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FR3136481A1 - Procedes et compositions d'apport d'acide nucleique - Google Patents

Procedes et compositions d'apport d'acide nucleique Download PDF

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FR3136481A1
FR3136481A1 FR2213569A FR2213569A FR3136481A1 FR 3136481 A1 FR3136481 A1 FR 3136481A1 FR 2213569 A FR2213569 A FR 2213569A FR 2213569 A FR2213569 A FR 2213569A FR 3136481 A1 FR3136481 A1 FR 3136481A1
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FR
France
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phage
bacteriophage
dna
target
plasmid
Prior art date
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Pending
Application number
FR2213569A
Other languages
English (en)
Inventor
Adam TAKOS
Virginia MARTINEZ
Andreas PORSE
Camilla Kristensen
Alex SALAZAR
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SNIPR Biome ApS
Original Assignee
SNIPR Biome ApS
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Publication date
Application filed by SNIPR Biome ApS filed Critical SNIPR Biome ApS
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Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
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Abstract

.La présente invention concerne des procédés améliorés d'apport d'ADN à des bactéries et archées cibles. Fig. 1

Description

PROCEDES ET COMPOSITIONS D'APPORT D'ACIDE NUCLEIQUE
La présente invention concerne des procédés améliorés d'apport d'ADN à des bactéries et archées cibles.
Les bactéries et les archées, telles que celles présentes dans le microbiote humain et animal ou dans des environnements, codent pour les enzymes méthyltransférases qui protègent l'ADN bactérien hôte contre le clivage d'ADN par des systèmes de restriction modification (RM) codés par l'hôte. Ces systèmes RM ciblent l'ADN qui n'est pas méthylé de la même manière que l'ADN hôte. Les enzymes de systèmes RM clivent l'ADN au niveau de motifs spécifiques au sein de l'ADN, et le clivage à spécificité de site est empêché par la méthylation. Dans des bactéries de laboratoire, les systèmes RM peuvent être modifiés pour permettre une transformation plus efficace d'ADN étranger, mais cela n'est pas possible pour l'apport à des bactéries dans des environnements naturels tels que le microbiome.
WO 2016/205276 divulgue des procédés pour méthyler de l'ADN de bactériophages ou de phagémides dans des souches de production avant l'apport.
L'invention concerne :
Une bactérie support comprenant un plasmide conjugatif, le plasmide codant pour une enzyme méthyltransférase.
Un procédé d'apport d'ADN depuis une bactérie support à une bactérie cible par conjugaison, le procédé comprenant la mise en contact de l'espèce bactérienne cible avec la bactérie support telle que divulguée ici, dans lequel la bactérie cible comprend un système de restriction modification qui clive l'ADN qui est non méthylé en un site cible de méthylation de l'enzyme méthyltransférase.
Un bactériophage codant pour une enzyme méthyltransférase, optionnellement dans lequel l'enzyme méthyltransférase protège contre un système de restriction modification trouvé dans une bactérie cible qui est pathogène chez les humains ou animaux, et/ou dans une bactérie cible qui est associée à un encrassement biologique (en anglais : « biofouling ») ou à une corrosion microbienne.
Un procédé d'apport d'ADN de bactériophage à une bactérie cible, le procédé comprenant la mise en contact de l'espèce bactérienne cible avec un bactériophage codant pour une enzyme méthyltransférase, dans lequel la bactérie cible comprend un système de restriction modification qui clive l'ADN qui est non méthylé en un site cible de méthylation de l'enzyme méthyltransférase.
Un procédé de méthylation d'un ADN de bactériophage ou d'un ADN de plasmide ou de phagémide, le procédé comprenant :
l’introduction dans une bactérie de production (i) d’un polynucléotide codant pour une pluralité de méthyltransférases, ou (ii) de polynucléotides qui codent ensemble pour une pluralité de méthyltransférases,
la production, par cela, d’une bactérie de production modifiée exprimant au moins 2 méthyltransférases introduites ;
l’infection de la bactérie de production modifiée avec une particule de bactériophage comprenant de l'ADN de bactériophage ou de l'ADN de phagémide ou de l'ADN de plasmide, méthylant ainsi ledit ADN de bactériophage ou ADN de phagémide ou de plasmide; et
la production d’une particule de bactériophage comprenant de l'ADN de bactériophage ou de l'ADN de phagémide ou de l'ADN de plasmide ayant un motif de méthylation modifié, optionnellement la purification de la particule de bactériophage comprenant de l'ADN de bactériophage ou de l'ADN de phagémide ou de l'ADN de plasmide.
Une composition pharmaceutique comprenant un/une bactérie support ou bactériophage ou phagémide ou plasmide tel que divulgué ici en combinaison avec un support ou un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Un procédé de prévention ou de traitement d'une maladie provoquée par une bactérie cible pathogène chez l’humain ou l’animal, le procédé comprenant l'apport d'un bactériophage, d'un phagémide ou d'une bactérie support ou d'un plasmide ou d'une composition pharmaceutique telle que décrite ici à un humain ou un animal en ayant besoin.
Un/une bactériophage, phagémide ou bactérie support ou plasmide ou composition pharmaceutique tel que divulgué ici pour utilisation dans un procédé de prévention ou traitement d'une maladie provoquée par une bactérie cible pathogène chez l’humain ou l’animal, le procédé comprenant l'apport du bactériophage, phagémide ou de la bactérie support ou composition pharmaceutique à l'homme ou à l'animal en ayant besoin.
Un procédé de destruction d'une bactérie cible ou de modification ciblée du génome d'une bactérie cible, le procédé comprenant l'apport d'un(e) bactériophage, phagémide ou bactérie support ou plasmide tel que divulgué ici aux bactéries cibles, dans lequel/laquelle la bactérie cible est comprise dans une population apparaissant naturellement et associée à une corrosion microbienne ou à un encrassement biologique d'un substrat ou fluide dans un système industriel ou domestique.
Un procédé pour modification ciblée d'une espèce ou souche bactérienne cible, le procédé comprenant la mise en contact d'une bactérie cible avec un/une bactérie support, bactériophage ou phagémide ou plasmide tel que divulgué(e) ici, de sorte que la séquence cible de l'espèce bactérienne cible est modifiée, là où le plasmide, phage ou phagémide conjugable comprend en outre un réseau CRISPR modifiant la cellule cible.
D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :
Fig. 1
Efficacité de conjugaison de petits plasmides conjugatifs méthylés en cis (n = 3) ;
Fig. 2
Efficacité de conjugaison d'un grand plasmide conjugatif méthylé en cis (n = 3) ;
Fig. 3
Comparaison de l'efficacité de conjugaison de petits plasmides conjugatifs méthylés en cis et en trans (n = 3) ;
Fig. 4
Efficacité de mise en culture de lysats de phages, méthylés soit en trans, soit en cis (n = 3) ;
Fig. 5
Efficacité de la transduction du phage après méthylation en trans par une souche de production exprimant un opéron MTase (n = 3).
La présente invention démontre qu'il n'est pas nécessaire de pré-méthyler de l'ADN en utilisant des méthyltransférases (MTases) dans une souche bactérienne de production avant apport à des bactéries cibles comprenant un système RM qui autrement cliverait l'ADN introduit et réduirait l'efficacité du transfert. Au lieu de cela, nous montrons de manière surprenante que les méthyltransférases peuvent être directement codées sur l'acide nucléique qui est apporté à une cellule cible, tel que sur un phage ou un plasmide conjugatif, puis peuvent être exprimées dans cette cellule cible pour fournir une protection contre la restriction modification de l'hôte. Cela évite le besoin de pré-méthyler au stade de production du phage ou plasmide.
En outre, nous avons démontré que la méthylation d'ADN utilisant de multiples MTases au sein d'une souche de production offre également une protection significative à l'ADN lors du transfert ultérieur à une bactérie cible. Cette approche peut être directement utilisée en combinaison avec le codage de MTases dans le phage ou les plasmides conjugatifs si désiré.
En outre, nous comparons la méthylation d'ADN tel que de l'ADN plasmidique en trans dans une cellule par un plasmide non conjugatif corésident, avec la méthylation cis. Les deux approches sont efficaces pour empêcher la restriction d'ADN introduit avec une méthylation cis hautement efficace.
Dans tout procédé ou autre aspect mentionné ici, où il est divulgué la mise en contact d'une cellule support avec une cellule cible, dans le mode de réalisation alternatif, il est prévu la mise en contact d'une population de cellules supports avec une population de cellules cibles.
Dans un premier aspect, la présente invention concerne une cellule bactérienne support comprenant un plasmide conjugatif, le plasmide codant pour une enzyme méthyltransférase. Les données fournies ici montrent que l'inclusion d'une enzyme méthyltransférase sur un plasmide conjugatif qui est apporté à une bactérie cible augmente l'efficacité du transfert conjugatif par rapport à un plasmide dépourvu de la méthyltransférase, dans le contexte d'une bactérie cible dans laquelle cette méthyltransférase peut protéger contre un système RM hôte. L'invention prévoit également une population desdites cellules supports, par ex. dans laquelle la population est comprise par une composition pharmaceutique pour administration à un sujet humain ou animal pour prévenir ou traiter une affection médicale.
L'invention concerne donc également un procédé d'apport d'ADN plasmidique depuis une cellule bactérienne support à une cellule bactérienne cible par conjugaison, le procédé comprenant la mise en contact de la cellule bactérienne cible avec la cellule support telle que divulguée ici, la cellule cible comprenant un système de restriction modification (RM) qui clive l'ADN qui est non méthylé au niveau d'un site cible de méthylation de l'enzyme méthyltransférase.
De cette manière, l'ADN plasmidique transféré par conjugaison est protégé d’un clivage par le système RM dans la cellule cible par l'expression, directement dans la cellule cible, de la MTase codée.
La mise en contact de la cellule bactérienne support et de la bactérie cible peut se faire par administration de la première par une composition pharmaceutique destinée à être administrée à un sujet humain ou animal pour prévenir ou traiter une condition médicale, par ex. à un microbiote intestinal, pulmonaire, cutané ou rénal. L'administration peut être orale, par inhalation, topique ou parentérale (par exemple IV).
De préférence, le plasmide code pour plus d'une MTase, de préférence 2, 3, 4, 5 ou même plus de MTases. De préférence, le plasmide code pour plus d'une MTase de type I. De préférence, le plasmide code pour plus d'une MTase de type II. De préférence, le plasmide code pour plus d'une MTase de type III. De préférence, le plasmide code pour une MTase de type I et une MTase de type II et/ou III.
Le plasmide peut coder pour de multiples MTases en tant que partie d'un opéron, ou l'expression de différentes MTases peut être contrôlée par plus d'un promoteur, par exemple en tant que partie de 2 ou plus opérons. Chaque séquence nucléotidique codant pour une MTase peut être sous le contrôle d'un promoteur respectif.
Le plasmide peut coder pour l'ADN du phage ou coder pour un génome de phage entier.
Lorsqu'une cellule bactérienne ou des bactéries sont mentionnées ici en relation avec l'invention, l'invention peut s'appliquer à la placemutatis mutandisà une cellule d'archée ou à une archée.
Le plasmide à transférer par conjugaison peut lui-même comprendre de l'ADN méthylé pour protéger davantage contre la digestion par les enzymes de restriction des cellules cibles. La méthylation du plasmide peut être par exemple par expression d’enzymes méthylases dans la cellule bactérienne support à partir d'un plasmide différent du plasmide conjugatif, ou résulter des enzymes du plasmide conjugatif lui-même, ou peut résulter d'une pré-méthylation dans une souche de production.
L'invention porte donc sur une cellule bactérienne support ayant un plasmide et/ou un génome codant pour une ou plus MTases qui offrent la méthylation d'un dit ADN plasmidique conjugatif dans la cellule support.
La cellule bactérienne support peut être fournie sous la forme d'une population de cellules telles que 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014cellules ou plus.
Dans un deuxième aspect, l'invention porte sur un bactériophage codant pour une enzyme méthyltransférase, optionnellement dans lequel l'enzyme méthyltransférase est une enzyme qui protège contre un système RM trouvé dans une espèce ou souche bactérienne qui est pathogène chez les humains et animaux.
L'invention prévoit également un acide nucléique (par ex. un ADN) qui code pour un tel bactériophage.
Le génome du bactériophage peut coder pour plus d'une MTase.
L'invention porte également sur un mélange (également appelé ici cocktail) d'au moins 2 bactériophages, chaque bactériophage codant pour une enzyme méthyltransférase différente, tel que 3, 4, 5 bactériophages voire plus, chacun codant pour une MTase différente. L'invention concerne également un mélange (également appelé ici cocktail) d’un premier et d’un second bactériophages, dans lequel chaque bactériophage code pour au moins une méthyltransférase et dans lequel le premier bactériophage code pour une méthyltransférase qui n'est pas codée par le second bactériophage. Par exemple, le premier bactériophage et le second bactériophage ne codent pour aucune MTase en commun.
Les données fournies ici montrent que l'inclusion d'une enzyme méthyltransférase sur un bactériophage qui est apporté à une cellule bactérienne cible augmente l'efficacité de l’infection par bactériophage par rapport à un bactériophage dépourvu de cette même méthyltransférase, dans le contexte d'une cellule bactérienne cible dans laquelle cette méthyltransférase peut protéger contre un système RM hôte.
L’invention porte également sur un procédé d'apport d'un bactériophage à une cellule bactérienne cible, le procédé comprenant la mise en contact de la cellule cible avec un bactériophage codant pour une enzyme méthyltransférase telle que divulguée ici, dans lequel la bactérie cible comprend un système de restriction modification qui clive l'ADN qui est non méthylé en un site cible de méthylation de l'enzyme méthyltransférase.
Les données fournies ici montrent également que l'expression de multiples MTases dans une souche de production peut améliorer l'infection médiée par les bactériophages des bactéries cibles par rapport à un témoin non méthylé.
Avantageusement, de multiples MTases peuvent être utilisées pour protéger le plasmide, le phagémide ou l'acide nucléique de phage, de l'action de différents systèmes RM au sein d'une cellule bactérienne cible. Ainsi, dans un mode de réalisation, le plasmide ou l'acide nucléique de phage code pour des première et seconde MTases, les MTases étant des MTases de différents systèmes RM, par ex. des systèmes RM trouvés ensemble dans une seule espèce ou souche bactérienne ou archéale.
Par conséquent, dans un autre aspect encore l'invention porte sur un procédé de méthylation d'un ADN de bactériophage ou d'un ADN de phagémide ou d'un ADN de plasmide, le procédé comprenant :
l’introduction dans une bactérie hôte de production, tel que dans le génome d'une bactérie hôte de production (i) d’une séquence nucléotidique codant pour une pluralité de méthyltransférases, ou (ii) de deux ou plus séquences nucléotidiques codant ensemble pour une pluralité de méthyltransférases,
la production, par cela, d’une bactérie hôte de production modifiée exprimant au moins 2 méthyltransférases introduites, convenablement qui se trouvent ne pas naturellement apparaître dans la cellule de bactérie hôte ;
l’infection de la bactérie hôte de production ayant une activité de méthylation altérée avec une particule de bactériophage comprenant de l'ADN de bactériophage ou de l'ADN de phagémide, ou la transformation de la bactérie avec un plasmide comprenant de l'ADN de plasmide, méthylant ainsi ledit ADN de bactériophage ou ADN de phagémide ou ADN de plasmide ; et
la production d’une particule de bactériophage comprenant de l'ADN de bactériophage ou de l'ADN de phagémide, ou la production de l'ADN de plasmide, ayant un motif de méthylation produit par des méthyltransférases dans la bactérie hôte, optionnellement l’isolation, encore, de la particule de bactériophage comprenant de l'ADN de bactériophage ou de l'ADN de phagémide, ou l’isolation de l'ADN de plasmide ou du plasmide.
Optionnellement, le procédé comprend en outre la formulation du bactériophage, du plasmide ou de l’ADN isolé avec un diluant, support ou excipient pharmaceutiquement acceptable pour produire une composition pharmaceutique.
Le procédé de méthylation d'un ADN de bactériophage ou d’un ADN de phagémide ou d’un ADN plasmidique peut également mettre en œuvre un acide nucléique de bactériophage ou de phagémide ou un ADN plasmidique tel que décrit ci-dessus qui code lui-même pour une MTase, et ce procédé combine donc une méthylation de souche de production (apportée en trans) et une méthylation par une MTase ou des MTases codées par l'ADN qui est introduit dans la bactérie cible (apportée en cis).
L'invention concerne également un bactériophage ou phagémide ou plasmide produit par le procédé ci-dessus dans la souche de production.
Chaque MTase décrite ici peut être une MTase de type 1, de type II ou de type III. Dans un exemple, au moins une MTase de Type I est utilisée.
Une MTase peut être fournie en cis et/ou trans.
Lorsque plusieurs MTases sont fournies, celles-ci peuvent être fournies en cis (par ex. sur le plasmide conjugatif ou le phage ou le phagémide qui est apporté à une cellule cible), ou en trans (par ex. par un plasmide non conjugatif corésident dans une cellule souche de production ou cellule support), ou les deux.
Dans un aspect, la MTase est une MTase Eco0015, (une MTase de Type I) qui méthyle au sein de la séquence de reconnaissance CCANNNNNNNCTTC.
L'invention concerne également toute MTase qui méthyle au sein de la séquence de reconnaissance CCANNNNNNNCTTC
Dans un aspect, la MTase est une MTase EcoK1, (de type I) qui méthyle au sein de la séquence de reconnaissance AACNNNNNNGTGC
L'invention concerne également toute MTase qui méthyle au sein de la séquence AACNNNNNNGTGC
D'autres méthylases qui peuvent être codées sur le phage, le plasmide conjugatif ou la souche de production comprennent M. EcoA1, M. EcoAO831, M.EcoMII, M.EcoMIII, M1 M2 Eco31I, M.Eco1167.
L'invention concerne également toute MTase qui méthyle au sein d’une séquence suivante. Ces séquences sont, par exemple, associées à la MTase comme répertorié ci-dessous :
M.EcoAI GAGNNNNNNNGTCA
M.EcoAO83I GGANNNNNNNNATGC
M.EcoMII RTACNNNNGTG
M.EcoMIII AAAGNNNNGTT
M1 M2 Eco31I GGT CTC
M.Eco1167 YTCANNNNNNGTTY
M.EcoRII CCWGG
En particulier, nous avons identifié la prévalence de ces sites comme suit :
Identifiant REBASE Séquence de reconnaissance* Type Prévalence dans les isolats d'E. coli**
EcoMII RTACNNNNGTG I 147
EcoAI GAGNNNNNNNGTCA I 48
EcoKI AACNNNNNNGTGC I 38
EcoAO83I GGANNNNNNNNATGC I 34
EcoMIII AAAGNNNNGTT I 157
Eco0015 CCANNNNNNNCTTC I 55
Eco1167 YTCANNNNNNGTTY I 29
M1.Eco31I GGTCTC II 177
* séquence de reconnaissance avec A méthylé en gras et T correspondant à l’A méthylé sur le brin complémentaire souligné (en l’absence d’indication : les bases méthylées n'ont pas été déterminées)
** prévalence dans une collection de 932 isolats cliniques d'E. coli au total
Les systèmes RM les plus répandus trouvés dans la séquence génomique des isolats cliniques d'E. coli ont reçu un identifiant basé sur une identité minimale de 99,5 % des acides aminés avec les séquences décrites dans REBASE (http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html)
Dans tout aspect, la méthyltransférase peut être une méthyltransférase provenant d'une souche ou d'une espèce bactérienne pathogène.
