实施例2-6

N-((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)-1-(羟基甲基)环丁烷-1-甲酰胺6

向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加1mL N，N-二甲基甲酰胺，冰水浴冷却至0-5℃，滴加一滴三乙胺，搅拌至反应液变澄清。向反应液中依次加入1-(羟基甲基)环丁烷-1-甲酸6a(2.2mg，16.9μmol；采用文献“Journal of the American Chemical Society，2014，vol.136，#22，p.8138-8142”公开的方法制备而得)和4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(4.7mg，169μmol)，加毕，在0-5℃搅拌反应1小时。向反应液中加入5mL水淬灭反应，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取反应液，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(5mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液减压浓缩，用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物6(2.1mg，产率：67.9％)。

MS m/z(ESI)：548.0[M+1]。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ7.85-7.62(m，1H)，6.88(br，1H)，5.87-5.48(m，2H)，5.47-5.33(m，1H)，5.31-5.06(m，1H)，4.25-3.91(m，2H)，3.25(br，1H)，2.60-2.32(m，3H)，2.23(t，1H)，2.15-1.95(m，3H)，1.70-1.56(m，2H)，1.41-1.17(m，9H)，1.03(s，1H)，0.95-0.80(m，2H)。

实施例2-7

N-((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)-1-羟基环丁烷-1-甲酰胺7

向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加2mL乙醇和0.4mL N，N-二甲基甲酰胺，冰水浴冷却至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基吗啡啉，搅拌至反应液变澄清。向反应液中依次加入1-羟基环丁烷甲酸7a(2.0mg，17.22μmol，供应商药石)，1-羟基苯并三唑(2.3mg，17.0μmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(3.2mg，16.7μmol)，加毕，在0-5℃搅拌反应10分钟。撤去冰水浴，常温搅拌2小时。反应液减压浓缩，用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物7(2.5mg，产率：83.1％)。

MS m/z(ESI)：534.0[M+1]。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ8.28(d，1H)，7.75(d，1H)，7.29(s，1H)，6.51(s，1H)，6.12(s，1H)，5.59-5.51(m，1H)，5.41(s，2H)，5.20-5.01(m，2H)，3.27-3.17(m，1H)，3.15-3.05(m，1H)，2.71-2.63(m，1H)，2.37(s，3H)，2.12-2.05(m，1H)，2.03-1.94(m，2H)，1.92-1.78(m，4H)，1.50-1.42(m，1H)，0.90-0.83(m，4H)。

实施例2-8

1-(((S)-7-苄基-20-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3，6，9，12，15-五氧代-2，5，8，11，14-五氮杂二十烷基)氧基)-N-((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)环丙烷-1-甲酰胺8

第一步

1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)甲氧基)环丙烷-1-羧酸苄酯8c

将1-羟基环丙烷-1-羧酸苄酯8a(104mg，0.54mmol；采用专利申请“US2005/20645”公开的方法制备而得)和2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)甲基乙酸酯8b(100mg，0.27mmol；采用专利申请“CN105829346A”公开的方法制备而得)加入反应瓶，加入5mL四氢呋喃，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入叔丁醇钾(61mg，0.54mmol)，撤去冰浴，升至室温搅拌10分钟，加入20mL冰水，用乙酸乙酯(5mL×2)和氯仿(5mL×5)萃取，合并有机相并浓缩。所得残余物溶于3mL 1，4-二氧六环中，加入0.6mL水，加入碳酸氢钠(27mg，0.32mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(70mg，0.27mmol)，室温搅拌1小时。加入20mL水，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物8c(100mg，产率：73.6％)。

MS m/z(ESI)：501.0[M+1]。

第二步

1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)甲氧基)环丙烷-1-羧酸8d

将8c(50mg，0.10mmol)溶于3mL四氢呋喃和乙酸乙酯(V∶V＝2∶1)混合溶剂中，加入钯碳(25mg，含量10％)，氢气置换三次，室温搅拌反应1小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用四氢呋喃淋洗，滤液浓缩，得到标题产物8d(41mg，产率：100％)。

MS m/z(ESI)：411.0[M+1]。

第三步

(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-(((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)氨基羰基)环丙氧基)甲基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸酯8e

将1b(7mg，0.013mmol)加入反应瓶，加入1mL N，N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入8d(7mg，0.017mmol)的0.5mL N，N-二甲基甲酰胺溶液，加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(7mg，0.026mmol)，冰浴搅拌反应35分钟。加入10mL水，用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物8e(8.5mg，产率78.0％)。

MS m/z(ESI)：828.0[M+1]。

第四步

1-((2-氨基乙酰氨基)甲氧基)-N-((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)环丙烷-1-甲酰胺8f

将8e(4mg，4.84μmol)溶于0.2mL二氯甲烷中，加入0.1mL二乙胺，室温搅拌2小时。反应液减压浓缩，加入2mL甲苯减压浓缩，重复两次，加入3mL正己烷打浆，倾倒出上层正己烷，重复三次，减压浓缩得到粗品标题产物8f(2.9mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI)：606.0[M+1]。

第五步

将粗品8f(2.9mg，4.84μmol)溶于0.5mL N，N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入(S)-2(-2-(-2-(6-(2，5-二氧代-1H-吡咯-1-基)已酰氨基)乙酰氨基)乙酰氨基)-3-苯基丙酸8g(2.7mg，5.80μmol，采用专利申请“EP2907824”公开的方法制备而得)的0.3mL N，N-二甲基甲酰胺溶液，加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(2.7mg，9.67μmol)，冰浴搅拌反应30分钟，撤去冰浴，升至室温搅拌15分钟。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流动相：A-水(10mmol NH₄OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩得到标题产物8(2mg，产率：39.0％)。

MS m/z(ESI)：1060.0[M+1]。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ9.01(d，1H)，8.77(t，1H)，8.21(t，1H)，8.08-7.92(m，2H)，7.73(d，1H)，7.28(s，1H)，7.24-7.07(m，4H)，6.98(s，1H)，6.50(s，1H)，5.61(q，1H)，5.40(s，2H)，5.32(t，1H)，5.12(q，2H)，4.62(t，1H)，4.52(t，1H)，4.40-4.32(m，1H)，3.73-3.47(m，8H)，3.16-3.04(m，2H)，2.89(dd，1H)，2.69-2.55(m，2H)，2.37-2.23(m，4H)，2.12-1.93(m，4H)，1.90-1.74(m，2H)，1.52-1.38(m，4H)，1.33-1.11(m，5H)，0.91-0.81(m，4H)。

实施例2-9

N-((2R，10S)-10-苄基-2-环丙基-1-(((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)氨基)-1，6，9，12，15-五氧代-3-氧杂-5，8，11，14-四氮杂十六-16-基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺9-A

N-((2S，10S)-10-苄基-2-环丙基-1-(((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)氨基)-1，6，9，12，15-五氧代-3-氧杂-5，8，11，14-四氮杂十六-16-基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺9-B

第一步

2-环丙基-2-羟基乙酸苄酯9a

将2a(1.3g，11.2mmol；采用专利申请“WO2013/106717”公开的方法制备而得)溶于50mL乙腈中，依次加入碳酸钾(6.18g，44.8mmol)，溴化苄(1.33mL，11.2mmol)和四丁基碘化铵(413mg，1.1mmol)。将反应液室温搅拌48小时，通过硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯(10ml)淋洗，合并滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到标题产物9a(2g，产率：86.9％)。

第二步

10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3，6-二氧代-2，9-二氧杂-4，7-二氮杂十一-11-酸苄酯9b

将9a(120.9mg，0.586mmol)和8b(180mg，0.489mmol)加入反应瓶，加入4mL四氢呋喃，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入叔丁醇钾(109mg，0.98mmol)，撤去冰浴，升至室温搅拌40分钟，加入10mL冰水，用乙酸乙酯(20mL×2)和氯仿(10mL×5)萃取，合并有机相并浓缩。所得残余物溶于4mL二氧六环中，加入2mL水，加入碳酸氢钠(49.2mg，0.586mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(126mg，0.49mmol)，室温搅拌2小时。加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到标题产物9b(48mg，产率：19％)。

MS m/z(ESI)：515.0[M+1]。

第三步

10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3，6-二氧代-2，9-二氧杂-4，7-二氮杂十一-11-酸9c

将9b(20mg，0.038mmol)溶于4.5mL四氢呋喃和乙酸乙酯(V∶V＝2∶1)混合溶剂中，加入钯碳(12mg，含量10％，干型)，氢气置换三次，室温搅拌反应1小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，滤液浓缩，得到粗品标题产物9c(13mg)，产品不经纯化直接进行下一步反应。

MS m/z(ESI)：424.9[M+1]。

第四步

(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-环丙基-2-(((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸酯9d

将1b(10mg，18.8μmol)加入反应瓶，加入1mL N，N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入粗品9c(13mg，30.6μmol)，加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(16.9mg，61.2μmol)，冰浴搅拌反应40分钟。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(10mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物9d(19mg，产率：73.6％)。

MS m/z(ESI)：842.1[M+1]。

第五步

2-((2-氨基乙酰氨基)甲氧基)-2-环丙基-N-((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)乙酰胺9e

将9d(19mg，22.6μmol)溶于2mL二氯甲烷中，加入1mL二乙胺，室温搅拌2小时。反应液减压浓缩，加入1mL甲苯并减压浓缩，重复两次。往残余物中加入3mL正己烷打浆，静置后倾倒出上层清液，保留固体。将固体残余物减压浓缩，油泵拉干得到粗品标题产物9e(17mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI)：638.0[M+18]。

第六步

将粗品9e(13.9mg，22.4μmol)溶于0.6mL N，N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入8g(21.2mg，44.8μmol)的0.3mL N，N-二甲基甲酰胺溶液，加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(18.5mg，67.3μmol)，冰浴搅拌反应10分钟，撤去冰浴，升至室温搅拌1小时，反应生成化合物9。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm；流动相：A-水(10mmol NH₄OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物(9-A：2.4mg，9-B：1.7mg)。

MS m/z(ESI)：1074.4[M+1]。

单一构型化合物9-A(较短保留时间)

UPLC分析：保留时间114分钟，纯度：85％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH₄OAc)，B-乙腈)。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ8.60(t，1H)，8.51-8.49(d，1H)，8.32-8.24(m，1H)，8.13-8.02(m，2H)，8.02-7.96(m，1H)，7.82-7.75(m，1H)，7.31(s，1H)，7.26-7.15(m，4H)，6.99(s，1H)，6.55-6.48(m，1H)，5.65-5.54(m，1H)，5.41(s，2H)，5.35-5.15(m，3H)，4.74-4.62(m，1H)，4.54-4.40(m，2H)，3.76-3.64(m，4H)，3.62-3.48(m，2H)，3.20-3.07(m，2H)，3.04-2.94(m，1H)，2.80-2.62(m，1H)，2.45-2.30(m，3H)，2.25-2.15(m，2H)，2.15-2.04(m，2H)，1.93-1.78(m，2H)，1.52-1.39(m，3H)，1.34-1.12(m，5H)，0.87(t，3H)，0.64-0.38(m，4H)。