Dans tout aspect, la méthyltransférase peut être une méthyltransférase provenant d'une bactérie associée à une corrosion bactérienne ou à un encrassement biologique.
La méthyltransférase peut être une méthyltransférase qui protège contre les systèmes RM de type I, de type II ou de type III, et optionnellement de multiples systèmes, tels que le type I et le type II, le type I et le type III ou le type II et III, ou tous les trois.
La méthyltransférase peut être une méthyltransférase qui protège contre un système RM présent dans l'une quelconque des bactériesStaphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Salmonella, Listeria, E coli, DesulfovibrioouClostridium. Par exemple, la méthyltransférase peut être une méthyltransférase qui protège contre un système RM trouvé dansE coli. Par exemple, la méthyltransférase peut être une méthyltransférase qui protège contre un système RM trouvé dansC difficile. Par exemple, la méthyltransférase peut être une méthyltransférase qui protège contre un système RM trouvé dansK pneumoniae. Par exemple, la méthyltransférase peut être une méthyltransférase qui protège contre un système RM trouvé dansP aeruginosa. Par exemple, la méthyltransférase peut être une méthyltransférase qui protège contre un système RM trouvé dansS typhimurium. Par exemple, la méthyltransférase peut être une méthyltransférase qui protège contre un système RM trouvé dansH pylori.
La MTase peut être toute MTAse qui protège contre un système RM trouvé dans une espèce bactérienne divulguée dans le Tableau 1 de WO 2017/211753 A1, laquelle liste est spécifiquement incorporée ici par référence.
La MTase peut être une MTase d'Enterobacteriaceaetelles queE. coli, Salmonella, Yersinia pestis, Klebsiella, Shigella, Proteus, Enterobacter, SerratiaetCitrobacter.
Une MTase peut être une MTase orpheline ou de promiscuité.
Lorsque plus d'une MTase est codée, il peut s'agir d'une combinaison d'une MTase de promiscuité et d'une MTase spécifique de non promiscuité.
Le bactériophage auquel il est fait référence ici peut être tout bactériophage approprié pour un ciblage d'une cellule cible qui porte un système RM qui clive de l'ADN non méthylé, de préférence des virus à ADN.
Les Bacteriophages mentionnés ici peuvent être tout phage d'un genre sélectionné parmi lesDhakavirus , Gaprivervirus , Gelderlandvirus , Jiaodavirus , Karamvirus , Krischvirus , Moonvirus , Mosigvirus , Schizotequatrovirus , SlopekvirusetTequatrovirus. Chaque phage mentionné ici peut être un phage d'entérobactéries, phage d’E coli, phage deMyoviridae, phage deTevenvirinae, phage deTequatrovirus, phage deCaudovirales, des virus adéno-associés (AAV), des virus herpès simplex, des rétrovirus ou des lentivirus. Par exemple, chaque virus ou phage mentionné ici peut être d'un genre sélectionné parmi lesDhakavirus , Gaprivervirus , Gelderlandvirus , Jiaodavirus , Karamvirus , Krischvirus , Moonvirus , Mosigvirus , Schizotequatrovirus , SlopekvirusetTequatrovirus. Chaque phage mentionné ici peut être un virus de Klebsiella (par ex. phage de Klebsiella PMBT1, phage de Klebsiella PKO111, phage de Klebsiella phi KpNIH-6, phage de Klebsiella Miro, phage de Klebsiella vB_KpnM_Kp_V477, phage de Klebsiella KP27, phage de Klebsiella KP15, phage de Klebsiella KP1 ou phage de Klebsiella JD18), un phage d’Acinetobacter (par ex. virus d’Acinetobacter 133), un phage d’Aeromonas (par ex. virus d’Aeromonas 65 ou virus d’Aeromonas Aeh1), un phage d’Escherichia (par ex. virus d’Escherichia RB16, virus d’Escherichia RB32 ou virus d’Escherichia RB43) ou un phage de Pseudomonas (par ex. virus de Pseudomonas 42). Chaque phage mentionné ici peut être un phage de Tevenvirinae, par ex. un phage sélectionné dans le Tableau D. Un phagémide mentionné ici peut être une version modifiée du génome de tout phage divulgué dans ce paragraphe.
Des cocktails (mélanges) de 2 bactériophages ou plus peuvent être utilisés dans lesquels chaque bactériophage d’un même type code pour une enzyme MTase différente nécessaire pour une protection dans une cellule hôte cible.
Un cocktail ou un mélange ainsi que mentionné ici peut être une population de phages, la population consistant en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 (ou plus de 10) types différents de bactériophages ou de phagémides, chaque bactériophage/phagémide étant conforme à l'invention.
Alternativement, un cocktail de bactériophages peut également comprendre un phage ayant un squelette de bactériophage différent ainsi qu'une MTase différente - ainsi, le cocktail pourrait, par exemple, être un bactériophage P1 et M13, où le P1 code pour une MTase qui n'est pas codée par le M13, où le M13 code pour une MTase qui est (ou n'est pas) codée par le P1 ; ou où le M13 code pour une MTase qui n'est pas codée par le P1, où le P1 code pour une MTase qui est (ou n'est pas) codée par le M13.
Dans un mode de réalisation, les bactériophages sont spécifiques à une seule souche ou une seule espèce de bactéries. Ici, l'homme du métier comprendra que "spécifique à" fait référence au profil d'infectivité de l'hôte de chaque phage.
Dans un autre mode de réalisation, des bactériophages qui sont capables d'infecter deux ou plus souches bactériennes ou deux ou plus espèces de bactéries peuvent être utilisés.
Dans un mode de réalisation, chaque bactériophage, plasmide ou phagémide est destiné à être utilisé chez l’humain ou l’animalin vivo, par ex. pour une utilisation en tant que médicament.
Dans un mode de réalisation, chaque bactériophage, plasmide ou phagémide est destiné à être utilisé dans un environnement, par ex. pour une utilisation dans le rattrapage d'un encrassement biologique ou d'une corrosion microbienne d'une surface (par ex. une surface métallique).
Dans un mode de réalisation, chaque bactériophage, plasmide ou phagémide est utiliséex vivoouin vitro.
Le phage tel que divulgué ici peut être un phage P1, un phage M13, un phage A, un phage T4, un phage PhiC2, un phage PhiCD27, un phage PhiNMl, un phage Bc431v3, un phage Phi10, un phage Phi25, un phage Phi151, un phage de type A511, un phage B054, un phage de type 01761 ou un phage de Campylobacter, optionnellement NCTC12676 ou NCTC12677. Le phage peut être un phage lambda. Le phage peut être tout phage d'un genre sélectionné parmi lesDhakavirus , Gaprivervirus , Gelderlandvirus , Jiaodavirus , Karamvirus , Krischvirus , Moonvirus , Mosigvirus , Schizotequatrovirus , SlopekvirusetTequatrovirus , tels que ceux divulgués ici.
Le phagémide tel que divulgué ici peut être un phagémide P1, un phagémide M13, un phagémide A, un phagémide T4, un phagémide PhiC2, un phagémide PhiCD27, un phagémide PhiNMl, un phagémide Bc431v3, un phagémide Phi10, un phagémide Phi25, un phagémide Phi151, un phagémide de type A511, un phagémide B054, un phagémide de type 01761, un phagémide de Campylobacter, optionnellement NCTC12676 ou NCTC12677. Dans un exemple, le phagémide est un phagémide lambda. Le phagémide peut être dérivé de tout phage d'un genre sélectionné parmi lesDhakavirus , Gaprivervirus , Gelderlandvirus , Jiaodavirus , Karamvirus , Krischvirus , Moonvirus , Mosigvirus , Schizotequatrovirus , SlopekvirusetTequatrovirus , tels que ceux divulgués ici.
Un phagémide peut coder pour une particule de transduction non autoréplicative, comme cela est familier à l'homme du métier.
Un plasmide conjugatif tel que divulgué ici est un plasmide qui est transféré par conjugaison bactérienne. Les plasmides conjugatifs comprennent au moins une origine de transfert, oriT, et peuvent comprendre un ou plus ou la totalité d'un ensemble de gènes de transfert (tra) nécessaires à la conjugaison. Ces fonctions géniques tra peuvent être alternativement être fournies en tout ou en partie par la cellule support comprenant le plasmide.
Dans un mode de réalisation préféré, tous les gènes tra nécessaires requis pour la conjugaison sont compris sur le plasmide.
La cellule bactérienne support comprenant le plasmide conjugatif peut être toute bactérie appropriée, mais est de préférence une bactérie qui n'est pas pathogène chez les humains ou animaux. L'espèce bactérienne peut être toute espèce divulguée ici, par ex.E. coliou une espèce de Bacteriodies. La cellule bactérienne support peut être, par exemple, une cellule de Bacteriodes,Escherichia, Salmonella, Clostridium, Bifidobacterium , Lactobacillus, Pseudomonas, Caulobacter , Listeria, Proteus ou Streptococcus.
Des répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR, de l’anglais « Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats »), en combinaison avec les gènes associés à CRISPR (cas, de l’anglais « CRISPR-associated ») constituent le système CRISPR-Cas, qui confère une immunité adaptative à de nombreuses bactéries et à la plupart des archées. L'immunisation médiée par CRISPR se produit par l'intégration d'ADN d'éléments génétiques invasifs tels que des plasmides et bactériophages qui peuvent être utilisés pour prévenir de futures infections par des envahisseurs contenant la même séquence. Les systèmes CRISPR-Cas consistent en des matrices CRISPR de courtes "répétitions" d'ADN espacées par des séquences "espaceur" hypervariables et un ensemble de gènes cas flanquants. Dans tout aspect de l'invention, l'acide nucléique qui est apporté à la cellule cible peut comprendre une matrice CRISPR, de manière appropriée une matrice qui comprend au moins un espaceur sensiblement complémentaire d'une séquence d'ADN cible dans la bactérie cible. De cette manière, la séquence d'ADN cible de la bactérie cible peut être modifiée par le système CRISPR-cas en utilisant l'espaceur pour cibler spécifiquement la séquence cible. La méthylation de l'ADN codant pour la matrice - ainsi que pour tous les autres composants du système CRISPR-cas qui sont également apportés à la cellule cible - est protégée du clivage par restriction et fonctionnera donc plus efficacement au sein de la cellule cible. La matrice CRISPR est également appelée ici matrice CRISPR de modification de cellule cible.
La matrice CRISPR peut faire partie de l'acide nucléique du bactériophage, de l'acide nucléique du phagémide ou du plasmide conjugatif.
La matrice comprend de manière appropriée une séquence espaceur et des répétitions codant pour un ARNcr, l'ARNcr comprenant une séquence qui s'hybride à une cible ADN d’une cellule cible pour guider une enzyme Cas vers la cible.
La modification de la séquence génique cible qui résulte de l'apport d'une matrice CRISPR dans la bactérie cible peut inclure un clivage d'un ou des deux brins de l'ADN cellulaire cible au niveau de la séquence cible, provoquant l'inactivation de l'expression du gène, directement ou indirectement, ou peut entraîner la destruction de la cellule.
Dans un aspect, le réseau CRISPR est une molécule d'acide nucléique qui comprend au moins deux séquences de répétition et au moins une séquence espaceur, l'une des deux séquences de répétition étant liée à l'extrémité 5' de la séquence espaceur et l'autre des deux séquences de répétition est liée à l'extrémité 3' de la séquence espaceur. Le réseau CRISPR peut comprendre 2 ou plus séquences espaceurs de répétition, tel que 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 séquences espaceurs de répétition ou plus, de manière appropriée tous les espaceurs dans ladite matrice étant flanqués sur à la fois l'extrémité 5' et l'extrémité 3' par une séquence de répétition.
D'autres composants du système CRISPR-cas peuvent être compris dans (codés par) l'acide nucléique du bactériophage, l'acide nucléique du phagémide ou le plasmide conjugatif, et ceux-ci incluent l’un ou plus parmi
(i) une endonucléase cas,
(ii) une séquence d’ARNtracr ou une séquence d'ADN exprimant une séquence d’ARNtracr.
La fonctionnalité de l'endonucléase cas peut alternativement être fournie naturellement de l’intérieur de la bactérie cible.
Lorsqu'elle est apportée en tant que partie du bactériophage, phagémide ou plasmide, l'endonucléase cas peut être une nucléase cas de type I, type II, type III, type IV, type V ou type VI, telle que cas3 ou cas9 ou cpf1.
La séquence d'espaceur est complémentaire d'une séquence d'ADN cible dans le génome de la cellule cible, et peut être entièrement (100 %) complémentaire ou substantiellement complémentaire (par ex. au moins environ complémentaire à 70% (par ex. environ 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) à l'ADN cible. La séquence d'espaceur peut avoir un, deux, trois, quatre ou cinq mésappariements par rapport à l'ADN cible. Les mésappariements peuvent être contigus ou non contigus. La séquence espaceur peut avoir une complémentarité complète ou une complémentarité substantielle sur une région d'une séquence de nucléotides cible qui a une longueur d'au moins environ 20 nucléotides à environ 100 nucléotides.
La cellule bactérienne support, le bactériophage, le phagémide ou le plasmide divulgué(e) ici code de préférence pour une MTase et une charge utile, par ex. un réseau CRISPR. Par exemple, la charge utile et la MTase sont codées sur le même ADN.
L'acide nucléique apporté peut coder pour une nucléase guidée (optionnellement une Cas) et/ou un ARN guide et/ou l'acide nucléique apporté comprend une matrice CRISPR pour produire un ARNcr dans la cellule cible. La nucléase guidée peut être une nucléase Cas (par ex. une nucléase Cas de Type I, II, III, IV, V ou VI, par ex. une Cas9, une Cas3, une Cas12 ou une Cas13). La nucléase guidée peut être une TALEN, une nucléase à doigt de zinc ou une méganucléase.
L'acide nucléique apporté peut comprendre ou consister en 1 à 10 kb, par ex. 1 à 9, 1 à 8, 1 à 7, 1 à 6, 1 à 5, 1 à 4, 1 à 3 ou 1 à 2 kb d'ADN. Par exemple, l'acide nucléique apporté comprend une matrice CRISPR (et/ou une séquence nucléotidique codant pour un ARN guide, tel qu'un ARN guide unique) et optionnellement une ou plus séquence(s) nucléotidique(s) codant chacune pour une Cas respective.
L'acide nucléique apporté peut coder pour une protéine CRISPR Cascade (par ex. Cas A, B, C, D ou E).
L'acide nucléique apporté peut coder pour un ARNcr. L'ADN hétérologue peut coder pour un ARN simple guide (ARNsg). L'ADN hétérologue peut coder pour un ARNtracr.
Voici les aspects préférés des composants du système CRISPR-cas :
La Cas peut être toute Cas (par ex. une Cas2, 3, 4, 5 ou 6) d'un système de Type I. Dans un mode de réalisation, la Cas peut être fusionnée ou conjuguée à un fragment qui est utilisable pour augmenter ou réduire la transcription d'un gène comprenant la séquence de proto-espaceur cible. Par exemple, l'acide nucléique codant pour la Cas qui est introduit dans une cellule peut comprendre une séquence nucléotidique codant pour le fragment, la Cas et le fragment étant exprimés dans la cellule hôte en tant que protéine de fusion. Dans un mode de réalisation, la Cas est N-terminale du fragment ; dans un autre mode de réalisation, elle est C-terminale du fragment.
Optionnellement, une ou plus protéine(s) Cascade peut(peuvent) être fournie(s) par ou à une cellule cible. Par exemple, une première Cas (C1) et/ou une deuxième Cas (C2) peut(peuvent) être fournie(s) et la ou les protéine(s) Cascade est(sont) apparentée(s) à la C1 ou C2, qui est une Cas3. Par exemple, une première Cas (C1) et/ou une deuxième Cas (C2) sont fournies et Cas1 ou Cas2 est une Cas3 qui est apparentée aux protéines Cascade codées par la cellule.
Optionnellement, les protéines Cascade comprennent ou consistent en cas5 (casD, csy2), cas6 (cas6f, cse3, casE), cas7 (csc2, csy3, cse4, casC) et cas8 (casA, cas8a1, cas8b1, cas8c, cas10d, cas8e, cse1, cas8f, csy1).
Optionnellement, de l’acide nucléique apporté est fourni, comprenant un promoteur et une séquence codant pour Cas3 ou codant pour l’ARNcr qui ne sont pas espacées de plus de 150, 100, 50, 40, 30, 20 ou 10 pb, et sont p. ex. espacées de 30-45, ou de 30-40, ou de 39 ou d’environ 39 pb. Optionnellement ici, un site de liaison du ribosome et la séquence codant pour Cas3 ou codant pour l’ARNcr ne sont pas espacées de plus de 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 4 ou 3 pb, et sont p. ex. séparées de 10 à 5, de 6 ou d’environ 6 pb.
Dans un exemple, un promoteur mentionné ici est en combinaison avec une séquence Shine-Dalgarno comprenant la séquence 5'-aaagaggagaaa-3' (SEQ ID NO : 1) ou une homologue de site de liaison de ribosome de celle-ci. Optionnellement, le promoteur a un score d'Anderson (AS) de AS ≥ 0,5 ; ou un score d'Anderson (AS) de 0,5 > AS > 0,1 ; ou un score d'Anderson (AS) de ≤ 0,1.
Optionnellement, l’acide nucléique apporté est dépourvu de séquence nucléotidique codant pour une, plus ou la totalité de Cas1, Cas2, Cas4, Cas6 (optionnellement Cas6f), Cas7 et Cas 8 (optionnellement Cas8f). Optionnellement, l’ADN est dépourvu d'une séquence codant pour une Cas6 (optionnellement une Cas6f). Optionnellement, l’ADN comprend (optionnellement dans la direction 5' à 3') une séquence nucléotidique codant pour une, plus ou la totalité de Cas11, Cas7 et Cas8a1. Optionnellement, l’ADN comprend une séquence nucléotidique codant pour Cas3' et/ou Cas3''. Dans un mode de réalisation, l’ADN comprend des séquences nucléotidiques (dans la direction 5' à 3') qui codent pour une Cas3 (p. ex., Cas3' et/ou Cas3''), Cas11, Cas7 et Cas8a1.
Optionnellement, une séquence nucléotidique codant pour Cas6 se situe entre la ou les séquence(s) Cas3 et la séquence Cas11.
Optionnellement, l’acide nucléique apporté comprend une matrice CRISPR de Type IA ou une ou plus séquence(s) nucléotidique(s) codant pour un ou plus ARN guide(s) unique(s) (ARNg(s)), la matrice et chaque ARNg comprenant une séquence de répétition qui est apparentée à une Cas3. Ainsi, la matrice est utilisable dans une cellule hôte lorsque l’ADN hybride a été introduit dans la cellule pour la production d'ARN guides, les ARN guides pouvant être utilisés avec les protéines Cas et Cascade pour cibler et modifier (p. ex., couper) une séquence nucléotidique cible dans la cellule hôte, tuant ainsi optionnellement la cellule. De même, les ARN guides uniques codés par l’acide nucléique apporté dans un mode de réalisation sont utilisables avec les protéines Cas et Cascade pour cibler et modifier (p. ex., couper) une séquence nucléotidique cible dans la cellule hôte, tuant ainsi optionnellement la cellule.