单一构型化合物9-B(较长保留时间)

UPLC分析：保留时间1.16分钟，纯度：89％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH₄OAc)，B-乙腈)。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ8.68-8.60(m，1H)，8.58-8.50(m，1H)，8.32-8.24(m，1H)，8.13-8.02(m，2H)，8.02-7.94(m，1H)，7.82-7.75(m，1H)，7.31(s，1H)，7.26-7.13(m，3H)，6.99(s，1H)，6.55-6.48(m，1H)，5.60-5.50(m，1H)，5.41(s，2H)，5.35-5.15(m，2H)，4.78-4.68(m，1H)，4.60-4.40(m，2H)，3.76-3.58(m，4H)，3.58-3.48(m，1H)，3.20-3.10(m，2H)，3.08-2.97(m，2H)，2.80-2.72(m，2H)，2.45-2.30(m，3H)，2.25-2.13(m，2H)，2.13-2.04(m，2H)，2.03-1.94(m，2H)，1.91-1.78(m，2H)，1.52-1.39(m，3H)，1.34-1.12(m，4H)，0.91-0.79(m，3H)，0.53-0.34(m，4H)。

实施例3.ADC的制备

ADC药物载量分析

实验目的及原理

采用紫外分光光度法(UV-Vis)测定ADC载量。仪器：Thermo nanodrop2000紫外分光光度计。其原理是在某波长下ADC的总吸光值等于药物与单克隆抗体在该波长下吸光值的加和。

实验方法

将装有琥珀酸钠缓冲液的比色皿分别置于参比吸收池和样品测定吸收池中后，扣除溶剂空白后，再将装有供试品溶液的比色皿置于样品测定吸收池中，测定280nm和370nm处吸光度。

结果计算：

(1)A_280nm＝ε_mab-280bC_mab+ε_Drug-280bC_Drug

ε_Drug-280：药物在280nm平均摩尔消光系数5100；

C_Drug：药物的浓度；

ε_mab-280：单抗在280nm平均摩尔消光系数214600；

C_mab：单抗的浓度；

b：光程长度为1cm。

同理可以得到样品在370nm下的总吸光值方程：

(2)A_370nm＝ε_mab-370bC_mab+ε_Drug-370bC_Drug

ε_Drug-370：药物在370nm平均摩尔消光系数19000；

C_Drug：药物的浓度；

ε_mab-370：单抗在370nm消光系数为0；

C_mab：单抗的浓度；

b：光程长度为1cm。

由(1)和(2)两种方程结合单克隆抗体和药物在两个检测波长下的消光系数和浓度数据可以计算出ADC中药物的载量。

药物载量＝C_Drug/C_mab。

不同DAR值的PSMA抗体-药物偶联物PM-9-A制备实施例

以下实施例为本公开相关ADC的制备过程。其中实施例3-4、实施例3-5、实施例3-7、实施例3-11中抗体PM通过半胱氨酸上的巯基偶联带有连接单元的药物9-A反应，制备抗体药物偶联PM-9-A(DAR＝约3-4)；实施例3-1至实施例3-3和实施例3-6中抗体PM通过半胱氨酸上的巯基偶联带有连接单元的药物9-A反应，制备PSMA ADC分子PM-9-A(DAR＝约6-7)；实施例3-8至实施例3-10通过抗体PM半胱氨酸上的巯基，与带有连接单元的药物VcMMAE(瀚香生物科技，CAS 646502-53-6)反应制备偶联物分子PM-VcMMAE为对照。

通过对抗体和药物比例，反应量规模，以及其它条件的调整，可以获得不同DAR值(n)的抗体药物偶联物，优选DAR值为1-8，更优先为3-8，最优选3-7。

(一)不同DAR值的抗体药物偶联PM-9-A的制备

实施例3-1 ADC-1

在37℃条件下，向抗体PM的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，0.27mL，18nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，9.8μL，98nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物9-A(0.3mg，277nmol)溶解于20μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-9-A所示偶联物的示例性产物ADC-1的PBS缓冲液(0.18mg/mL，11mL)，于4℃储存。

UV-Vis计算平均值：n＝6.31。

实施例3-2 ADC-2

在37℃条件下，向抗体PM的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，3.6mL，243nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，128.9μL，1289nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物9-A(3.93mg，3649nmol)溶解于200μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-9-A所示偶联物的示例性产物ADC-2的PBS缓冲液(1.93mg/mL，15.4mL)，于4℃储存。

UV-Vis计算平均值：n＝6.63。

实施例3-3 ADC-3

在37℃条件下，向抗体PM的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，10mL，676nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，358.1μL，3581nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物9-A(10.91mg，10135nmol)溶解于480μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-9-A所示偶联物的示例性产物ADC-3的PBS缓冲液(3.47mg/mL，25mL)，于4℃储存。

UV-Vis计算平均值：n＝6.9。

实施例3-4 ADC-4

在37℃条件下，向抗体PM的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，0.21mL，14nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，3.SμL，35nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物9-A(0.15mg，139nmol)溶解于20μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-9-A所示偶联物的示例性产物ADC-4的PBS缓冲液(0.28mg/mL，4.6mL)，于4℃储存。

UV-Vis计算平均值：n＝3.68。

实施例3-5 ADC-5

在37℃条件下，向抗体PM的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，5.23mL，353nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，84.8μL，848nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物9-A(3.8mg，3534nmol)溶解于260μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-9-A所示偶联物的示例性产物ADC-5的PBS缓冲液(2.48mg/mL，18.2mL)，于4℃储存。