Optionnellement, une cellule cible comprend une matrice CRISPR de Type IA qui est apparentée à la Cas3 (C1 ou C2). Optionnellement, une cellule cible comprend un système CRISPR/Cas endogène de Type IB, C, U, D, E ou F. Optionnellement, l’acide nucléique apporté comprend (optionnellement dans la direction 5' à 3') une séquence nucléotidique codant pour une, plus ou la totalité de Cas8b1, Cas7 et Cas5. Dans un mode de réalisation, l’acide nucléique apporté comprend des séquences nucléotidiques (dans la direction 5' à 3') qui codent pour Cas3, Cas8b1, Cas7 et Cas5. Optionnellement, une séquence nucléotidique codant pour Cas6 se situe entre la ou les séquence(s) Cas3 et la séquence Cas8b1. Optionnellement, l’acide nucléique apporté comprend une matrice CRISPR de Type IB ou une ou plus séquence(s) nucléotidique(s) codant pour un ou plus ARN guide(s) unique(s) (ARNg(s)), la matrice et chaque ARNg comprenant une séquence de répétition qui est apparentée à la Cas3. Ainsi, la matrice est utilisable dans une cellule hôte lorsque l’acide nucléique apporté a été introduit dans la cellule pour la production d'ARN guides, les ARN guides étant utilisables avec les protéines Cas et Cascade pour cibler et modifier (p. ex., couper) une séquence nucléotidique cible dans la cellule hôte, tuant ainsi optionnellement la cellule hôte. De même, les ARN guides uniques codés par l’acide nucléique apporté dans un mode de réalisation sont utilisables avec les protéines Cas et Cascade pour cibler et modifier (p. ex., couper) une séquence nucléotidique cible dans la cellule, tuant ainsi optionnellement la cellule.
Optionnellement, la cellule cible comprend une matrice CRISPR de Type IB qui est apparentée à la Cas3.
Optionnellement, la cellule cible comprend un système CRISPR/Cas endogène de Type IA, C, U, D, E ou F. Optionnellement, l’acide nucléique apporté comprend (optionnellement dans la direction 5' à 3') une séquence nucléotidique codant pour une, plus ou la totalité de Cas5, Cas8c et Cas7. Dans un mode de réalisation, l’acide nucléique apporté comprend des séquences nucléotidiques (dans la direction 5' à 3') qui codent pour Cas3, Cas5, Cas8c et Cas7. Optionnellement, une séquence nucléotidique codant pour Cas6 se situe entre la ou les séquence(s) Cas3 et la séquence Cas5. Optionnellement, l’acide nucléique apporté comprend une matrice CRISPR de Type IC ou une ou plus séquence(s) nucléotidique(s) codant pour un ou plus ARN guide(s) unique(s) (ARNg(s)), la matrice et chaque ARNg comprenant une séquence de répétition qui est apparentée à la Cas3. Ainsi, la matrice est utilisable dans une cellule hôte lorsque l’acide nucléique apporté a été introduit dans la cellule pour la production d'ARN guides, les ARN guides étant utilisables avec les protéines Cas et Cascade pour cibler et modifier (p. ex., couper) une séquence nucléotidique cible dans la cellule, tuant ainsi optionnellement la cellule. De même, les ARN guides uniques codés par l’acide nucléique apporté dans un mode de réalisation sont utilisables avec les protéines Cas et Cascade pour cibler et modifier (p. ex., couper) une séquence nucléotidique cible dans la cellule, tuant ainsi optionnellement la cellule.
Optionnellement, la cellule cible comprend une matrice CRISPR de Type IC qui est apparentée à la Cas3. Optionnellement, la cellule cible comprend un système CRISPR/Cas endogène de Type IA, B, U, D, E ou F. Optionnellement, l’acide nucléique apporté comprend (optionnellement dans la direction 5' à 3') une séquence nucléotidique codant pour une, plus ou la totalité de Cas8U2, Cas7, Cas5 et Cas6. Dans un mode de réalisation, l’acide nucléique apporté comprend des séquences nucléotidiques (dans la direction 5' à 3') qui codent pour Cas3, Cas8U2, Cas7, Cas5 et Cas6. Optionnellement, une séquence nucléotidique codant pour Cas6 se situe entre la ou les séquence(s) Cas3 et la séquence Cas8U2.
Optionnellement, l’acide nucléique apporté comprend une matrice CRISPR de Type IU ou une ou plus séquence(s) nucléotidique(s) codant pour un ou plus ARN guide(s) unique(s) (ARNg(s)), la matrice et chaque ARNg comprenant une séquence de répétition qui est apparentée à la Cas3. Ainsi, la matrice est utilisable dans une cellule hôte lorsque l’acide nucléique apporté a été introduit dans la cellule pour la production d'ARN guides, les ARN guides étant utilisables avec les protéines Cas et Cascade pour cibler et modifier (p. ex., couper) une séquence nucléotidique cible dans la cellule, tuant ainsi optionnellement la cellule. De même, les ARN guides uniques codés par le vecteur dans un mode de réalisation sont utilisables avec les protéines Cas et Cascade pour cibler et modifier (p. ex., couper) une séquence nucléotidique cible dans la cellule, tuant ainsi optionnellement la cellule.
Optionnellement, la cellule cible comprend une matrice CRISPR de Type IU qui est apparentée à la Cas3. Optionnellement, la cellule hôte comprend un système CRISPR/Cas endogène de Type IA, B, C, D, E ou F. Optionnellement, le vecteur comprend (optionnellement dans la direction 5' à 3') une séquence nucléotidique codant pour une, plus ou la totalité de Cas10d, Cas7 et Cas5. Optionnellement, l’acide nucléique apporté comprend une séquence nucléotidique codant pour Cas3' et/ou Cas3''. Dans un mode de réalisation, l’acide nucléique apporté comprend des séquences nucléotidiques (dans la direction 5' à 3') qui codent pour Cas3, Cas10d, Cas7 et Cas5. Optionnellement, une séquence nucléotidique codant pour Cas6 se situe entre la ou les séquence(s) Cas3 et la séquence Cas10d. Optionnellement, l’acide nucléique apporté comprend une matrice CRISPR de Type ID ou une ou plus séquence(s) nucléotidique(s) codant pour un ou plus ARN guide(s) unique(s) (ARNg(s)), la matrice et chaque ARNg comprenant une séquence de répétition qui est apparentée à la Cas3. Ainsi, la matrice est utilisable dans une cellule lorsque le vecteur a été introduit dans la cellule pour la production d'ARN guides, les ARN guides pouvant être utilisés avec les protéines Cas et Cascade pour cibler et modifier (p. ex., couper) une séquence nucléotidique cible dans la cellule, tuant ainsi optionnellement la cellule. De même, les ARN guides uniques codés par l’acide nucléique apporté dans un mode de réalisation sont utilisables avec les protéines Cas et Cascade pour cibler et modifier (p. ex., couper) une séquence nucléotidique cible dans la cellule, tuant ainsi optionnellement la cellule.
Optionnellement, la cellule cible comprend une matrice CRISPR de Type ID qui est apparentée à la Cas3.
Optionnellement, la cellule cible comprend un système CRISPR/Cas endogène de Type IA, B, C, U, E ou F.
Optionnellement, l’acide nucléique apporté comprend (optionnellement dans la direction 5' à 3') une séquence nucléotidique codant pour une, plus ou la totalité de Cas8e, Cas11, Cas7, Cas5 et Cas6. Dans un mode de réalisation, l’acide nucléique apporté comprend des séquences nucléotidiques (dans la direction 5' à 3') qui codent pour Cas3, Cas8e, Cas11, Cas7, Cas5 et Cas 6. Optionnellement, une séquence nucléotidique codant pour Cas6 se situe entre la ou les séquence(s) Cas3 et la séquence Cas11. Optionnellement, l’acide nucléique apporté comprend une matrice CRISPR de Type IE ou une ou plus séquence(s) nucléotidique(s) codant pour un ou plus ARN guide(s) unique(s) (ARNg(s)), la matrice et chaque ARNg comprenant une séquence de répétition qui est apparentée à la Cas3. Ainsi, la matrice est utilisable dans une cellule hôte lorsque le vecteur a été introduit dans la cellule pour la production d'ARN guides, les ARN guides pouvant être utilisés avec les protéines Cas et Cascade pour cibler et modifier (p. ex., couper) une séquence nucléotidique cible dans la cellule, tuant ainsi optionnellement la cellule. De même, les ARN guides uniques codés par l’acide nucléique apporté dans un mode de réalisation sont utilisables avec les protéines Cas et Cascade pour cibler et modifier (p. ex., couper) une séquence nucléotidique cible dans la cellule, tuant ainsi optionnellement la cellule.
Optionnellement, la cellule cible comprend une matrice CRISPR de Type IE qui est apparentée à la Cas3.
Optionnellement, la cellule cible comprend un système CRISPR/Cas endogène de Type IA, B, C, D, U ou F.
Optionnellement, l’acide nucléique apporté comprend (optionnellement dans la direction 5' à 3') une séquence nucléotidique codant pour une, plus ou la totalité de Cas8f, Cas5, Cas7 et Cas6f. Dans un mode de réalisation, l’acide nucléique apporté comprend des séquences nucléotidiques (dans la direction 5' à 3') qui codent pour Cas3, Cas8f, Cas5, Cas7 et Cas6f. Optionnellement, une séquence nucléotidique codant pour Cas6 se situe entre la ou les séquence(s) Cas3 et la séquence Cas8f. Optionnellement, l’acide nucléique apporté comprend une matrice CRISPR de Type IF ou une ou plus séquence(s) nucléotidique(s) codant pour un ou plus ARN guide(s) unique(s) (ARNg(s)), la matrice et chaque ARNg comprenant une séquence de répétition qui est apparentée à la Cas3. Ainsi, la matrice est utilisable dans une cellule lorsque le vecteur a été introduit dans la cellule pour la production d'ARN guides, les ARN guides pouvant être utilisés avec les protéines Cas et Cascade pour cibler et modifier (p. ex., couper) une séquence nucléotidique cible dans la cellule, tuant ainsi optionnellement la cellule. De même, les ARN guides uniques codés par l’acide nucléique apporté dans un mode de réalisation sont utilisables avec les protéines Cas et Cascade pour cibler et modifier (p. ex., couper) une séquence nucléotidique cible dans la cellule, tuant ainsi optionnellement la cellule.
Optionnellement, la cellule comprend une matrice CRISPR de Type IF qui est apparentée à la Cas3
Optionnellement, la cellule comprend un système CRISPR/Cas endogène de Type IA, B, C, D, U ou E.
Optionnellement, les Cas et Cascade sont des protéines Cas et Cascade de Type IA.
Optionnellement, les Cas et Cascade sont des protéines Cas et Cascade de Type IB.
Optionnellement, les Cas et Cascade sont des protéines Cas et Cascade de Type IC.
Optionnellement, les Cas et Cascade sont des protéines Cas et Cascade de Type ID.
Optionnellement, les Cas et Cascade sont des protéines Cas et Cascade de Type IE.
Optionnellement, les Cas et Cascade sont des protéines Cas et Cascade de Type IF.
Optionnellement, les Cas et Cascade sont des protéines Cas et Cascade de Type IU.
Optionnellement, les Cas et Cascade sont des protéines Cas et Cascade d'E coli (optionnellement de Type IE ou IF), l’E coli étant optionnellement une E. coli produisant des BLSE ou E. coli ST131-O25b:H4.
Optionnellement, les Cas et Cascade sont des protéines Cas et Cascade de Clostridium (p. ex., de C difficile), optionnellement de C difficile résistantes à un ou plus antibiotiques sélectionnés parmi les aminoglycosides, la lincomycine, les tétracyclines, l'érythromycine, la clindamycine, les pénicillines, les céphalosporines et les fluoroquinolones.
Optionnellement, les Cas et Cascade sont des protéines Cas et Cascade de Pseudomonas aeruginosa, optionnellement de P aeruginosa résistantes à un ou plus antibiotiques sélectionnés parmi les carbapénèmes, les aminoglycosides, le céfépime, la ceftazidime, les fluoroquinolones, la pipéracilline et le tazobactam.
Optionnellement, les Cas et Cascade sont des protéines Cas et Cascade de Klebsiella pneumoniae (p. ex., de Klebsiella pneumoniae résistante aux carbapénèmes ou K pneumoniae produisant de la bêta-lactamase à spectre étendu (BLSE)).
Optionnellement, les Cas et Cascade sont des protéines Cas et Cascade d’E coli, de C difficile, de P aeruginosa, de K pneumoniae, de P furiosus ou de B halodurans.
Optionnellement, chaque ARNcr ou ARNg comprend une séquence d’espaceur qui est capable de s'hybrider avec une séquence nucléotidique de proto-espaceur de la cellule, la séquence de proto-espaceur étant adjacente à un PAM (de l’anglais « protospacer adjacent motif », soit « motif adjacent au proto-espaceur »), le PAM étant apparenté à la C1 ou C2, C1 ou C2 étant une nucléase Cas, p. ex., une Cas3. Ainsi, l'espaceur s'hybride avec le proto-espaceur pour guider la Cas3 vers le proto-espaceur. Optionnellement, la Cas3 coupe le proto-espaceur, p. ex. en utilisant l'activité d’exo- et/ou endonucléase de la Cas3. Optionnellement, la Cas3 enlève une pluralité (p. ex., au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) nucléotides du proto-espaceur.
L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques comprenant le bactériophage, phagémide ou les cellules supports tel(les) que divulgué(e)s ici en combinaison avec un diluant, support ou excipient pharmaceutiquement acceptable. Les supports et excipients appropriés sont bien connus et incluent l'eau convenablement stérilisée, les solutions salines et les solutions salines tamponnées. Dans certains aspects, lorsqu'il y a apport au tractus gastro-intestinal, la cellule support ou le phage apporté est convenablement protégé de l'acide par un revêtement entérique, ou un autre revêtement qui peut empêcher un effet adverse sur la cellule ou le phage dans l'environnement gastrique tel que l'estomac.
Toute composition (par ex. une composition pharmaceutique) mentionnée ici peut être comprise par un récipient médical ou un récipient stérile, par ex. une seringue, une poche IV, un stylo auto-injecteur ou un flacon.
Lorsqu'il est utilisé, le bactériophage peut être lyophilisé préalablement à l'apport, puis reconstitué avant utilisation avec un diluant approprié.
L’apport du/de la bactériophage, phagémide ou cellule support comprenant un plasmide conjugatif tel que divulgué ici peut faire partie d'un procédé de prévention ou traitement d'une maladie humaine ou animale, optionnellement en combinaison avec une modification ciblée CRISPR-CAS d'une séquence cible au sein de la bactérie cible.
Dans un mode de réalisation, la modification au niveau de l'ADN cible de la bactérie cible entraîne la destruction ou l'atténuation de la bactérie cible. Lorsque la bactérie cible est pathogène, la modification fournit alors une prévention ou un traitement d'une maladie bactérienne pathogène directement par ladite destruction ou atténuation de la bactérie pathogène.
Par conséquent, l'invention concerne un procédé de prévention ou traitement d'une maladie causée par une bactérie cible pathogène chez l’humain ou l’animal, le procédé comprenant l'apport d'un bactériophage, d'un phagémide ou d'une cellule bactérienne support comprenant un plasmide conjugatif tel que divulgué ici, ou une composition pharmaceutique telle que divulguée ici, à l’humain ou l’animal en ayant besoin, et un bactériophage, un phagémide ou une cellule bactérienne support selon tel que divulgué(e) ici, ou une composition pharmaceutique telle que divulguée ici, destiné à être utilisé dans un procédé de prévention ou de traitement d'une maladie provoquée par une bactérie cible pathogène chez l’humain ou l’animal, le procédé comprenant l'apport du bactériophage, du phagémide ou de la cellule bactérienne support ou de la composition pharmaceutique à l'humain ou l'animal en ayant besoin.
La modification peut également offrir un traitement indirect ou la prévention d'une maladie, dans le cas où des bactéries présentes dans un hôte affectent négativement la réponse de l'hôte à des maladies autres qu'une maladie bactérienne. Par exemple, il a été démontré que les réponses des patients à des traitements contre le cancer sont influencées par la composition de leur microbiome, voir Vancheswaran Gopalakrishnan et al, Cancer Cell (en anglais : « Cellules cancéreuses »). 9 avril 2018 ; 33(4): 570–580.
Par conséquent, la présente invention concerne également un procédé de prévention ou traitement d'une maladie, le procédé comprenant l'apport d'un(e) bactériophage, phagémide ou cellule bactérienne support comprenant un plasmide conjugatif tel que divulgué ici, ou une composition pharmaceutique divulguée ici, à un humain ou animal ayant besoin de celui-ci, l'humain ou animal comprenant une bactérie cible ayant une séquence cible dont la modification entraîne des réponses améliorées au cancer ou à une immunothérapie anticancéreuse.
Par exemple, les bactéries cibles peuvent être desSalmonella, Clostridium, Bifidobacterium , Lactobacillus, Escherichia, Pseudomonas, Caulobacter , Listeria, ProteusetStreptococcus.
Les bactéries cibles peuvent être toute bactérie répertoriée dans le Tableau 1 de WO 2017/211753 A1, laquelle liste est spécifiquement incorporée ici par référence.
Le bactériophage, le phagémide et les cellules supports et les compositions pharmaceutiques divulgué(e)s ici peuvent également être utilisés dans des procédés en combinaison avec d'autres traitements médicaux, y compris, mais sans s'y limiter,
(i) des agents anticancéreux,
(ii) des antibiotiques et
(iii) des cellules bactériennes qui sont utilisées pour repeupler le microbiote humain ou animal.
Des exemples de médicaments appropriés sont fournis dans le Tableau E
L'apport d’un bactériophage, d’un phagémide et de cellules supports et de compositions pharmaceutiques telles que divulguées peut se faire par toute voie d’apport appropriée, telle qu’intraveineuse, intradermique, sous-cutanée, intramusculaire, topique, par inhalation ou apport intranasal(e), ou apport oral.
La présente invention peut être utilisée dans le traitement de maladies ou affections telles que les suivantes :
(a) Une maladie ou affection neurodégénérative ;
(b) Une maladie ou affection du cerveau ;
(c) Une maladie ou affection du SNC ;
(d) Perte ou altération de la mémoire ;
(e) Une maladie ou affection cardiaque ou cardiovasculaire, par ex. une crise cardiaque, un accident vasculaire cérébral ou une fibrillation auriculaire ;
(f) Une maladie ou affection du foie ;
(g) Une maladie ou affection des reins, par ex. une maladie rénale chronique (MRC) ;
(h) Une maladie ou affection du pancréas ;
(i) Une maladie ou affection pulmonaire, par ex. une fibrose kystique ou la MPOC ;
(j) Une maladie ou affection gastro-intestinale ;
(k) Une maladie ou affection de la gorge ou de la cavité buccale ;
(l) Une maladie ou affection oculaire ;
(m) Une maladie ou affection génitale, par ex. une maladie ou affection vaginale, labiale, pénienne ou scrotale ;
(n) Une maladie ou affection sexuellement transmissible, par ex. une gonorrhée, infection par le VIH, syphilis ou infection à Chlamydia ;
(o) Une maladie ou affection de l'oreille ;
(p) Une maladie ou affection de la peau ;
(q) Une maladie ou affection cardiaque ;
(r) Une maladie ou affection nasale ;
(s) Une maladie ou affection hématologique, par ex. une anémie, par ex. une anémie issue d'une maladie chronique ou d'un cancer ;
(t) Une infection virale ;
(u) Une infection bactérienne pathogène ;
(v) Un cancer ;
(w) Une maladie ou une affection auto-immune, par ex. le LED ;
(x) Une maladie ou une affection inflammatoire, par exemple la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis, l'eczéma, l'asthme, la rectocolite hémorragique, la colite, la maladie de Crohn ou une MICI (en anglais IBD) ;
(y) Autisme ;
(z) TDAH ;
(aa) Trouble bipolaire ;
(bb) SLA [Sclérose Latérale Amyotrophique] ;
(cc) Arthrose ;
(dd) Un défaut ou une affection congénitale ou du développement ;
(ee) Une fausse couche ;
(ff) Une maladie de la coagulation du sang ;
(gg) Bronchite ;
(hh) DMLA sèche ou humide ;
(ii) Néovascularisation (par ex. d'une tumeur ou dans l'œil) ;
(jj) Rhume commun ;
(kk) Epilepsie ;
(ll) Fibrose, par ex. fibrose hépatique ou pulmonaire ;
(mm) Une maladie ou affection fongique, par ex. le muguet ;
(nn) Une maladie ou affection métabolique, par ex. l'obésité, l'anorexie, les diabètes, les diabètes de Type I ou de Type II ;
(oo) Ulcère(s), par ex. ulcération gastrique ou ulcération cutanée ;
(pp) Peau sèche ;
(qq) Syndrome de Sjögren ;
(rr) Choc cytokinique ;
(ss) Surdité, perte ou déficience auditive ;
(tt) Métabolisme lent ou rapide (c-à-d plus lent ou rapide que la moyenne pour le poids, sexe et âge du sujet) ;
(uu) Trouble de la conception, par ex. infertilité ou faible fertilité ;
(vv) Ictère ;
(ww) Eruption cutanée ;
(xx) Maladie de Kawasaki ;
(yy) Maladie de Lyme ;
(zz) Une allergie, par ex. aux noix, à l'herbe, au pollen, aux acariens, à la fourrure ou aux squames de chats ou chiens ;
(aaa) Paludisme, fièvre typhoïde, tuberculose ou choléra ;
(bbb) Dépression ;
(ccc) Retard mental ;
(ddd) Microcéphalie ;
(eee) Malnutrition ;
(fff) Conjonctivite ;
(ggg) Pneumonie ;
(hhh) Embolie pulmonaire ;
(iii) Hypertension pulmonaire ;
(jjj) Trouble osseux ;
(kkk) Sepsis ou choc septique ;
(lll) Sinusite ;
(mmm) Stress (par ex. stress professionnel) ;
(nnn) Thalassémie, anémie, maladie de von Willebrand ou hémophilie ;
(ooo) Zona ou bouton de fièvre ;
(ppp) Menstruations ;
(qqq) Faible nombre de spermatozoïdes.
MALADIES OU AFFECTIONS NEURODEGENERATIVES OU DU SNC A TRAITER OU PREVENIR
Dans un exemple, une maladie ou une affection neurodégénérative ou du SNC est sélectionnée dans le groupe consistant en la maladie d'Alzheimer, la gériopsychose, le syndrome de Down, la maladie de Parkinson, la maladie de Creutzfeldt-Jakob, la neuropathie diabétique, le syndrome de Parkinson, la maladie de Huntington, la maladie de Machado-Joseph et la sclérose latérale amyotrophique. Par exemple, la maladie est la maladie d'Alzheimer. Par exemple, la maladie est le syndrome de Parkinson.
Dans un exemple, le procédé de l'invention étant pratiqué sur un sujet humain ou animal pour traiter une maladie ou une affection du SNC ou neurodégénérative, le procédé provoque une régulation à la baisse des cellules Treg chez le sujet, favorisant ainsi l'entrée de macrophages systémiques dérivés de monocytes et/ ou de cellules Treg à travers le plexus choroïde dans le cerveau du sujet, moyennant quoi la maladie ou l'affection (par exemple la maladie d'Alzheimer) est traitée, prévenue ou sa progression est réduite. Dans un mode de réalisation, le procédé provoque une augmentation des IFN-gamma dans le système SNC (par ex. dans le cerveau et/ou le LCR (de l’anglais CerebroSpinal Fluid ou CSF) du sujet. Dans un exemple, le procédé restaure la fibre nerveuse et/ou réduit la progression des lésions des fibres nerveuses. Dans un exemple, le procédé restaure la myéline nerveuse et/ou réduit la progression des lésions de la myéline nerveuse. Dans un exemple, le procédé de l'invention traite ou prévient une maladie ou une affection divulguée dans WO2015136541 et/ou le procédé peut être utilisé avec n'importe quel procédé divulgué dans WO2015136541 (la divulgation de ce document est incorporée ici par référence dans son intégralité, par exemple, pour proposer la description de procédés, maladies, affections et agents thérapeutiques potentiels qui peuvent être administrés au sujet pour effectuer le traitement et/ou la prévention du SNC et de maladies et affections neurodégénératives, par exemple, des agents tels que des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire, par exemple, des anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-TIM3 ou autres anticorps qui y sont divulgués).
CANCERS A TRAITER OU A PREVENIR
Les cancers qui peuvent être traités comprennent les tumeurs qui ne sont pas vascularisées, ou pas substantiellement vascularisées, ainsi que les tumeurs vascularisées. Les cancers peuvent comprendre des tumeurs non solides (telles que des tumeurs hématologiques, par exemple des leucémies et des lymphomes) ou peuvent comprendre des tumeurs solides. Les types de cancers à traiter avec l'invention comprennent, mais sans s'y limiter, le carcinome, le blastome et le sarcome, et certaines leucémies ou malignités lymphoïdes, tumeurs bénignes et malignes, et malignités par exemple, sarcomes, carcinomes et mélanomes. Les tumeurs/cancers de l'adulte et les tumeurs/cancers pédiatriques sont également inclus.
Les cancers hématologiques sont des cancers du sang ou de la moelle osseuse. Des exemples de cancers hématologiques (ou hématogènes) incluent les leucémies, y compris les leucémies aiguës (telles que la leucémie aiguë lymphoïde, la leucémie aiguë myéloïde, la leucémie aiguë myélogène et les myéloblastes, promyélocytaires, myélomonocytaires, monocytaires et érythroleucémie), les leucémies chroniques (telles que la leucémie myéloïde (granulocytaire) chronique, la leucémie myélogène chronique et la leucémie lymphoïde chronique), la polyglobulie essentielle, le lymphome, la maladie de Hodgkin, le lymphome non hodgkinien (formes indolentes et de haut grade), les myélomes multiples, la macroglobulinémie de Waldenström, la maladie des chaînes lourdes, le syndrome myélodysplasique, la leucémie à tricholeucocytes et la myélodysplasie.
Les tumeurs solides sont des masses tissulaires anormales qui ne contiennent généralement pas de kyste ou de zone liquide. Les tumeurs solides peuvent être bénignes ou malignes. Différents types de tumeurs solides sont nommés d’après le type de cellules qui les forment (telles que les sarcomes, les carcinomes et les lymphomes). Des exemples de tumeurs solides, tels les sarcomes et carcinomes, incluent : fibrosarcome, myxosarcome, liposarcome, chondrosarcome, l'ostéosarcome et autres sarcomes, synoviome, mésothéliome, tumeur d'Ewing, léiomyosarcome, rhabdomyosarcome, carcinome du côlon, lymphopathie maligne, cancer du pancréas, cancer du sein, cancers du poumon, cancer de l'ovaire, cancer de la prostate, carcinome hépatocellulaire, carcinome épidermoïde (en anglais « squamous cell carcinoma »), carcinome basocellulaire, adénocarcinome, carcinome des glandes sudoripares, carcinome médullaire thyroïdien, carcinome papillaire thyroïdien, phéochromocytomes, carcinome des glandes sébacées, carcinome papillaire, adénocarcinomes papillaires, carcinome médullaire, carcinome bronchogénique, carcinome des cellules rénales, carcinome hépatocellulaire (en anglais hepatoma), cholangiocarcinome, choriocarcinome, tumeur de Wilms, cancer cervical, tumeur testiculaire, séminome, carcinome de la vessie, mélanome et tumeurs du SNC (tel que le gliome (tel que le gliome du tronc cérébral et les gliomes mixtes), le glioblastome (également appelé glioblastome multiforme), astrocytome, lymphome du SNC, germinome, médulloblastome, craniopharyogiome à neurinome, épendymome, pinéaiome, hémangioblastome, néurinome de l’acoustique, oligodendrogliome, méningiome, neuroblastome, rétinoblastome et métastases cérébrales).
MALADIES AUTO-IMMUNES A TRAITER OU PREVENIR
Encéphalomyélite aiguë disséminée (de l’anglais ADEM ou Acute Disseminated Encephalomyelitis)
Leucoencéphalite hémorragique aiguë nécrosante
Maladie d'Addison
Agammaglobulinémie
Pelade (en anglais Alopecia areata)
Amylose
Spondylarthrite ankylosante
Néphrite anti-GBM/Anti-TBM
Syndrome des antiphospholipides (SAP)
Angio-œdème auto-immun
Anémie aplasique auto-immune
Dystonie neurovégétative auto-immune
Hépatite auto-immune
Hyperlipidémie auto-immune
Immunodéficience auto-immune
Maladie auto-immune de l'oreille interne (en anglais AIED ou Autoimmune inner ear disease)
Myocardite auto-immune
Ovarite auto-immune
Pancréatite auto-immune
Rétinopathie auto-immune
Purpura thrombocytopénique auto-immun (en anglais ATP ou Autoimmune thrombocytopenic purpura)
Maladie auto-immune thyroïdienne
Urticaire auto-immune
Neuropathies axonales et neuronales
Maladie de Balo
Maladie de Behçet
Pemphigoïde bulleuse
Cardiomyopathie
Maladie de Castleman
Maladie cœliaque
Maladie de Chagas
Syndrome de fatigue chronique
Polyneuropathie inflammatoire démyélinisante chronique (en anglais Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy ou CIDP)
Ostomyélite multifocale chronique récurrente (en anglais Chronic recurrent multifocal ostomyelitis ou CRMO)
Syndrome de Churg-Strauss
Pemphigoïde cicatricielle/pemphigoïde muqueuse bénigne
Maladie de Crohn
Syndrome de Cogan
Maladie des agglutinines froides
Bloc cardiaque congénital
Myocardite à Coxsackie
Syndrome de CREST
Cryoglobulinémie mixte essentielle
Neuropathies démyélinisantes
Dermatite herpétiforme
Dermatomyosite
Maladie de Devic (neuromyélite optique)
Lupus discoïde
Syndrome de Dressler
Endométriose
Œsophagite à éosinophiles
Fasciite à éosinophiles
Erythème noueux
Encéphalomyélite allergique expérimentale
Syndrome d'Evans
Fibromyalgie
Alvéolite fibrosante
Artérite à cellules géantes (artérite temporale)
Myocardite à cellules géantes
Glomérulonéphrite
Syndrome de Goodpasture
Granulomatose avec polyangéite (GPA) (anciennement appelée granulomatose de Wegener)
Maladie de Graves
Syndrome de Guillain-Barré
Encéphalite de Hashimoto
Thyroïdite d'Hashimoto
Anémie hémolytique
Purpura d'Hénoch-Schönlein
Herpès gestationnel
Hypogammaglobulinémie
Purpura thrombocytopénique idiopathique (PTI)
Néphropathie à IgA
Maladie sclérosante associée aux IgG4
Lipoprotéines immunorégulatrices
Myosite à inclusions
Cystite interstitielle
Arthrite juvénile
Diabète juvénile (diabète de Type 1)
Myosite juvénile
Syndrome de Kawasaki
Syndrome de Lambert-Eaton
Vascularite leucocytoclasique
Lichen plan
Lichen scléreux
Conjonctivite ligneuse
Maladie à IgA linéaires (en anglais LAD ou Linear IgA disease)
Lupus (LED)
Maladie de Lyme, chronique
Maladie de Ménière
Polyangéite microscopique
Maladie du tissu conjonctif mixte (en anglais MCTD ou Mixed connective tissue disease)
Ulcère de Mooren
Maladie de Mucha-Habermann
Sclérose en plaques
Myasthénie grave
Myosite
Narcolepsie
Neuromyélite optique (Devic)
Neutropénie
Pemphigoïde cicatricielle oculaire
Névrite optique
Rhumatisme palindromique
PANDAS (troubles neuropsychiatriques auto-immuns pédiatriques associés au streptocoque, de l’anglais Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcus)
Dégénérescence cérébelleuse paranéoplasique
Hémoglobinurie paroxystique nocturne (HPN)
Syndrome de Parry Romberg
Syndrome de Parsonnage-Turner
Pars planitis (uvéite périphérique)
Pemphigus
Neuropathie périphérique
Encéphalomyélite périveineuse
Anémie pernicieuse
Syndrome POEMS
Périartérite noueuse
Syndromes polyglandulaires auto-immuns de Type I, II et III
Polymyalgie rhumatismale
Polymyosite
Syndrome post-infarctus du myocarde
Syndrome postpéricardiotomie
Dermatite à progestérone
Cirrhose biliaire primitive
Cholangite sclérosante primitive
Psoriasis
Arthrite psoriasique
Fibrose pulmonaire idiopathique
Pyodermite phagédénique
Aplasie pure des globules rouges
Phénomène de Raynaud
Arthrite réactive
Dystrophie sympathique réflexe
Syndrome de Reiter
Polychondrite récidivante
Syndrome des jambes sans repos
Fibrose rétropéritonéale
Fièvre rhumatismale
Polyarthrite rhumatoïde
Sarcoïdose
Syndrome de Schmidt
Sclérite
Sclérodermie
Syndrome de Sjögren
Auto-immunité au sperme et testiculaire
Syndrome de la personne raide
Endocardite bactérienne subaiguë (en anglais : Subacute bacterial endocarditis ou SBE)
Syndrome de Susac
Ophtalmie sympathique
Artérite de Takayasu
Artérite temporale/Artérite à cellules géantes
Purpura thrombocytopénique (PTT)
Syndrome de Tolosa-Hunt
Myélite transverse
Diabète de Type 1
Rectocolite hémorragique
Maladie du tissu conjonctif indifférencié (en anglais UCTD ou Undifferentiated connective tissue disease)
Uvéite
Vascularite
Dermatose vésiculobulleuse
Vitiligo
Granulomatose de Wegener (maintenant appelée Granulomatose avec polyangéite (en anglais : Granulomatosis with Polyangiitis ou GPA).
MALADIES INFLAMMATOIRES A TRAITER OU PREVENIR
Alzheimer
spondylarthrite ankylosante
arthrite (arthrose, polyarthrite rhumatoïde (PR), arthrite psoriasique)
asthme
athérosclérose
maladie de Crohn
colite
dermatite
diverticulite
fibromyalgie
hépatite
syndrome du côlon irritable (SCI)
lupus érythémateux disséminé (LED)
néphrite
maladie de Parkinson
rectocolite hémorragique
L’apport amélioré possible en utilisant des cellules bactériennes supports de bactéries, bactériophages et phagémides tels que divulgué(e)s ici a également une large gamme d'applications non médicales, telles que le traitement de bactéries associées à une corrosion microbienne ou à un encrassement biologique d'un substrat ou fluide dans un système industriel ou domestique.
Par conséquent, le bactériophage, phagémide et les cellules supports de l'invention tels/telles que divulgué(e)s ici peuvent être sous la forme d'une composition qui est une composition médicale, ophtalmique, dentaire ou pharmaceutique. Dans un exemple, la composition est une composition antimicrobienne, par ex. un antibiotique ou antiviral, par ex. un médicament, désinfectant ou bain de bouche. Dans un exemple, la composition est une composition cosmétique (par ex. composition de maquillage pour le visage ou le corps). Dans un exemple, la composition est un herbicide. Dans un exemple, la composition est un pesticide (par ex. lorsque la bactérie cible est un Bacillus (par ex. thuringiensis)). Dans un exemple, la composition est un additif pour boisson (par ex. bière, vin ou boisson alcoolisée). Dans un exemple, la composition est un additif alimentaire (par ex. lorsque la bactérie cible est un E coli, Salmonella, Listeria ou Clostridium (par ex. botulinum)). Dans un exemple, la composition est un additif pour l'eau. Dans un exemple, la composition est un additif pour les environnements d'animaux aquatiques (par ex. dans un aquarium). Dans un exemple, la composition est une composition de l'industrie pétrolière ou pétrochimique ou comprise dans une telle composition (par ex. lorsque la bactérie cible est une bactérie sulfato-réductrice, par ex. un Desulfovibrio). Dans un exemple, la composition est un additif pétrolier ou pétrochimique. Dans un exemple, la composition est un additif chimique. Dans un exemple, la composition est un désinfectant (par ex. pour stériliser un équipement à usage humain ou animal, par ex. à usage chirurgical ou médical, ou pour l'alimentation des bébés). Dans un exemple, la composition est une composition d'hygiène personnelle à usage humain ou animal. Dans un exemple, la composition est une composition à usage environnemental, par ex. pour le traitement des sols ou la décontamination de l'environnement (par ex. à partir d'eaux usées, ou à partir de pétrole, d'un produit pétrochimique ou chimique, par ex. lorsque la bactérie cible est une bactérie sulfato-réductrice, par ex. un Desulfovibrio). Dans un exemple, la composition est un stimulateur de croissance végétale. Dans un exemple, la composition est une composition destinée à être utilisée dans l'extraction pétrolière, pétrochimique, métallique ou minérale. Dans un exemple, la composition est un traitement ou un additif pour tissu. Dans un exemple, la composition est un traitement ou additif pour peau, cuir ou daim. Dans un exemple, la composition est un additif pour colorant/teinture (en anglais : « dye »). Dans un exemple, la composition est un additif de brassage ou de fermentation de boisson (par ex. bière ou vin) (par ex. lorsque la bactérie cible est un Lactobacillus). Dans un exemple, la composition est un additif pour papier. Dans un exemple, la composition est un additif pour encre. Dans un exemple, la composition est un additif pour colle. Dans un exemple, la composition est une composition antiparasitaire humaine ou animale ou végétale. Dans un exemple, la composition est un additif pour l'air (par ex. pour de l'air dans ou produit par un équipement de climatisation, par ex. lorsque la bactérie cible est une Legionella). Dans un exemple, la composition est un additif antigel (par ex. lorsque la bactérie cible est une Legionella). Dans un exemple, la composition est un collyre ou une composition ophtalmique (par ex. un fluide pour lentilles de contact). Dans un exemple, la composition est comprise par un aliment laitier (par ex. la composition est dans ou est un lait ou un produit laitier ; la bactérie cible étant par ex. un Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus ou Listeria). Dans un exemple, la composition est ou est comprise par un produit de nettoyage domestique ou industriel (par ex. lorsque la bactérie cible est un(e) E coli, Salmonella, Listeria ou Clostridium (par ex. botulinum)). Dans un exemple, la composition est comprise par un carburant. Dans un exemple, la composition est comprise par un solvant (par ex. autre que l'eau). Dans un exemple, la composition est un additif de cuisson (par ex. un additif de cuisson alimentaire). Dans un exemple, la composition est un réactif de laboratoire (par ex. pour une utilisation en biotechnologie ou dans une technologie à ADN ou à ARN recombinant). Dans un exemple, la composition est comprise par un agent de rouissage de fibres. Dans un exemple, la composition est destinée à être utilisée dans un procédé de synthèse de vitamine. Dans un exemple, la composition est une composition antipourrissement des cultures ou plantes (par ex. lorsque la bactérie cible est une bactérie saprotrophe). Dans un exemple, la composition est un composé anticorrosion, par ex. pour prévenir ou réduire la corrosion de métaux (par ex. lorsque la bactérie cible est une bactérie sulfatoréductrice, par ex. un Desulfovibrio, par ex. pour utilisation dans la réduction ou prévention de la corrosion d’équipements d’extraction, de traitement ou de confinement de pétrole ; les équipement d'extraction, de traitement ou de confinement de métaux ; ou les équipements d'extraction, de traitement ou de confinement de minéraux). Dans un exemple, la composition est une composition agricole ou d'élevage ou comprise dans une telle composition. Dans un exemple, la composition est un additif pour ensilage.