UV-Vis计算平均值：n＝3.89。

实施例3-6 ADC-6

在37℃条件下，向抗体PM的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，3.5mL，236nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，125.3μL，1253nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物9-A(3.82mg，3547nmol)溶解于150μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-9-A所示偶联物的示例性产物ADC-6的PBS缓冲液(1.83mg/mL，14mL)，于4℃储存。

UV-Vis计算平均值：n＝6.61。

实施例3-7 ADC-7

在37℃条件下，向抗体PM的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，14.68mL，992nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，238.1μL，2381nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物9-A(10.67mg，9919nmol)溶解于420μl二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-9-A所示偶联物的示例性产物ADC-7的PBS缓冲液(3.61mg/mL，37mL)，于4℃储存。

UV-Vis计算平均值：n＝3.93。

(二)对照抗体药物偶联PM-VcMMAE的制备(参考专利WO2007002222A2)

实施例3-8 ADC-8

在37℃条件下，向抗体PM的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，2.5mL，169nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，42.2μL，422nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物VcMMAE(2.22mg，1689nmol)溶解于100μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-VcMMAE所示偶联物的示例性产物ADC-8的PBS缓冲液(1.76mg/mL，12mL)，于4℃储存。

CE-SDS计算平均值：n＝4.47。

实施例3-9 ADC-9

在37℃条件下，向抗体PM的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，3.3mL，223nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，55.7μL，557nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物VcMMAE(2.93mg，2230nmol)溶解于200μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-VcMMAE所示偶联物的示例性产物ADC-9的PBS缓冲液(2.05mg/mL，17mL)，于4℃储存。

CE-SDS计算平均值：n＝4.23。

实施例3-10 ADC-10

将化合物VcMMAE(2.22mg，1689nmol)溶解于150μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-VcMMAE所示偶联物的示例性产物ADC-10的PBS缓冲液(2.2mg/mL，13mL)，于4℃储存。

CE-SDS计算平均值：n＝3.92。

实施例3-11 ADC-11

在37℃条件下，向抗体PM的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，2.4mL，160nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，42.2μL，422nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物9-A(1.75mg，1629nmol)溶解于100μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-9-A所示偶联物的示例性产物ADC-11的PBS缓冲液(1.34mg/mL，15.5mL)，于4℃储存。

UV-Vis计算平均值：n＝4.19。

实施例3-12 ADC-12

将化合物58(参照专利“CN104755494A中第163页的实施例58制备，1.68mg，1624nmol)溶解于100μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-58所示偶联物的示例性产物ADC-12的PBS缓冲液(1.45mg/mL，14.8mL)，于4℃储存。

UV-Vis计算平均值：n＝4.16。

(三)对照抗体药物偶联Lmab-9-A的制备

在37℃条件下，向抗体Lmab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，2.15mL，145nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，74.1μL，741nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物9-A(3.20mg，2179nmol)溶解于155μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物Lmab-9-A的PBS缓冲液(0.99mg/mL，15mL)，于4℃储存。

UV-Vis计算平均值：n＝7.07。

以下用生化测试方法验证本公开的抗体的活性

测试例1：体外细胞结合实验

本实验通过检测细胞表面抗体的荧光信号，根据荧光信号强弱来评价抗体的结合。制备好的ADC-2、ADC-10、对照ADC Lmab-9-A和抗体PM一起被用于进行体外结合检测。

将梯度稀释的ADC-2、ADC-10和抗体PM与1×10⁵个细胞(ATCC，MDA PCa 2b/CRL-2422，LNCaP/CRL-1740，22Rv1/CRL-2505，PC-3/CRL-1435，DU 145/HTB-81)在4℃孵育60分钟后洗掉多余的ADC或抗体。将细胞与FITC标记的山羊抗人IgG(H+L)二抗(Jackson ImmunoResearch，109-095-003)在4℃孵育30分钟，洗掉多余抗体后，使用BD CantoII读取细胞表面的荧光信号，(结果如表2，图1A，图1B，图1C，图1D，图1E所示)。

表2体外细胞结合活性(EC₅₀，nM)

	MDAPCa 2b	LNCaP	22RV1	PC-3	DU145
						抗体PM	1.079	1.421	0.6761	不结合	不结合
ADC-2	0.7183	0.9381	0.5714	不结合	不结合
						ADC-10	0.9537	1.581	0.6894	不结合	不结合
Lmab-9-A	不结合	不结合	不结合	不结合	不结合

检测用细胞的抗原PSMA的表达水平：MDA PCa 2b＞LNCaP＞22Rv1，PC-3和DU 145不表达PSMA。

结果表明：ADC-2、ADC-10、对照ADCLmab-9-A和抗体PM与不同PSMA抗原表达水平的细胞具有相应强或弱的结合能力。EC₅₀越小代表结合能力越强。

测试例2：体外细胞内吞实验

DT3C，70kd，是重组表达的融合蛋白，由白喉毒素的Fragment A(仅毒素部分)和G群链球菌的3C片段(IgG结合部分)融合而成，该蛋白能够与抗体的IgG部分高度亲和，在抗体发生内吞时一同进入细胞，在胞内弗林蛋白酶的作用下，释放出具有毒性的DT，DT能够抑制EF2-ADP核糖基化的活性，阻断蛋白翻译过程，最终导致细胞死亡。而未进入细胞的DT3C则不具有杀伤细胞的活性。根据细胞杀伤情况来评价抗体的内吞活性。