Tout aspect de la présente invention est destiné à une utilisation industrielle ou domestique, ou est utilisé dans un procédé pour une telle utilisation. Par exemple, elle est destiné à ou utilisé dans l'agriculture, l'industrie pétrolière ou des hydrocarbures, l'industrie alimentaire ou des boissons, l'industrie du vêtement, l'industrie de l'emballage, l'industrie électronique, l'industrie informatique, l'industrie environnementale, l'industrie chimique, l'industrie aérospatiale, l'industrie automobile, l'industrie biotechnologique, l'industrie médicale, l’industrie de la santé, l’industrie dentaire, l’industrie de l'énergie, l’industrie des produits de consommation, l’industrie pharmaceutique, l’industrie minière, l’industrie du nettoyage, l’industrie forestière, l’industrie de la pêche, l’industrie des loisirs, l’industrie du recyclage, l’industrie cosmétique, l’industrie des plastiques, l’industrie de la pâte à papier ou du papier, l’industrie textile, l'industrie de l’habillement, l'industrie du cuir ou daim ou des peaux animales, l'industrie du tabac ou l'industrie de l’acier.
Ces différentes applications impliquent que la cellule bactérienne support comprenant des plasmides et ou un bactériophage conjugatif(s) utilisé(s) soi(en)t capable d’apporter la MTase aux bactéries associées à l’encrassement biologique ou à la corrosion microbienne dans ces industries.
En effet, on verra que l'invention trouve une application dans tout procédé qui génère un effet par la modification ciblée spécifique (par ex. la destruction) d'une cellule bactérienne cible dans le contexte d'une autre, de sorte que la population relative de la bactérie ciblée et d'une autre la bactérie est altérée. Ceci peut avoir des applications médicales et non médicales.
Toutes ces applications bénéficient toutes également de la combinaison de l'utilisation des MTases telles que divulguées ici en combinaison avec des composants du système CRISPR comme décrit ci-dessus, pour modifier l'ADN des bactéries cibles, entraînant par exemple la destruction de cellules cibles.
On comprendra que les modes de réalisation particuliers décrits ici sont présentés à titre d'illustration et non en tant que limitations de l'invention.
Les caractéristiques principales de cette invention peuvent être utilisées dans divers modes de réalisation sans s'écarter de la portée de l'invention. Les personnes du métier reconnaîtront, ou seront capable de déterminer en n'utilisant rien de plus qu'une étude de routine, de nombreux équivalents aux procédures spécifiques décrites ici. De tels équivalents sont considérés comme étant compris dans la portée de cette invention et sont couverts par les revendications.
Toutes les publications et demandes de brevet mentionnées dans la description sont indicatives du niveau de compétence des personnes du métier auxquelles cette invention se rapporte. Toutes les publications et demandes de brevet sont incorporés ici par référence dans la même mesure que si chaque publication ou demande de brevet particulière était spécifiquement et individuellement mentionnée comme étant incorporée par référence. L'utilisation du mot « un » ou « une », lorsqu'il est utilisé conjointement avec le terme « comprenant » dans les revendications et/ou la description peut signifier « un », respectivement « une », mais il est également cohérent avec le sens de « un(e) ou plus », « au moins un(e) » et « un(e) ou plus d’un(e) ». L'utilisation du terme « ou » dans les revendications est utilisée pour signifier « et/ou » à moins qu'il ne soit explicitement indiqué pour se référer seulement à des alternatives ou que les alternatives s'excluent mutuellement, bien que la divulgation appuie une définition qui se réfère uniquement à des alternatives et à « et/ou ».
Tout au long de cette demande, le terme « environ » est utilisé pour indiquer qu'une valeur comprend la variation d'erreur inhérente au dispositif, le procédé étant employé pour déterminer la valeur, ou la variation, qui existe parmi les sujets d'étude.
Tels qu'utilisés dans la présente description et la ou les revendication(s), les mots « comprenant » (et toute forme d’englobement, telle que « comprennent » et « comprend »), « avoir » (et toute forme de possession, telle que « ont » et « a »), « incluant » (et toute forme d'inclusion, telle que « inclut » et « incluent ») ou « contenant » (et toute forme de contenance, telle que « contient » et « contiennent ») sont inclusifs ou ouverts et n'excluent pas la présence d’éléments ou d’étapes de procédé supplémentaires non mentionné(e)s.
Le terme « ou combinaisons de ceux-ci/celles-ci » ainsi qu'utilisé ici se réfère à toutes les permutations et combinaisons des éléments énumérés précédant le terme. Par exemple, « A, B, C ou des combinaisons de ceux-ci » sont censés inclure au moins l'un des éléments suivants : A, B, C, AB, AC, BC ou ABC, et si l'ordre est important dans un contexte particulier, également BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC ou CAB. En poursuivant avec cet exemple, les combinaisons qui contiennent des répétitions d'un ou plusieurs éléments ou termes, tels que BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, et ainsi de suite, sont expressément incluses. La personne du métier comprendra qu'il n'y a typiquement pas de limite au nombre d'éléments ou de termes dans une quelconque combinaison, à moins que le contraire ne ressorte du contexte.
Toute partie de cette divulgation peut être lue en combinaison avec toute autre partie de la divulgation, à moins que le contraire ne ressorte du contexte.
Toutes les compositions et/ou tous les procédés divulgué(e)s et revendiqué(e)s ici peuvent être préparé(e)s et exécuté(e)s sans expérimentation excessive à la lumière de la présente divulgation. Bien que les compositions et les procédés de cette invention aient été décrits au moyen des modes de réalisation préférés, il apparaîtra à la personne du métier que des variations peuvent être appliquées aux compositions et/ou aux procédés et aux étapes ou à la séquence d'étapes du procédé mentionné ici sans s'écarter du concept, de l'esprit et de la portée de l'invention. Tous tels substituts et modifications similaires apparents à la personne du métier sont considérés comme compris dans l'esprit, la portée et le concept de l'invention tels que définis par les revendications jointes.
Exemples
La présente invention est décrite plus en détail dans les exemples non limitatifs suivants.
Procédés et matériels
Plasmides
Tous les plasmides auxquels il est fait référence dans ce document sont décrits dans le Tableau A.
Des fragments d'ADN contenant des ORF codant pour les activités de MTase des systèmes RM de type I (sous-unités M et S) ont été amplifiés par PCR à partir de souches d' E. coli appropriées. Pour les expériences de conjugaison, les fragments d'ADN codant pour les MTases de type I M.Eco0015 et M.EcoKI ont été clonés dans le petit plasmide conjugatif p1114 qui contient la mobilisation et l'origine des éléments de réplication de pBBR1 (Antoine et Locht. Mol. Microbiol. (en anglais : « Microbiol. Mol. ») 6(13):1785-1799 (1992), ou dans le grand plasmide de conjugaison pCol1B9SL1344 du groupe d'incompatibilité IncI1 (Kröger et al. PNAS. 109(20):E1277-E1286 (2012). (PNAS : « Proceedings of the National Academy of Sciences », soit de l’anglais « Actes de l’Académie Nationale des Sciences ») Dans les deux cas, les MTases sont codées sur l'ADN transféré aux cellules réceptrices et ainsi la méthylation de cet ADN est dite « en cis ». Pour les constructions basées sur p1114, une paire de chacun des sites de reconnaissance RM de type I séparés d'environ 850 à 1350 pb a été clonée pour offrir un substrat pour les systèmes RM testés.
Les ORF de la MTase ont également été clonés dans le plasmide p145 non conjugatif qui a un marqueur compatible (résistance à la tétracycline (Tet)) et une origine de réplication (pSC101) pour corésider dans les mêmes cellules que le petit plasmide conjugatif p1114 (dépourvu de tout codage de MTAse). La méthylation ultérieure de p1114 par l'activité méthylase codée sur un plasmide corésidant est dite « en trans ». Pour chacun des plasmides codant pour la MTase, des plasmides témoins négatifs correspondants ont été créés dans lesquels des codons d'arrêt ont été introduits dans les orfs pour supprimer l'activité de la MTase sans altérer le reste de la séquence d'ADN. La résistance au chloramphénicol (Cm) a été codée sur l'ADN transféré pour une sélection de transconjugants tandis que l'expression à partir des ORF de MTase était sous le contrôle du promoteur arabinose.
Pour méthyler l'ADN empaqueté dans une particule de phage transducteur P4, sept MTases de type I (ORF des sous-unités M et S, qui fournissent ensemble l'activité de méthylation) ont été clonées dans p1114 pour créer la construction d'opéron p1160. L'ordre des MTases dans l'opéron a été EcoMII, EcoAI, EcoKI, EcoAO83I, EcoMIII, Eco0015 et Eco1167, avec un promoteur arabinose cloné en 5' de la séquence EcoMII et en 5' de la séquence Eco0015. Pour l'empaquetage dans des particules P4, le plasmide p1065 a été construit pour contenir un signal d'empaquetage P4, un marqueur de résistance à la spectinomycine (Spec), l'ORF de la sGFP sous le contrôle du promoteur BBa_J23100 (collection de promoteurs Andersen) et une paire de chacun des sites de reconnaissance de type I (comme ci-dessus) séparés d'environ 850 à 1350 pb. Le squelette de ce plasmide est basé sur pCasens3 (Uribe et al. Cell Host & Microbe (en anglais : « Hôte Cellulaire et Microbe »). 25:233-241 (2019)).
Pour l'expression du système RM Eco0015 à utiliser dans les tests par points de phages lambda, le plasmide p1331 a été construit en clonant un fragment de PCR contenant les ORFhsdR-hsdM-hsdSd’Eco0015, dans le plasmide p145. Pour une expression constitutive faible, le promoteur pM0 est situé en 5' de l'ORF de la sous-unité M.
Souches bactériennes et leur culture
Toutes les souches ont été cultivées dans un milieu de culture LB (de l’anglais : « lysogeny broth ») à 37°C avec ajout d'antibiotiques, de suppléments ou dans des conditions de culture telles qu'indiquées pour les expériences.
Toutes les souches utilisées pour les procédures de biologie moléculaire, y compris la conjugaison et la préparation de lysats de phages, sont répertoriées dans le Tableau B.
Toutes les souches utilisées pour tester la conjugaison et la lyse de phage ou l'efficacité de transduction sont répertoriées dans le Tableau C.
Pour les expériences de conjugaison, la soucheE. coliJKE201 (Harms et al.PLos Genet. 13(10): e1007077(2017)) a été transformée avec les plasmides de conjugaison et utilisée comme donneuse. Cette souche contient le système de conjugaison RP4 sur son chromosome et est produite auxotrophe pour l'acide diaminopimélique (DAP), permettant une contre-sélection de transconjugants à partir de cellules donneuses.
Pour tester les avantages de la méthylation sur la conjugaison et la transduction du phage P4, un panel d'isolats cliniques d’E. colihébergeant des systèmes RM de type I, en particulier les systèmes RM EcoKI ou Eco0015, ont été sélectionnés en tant que souches réceptrices. Une souche de type sauvage E. coli C-1 (souche CGSCG # : 3121), appelée b52, a été choisie en tant que souche de comparaison et n'a pas de système de restriction actif de type I ou de type II.
L'efficacité de mise en culture (ou eop, de l’anglais « efficiency of plating ») de phages lambda a été testée par des tests par points sur plusieurs souches. Pour tester l’eop par rapport au système de restriction EcoKI, la souche MG1655 a été utilisée. Pour tester l’eop par rapport au système Eco0015, la souche NEB 10-beta a été transformée avec p1331 (hébergeant le système hsdR-hsdM-hsdS d’Eco0015 sous expression constitutive) ; et pour tester l’eop par rapport à EcoKI et Eco0015 dans la même souche, MG1655 a été transformé avec p1331.
La souche b587 a été la souche de production pour l'ADN empaqueté P4.
Conditions de conjugaison
Pour les expériences de conjugaison, des cultures de souches donneuses ont été mises à croitre dans du milieu de culture LB additionné de chloramphénicol (Cm 20 µg ml-1), de DAP (100 µM) et d'arabinose (0,2 % p/v). Les cultures d'une nuit des souches donneuses ont été lavées dans une solution saline tamponnée au phosphate (de l’anglais PBS, soit « Phosphate Buffered Saline ») et remises en suspension dans un volume de milieu de culture LB égal à celui de la culture d'une nuit tandis que les souches receveuses ont été cultivées une nuit dans un milieu de culture LB sans aucun supplément ni culture utilisée directement. Dans une plaque de microtitration à 96 puits, 50 µl de souche donneuse et 10 µl de souche receveuse ont été mélangés dans 140 µl de milieu de culture LB, additionné de DAP et d'arabinose. Les réactions de conjugaison ont été laissées en incubation stationnaire à 37°C pendant 18 h. Les cultures de transconjugant ont été étalées sur plaque sous forme de dilutions 10 fois dans du PBS sur des plaques de gélose LB additionnées d'arabinose et de Cm et incubées pendant 18 h à 37°C.Les cellules donneuses ne croissent pas car elles ont besoin de DAP, tandis que les receveurs de transconjugant, hébergeant le gène Cm sur le plasmide donneur, sont capables de croître et ont été dénombrées en ufc ml-1du mélange transconjugant.
Ingénierie des phages lambda
Des génomes synthétiques de phages lambda ont été conçus pour être assemblés à partir de fragments PCR en utilisant de l'ADN lambda disponible dans le commerce (NEB Cat # N3011S) en tant que matrice pour la PCR. Les gènes cI, rexA et rexB ont été exclus des conceptions d'assemblage et ainsi le phage lambda redémarré ultérieurement est virulent. La mutation ambre Sam7 (45.352 G-> A), une mutation dans un gène impliqué dans la lyse cellulaire qui est présent dans la trame d'ADN commerciale, a été rétablie en séquence de type sauvage (A-> G). Trois conceptions de génome ont été réalisées, qui, comme décrit ci-dessus sans aucune séquence supplémentaire, sont appelées Conception I (voir Annexe I pour la séquence génomique). La Conception II comprend les ORF hsdM et hsdS d'EcoKI sous le contrôle du promoteur Anderson pJ23100, amplifiés par PCR à partir de p1172 et assemblés à la place des gènes lambda supprimés (voir Annexe II pour la séquence génomique). De même, la Conception III comprend les ORF hsdM et hsdS d’Eco0015, qui ont été amplifiés par PCR à partir de p1174, mais contrairement à la Conception II, leur expression est sous le contrôle de la séquence lambda native et assemblés à la place des gènes lambda supprimés (voir Annexe III pour la séquence génomique).
L'ADN polymérase haute fidélité Platinum™ SuperFi™ (Invitrogen) a été utilisée dans toutes les réactions PCR. Des amorces PCR ont été conçues pour incorporer des sites BsaI afin de faciliter un assemblage Golden Gate transparent (de l’anglais « seamless ») des fragments PCR. Des génomes de phages assemblés ont été utilisés pour transformer des cellules E. coli NEB 10-beta par électroporation. La transformation a été mélangée avec 3 ml de top agar LB (gélose à 0,4 % p/v) contenant 100 µl de culture d'une nuit de NEB 10-beta et additionnée de 5 mM de CaCl2et de 10 mM de MgCl2. Après une nuit d'incubation des plaques à 37°C, des plaques individuelles ont été isolées et propagées sur des souches de production pertinentes pour créer des lysats.
Propagation du phage lambda et détermination du titrage
Pour l'ADN du phage lambda non méthylé, le phage a été cultivé sur du NEB 10-beta, pour la méthylation en trans par la MTase EcoKI des phages ont été cultivés sur MG1655, pour la méthylation en trans par la MTase Eco0015 des phages ont été cultivés sur NEB-10 beta hébergeant le plasmide p1331, pour la méthylation en trans par les MTases EcoKI et Eco0015 des phages ont été cultivés sur MG1655 hébergeant p1331, et pour la production de phages lambda avec les conceptions génomiques II et III (pour la méthylation cis), le phage a été propagé sur NEB 10-beta. Les souches ont été cultivées jusqu'au début de la phase exponentielle à 37°C dans du milieu LB additionné de 5 mM de CaCl2et de 10 mM de MgCl2avant l'addition des phages. Après une nuit d'incubation, les cultures ont été centrifugées à 10.000 g pendant 5 min et le surnageant filtré à travers un filtre à pores de 0,2 µm. Les titres de ces lysats résultants ont été déterminés par titrage sur des superpositions bactériennes (en anglais « bacterial overlay ») E. coli NEB 10-beta. Des superpositions ont été créées en utilisant 3 ml de top agar LB (gélose à 0,4 %) contenant 100 µl de culture d'une nuit NEB 10-beta et additionnées de 5 mM de CaCl2et de 10 mM de MgCl2. Les lysats ont été dilués en série 10 fois dans du tampon SM (50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 8 mM de MgSO4, 100 mM de NaCl), déposés sur la superposition bactérienne, et après incubation pendant une nuit, les plaques résultantes ont été dénombrées pour calculer un eop en ufp ml-1de lysat.
Test par points du phage lambda
Tous les lysats de phages ont été dilués dans du tampon SM (50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 8 mM de MgSO4, 100 mM de NaCl) jusqu'à un eop similaire à celui déterminé sur E. coli NEB 10-beta. Ceux-ci ont ensuite été dilués en série 10 fois dans du tampon SM et déposés sur des superpositions bactériennes (réalisées comme décrit ci-dessus) des souches pertinentes. Pour le test par points de lysats de cocktail, des volumes égaux des deux lysats à des titres identiques ont été mélangés avant une dilution et une répartition par points supplémentaires. Pour tester l’eop au regard du système de restriction EcoKI, la souche E. coli MG1655 a été utilisée. Pour tester l’eop au regard du système Eco0015, la souche NEB 10-beta a été transformée avec p1331 (portant le système hsdR-hsdM-hsdS d’Eco0015 sous expression constitutive). Pour tester à la fois les systèmes EcoKI et Eco0015 dans la même souche, MG1655 a été transformé avec p1331.
Préparation et titrage du lysat de phage transducteur P4
Le plasmide p1065 (contenant une sGFP, un marqueur spectinomycine, des sites de reconnaissance de restriction de type I et un site d'empaquetage COS P4 tel que décrit ci-dessus) a été utilisé pour transformer la souche d'E. coli b587 qui contient toute la machinerie génétique nécessaire pour catalyser l'empaquetage de p1065 dans des têtes de phage. Pour la méthylation de l'ADN encapsidé, le plasmide p1160 (contenant un opéron de MTases sous le contrôle du promoteur arabinose) a été cotransformé en b587.
Des cultures d'une nuit des transformants ont été mises en croissance dans du milieu LB (supplémenté avec Tet + Spec + 5 mM de CaCl2et 10 mM de MgCl2) et incubées à 37°C, sous agitation. Le lendemain, des cultures fraîches de 10 ml ont été inoculées à DO600=0,1 puis cultivées à DO600=0,2, moment auquel les gènes d'empaquetage et de lyse, et dans le cas de p1160 l'expression des MTases, ont été induits par l'ajout d'arabinose (0,2% p/v). Les cultures ont été laissées à lyser pendant 3-4h à 37°C sous agitation. Les cultures lysées ont été centrifugées (5 minutes à 10.000xg) et le filtre surnageant a été stérilisé à l'aide d'un filtre 2uM. Pour éliminer l'ADN bactérien résiduel, le lysat a été incubé avec de la DNaseI pendant une nuit à 37°C.