将无菌过滤的DT3C(70KD，SB HRS3A，MEI3AU0803)和抗体PM抗体(DT3C摩尔浓度为抗体摩尔浓度的6倍)按照1∶1的体积混匀，于室温下静置孵育30分钟后用无血清培养基梯度稀释，加入提前一天准备的用含20％low IgG FBS的培养基培养的细胞(ATCC，LNCaP/CRL-1740，22Rv1/CRL-2505)中(2000个细胞/孔)，5％二氧化碳培养箱中37℃孵育三天。加入CellTiter-Glo(Promega，G7573)，室温下避光孵育10分钟，Victor3上读取化学发光(结果如表3，图2A，图2B所示)。

表3抗体在不同细胞的内吞活性(IC₅₀，nM)

	LNCaP	22RV1
			抗体PM+DT3C	～4.641e+012	0.08563
hIgG1对照+DT3C	不内吞	不内吞
			仅DT3C	不内吞	不内吞

结果表明：抗体PM在阳性表达PSMA抗原的细胞上具备内吞能力。

测试例3：细胞增殖抑制实验

本实验通过检测细胞内ATP含量，根据IC₅₀大小评价PSMAADC对细胞(ATCC，LNCaP/CRL-1740，22Rv1/CRL-2505，PC-3/CRL-1435)增殖的抑制效果。

待检测样品：ADC-2，ADC-4，对照ADC Lmab-9-A

1、对LNCaP细胞增殖的抑制效果

LNCaP细胞培养在含10％FBS的RPMI-1640培养基中，一周传代2～3次，传代比列1∶3或1∶6。传代时，吸掉培养基，用5mL 0.25％的胰酶冲洗细胞层，然后吸掉胰酶，将细胞放在培养箱中消化3～5分钟，加入新鲜培养基重悬细胞。在96孔细胞培养板中加入180μL的细胞悬液，2×10³细胞/孔，培养基为4.5％FBS的RPMI-1640，96孔板外围只加入培养基。将培养板在培养箱培养24小时(37℃，5％CO₂)。

将待测ADC(ADC-2，ADC-4，Lmab-9-A)配成起始浓度，用PBS 1∶6梯度稀释9个点，另加0浓度点。取20μL加入到上述细胞板中，在培养箱中孵育5天(37℃，5％CO₂)。对于化合物2-B(即9-A的游离毒素)，先用DSMO稀释成母液并用PBS配成200μM为起始，再用PBS 1∶6梯度稀释9个点，另加0浓度点，取1μL加入20μLRPMI-1640中并转至96孔细胞培养板中，在培养箱中孵育5天(37℃，5％CO₂)。在96孔细胞培养板中，每孔加入80μL CellTiter-Glo试剂，室温避光放置10-15分钟，在Victor3中读取化学发光信号值，数据使用GraphPad软件处理。(结果如表4，图3A，图3B所示)。

2、对22Rv1细胞增殖的抑制效果

22Rv1细胞培养在含10％FBS的RPMI-1640培养基中，一周传代2次，传代比列1∶3或1∶6。传代时，吸掉培养基，用5mL 0.25％的胰酶冲洗细胞层，然后吸掉胰酶，将细胞放在培养箱中消化3～5分钟，加入新鲜培养基重悬细胞。在96孔细胞培养板中加入180μL的细胞悬液，4×10³细胞/孔，培养基为4.5％FBS的RPMI-1640，96孔板外围只加入培养基。将培养板在培养箱培养24小时(37℃，5％CO₂)。待测ADC及化合物2-B配制及实验方法同上。(结果如表4，图3C，图3D所示)。

3、对PC-3细胞增殖的抑制效果

PC-3细胞培养在含10％FBS的F-12K培养基中，一周传代2-3次，传代比列1∶3或1∶6。传代时，吸掉培养基，用5mL 0.25％的胰酶冲洗细胞层，然后吸掉胰酶，将细胞放在培养箱中消化3～5分钟，加入新鲜培养基重悬细胞。在96孔细胞培养板中加入180μL的细胞悬液，4×10³细胞/孔，培养基为4.5％FBS的F-12K，96孔板外围只加入培养基。将培养板在培养箱培养24小时(37℃，5％CO₂)。待测ADC及化合物2-B配制及实验方法同上。(结果如表4，图3E，图3F所示)。

表4对细胞杀伤作用(IC₅₀，nM)

	化合物2-B	ADC-2	ADC-4	Lmab-9-A
					LNCaP	1.695	0.7988	4.67	～7.751e+006
22RV1	2.843	1.238	78.34	～3.509e+007
					PC-3	8.328	～1.256e+006	～3.140e+006	～529.9

结论：PSMAADC在LNCaP和22RV1细胞上具有杀伤作用。化合物2-B(即9-A的游离毒素)具有透膜杀伤作用。

测试例4：ADC药物对人前列腺癌细胞22Rv1裸小鼠移植瘤的疗效评价

一、测试方法

实验用nu/nu裸小鼠，雄性，6-8周，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证编号1908120082)。饲养环境：SPF级。裸小鼠皮下接种人前列腺癌细胞22Rv1(中科院)，当肿瘤平均体积达到220mm³时，将动物随机分组(D0)，每组6只，开始腹腔注射给药2次/周，共给药5次，每周2次检测瘤体积和体重，记录数据。

肿瘤体积V＝1/2×a×b²，其中a、b分别表示长、宽。

相对肿瘤增殖率T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100其中T、C为实验结束时治疗组和对照组的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。

抑瘤率TGI(％)＝1-T/C(％)。

二、测试对象

ADC-10：3mpk，10mpk；

ADC-2：3mpk，10mpk；

空白对照组：pH7.4的PBS缓冲液。

三、抗体ADC的抑瘤效果

观察至给药开始后第17天(D17)时，阳性ADC-10的10mpk和3mpk的抑瘤率分别为48.9％和10.0％，ADC-2的10mpk和3mpk的抑瘤率分别为＞100％和91.5％，显著优于空白对照组和阳性ADC组，且呈现良好的剂量依赖关系(表5，图4A)。

给药过程中小鼠体重平稳，提示ADC-2各给药剂量没有明显的毒副作用(图4B)。

表5给药ADC对荷瘤裸鼠22Rv1移植瘤的疗效

vs空白对照组：*p＜0.05，***p＜0.001；vs ADC-10相应剂量组：###p＜0.001

测试例5：ADC药物对人前列腺癌细胞22Rv1裸小鼠移植瘤的疗效评价

一、测试方法

实验用nu/nu裸小鼠，雄性，6-8周，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证编号1908120082)。饲养环境：SPF级。裸小鼠皮下接种人前列腺癌细胞22Rv1(中科院)，当肿瘤平均体积达到210mm³时，将动物随机分组(D0)，每组8只，开始腹腔注射给药2次/周，共给药6次，每周2次检测瘤体积和体重，记录数据。

肿瘤体积V＝1/2×a×b²，其中a、b分别表示长、宽。

抑瘤率TGI(％)＝1-T/C(％)。

二、测试对象

ADC-8：10mpk；

ADC-6：3mpk，6mpk；

ADC-7：3mpk，6mpk，10mpk；

空白对照组：pH7.4的PBS缓冲液。

三、抗体ADC的抑瘤效果

观察至给药开始后第14天(D14)时，阳性ADC-8的10mpk抑瘤率为81.6％，受试ADC-6的6mpk和3mpk的抑瘤率分别为＞100％和97.8％，另一个受试ADC-7的10mpk、6mpk和3mpk的抑瘤率分别为＞100％、88.4％和80.5％，所有给药组均显著优于对照组，受试ADC-6在同等剂量下显著优于受试ADC-7，2个受试ADC均呈现良好的剂量依赖关系(表6，图5A)。

给药过程中小鼠体重平稳，提示各受试抗体各给药剂量没有明显的毒副作用(图5B)。

表6给药ADC对荷瘤裸鼠22Rv1移植瘤的疗效

vs对照组：***p＜0.001；vs ADC-6相应剂量组：##p＜0.01，###p＜0.001

测试例6：ADC药物对人前列腺癌细胞LNCap在SCID Beighe小鼠上的移植瘤的疗效评价

一、测试方法

实验用SCID Beige小鼠，雄性，6-8周，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证编号1908120082)。饲养环境：SPF级。小鼠皮下接种人前列腺癌细胞LNCap(ATCC)，当肿瘤平均体积达到160mm³时，将动物随机分组(D0)，每组7只，于D0和D4腹腔注射给药2次，每周2次检测瘤体积和体重，记录数据。

肿瘤体积V＝1/2×a×b²，其中a、b分别表示长、宽。

抑瘤率TGI(％)＝1-T/C(％)。

二、测试对象

ADC-9：10mpk；

ADC-3：3mpk，10mpk；

ADC-5：3mpk，6mpk，10mpk；

空白对照组：pH7.4的PBS缓冲液。

三、抗体ADC的抑瘤效果

所有给药组肿瘤在D0和D4两次给药后即开始消退，且其药效一直维持到实验终点D18。受试ADC-3和ADC-5均呈现出一定的剂量依赖关系，但它们之间并没有显著性差异(表7，图6A)。

给药过程中小鼠体重平稳，提示各受试抗体各给药剂量没有明显的毒副作用(图6B)。

表7给药ADC对荷瘤SCID Beige鼠LNCap移植瘤的疗效

vs对照组：***p＜0.001

测试例7：PMSAADC SD大鼠T1/2评价

SD雄性大鼠9只，分为三组，每组3只，12/12小时光/暗调节，温度20-26℃恒温，湿度40-70％，自由进食饮水。购自浙江维通利华实验动物有限公司。实验当天对SD雄性大鼠分别尾静脉注射受试药物ADC-2，ADC-5，ADC-10，给药剂量为3mg/kg，注射体积5mL/kg。

取血时间点为：第1天给药后5分钟、8小时、24小时(第2天)、第3天、第5天、第8天、第11天、第15天、第22天和第29天，于大鼠眼底静脉取血，每次300μL(相当于取血清150μL)；收集的血样在室温下置放半小时至凝集，然后4℃下1000×g离心15分钟，将上清(血清)转移至EP管中，立即放置-80℃贮存。采用ELISA法检测SD大鼠血清中PSMA抗体ADC的浓度。