Pour déterminer le titre du lysat, 100 µl de lysat ont été mélangés à 100 µl de culture d'une nuit de la souche b52 et incubés à température ambiante pendant 30 minutes. Ce mélange a été dilué en série à 1:10 dans du tampon SM, déposé sur des plaques LB + Spec et les colonies positives à la GFP ont été dénombrées pour calculer un titre en ufc ml-1de lysat. Le titre sur les souches cliniques a été déterminé par le même procédé.
Les résultats des expériences sont illustrés dans les Figures 1 à 5
. Efficacité de conjugaison de petits plasmides conjugatifs méthylés en cis (n=3)
A. De petits plasmides conjugatifs codant pour les versions de types sauvages (p1172 et p1174) ou mutés (p1243 et p1244) de M.EcoKI et M.Eco0015 sont directement comparés quant à l'efficacité de la conjugaison dans des isolats cliniques d'E. coli. La souche b52 est utilisée en tant que témoin négatif car elle n’héberge aucun système de restriction actif. Les barres marquées d'un X sont pour des souches hébergeant le système de restriction EcoKI tandis que toutes les autres souches hébergent le système de restriction Eco0015. La ligne pointillée représente la limite de détection à 2,3 log.
B. Comparaison test-T non apparié de l'efficacité de conjugaison de p1174 (codant pour M.Eco0015 de type sauvage) et de p1244 (codant pour M.Eco0015 muté) dans des souches hébergeant le système de restriction Eco0015 (p < 0,05).
. Efficacité de conjugaison d'un grand plasmide conjugatif méthylé en cis (n = 3)
A. De grands plasmides conjugatifs basés sur pCol1B9SL1344 et codant pour les versions de type sauvage (p1284) ou muté (p1286) de M.Eco0015 respectivement sont directement comparés quant à l'efficacité de conjugaison dans des souches de collections cliniques d’E. coli.
La souche b52 est utilisée en tant que témoin négatif car elle n’héberge aucun système de restriction actif. Les barres marquées d'un X sont pour des souches hébergeant le système de restriction EcoKI tandis que toutes les autres souches hébergent le système de restriction Eco0015.
La ligne pointillée représente la limite de détection à 2,3 log.
B. Comparaison test-T non apparié de l'efficacité de conjugaison de p1284 (codant pour M.Eco0015 de type sauvage) et de p1286 (codant pour M.Eco0015 muté) dans des souches hébergeant le système de restriction Eco0015 (p < 0,05).
. Comparaison de l'efficacité de conjugaison de petits plasmides conjugatifs méthylés en cis et en trans (n=3)
A. Le petit plasmide conjugatif (p1114) est méthylé en trans par un plasmide corésident non conjugatif codant respectivement pour les versions soit de types sauvages (p1082 et p819) soit de types mutés (p1369 et p1368) de M.EcoKI et M.Eco0015 (n=3). L'efficacité de conjugaison des plasmides trans-méthylés est tracée par rapport aux données d'efficacité de conjugaison par cis-méthylation de la (A), avec les plasmides codant pour les versions de types sauvages (p1172 et p1174) et mutés (p1243 et p1244) de M.EcoKI et M.Eco0015 respectivement. La souche b52 est utilisée en tant que témoin négatif car elle n’héberge aucun système de restriction actif. Les barres marquées d'un X sont pour des souches hébergeant le système de restriction EcoKI tandis que toutes les autres souches hébergent le système de restriction Eco0015. La ligne pointillée représente la limite de détection du test à 2,3 logs.
B. Comparaison test-T non apparié de l'efficacité de conjugaison de p1082 (codant pour M.Eco0015 en trans de type sauvage) et de p1174 (codant pour M.Eco0015 en cis de type sauvage) dans des souches hébergeant le système de restriction Eco0015 (p < 0,05).
. Efficacité de mise en culture de lysats de phages, méthylés soit en trans, soit en cis (n=3)
Sur l'axe horizontal se trouve la description de l'arrière-plan de la souche dans laquelle les lysats de phage ont été fabriqués pour ce qui est des propriétés de méthylation. Les catégories étant : phages non méthylés, phages méthylés en trans ex. à partir de MTases codées par le génome de la souche ou sur un plasmide corésident, et méthylation en cis par ex. à partir de MTases codées sur le génome des phages. Dans certains cas, deux lysats ont été produits séparément puis mélangés pour former un cocktail. Chaque graphique montre l'eop de repérage de ces lysats sur une souche d'E. coli aux propriétés de restriction particulières :
A. eop sur une souche ne contenant aucune enzyme de restriction (NEB 10-beta)
B. eop sur souche hébergeant le système EcoKI (MG1655)
C. eop sur souche hébergeant le système Eco0015 (NEB 10-beta contenant p1331)
D. eop sur une souche hébergeant à la fois des systèmes EcoKI et Eco0015 (MG1655 contenant p1331)
. Efficacité de la transduction du phage après méthylation en trans par une souche de production exprimant un opéron MTase (n=3)
Le plasmide p1065 méthylé et non méthylé a été empaqueté dans une particule de phage transducteur P4 et l'efficacité de la transduction a été comparée dans un panel d'isolats cliniques d'E. coli. La méthylation de l'ADN de p1065 a été réalisée en trans en produisant un lysat à partir d'une souche hébergeant un plasmide corésident (p1160) codant pour un opéron de sept MTases. La souche b52 est utilisée en tant que témoin négatif car elle n’héberge aucun système de restriction actif. Les souches marquées d'un X codent pour un système de restriction apparenté aux MTases codées par p1160 et montrent une transduction améliorée lors de la méthylation de p1065, les souches marquées d'un Y codent également pour un système de restriction apparenté aux MTases codées par p1160 mais ne montrent aucune amélioration de l’efficacité de transduction. Toutes les autres souches ne codent pas pour un système de restriction apparenté aux MTases codées par p1160. La ligne pointillée représente la limite de détection du test à 2,3 logs.
Des détails de diverses Mtases utilisées dans ces expériences sont fournis à l'Annexe IV.
L'Annexe V est la séquence de p1065
Conclusions
On peut voir que :
Les plasmides conjugatifs codant pour les enzymes MTase sont significativement protégés des systèmes RM hôtes après conjugaison ;
La protection peut être offerte par méthylation en cis ou en trans (par ex. par un plasmide non conjugatif corésident dans la souche de conjugaison) ;
Des cocktails de MTases peuvent offrir des niveaux élevés de protection contre les systèmes RM ;
et des opérons codant pour de multiples MTases peuvent être utilisés pour méthyler efficacement de l'ADN plasmidique pour un apport par transduction par phage.
Tableau A : Plasmides
ID de plasmide Description Insérer les fonctionnalités clés* Marqueur OriR Source du squelette
p1114 Squelette de clonage de conjugaison éléments mobilisables de pBBR1, gène SpisPink dans le site de clonage Cm pBBR1 rep La séquence du squelette est dérivée de pBBR1-mcs2 et est identique à l'entrée GeneBank MH539767
p145 Vecteur de clonage gène SpisPink dans le site de clonage Tet pSC101 La séquence du squelette est dérivée de pLG388 et est identique à l'entrée GenBank KM604642
p1172 MTase EcoK1 de type sauvage dans petit plasmide conjugatif Orfs AraCpBAD-EcoK1 M+S, 2x copies de chaque site de restriction de Type I Cm pBBR1 rep P1114
p1174 MTase Eco0015 de type sauvage dans petit plasmide conjugatif Orfs AraCpBAD-Eco0015 M+S, 2x copies de chaque site de restriction de Type I Cm pBBR1 rep P1114
p1243 MTase EcoK1 de type mutant dans petit plasmide conjugatif Orfs AraCpBAD-EcoK1 M (codon d’arrêt) + S (codon d’arrêt), 2x copies de chaque site de restriction de Type I Cm pBBR1 rep P1114
p1244 MTase Eco0015 de type mutant dans petit plasmide conjugatif Orfs AraCpBAD-Eco0015 M (codon d’arrêt) + S (codon d’arrêt), 2x copies de chaque site de restriction de Type I Cm pBBR1 rep P1114
p1284 MTase Eco0015 de type sauvage dans grand plasmide conjugatif Orfs AraCpBAD-Eco0015 M+S Cm repA La séquence du squelette est dérivée de pCol1B9SL1344 et est identique à l'entrée GenBank HE654725
p1286 MTase Eco0015 de type mutant dans grand plasmide conjugatif Orf AraCpBAD-Eco0015 M (codon d’arrêt) + S (codon d’arrêt) Cm repA La séquence du squelette est dérivée de pCol1B9SL1344 et est identique à l'entrée GenBank HE654725
p819 MTase EcoK1 de type sauvage dans squelette de clonage Orfs AraCpBAD-EcoK1 M+S, 2x copies de chaque site de restriction de Type I Tet pSC101 p145
p1082 MTase Eco0015 de type sauvage dans squelette de clonage Orfs AraCpBAD-Eco0015 M+S, 2x copies de chaque site de restriction de Type I Tet pSC101 p145
p1368 MTase EcoK1 de type mutant dans squelette de clonage Orfs AraCpBAD-EcoK1 M (codon d’arrêt) + S (codon d’arrêt), 2x copies de chaque site de restriction de Type I Tet pSC101 p145
p1369 MTase Eco0015 de type mutant dans squelette de clonage Orfs AraCpBAD-Eco0015 M (codon d’arrêt) + S (codon d’arrêt), 2x copies de chaque site de restriction de Type I Tet pSC101 p145
p1331 Système de restriction Eco0015 dans squelette de clonage Orfs pM0-Eco0015 R + M + S Tet pSC101 p145
p1160 Opéron de MTases de type I dans petit plasmide conjugatif AraCpBAD-EcoMII-EcoAI-EcoKI-EcoAO83I-EcoMIII-pBAD-Eco0015-Eco1167 (M + S orfs de chacun) Cm pBBR1 rep P1114
p1065** Plasmide pour l’empaquetage en particules P4 pJ23100-sGFP, AraCpBAD-delta(activation P2)-psu, signal d'empaquetage P4 Spec CloDF13 (la mutation donne env. 70 copies/cellule) Basé sur pCasens3, voir annexe V pour la séquence d'ADN
Tableau B : Biologie moléculaire générale des souches d'E. coli
ID de souche Description Notes clés
b3235 JKE201 souche donneuse, auxotrophe DAP, code pour le système de sécrétion RP4 de type IV
b230 MG1655 souche K-12, code pour le système EcoKI type I RM
b2522 NEB 10-beta souche K-12, dérivée de DH10B, pas de système RM actif
b587 Souche C-1a lysogène P2 wt, délétion du récepteur P2, résistante à la zéocine
Tableau C : Souches d'E. coli pour tester l'efficacité de la conjugaison et de la transduction des phages
ID de souche Description GMO Systèmes RM de type I et II*
b52 Souche C-1a 1 -
b292 ECOR33 1 -
b294 ECOR35 2 -
b315 ECOR56 2 Eco31I (type II), EcoMII (type I)
b325 ECOR66 2 -
b331 ECOR72 2 -
b662 ESBL20170384 2 EcoMIII (type I), Eco89II (type I)
b682 ESBL20180320 2 Eco0008 (type I), Eco736 (type II)
b692 ESBL20150072 2 Eco1167 (type I)
b751 SEATTLE_BLOOD-08-0654 2 Eco0015 (type I)
b755 SEATTLE_BLOOD-10-0686 2 Eco0015 (type I)
b762 SEATTLE_BLOOD-10-0687 2 Eco0015 (type I)
b766 SEATTLE_BLOOD-09-0751 2 Eco0015 (type I)
b770 SEATTLE_BLOOD-08-0493 2 Eco0015 (type I)
b771 SEATTLE_BLOOD-09-1294 2 EcoKI (type I), Eco1246 (type I)
b803 SEATTLE_UPEC-76 2 Eco0015 (type I)
b819 SEATTLE_UPEC-129 2 Eco0015 (type I)
b821 SEATTLE_UPEC-169 2 Eco0015 (type I)
b830 SEATTLE_UPEC-186 2 EcoAO83I (type I)
b838 SEATTLE_UPEC-124 2 Eco31I (type II)
b848 SEATTLE_UPEC-142 2 Eco31I (type II), EcoMII (type I), EcoMIII (type I)
b854 SEATTLE_UPEC-120 2 Eco0015 (type I)
b867 SEATTLE_UPEC-211 2 Eco0015 (type I), Eco1167 (type I)
b879 SEATTLE_UPEC-256 2 EcoKI (type I)
*Désignations de systèmes RM extraites des séquences de reconnaissance connues REBASE
Tableau D : Exemple de phage Tevenvirinae
Virus d’Acinetobacter 133
Virus d’Aeromonas 65
Virus d’Aeromonas Aeh1
Dhakavirus
Virus d’Escherichia Bp7
Virus d’Escherichia IME08
Virus d’Escherichia JS10
Virus d’Escherichia JS98
Virus d’Escherichia MX01
Virus d’Escherichia QL01
Virus d’Escherichia VR5
Virus d’Escherichia WG01
Phage d’Escherichia RB16
Phage d’Escherichia RB32
Virus d’Escherichia RB43
Phage d’Enterobacteria RB43-GVA
Gaprivervirus
Virus d’Escherichia VR20
Virus d’Escherichia VR25
Virus d’Escherichia VR26
Virus d’Escherichia VR7
Virus de Shigella SP18
Gelderlandvirus
Phage de Salmonella Melville
Phage de Salmonella S16
Phage de Salmonella STML198
Phage de Salmonella STP4a
Jiaodavirus
Virus de Klebsiella JD18
Virus de Klebsiella PKO111
Karamvirus
Virus d’Enterobacter PG7
Virus d’Escherichia CC31
Krischvirus
Virus d’Escherichia ECD7
Virus d’Escherichia GEC3S
Virus d’Escherichia JSE
Virus d’Escherichia phi1
Virus d’Escherichia RB49
Moonvirus
Virus de Citrobacter CF1
Virus de Citrobacter Merlin
Virus de Citrobacter Moon
Mosigvirus
Virus d’Escherichia APCEc01
Virus d’Escherichia HP3
Virus d’Escherichia HX01
Virus d’Escherichia JS09
Virus d’Escherichia O157tp3
Virus d’Escherichia O157tp6
Virus d’Escherichia PhAPEC2
Virus d’Escherichia RB69
Virus d’Escherichia ST0
Virus de Shigella SHSML521
Virus de Shigella UTAM
Schizotequatrovirus
Virus de Vibrio KVP40
Virus de Vibrio nt1
Virus de Vibrio ValKK3
Slopekvirus
Virus d’Enterobacter Eap3
Virus de Klebsiella KP15
Virus de Klebsiella KP27
Virus de Klebsiella Matisse
Virus de Klebsiella Miro
Virus de Klebsiella PMBT1
Tequatrovirus
Phage d’Enterobacteria T4 sensu lato
Virus d’Escherichia AR1
Virus d’Escherichia C40
Virus d’Escherichia CF2
Virus d’Escherichia E112
Virus d’Escherichia ECML134
Virus d’Escherichia HY01
Virus d’Escherichia HY03
Virus d’Escherichia Ime09
Virus d’Escherichia RB14
Virus d’Escherichia RB3
Virus d’Escherichia slur03
Virus d’Escherichia slur04
Virus d’Escherichia SV14
Virus d’Escherichia T4
Virus de Shigella Pss1
Virus de Shigella Sf21
Virus de Shigella Sf22
Virus de Shigella Sf24
Virus de Shigella SHBML501
Virus de Shigella Shfl2
Phage de Vibrio nt-1 sensu lato
Virus d’Yersinia D1
Virus d’Yersinia PST
Tevenvirinae non classifiés
Phage d’Acinetobacter AbTZA1
Phage d’Acinetobacter Ac42
Phage d’Acinetobacter Acj61
Phage d’Acinetobacter Acj9
Phage d’Acinetobacter AM101
Phage d’Acinetobacter Henu6
Phage d’Acinetobacter KARL-1
Phage d’Acinetobacter vB_AbaM_PhT2
Phage d’Acinetobacter vB_AbaP_Abraxas
Phage d’Acinetobacter vB_ApiM_fHyAci03
Phage d’Acinetobacter ZZ1
Phage d’Aeromonas 65.2
Phage d’Aeromonas Ah1
Phage d’Aeromonas AS-sw
Phage d’Aeromonas AS-szw
Phage d’Aeromonas AS-yj
Phage d’Aeromonas AS-zj
Phage d’Aeromonas AsFcp_1
Phage d’Aeromonas AsFcp_2
Phage d’Aeromonas AsFcp_4
Phage d’Aeromonas Assk
Phage d’Aeromonas Asswx_1
Phage d’Aeromonas AsSzw2
Phage d’Aeromonas Aswh_1
Phage d’Aeromonas Aszh-1
Phage d’Aeromonas CC2
Phage d’Aeromonas phiAS5
Phage d’Aeromonas PX29
Phage de Buttiauxella vb_ButM_GuL6
Phage de Citrobacter IME-CF2
Phage de Citrobacter Margaery
Phage de Citrobacter Maroon
Phage de Citrobacter Miller
Phage de Citrobacter vB_CfrM_CfP1
Phage de Cronobacter S13
Phage de Cronobacter vB_CsaM_GAP161
Phage de Cronobacter vB_CsaM_leB
Phage de Cronobacter vB_CsaM_leE
Phage de Cronobacter vB_CsaM_leN
Phage d’Edwardsiella PEi20
Phage d’Edwardsiella PEi26
Phage d’Enterobacter EBPL
Phage d’Enterobacter EC-F1
Phage d’Enterobacter EC-F2
Phage d’Enterobacter EC-W1
Phage d’Enterobacter EC-W2
Phage d’Enterobacter vB_EclM_CIP9
Phage d’Erwinia Cronus
Phage d’Escherichia Lw1
Phage d’Escherichia RDN37
Phage de Klebsiella AmPh_EK29
Phage de Klebsiella EI
Phage de Klebsiella KOX11
Phage de Klebsiella KOX8
Phage de Klebsiella KPN1
Phage de Klebsiella Marfa
Phage de Klebsiella PhiKpNIH-6
Phage de Klebsiella vB_Kpn_F48
Phage de Klebsiella vB_Kpn_P545
Phage de Klebsiella vB_KpnM_Potts1
Phage de Morganella vB_MmoM_MP1
Phage de Panteoa Phynn
Bactériophage de Pectobacterium PM2
Phage de Proteus phiP4-3
Phage de Proteus PM2
Phage de Proteus vB_PmiM_Pm5461
Phage de Pseudomonas PspYZU05
Phage de Serratia Muldoon
Phage de Serratia PS2
Phage de Shewanella Thanatos-1
Phage de Shewanella Thanatos-2
Phage de Shigella vB_SdyM_006
Phage de Sinorhizobium vB_SmelM_phiM10
Phage de Sinorhizobium vB_SmelM_phiM14
Phage de Vibrio vB_VmeM-32
Phage d’Yersinia JC221
TABLEAU E : Médicaments
Inhibiteurs de l'ECA (Enzyme de Conversion de l'Angiotensine, ou en anglais « Angiotensin-Converting Enzyme ou ACE) avec agents bloquant les canaux calciques
Inhibiteurs de l'ECA avec thiazides
antiviraux à adamantane
stéroïdes corticosurrénaliens
inhibiteurs corticostéroïdes surrénaliens
bronchodilatateurs adrénergiques
agents pour urgences hypertensives
agents pour hypertension pulmonaire
antagonistes des récepteurs de l'aldostérone
agents alkylants
allergènes
inhibiteurs de l'alpha-glucosidase
médicaments alternatifs
amibicides
aminoglycosides
aminopenicillines
aminosalicylates
antagonistes des récepteurs AMPA
analogues de l'amyline
associations antalgiques
antalgiques
stéroïdes androgéniques et anabolisants
inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine
inhibiteurs de l'angiotensine II avec bloqueurs de canaux calciques
inhibiteurs de l'angiotensine II avec thiazidiques
bloqueurs des récepteurs de l'angiotensine
bloqueurs des récepteurs de l'angiotensine et inhibiteurs de la néprilysine
préparations anorectales
anorexigènes
antiacides
anthelminthiques
agents ophtalmiques anti-angiogéniques
anticorps monoclonaux anti-CTLA-4
anti-infectieux
anticorps monoclonaux anti-PD-1
agents antiadrénergiques (centraux) avec thiazides
agents antiadrénergiques (périphériques) avec thiazides
agents antiadrénergiques, agissant centralement
agents antiadrénergiques, agissant périphériquement
antiandrogènes
agents anti-angineux
agents antiarythmiques
associations antiasthmatiques
antibiotiques/antinéoplasiques
antiémétiques anticholinergiques
agents antiparkinsoniens anticholinergiques
bronchodilatateurs anticholinergiques
agents chronotropes anticholinergiques
anticholinergiques/antispasmodiques
agents d'inversion anticoagulants
anticoagulants
anticonvulsivants
antidépresseurs
agents antidiabétiques
associations antidiabétiques
antidiarrhéiques
hormones antidiurétiques
antidotes
agents antiémétiques/antivertiges
antifongiques
agents antigonadotropes
agents antigoutteux
antihistaminiques
agents antihyperlipidémiants
associations antihyperlipidémiques
associations antihypertensives
agents antihyperuricémiques
agents antipaludiques
associations antipaludiques
quinoléines antipaludiques
antimétabolites
agents antimigraineux
agents détoxifiants antinéoplasiques
interférons antinéoplasiques
antinéoplasiques
agents antiparkinsoniens
agents antiplaquettaires
pénicillines antipseudomonas
antipsoriasiques
antipsychotiques
antirhumatismaux
antiseptiques et germicides
agents antithyroïdiens
antitoxines et antivenins
agents antituberculeux
associations antituberculeuses
antitussifs
agents antiviraux
rappels antiviraux
associations antivirales
interférons antiviraux
anxiolytiques, sédatifs et hypnotiques
inhibiteurs de l'aromatase
antipsychotiques atypiques
antifongiques azolés
vaccins bactériens
anticonvulsivants barbituriques
barbituriques
inhibiteurs de la tyrosine kinase BCR-ABL
anticonvulsivants à la benzodiazépine
benzodiazépines
bêta-bloquants avec inhibiteurs des canaux calciques
bêta-bloquants avec thiazides
agents bloquants bêta-adrénergiques
inhibiteurs de bêta-lactamase
séquestrants des acides biliaires
produits biologiques
bisphosphonates
protéines morphogénétiques osseuses
inhibiteurs de la résorption osseuse
associations bronchodilatatrices
bronchodilatateurs
calcimimétiques
inhibiteurs de la calcineurine
calcitonine
agents bloquant les canaux calciques
anticonvulsivants au(x) carbamate(s)
carbapénèmes
inhibiteurs de l'anhydrase carbonique		 décongestionnants
agents dermatologiques
radiopharmaceutiques de diagnostic
diarylquinolines
anticonvulsivants à la dibenzazépine
enzymes digestives
inhibiteurs de la dipeptidyl peptidase 4
diurétiques
agents antiparkinsoniens dopaminergiques
médicaments utilisés dans la dépendance à l'alcool
échinocandines
Inhibiteurs de l'EGFR
antagonistes des récepteurs d’œstrogènes
œstrogènes
expectorants
inhibiteurs du facteur Xa
anticonvulsivants dérivés d'acides gras
dérivés de l'acide fibrique
céphalosporines de première génération
céphalosporines de quatrième génération
agents des troubles fonctionnels intestinaux
agents solubilisants des calculs biliaires
analogues de l'acide gamma-aminobutyrique
inhibiteurs de la recapture de l'acide gamma-aminobutyrique
agents gastro-intestinaux
anesthésiques généraux
agents du tractus génito-urinaire
stimulants gastro-intestinaux
glucocorticoïdes
agents élévateurs du niveau de glucose
antibiotiques glycopeptidiques
inhibiteurs plaquettaires glycoprotéiques
glycylcyclines
hormones de libération de gonadotrophines
antagonistes de l'hormone de libération de gonadotrophines
gonadotrophines
antiarythmiques du groupe I
antiarythmiques du groupe II
antiarythmiques du groupe III
antiarythmiques du groupe IV
antiarythmiques du groupe V
bloqueurs des récepteurs de l'hormone de croissance
hormones de croissance
agonistes de la guanylate cyclase-C
agents d'éradication de H. pylori
antagonistes d’H2
inhibiteurs de la voie hedgehog
mobilisateur de cellules souches hématopoïétiques
antagonistes de l'héparine
héparines
inhibiteurs de l’HER2
produits végétaux
inhibiteurs d'histone désacétylase
hormones
hormones/antinéoplasiques
anticonvulsivants à l’hydantoïne
dérivés de l'hydrazide
immunoglobulines
agents immunologiques
immunostimulants
agents immunosuppresseurs
agents contre l’impuissance
produits biologiques de diagnostic in vivo
mimétiques des incrétines
anti-infectieux inhalés
corticostéroïdes inhalés
agents inotropes
insuline
facteur de croissance analogue à l'insuline
inhibiteur de transfert de brin d'inté.g.rase
interférons
inhibiteurs d'interleukine
interleukines
produits nutritionnels intraveineux
produits de contraste iodés
produits de contraste iodés ioniques
produits ferreux
kétolides
laxatifs
léprostatiques
modificateurs des leucotriènes
dérivés de la lincomycine
anesthésiques injectables locaux
anesthésiques injectables locaux avec corticostéroïdes
diurétiques de l’anse
surfactants pulmonaires
agents colorants lymphatiques
enzymes lysosomales
dérivés des macrolides
macrolides
produits de contraste pour imagerie par résonance magnétique
stabilisateurs de mastocytes
gaz médicaux
méglitinides
agents métaboliques
méthylxanthines
minéralocorticoïdes
minéraux et électrolytes
agents
antalgiques
antibiotiques
anticonvulsivants
antidépresseurs
agents antidiabétiques
antiémétiques
antifongiques
agents antihyperlipidémiants
associations antihypertensives
antipaludiques
antinéoplasiques
agents antiparkinsoniens
agents antipsychotiques
agents antituberculeux
antiviraux
anxiolytiques, sédatifs et hypnotiques
inhibiteurs de la résorption osseuse
agents cardiovasculaires
agents du système nerveux central
modificateurs de coagulation
colorants/teintures de diagnostic
diurétiques
agents du tractus génito-urinaire
agents gastrointestinaux (de l’anglais « GI agents »)
hormones
agents métaboliques
agents ophtalmiques		 agents respiratoires
hormones sexuelles
agents topiques
agents non catégorisés
agents vaginaux
inhibiteurs mitotiques
inhibiteurs de la monoamine oxydase
produits pour la bouche et la gorge
inhibiteurs de la mTOR
mucolytiques
inhibiteurs de multikinases
relaxants musculaires
mydriatiques
associations analgésiques narcotiques
analgésiques narcotiques
anti-infectieux nasaux
antihistaminiques et décongestionnants nasaux
lubrifiants et irrigations nasaux
préparations nasales
stéroïdes nasaux
pénicillines naturelles
inhibiteurs de la néprilysine
inhibiteurs de la neuraminidase
agents bloquants neuromusculaires
ouvreurs de canaux potassiques neuronaux
céphalosporines de génération suivante
dérivés de l'acide nicotinique
antagonistes des récepteurs NK1
Inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI, de l’anglais NNRTIs)
bêta-bloquants non cardiosélectifs
produits de contraste non iodés
produits de contraste iodés non ionique
non-sulfonylurées
agents anti-inflammatoires non stéroïdiens
inhibiteurs de la NS5A
inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INTI)
produits nutraceutiques
produits nutritionnels
anesthésiques ophtalmiques
anti-infectieux ophtalmiques
agents anti-inflammatoires ophtalmiques
antihistaminiques et décongestionnants ophtalmiques
agents de diagnostic ophtalmique
agents de traitement du glaucome ophtalmique
lubrifiants et irrigations ophtalmiques
préparations ophtalmiques
stéroïdes ophtalmiques
stéroïdes ophtalmiques avec anti-infectieux
agents chirurgicaux ophtalmiques
compléments alimentaires oraux
immunostimulants
immunosuppresseurs
anesthésiques otiques
anti-infectieux otiques
préparations otiques
stéroïdes otiques
stéroïdes otiques avec anti-infectieux
anticonvulsivants à l’oxazolidinedione
antibiotiques à l’oxazolidinone
hormone parathyroïdienne et analogues
Inhibiteurs de la PARP
Inhibiteurs de la PCSK9
pénicillines résistantes à la pénicillinase
pénicillines
antagonistes des récepteurs d’opioïdes périphériques
agonistes/antagonistes mixtes des récepteurs d’opioïdes périphériques
vasodilatateurs périphériques
agents antiobésité agissant périphériquement
antiémétiques à phénothiazine
antipsychotiques à phénothiazine
antidépresseurs à phénylpipérazine
liants phosphatés
expanseurs de plasma
inhibiteurs de l'agrégation plaquettaire
agents stimulants plaquettaires
polyènes
diurétiques épargneurs de potassium avec thiazides
diurétiques épargneurs de potassium
probiotiques
modulateurs des récepteurs de la progestérone
progestatifs
inhibiteurs de la prolactine
antagonistes de la prostaglandine D2
inhibiteurs de protéase
antagonistes du récepteur 1 activé par la protéase
inhibiteurs du protéasome
inhibiteurs de la pompe à protons
psoralènes
agents psychothérapeutiques
associations psychothérapeutiques
nucléosides puriques
anticonvulsivants à la pyrrolidine
quinolones
agents de radiocontraste
auxiliaires radiologiques
agents radiologiques
agents de conjugaison radiologiques
radiopharmaceutiques
érythropoïétines humaines recombinantes

anticonvulsivants
inhibiteurs de l'anhydrase carbonique
agents de stress cardiaque
bêta-bloquants cardiosélectifs
agents cardiovasculaires
catécholamines
anticorps monoclonaux CD20
anticorps monoclonaux CD30
anticorps monoclonaux CD33
anticorps monoclonaux CD38
anticorps monoclonaux CD52
agents du système nerveux central
céphalosporines
inhibiteurs de bêta-lactamase/céphalosporines
céruménolytiques
associations de CFTR
potentiateurs CFTR
agents chélatants
antagonistes des récepteurs de chimiokines
 agents otiques
inhibiteurs de la rénine
agents respiratoires
produits respiratoires inhalés
dérivés de la rifamycine
salicylates
agents sclérosants
céphalosporines de deuxième génération
modulateurs sélectifs des récepteurs d’œstrogènes
immunosuppresseurs sélectifs
inhibiteurs sélectifs de la phosphodiestérase-4
inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine
inhibiteurs de la recapture de la sérotonine-norépinéphrine
modulateurs neuroentériques sérotoninergiques
associations d'hormones sexuelles
hormones sexuelles
inhibiteurs du SGLT-2
associations relaxantes des muscles squelettiques
relaxants des muscles squelettiques
agents de sevrage tabagique
somatostatine et analogues de la somatostatine
spermicides
statines
solutions d'irrigation stériles
dérivés de streptomyces
anticonvulsivants à la succinimide
sulfamides
sulfonylurées
stimulants synthétiques de l'ovulation
antidépresseurs tétracycliques
tétracyclines
radiopharmaceutiques thérapeutiques
vaccins thérapeutiques
diurétiques thiazidiques
thiazolidinediones
thioxanthènes
céphalosporines de troisième génération
inhibiteurs de la thrombine
thrombolytiques
médicaments pour la thyroïde
inhibiteurs du TNF alpha
agents tocolytiques
agents topiques contre l'acné
agents topiques
anesthésiques topiques
anti-infectieux topiques
agents anti-rosacée topiques
antibiotiques topiques
antifongiques topiques
antihistaminiques topiques
antinéoplasiques topiques
antipsoriasiques topiques
antiviraux topiques
antiviraux topiques
agents de débridement topiques
agents dépigmentants topiques
émollients topiques
kératolytiques topiques
anti-inflammatoires non stéroïdiens topiques
photochimiothérapie topique
rubéfiant topique
stéroïdes topiques
stéroïdes topiques avec anti-infectieux
anticonvulsivants à la triazine
antidépresseurs tricycliques
anticorps monoclonaux trifonctionnels
produits de contraste pour ultrasons
associations respiratoires supérieures
anticonvulsivants uréiques
agents des troubles du cycle de l'urée
anti-infectieux urinaires
antispasmodiques urinaires
modificateurs du pH urinaire
agents utérotoniques
associations de vaccins
anti-infectieux vaginaux
préparations vaginales
vasodilatateurs
antagonistes de la vasopressine
vasopresseurs
Inhibiteurs des VE.GF/VE.G.FR (de l’anglais : « VE.G.F/VE.G.FR inhibitors »)
vaccins viraux
agents de viscosupplémentation
associations de vitamines et de minéraux
vitamines
inhibiteurs de la 5-alpha-réductase
5-aminosalicylates
antagonistes des récepteurs 5HT3
activateurs des canaux chlorure
inhibiteurs de l'absorption du cholestérol
agonistes cholinergiques
stimulants musculaires cholinergiques
inhibiteurs de la cholinestérase
stimulants du SNC
modificateurs de coagulation
facteurs de stimulation des colonies
contraceptifs
corticotropine
coumarines et indandiones
inhibiteurs de la cox-2
Annexe I : Séquence de redémarrage du phage Lambda Conception I (lambda virulent) (SEQ ID NO : 2)
(la séquence commence au site COS)
Ces séquences sont celles mentionnées dans la section procédés sous "Ingénierie des phages lambda" et sont utilisées dans l'expérience pour la .
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Annexe II : Séquence de redémarrage du phage Lambda Conception II (lambda virulent, MTase EcoKI ) (SEQ ID NO : 3)
(la séquence commence au site COS)
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Annexe III : Séquence de redémarrage du phage Lambda Conception II (lambda virulent, MTase Eco0015) (SEQ ID NO : 4)
(la séquence commence au site COS)
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caaaggtactgcaagtgctcgcaacattcgcttatgcggattattgccgtagtgccgcgacgccgggggcaagatgcagagattgccatggtacaggccgtgcggttgatattgccaaaacagagctgtgggggagagttgtcgagaaagagtgcggaagatgcaaaggcgtcggctattcaaggatgccagcaagcgcagcatatcgcgctgtgacgatgctaatcccaaaccttacccaacccacctggtcacgcactgttaagccgctgtatgacgctctggtggtgcaatgccacaaagaagagtcaatcgcagacaacattttgaatgcggtcacacgttagcagcatgattgccacggatggcaacatattaacggcatgatattgacttattgaataaaattgggtaaatttgactcaacgatgggttaattcgctcgttgtggtagtgagatgaaaagaggcggcgcttactaccgattccgcctagttggtcacttcgacgtatcgtctggaactccaaccatcgcaggcagagaggtctgcaaaatgcaatcccgaaacagttcgcaggtaatagttagagcctgcataacggtttcgggattttttatatctgcacaacaggtaagagcattgagtcgataatcgtgaagagtcggcgagcctggttagccagtgctctttccgttgtgctgaattaagcgaataccggaagcagaaccggatcaccaaatgcgtacaggcgtcatcgccgcccagcaacagcacaacccaaactgagccgtagccactgtctgtcctgaattcattagtaatagttacgctgcggccttttacacatgaccttcgtgaaagcgggtggcaggaggtcgcgctaacaacctcctgccgttttgcccgtgcatatcggtcacgaacaaatctgattactaaacacagtagcctggatttgttctatcagtaatcgaccttattcctaattaaatagagcaaatccccttattgggggtaagacatgaagatgccagaaaaacatgacctgttggccgccattctcgcggcaaaggaacaaggcatcggggcaatccttgcgtttgcaatggcgtaccttcgcggcagatataatggcggtgcgtttacaaaaacagtaatcgacgcaacgatgtgcgccattatcgcctggttcattcgtgaccttctcgacttcgccggactaagtagcaatctcgcttatataacgagcgtgtttatcggctacatcggtactgactcgattggttcgcttatcaaacgcttcgctgctaaaaaagccggagtagaagatggtagaaatcaataatcaacgtaaggcgttcctcgatatgctggcgtggtcggagggaactgataacggacgtcagaaaaccagaaatcatggttatgacgtcattgtaggcggagagctatttactgattactccgatcaccctcgcaaacttgtcacgctaaacccaaaactcaaatcaacaggcgccggacgctaccagcttctttcccgttggtgggatgcctaccgcaagcagcttggcctgaaagacttctctccgaaaagtcaggacgctgtggcattgcagcagattaaggagcgtggcgctttacctatgattgatcgtggtgatatccgtcaggcaatcgaccgttgcagcaatatctgggcttcactgccgggcgctggttatggtcagttcgagcataaggctgacagcctgattgcaaaattcaaagaagcgggcggaacggtcagagagattgatgtatgagcagagtcaccgcgattatctccgctctggttatctgcatcatcgtctgcctgtcatgggctgttaatcattaccgtgataacgccattacctacaaagcccagcgcgacaaaaatgccagagaactgaagctggcgaacgcggcaattactgacatgcagatgcgtcagcgtgatgttgctgcgctcgatgcaaaatacacgaaggagttagctgatgctaaagctgaaaatgatgctctgcgtgatgatgttgccgctggtcgtcgtcggttgcacatcaaagcagtctgtcagtcagtgcgtgaagccaccaccgcctccggcgtggataatgcagcctccccccgactggcagacaccgctgaacgggattatttcaccctcagagagaggctgatcactatgcaaaaacaactggaaggaacccagaagtatattaatgagcagtgcagatagagttgcccatatcgatgggcaactcatgcaattattgtgagcaatacacacgcgcttccagcggagtataaatgcctaaagtaataaaaccgagcaatccatttacgaatgtttgctgggtttctgttttaacaacattttctgcgccgccacaaattttggctgcatcgacagttttcttctgcccaattccagaaacgaagaaatgatgggtgatggtttcctttggtgctactgctgccggtttgttttgaacagtaaacgtctgttgagcacatcctgtaataagcagggccagcgcagtagcgagtagcatttttttcatggtgttattcccgatgctttttgaagttcgcagaatcgtatgtgtagaaaattaaacaaaccctaaacaatgagttgaaatttcatattgttaatatttattaatgtatgtcaggtgcgatgaatcgtcattgtattcccggattaactatgtccacagccctgacggggaacttctctgcgggagtgtccgggaataattaaaacgatgcacacagggtttagcgcgtacacgtattgcattatgccaacgccccggtgctgacacggaagaaaccggacgttatgatttagcgtggaaagatttgtgtagtgttctgaatgctctcagtaaatagtaatgaattatcaaaggtatagtaatatcttttatgttcatggatatttgtaacccatcggaaaactcctgctttagcaagattttccctgtattgctgaaatgtgatttctcttgatttcaacctatcataggacgtttctataagatgcgtgtttcttgagaatttaacatttacaacctttttaagtccttttattaacacggtgttatcgttttctaacacgatgtgaatattatctgtggctagatagtaaatataatgtgagacgttgtgacgttttagttcagaataaaacaattcacagtctaaatcttttcgcacttgatcgaatatttctttaaaaatggcaacctgagccattggtaaaaccttccatgtgatacgagggcgcgtagtttgcattatcgtttttatcgtttcaatctggtctgacctccttgtgttttgttgatgatttatgtcaaatattaggaatgttttcacttaatagtattggttgcgtaacaaagtgcggtcctgctggcattctggagggaaatacaaccgacagatgtatgtaaggccaacgtgctcaaatcttcatacagaaagatttgaagtaatattttaaccgctagatgaagagcaagcgcatggagcgacaaaatgaataaagaacaatctgctgatgatccctccgtggatctgattcgtgtaaaaaatatgcttaatagcaccatttctatgagttaccctgatgttgtaattgcatgtatagaacataaggtgtctctggaagcattcagagcaattgaggcagcgttggtgaagcacgataataatatgaaggattattccctggtggttgactgatcaccataactgctaatcattcaaactatttagtctgtgacagagccaacacgcagtctgtcactgtcaggaaagtggtaaaactgcaactcaattactgcaatgccctcgtaattaagtgaatttacaatatcgtcctgttcggagggaagaacgcgggatgttcattcttcatcacttttaattgatgtatatgctctcttttctgacgttagtctccgacggcaggcttcaatgacccaggctgagaaattcccggaccctttttgctcaagagcgatgttaatttgttcaatcatttggttaggaaagcggatgttgcgggttgttgttctgcgggttctgttcttcgttgacatgaggttgccccgtattcagtgtcgctgatttgtattgtctgaagttgtttttacgttaagttgatgcagatcaattaatacgatacctgcgtcataattgattatttgacgtggtttgatggcctccacgcacgttgtgatatgtagatgataatcattatcactttacgggtcctttccggtgatccgacaggttacg 
Annexe IV Fichiers de séquences d'ADN GenBank d’ orfs codant pour les sous-unités RM
LOCUS M.EcoKI 2981 bp ds-DNA linear 09-NOV-2021 (SEQ ID NO: 5)
DEFINITION .