测试方法：

总抗体(Total antibody)的检测：

1.在ELISA板(cornning)中每孔加入100μL，1μg/mL羊抗人lgG FC(abcam)，4℃隔夜孵育。

2.用洗板液PBST冲洗三遍(1×PBS，0.5％tween-20(生工)。

3.每孔加入200μL封闭液(5％牛奶，碧云天)，37℃孵育1-3小时。

4.用洗板液PBST冲洗三遍。

5.加入100μL的标准样品，质控样品和检测样品，37℃孵育1-3小时。

6.用洗板液冲洗三遍。

7.加入100μL鼠预吸附过的羊抗人lgG轻/重链HRP(1∶5000，abcam)，37℃孵育1-1.5小时。

8.用洗板液冲洗三遍。

9.加入100μL TMB(KPL)，常温避光孵育10分钟。

10.加入100μL 1M稀硫酸(国药集团)终止，在450nm波长下读板(moleculardevice，flexstation 3)。

完整ADC(Intact ADC)的检测：

1.在ELISA板中每孔加入100uL，1μg/mL羊抗鼠IgGFc，4℃隔夜孵育。

2.用洗板液PBST冲洗三遍。

3.每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1-3小时。

4.用洗板液冲洗三遍。

5.每孔加入100μL 0.2μg/mL抗毒素抗体或anti-pab-mmae(中科英沐，s-497-8)，37℃孵育1-1.5小时。

6.用洗板液冲洗三遍。

7.加入100μL的标准样品，质控样品和检测样品，37℃孵育1-3小时。

8.用洗板液冲洗三遍。

9.加入100μL鼠预吸附过的羊抗人lgG轻/重链HRP(1∶5000)，37℃孵育1-1.5小时。

10.用洗板液冲洗三遍。

11.加入100μL TMB，常温避光孵育10分钟。

12.加入100μL 1M稀硫酸终止，在450nm波长下读板。

检测及分析结果：

用ELISA检测血清中的PSMA抗体ADC的浓度，进行PK分析，(结果见表8)。

表8 PSMA抗体偶联物在SD大鼠中的T_1/2

结果表明，大鼠静脉给予3mg/kg受试抗体偶联物ADC-10，ADC-2，ADC-5后，总抗体(ADC中偶联的抗体和血清中游离的抗体)在大鼠体内的半衰期约为219.8小时(9.2天)，171.2小时(7.1天)，172.5小时(7.2天)；完整ADC在大鼠体内的半衰期约为76.7小时(3.2天)，153.9小时(6.4天)，137.9小时(5.7天)。ADC-2和ADC-5的T_1/2优于ADC-10。

测试例8：PSMA ADC的稳定性研究(游离毒素检测)

1.大鼠药代样品中ADC-2稳定性

运用液质联用技术，监测样品经静脉给药，在雄性大鼠体内，28天中化合物2-B(9-A的游离毒素)随时间的释放量，用以反映样品在定浓度条件下的稳定性。通过对28天中，不同时间点(5分钟，8小时，1天，2天，4天，7天，10天，14天，21天，28天)的大鼠血浆中化合物2-B的含量测定，ADC-2表现了良好的稳定性，结果如表9所示。

结果显示，ADC-2在雄性大鼠体内28天之内均显示出良好的稳定性。

表9 PSMAADC的稳定性研究

Blq表示：1ng/mL；M表示大鼠性别为雄性。

2.PSMA ADC血浆稳定性研究

运用液质联用技术，监测样品ADC-2(100μg/mL)分别在(人、猴、狗、大鼠、小鼠五个种属的血浆(肝素抗凝)以及1％BSA-PBS作为对照)中，分别在(37℃&5％CO₂孵育箱中，放置0天，7天，14天，21天)不同时间内化合物2-B随时间的释放量，用以反映样品在特定浓度(100μg/mL)条件下的稳定性。通过对不同时间点中化合物2-B的含量测定，ADC-2表现了良好的稳定性，结果如图7和表10所示。

结果显示，ADC-2在不同种属血浆中，在一定温度、一定时间内显示出良好的稳定性。

注：试验操作是在无菌实验室中进行的，空白血浆用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

表10化合物2-B的含量(ng/mL)

化合物2-B线性范围1～5000ng/mL；BLQ表示：1ng/mL。“-1”和“-2”表示重复实验的第一次和第二次。

3.PSMA ADC血浆稳定性研究

运用液质联用技术，监测样品ADC-5分别在(人、猴、狗、大鼠、小鼠五个种属的血浆(肝素抗凝)以及1％BSA-PBS作为对照)中，分别在(37℃&5％CO₂孵育箱中，放置0天，7天，14天，23天)不同时间内化合物2-B随时间的掉落的量，用以反映样品在特定浓度(100μg/mL)条件下的稳定性。通过对不同时间点中化合物2-B的含量测定，ADC-5表现了良好的稳定性，结果如表11、图8所示。

结果显示，ADC-5在不同种属血浆，一定温度，一定时间内显示出良好的稳定性。

表11化合物2-B的含量(ng/mL)-ADC-5(100μg/mL)在不同血浆中37℃孵育23天

	BSA	大鼠	小鼠	人	狗	猴
							0d-1	BLQ	BLQ	BLQ	BLQ	BLQ	BLQ
0d-2	BLQ	BLQ	BLQ	BLQ	BLQ	BLQ
							7d-1	BLQ	3.74	4.69	2.46	7.14	BLQ
7d-2	BLQ	3.82	3.88	BLQ	5.89	BLQ
							14d-1	BLQ	10.1	9.32	BLQ	14.2	5.09
14d-2	BLQ	10.0	10.6	2.00	13.8	6.34
							23d-1	3.32	14.9	16.5	8.57	23.1	9.11

23d仅为单孔，化合物2-B线性范围2～5000ng/mL；BLQ表示：1ng/mL。

测试例9：ADC药物对人前列腺癌细胞22Rv1裸小鼠移植瘤的疗效评价

一、测试方法

实验用雄性nu/nu裸小鼠，6-8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证编号1908120082)。饲养环境：SPF级。裸小鼠皮下接种人前列腺癌细胞22Rv1(中科院)，当肿瘤平均体积达到190mm³时，将动物随机分组(D0)，每组8只，开始腹腔注射给药，2次/周，共给药4次，每周2次检测瘤体积和体重，记录数据。

肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×a×b²其中a、b分别表示长、宽。

相对肿瘤增殖率T/C(％)＝(T-T₀)/(C-C₀)×100，其中T、C为实验结束时治疗组和对照组的肿瘤体积；T₀、C₀为实验开始时的肿瘤体积。

抑瘤率TGI(％)＝1-T/C(％)。

二、测试对象

ADC-11：5mpk

ADC-12：5mpk

空白对照组：pH7.4的PBS缓冲液

三、抗体ADC的抑瘤效果

观察至给药开始后第13天(D13)时，ADC-11和ADC-12在5mpk剂量下的抑瘤率分别为87.63％和79.82％，均显著优于对照组。ADC-11和ADC-12之间没有显著性差异(表12，图9)。

给药过程中小鼠体重平稳，提示各受试抗体没有明显的毒副作用。

表12给药ADC对荷瘤裸鼠22Rv1移植瘤的疗效

vs空白对照组：**p＜0.01，***p＜0.001。

序列表

<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司

上海恒瑞医药有限公司

<120> 抗PSMA抗体-依喜替康类似物偶联物及其医药用途

<130> 721024CPCT

<150> CN202010218297.4

<151> 2020-03-25

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> AB-PG1-XG1-006重链可变区

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Gln Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Phe Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> AB-PG1-XG1-006轻链可变区

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Lys Val Pro Lys Phe Leu Ile

35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Tyr Asn Ser Ala Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> AB-PG1-XG1-006 HCDR1

<400> 3

Arg Tyr Gly Met His

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> AB-PG1-XG1-006 HCDR2

<400> 4

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> AB-PG1-XG1-006 HCDR3

<400> 5

Gly Gly Asp Phe Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> AB-PG1-XG1-006 LCDR1

<400> 6

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> AB-PG1-XG1-006 LCDR2

<400> 7

Glu Ala Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> AB-PG1-XG1-006 LCDR3

<400> 8

Gln Asn Tyr Asn Ser Ala Pro Phe Thr

1 5

<210> 9

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> PM-HC

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Gln Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Phe Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 10

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> PM-LC

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Lys Val Pro Lys Phe Leu Ile

35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Tyr Asn Ser Ala Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 11

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> 抗体重链序列Lmab-HC

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 12

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> 抗体轻链序列Lmab-LC

<400> 12

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 13

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 四肽接头

<400> 13

Gly Gly Phe Gly

1

Claims

1.一种通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐：

其中：

Y为-O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-；

R¹为卤代C_1-6烷基或C_3-6环烷基；

R²选自氢原子、卤代C_1-6烷基和C_3-6环烷基；

或者，R¹和R²与其相连接的碳原子一起形成C_3-6环烷基；

m为0或1；

n为1至10，n是小数或整数；

L为接头单元-L¹-L²-L³-L⁴-，

L¹选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH₂-C(O)-NR³-W-C(O)-和-C(O)-W-C(O)-，其中W选自C_1-8烷基和C_1-8烷基-C_3-6环烷基；

L³为由2至7个氨基酸残基构成的肽残基，其中所述的氨基酸残基选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸中的氨基酸形成的氨基酸残基；

R³、R⁴和R⁵相同或不同，且各自独立地选自氢原子、C_1-6烷基、卤代C_1-6烷基、氘代C_1-6烷基和C_1-6羟烷基；

R⁶和R⁷相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、C_1-6烷基、卤代C_1-6烷基、氘代C_1-6烷基和C_1-6羟烷基；

Pc为抗PSMA抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，其中：

所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

2.根据权利要求1所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述抗PSMA抗体是鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

3.根据权利要求1所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述抗PSMA抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：1所示的重链可变区和如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区。

4.根据权利要求1所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述抗PSMA抗体包含抗体重链恒定区和轻链恒定区；所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定区及其常规变体，所述轻链恒定区选自人抗体κ和λ链的恒定区及其常规变体。

5.根据权利要求1所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述抗PSMA抗体包含如SEQ ID NO：9所示的重链和如SEQ ID NO：10所示的轻链。

6.根据权利要求1所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中n为1至8，n是小数或整数。

7.根据权利要求1所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中n为3至8，n是小数或整数。

8.根据权利要求1所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中Y选自：

其中Y的O端与接头单元L相连。

9.根据权利要求1所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中接头单元L为-L¹-L²-L³-L⁴-，

L¹为s¹为2至8的整数；

L²为化学键；

L³为四肽残基；

L⁴为-NR⁵(CR⁶R⁷)t-，R⁵、R⁶或R⁷相同或不同，且各自独立地为氢原子或C_1-6烷基，t为1或2；

其中所述的L¹端与Pc相连，L⁴端与Y相连。

10.根据权利要求1所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中L为：

11.根据权利要求1所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，所述抗体-药物偶联物选自：

其中

所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

n为1至10，n是小数或整数。

12.根据权利要求11所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，所述抗体-药物偶联物为：

其中：

n为1至8，n是小数或整数；

13.根据权利要求12所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中n为3至8，n是小数或整数。

14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至13中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

15.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐、或根据权利要求14所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤和癌症的药物中的用途。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述肿瘤和癌症选自头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经母细胞瘤、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝细胞瘤、肝胆癌、胰腺癌、胃肠道癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、骨癌、骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、库肯勃氏瘤、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尿路上皮癌和梅克尔细胞癌。

17.根据权利要求16所述的用途，所述淋巴瘤选自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤；所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌；所述白血病选自：慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病；所述胃肠道癌选自胃癌、肠癌、结肠直肠癌；所述的肾癌为透明细胞肾细胞癌；所述的皮肤癌为黑色素瘤；所述的骨癌为软骨肉瘤和尤因氏肉瘤；所述的骨髓瘤为多发性骨髓瘤；所述的咽喉癌为鼻咽癌；所述的脑癌选自神经胶质瘤和多形性成胶质细胞瘤。