FEATURES Location/Qualifiers
misc_feature 1..1590
/label="M"
CDS 1..1590
/label="Translation 1-1590"
misc_feature 1587..2981
/label="S"
CDS 1587..2981
/label="Translation 1587-2981"
ORIGIN
1 atgaacaata acgatctggt cgcgaagctg tggaagctgt gcgacaacct gcgcgatggc
61 ggcgtttcct atcaaaacta cgtcaatgaa ctcgcctcgc tgctgttttt gaaaatgtgt
121 aaagagacgg gtcaggaagc ggaatacctg ccggaaggtt accgctggga tgacctgaaa
181 tcccgcatcg gccaggagca gttgcagttc taccgaaaaa tgctcgtgca tttaggcgaa
241 gatgacaaaa agctggtaca ggcagttttt cataatgtta gtaccaccat caccgagccg
301 aaacaaataa ccgcactggt cagcaatatg gattcgctgg actggtacaa cggcgcgcac
361 ggtaagtcgc gcgatgactt cggcgatatg tacgaagggc tgttgcagaa gaacgcgaat
421 gaaaccaagt ctggtgcagg ccagtacttc accccgcgtc cgctgattaa aaccattatt
481 catctgctga aaccgcagcc gcgtgaagtg gtgcaggacc cggcggcagg tacggcgggc
541 tttttgattg aagccgaccg ctatgttaag tcgcaaacca atgatctgga cgaccttgat
601 ggcgacacgc aggatttcca gatccaccgc gcgtttatcg gcctcgaact ggtgcccggc
661 acccgtcgtc tggcactgat gaactgcctg ctgcacgata ttgaaggcaa cctcgaccac
721 ggcggcgcaa tccgtctggg caacacTctg ggTagcgacg gtgaaaacct gccgaaggcg
781 catattgtcg ccactaaccc gccgtttggc agcgccgcag gcaccaacat tacccgcacc
841 tttgttcacc cgaccagcaa caaacagTtg tgctttatgc agcatattat cgaaacgctg
901 catcccggcg gtcgtgcggc ggtggtggtg ccGgataacg tgCtgtttga aggcggcaaa
961 ggcaccgaca tTcgtcgtga cctgatggat aagtgtcatc tgcacaccat tctgcgtctg
1021 ccgaccggta ttttttacgc Tcagggcgtg aagaccaacg tgctgttctt taccaaaggG
1081 acGgtggcga acccgAatca ggataagaac tgTaccgaTg aTgtgtgggt gtatgacctg
1141 cgtaccaata tgccgagttt cggcaagcgc acaccgttta ccgacgagca tttgcagccg
1201 tttgagcgcg tgtatggcga agacccgcac ggtttaagcc cgcgcactga aggtgaatgg
1261 agttttaacg ccgaagagac ggaagttgcc gacagcgaag agaacaaaaa caccgaccag
1321 catcttgcta ccagccgctg gcgcaagttc agccgtgagt ggatccgcac cgcaaaatcc
1381 gattcgctgg atatctcctg gctgaaagat aaagacagta ttgatgccga cagcctgccg
1441 gagccggatg tattagcggc agaagcgatg ggcgaactgg tacaggcgct gtctgaactg
1501 gatgcgctga tgcgtgaact gggggcgagc gatgaggccg atttgcagcg tcagttgctg
1561 gaagaagcgt ttggtggggt gaaggaatga gtgcggggaa attgccggag gggtgggtta
1621 tcgccccagt atctacggtc acaactctaa tccgaggagt aacgtataaa aaagagcagg
1681 caataaatta tctaaaagat gattatttgc ctcttatccg tgcgaacaat attcagaatg
1741 gcaagtttga tactacggac ttggtttttg ttcctaaaaa tcttgttaaa gaaaGtcaaa
1801 aaatatctcc tgaagatatt gttattgcaa tgtcatcagg gagcaaatcc gtagttggta
1861 aatccgcaca tcagcatcta ccatttgaat gtagtttcgg cgcattttgc ggtgtattac
1921 gtcctgaaaa acttatattt tctggtttta ttgctcattt cacaaaatct tctctttatc
1981 gaaacaaaat ttcatcactt tctgctggtg caaatattaa taatattaag ccggcaagct
2041 ttgatttgat aaatatacca atcccaccac ttgccgaaca aaaaatcatc gctgaaaaac
2101 tcgatacgct gctggcgcag gtagacagca ccaaagcacg ttttgagcaa atcccacaaa
2161 tcctgaaacg ttttcgtcaa gcggtattgg ggggcgcagt taatggaaaa ttgacagaaa
2221 aatggcgtaa ttttgagccg caacattctg tatttaagaa gttaaatttt gaatctatct
2281 taactgaatt acgtaatggt ctttcatcaa agccaaatga aagtggtgtt ggtcatccaa
2341 tactacgcat tagttctgta cgtgctggcc atgtagatca aaacgatatt cggtttctag
2401 aatgttcaga aagtgaacta aaccgccaca aattacaaga tggagatctt ttatttactc
2461 gctataacgg aagtttagaa tttgttggtg tttgtgggtt attgaaaaaa ttacaacatc
2521 aaaatttgct atatcctgat aaacttattc gagctcgatt aaccaaagat gctttaccag
2581 aatatatcga aatatttttt tcatccccct cagcacgaaa tgcaatgatg aactgcgtga
2641 aaacaacttc tggtcaaaaa ggtatttcag gaaaagatat caaatcccaa gttgttttat
2701 tacctccagt aaaagaacaa gccgaaatcg ttcgccgcgt cgagcaactc ttcgcctacg
2761 ccgacaccat agaaaaacag gtcaacaacg ccttagcccg cgtcaacaac ctgacgcaat
2821 ccatcctggc aaaagcgttc cgtggtgaac ttaccgccca gtggcgggcc gaaaacccgg
2881 atttgatcag cggagaaaac agcgccgccg cgttgctgga aaaaatcaaa gctgaacgcg
2941 cagctagcgg gggtaaaaaa gcctcacgta aaaaatcctg a
//
LOCUS mutant_M.EcoKI 2981 bp ds-DNA linear 09-NOV-2021 (SEQ ID NO: 6)
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FEATURES Location/Qualifiers
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/label="Translation 1-1590"
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/label="Translation 1587-2981"
ORIGIN
1 atgaacaata acTAActggt cgcgaagctg tggaagctgt gcgacaacct gcgcgatggc
61 ggcgtttcct atcaaaacta cgtcaatgaa ctcgcctcgc tgctgttttt gaaaatgtgt
121 aaagagacgg gtcaggaagc ggaatacctg ccggaaggtt accgctggga tgacctgaaa
181 tcccgcatcg gccaggagca gttgcagttc taccgaaaaa tgctcgtgca tttaggcgaa
241 gatgacaaaa agctggtaca ggcagttttt cataatgtta gtaccaccat caccgagccg
301 aaacaaataa ccgcactggt cagcaatatg gattcgctgg actggtacaa cggcgcgcac
361 ggtaagtcgc gcgatgactt cggcgatatg tacgaagggc tgttgcagaa gaacgcgaat
421 gaaaccaagt ctggtgcagg ccagtacttc accccgcgtc cgctgattaa aaccattatt
481 catctgctga aaccgcagcc gcgtgaagtg gtgcaggacc cggcggcagg tacggcgggc
541 tttttgattg aagccgaccg ctatgttaag tcgcaaacca atgatctgga cgaccttgat
601 ggcgacacgc aggatttcca gatccaccgc gcgtttatcg gcctcgaact ggtgcccggc
661 acccgtcgtc tggcactgat gaactgcctg ctgcacgata ttgaaggcaa cctcgaccac
721 ggcggcgcaa tccgtctggg caacacTctg ggTagcgacg gtgaaaacct gccgaaggcg
781 catattgtcg ccactaaccc gccgtttggc agcgccgcag gcaccaacat tacccgcacc
841 tttgttcacc cgaccagcaa caaacagTtg tgctttatgc agcatattat cgaaacgctg
901 catcccggcg gtcgtgcggc ggtggtggtg ccGgataacg tgCtgtttga aggcggcaaa
961 ggcaccgaca tTcgtcgtga cctgatggat aagtgtcatc tgcacaccat tctgcgtctg
1021 ccgaccggta ttttttacgc Tcagggcgtg aagaccaacg tgctgttctt taccaaaggG
1081 acGgtggcga acccgAatca ggataagaac tgTaccgaTg aTgtgtgggt gtatgacctg
1141 cgtaccaata tgccgagttt cggcaagcgc acaccgttta ccgacgagca tttgcagccg
1201 tttgagcgcg tgtatggcga agacccgcac ggtttaagcc cgcgcactga aggtgaatgg
1261 agttttaacg ccgaagagac ggaagttgcc gacagcgaag agaacaaaaa caccgaccag
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1381 gattcgctgg atatctcctg gctgaaagat aaagacagta ttgatgccga cagcctgccg
1441 gagccggatg tattagcggc agaagcgatg ggcgaactgg tacaggcgct gtctgaactg
1501 gatgcgctga tgcgtgaact gggggcgagc gatgaggccg atttgcagcg tcagttgctg
1561 gaagaagcgt ttggtggggt gaaggaatga gtgcgTAAaa attgccggag gggtgggtta
1621 tcgccccagt atctacggtc acaactctaa tccgaggagt aacgtataaa aaagagcagg
1681 caataaatta tctaaaagat gattatttgc ctcttatccg tgcgaacaat attcagaatg
1741 gcaagtttga tactacggac ttggtttttg ttcctaaaaa tcttgttaaa gaaaGtcaaa
1801 aaatatctcc tgaagatatt gttattgcaa tgtcatcagg gagcaaatcc gtagttggta
1861 aatccgcaca tcagcatcta ccatttgaat gtagtttcgg cgcattttgc ggtgtattac
1921 gtcctgaaaa acttatattt tctggtttta ttgctcattt cacaaaatct tctctttatc
1981 gaaacaaaat ttcatcactt tctgctggtg caaatattaa taatattaag ccggcaagct
2041 ttgatttgat aaatatacca atcccaccac ttgccgaaca aaaaatcatc gctgaaaaac
2101 tcgatacgct gctggcgcag gtagacagca ccaaagcacg ttttgagcaa atcccacaaa
2161 tcctgaaacg ttttcgtcaa gcggtattgg ggggcgcagt taatggaaaa ttgacagaaa
2221 aatggcgtaa ttttgagccg caacattctg tatttaagaa gttaaatttt gaatctatct
2281 taactgaatt acgtaatggt ctttcatcaa agccaaatga aagtggtgtt ggtcatccaa
2341 tactacgcat tagttctgta cgtgctggcc atgtagatca aaacgatatt cggtttctag
2401 aatgttcaga aagtgaacta aaccgccaca aattacaaga tggagatctt ttatttactc
2461 gctataacgg aagtttagaa tttgttggtg tttgtgggtt attgaaaaaa ttacaacatc
2521 aaaatttgct atatcctgat aaacttattc gagctcgatt aaccaaagat gctttaccag
2581 aatatatcga aatatttttt tcatccccct cagcacgaaa tgcaatgatg aactgcgtga
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2941 cagctagcgg gggtaaaaaa gcctcacgta aaaaatcctg a
//
LOCUS M.Eco0015 2954 bp ds-DNA linear 09-NOV-2021 (SEQ ID NO: 7)
DEFINITION .
FEATURES Location/Qualifiers
misc_feature 1..1590
/label="M"
CDS 1..1590
/label="Translation 1-1590"
misc_feature 1587..2954
/label="S"
CDS 1587..2954
/label="Translation 1587-2954"
ORIGIN
1 atgaacaata acgatctggt cgcgaagctg tggaagctgt gcgacaacct gcgcgatggc
61 ggcgtttcct atcaaaacta cgtcaatgaa ctcgcctcgc tgctgttttt gaaaatgtgt
121 aaagagacTg ggcaggaagc ggaatacctg ccggaaggtt accgctggga tgacctgaaa
181 tcccgcatcg gccaggagca gttgcagttc taccgaaaaa tgctcgtgca tttaggcgaa
241 gatgacaaaa agctggtaca ggcagttttt cataatgtta gtaccaccat caccgagccg
301 aaacaaataa ccgcactggt cagcaatatg gattcactgg actggtacaa cggtgcgcac
361 ggtaagtcgc gcgatgactt cggcgatatg tacgaagggc tgctgcagaa gaacgccaat
421 gaaaccaagt ctggcgcggg ccagtacttc accccgcgtc cgctgattaa aaccattatt
481 catctgctga aaccgcagcc acgtgaagtg gtacaggatc cggcagccgg tacggcgggc
541 tttttgattg aagccgaccg ctacgttaag tcgcagacta acgatctgga cgaccttgat
601 ggcgacacgc aggatttcca gatccaccgc gcgtttatcg gcctcgaact ggtgcccggc
661 acccgtcgtc tggcgctgat gaactgcctg ctgcacgata ttgaaggcaa cctcgaccac
721 ggcggcgcaa tccgtctggg caacaccctg ggcagcgacg gcgaaaacct gccgaaggcg
781 catattgtcg ccactaaccc gccgtttggc agcgccgcag gcaccaacat tacccgcacc
841 tttgttcacc cgaccagcaa caaacagttg tgctttatgc agcatattat cgaaacgctg
901 caccccggcg gtcgtgcggc ggtggtggtg ccggataacg tgctgtttga aggcggcaaa
961 ggtacggaca tccgtcgtga cctgatggat aagtgtcatc tgcacactat tctgcgtctg
1021 ccgaccggta ttttttacgc gcagggcgtg aagaccaacg tgctgttctt taccaaaggg
1081 acggtggcga acccgaatca ggataagaac tgcaccgatg acgtgtgggt gtacgacctg
1141 cggaccaata tgccgagctt tggtaaacgc acgccgttta ccgacgagca tttgcaaccg
1201 tttgagcgcg tgtttggcga agacccgcac ggcttaagcc cgcgcactga aggtgaatgg
1261 agttttaacg ccgaagagac ggaaattgcc gacagcgaag agaacaaaaa caccgaccag
1321 catcttgcta ccagccgctg gcgcaagttc agccgcgagt ggatccgcac cgcgaaatcc
1381 gattcgctgg atatctcctg gctgaaagat aaagacagta ttgatgccga caacctgccg
1441 gagccggatg tattagcggc agaagcgatg ggtgaactgg tacaggcgct gtctgaactg
1501 gatgcgctga tgcgtgaact gggggcgagc gatgaggcgg atgcgcagcg ccagttgctg
1561 gaagaagcat ttggtggggt gaaggaatga gtgctgggaa attgccggag gggtgggaac
1621 agattgaaat aggcgacatt gctgatgtca tctctggtgg gacaccaaaa tcgggagtcg
1681 ctgaaaattt tgcaccttcg ggtgagggag tcgcctggct tacgcctgcc gatttgagcg
1741 gttataaaga gaaatatatc tcacatggtg ccagagattt aactacacta ggctattcct
1801 cttgttcagc aaaactaatg cccaaaggca ctatactttt tagtagccgg gcaccgattg
1861 gatatgttgc tattgctgca aatgagattg cgactaacca gggtttcaaa agttttgctt
1921 ttccttcaga catttttcct gattatgcat attactttct ccgcaacatc agacatattg
1981 cagaggaaat gggcacagga acaactttta aagaaatttc tggtagttct gcgaaaacat
2041 taccatttgt tcttgtaccg tttgccgaac aaaaaatcat cgctgaaaaa ctcgatacgc
2101 tgctggcaca ggtagacagc accaaagcac gtcttgagca aatcccacaa atcctgaaac
2161 gttttcgtca ggcggttctg ggtgcagcgg tgagaggaaa actaactgaa gactggagag
2221 ataattcaag cctgtctggg tggagagaag gcaaacttgg ggagtttata aaaaaaccaa
2281 gttacggaac gtcatctaag tctaataaag aaggactcat tcctgtatta agaatgggca
2341 atcttcaggg aggaaagttg gactggacgg atctagtcta tacgtcagat accatagaaa
2401 ttgaaaagta taaacttgag tacaatgatg tattattcaa tcgtacaaat agtcctgaac
2461 ttgtcgggaa aacagccata tataaatcag agcaaccagc tatttatgca ggttatttga
2521 ttagggttca atgtttacct gatttaaacc ctgactatct taactaccat ttaaatagca
2581 ttttggggag acaatattgc tattcagtta aatctgatgg ggtcagtcaa tcaaatatta
2641 atgcacagaa attaattgca tacccaataa ctgttccccc ccttcccgaa caagctgaaa
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2761 acgccttagc ccgcgtcaac aatctgacgc aatccatcct ggcaaaagcg ttccgtggtg
2821 aactcaccgc ccagtggcgg gccgaaaacc cggaattaat cagcggtgaa aacagcgccg
2881 ccgcgttgct ggagaaaatc aaagctgaac gcgcagccag cgggggtaaa aaagcctcgc
2941 gtaaaaagtc ctga
//
LOCUS mutant_M.Eco0015 2954 bp ds-DNA linear 09-NOV-2021 (SEQ ID NO: 8)
DEFINITION .
FEATURES Location/Qualifiers
misc_feature 1..1590
/label="M"
CDS 1..1590
/label="Translation 1-1590"
misc_feature 1587..2954
/label="S"
CDS 1587..2954
/label="Translation 1587-2954"
ORIGIN
1 atgaacaata acTAActggt cgcgaagctg tggaagctgt gcgacaacct gcgcgatggc
61 ggcgtttcct atcaaaacta cgtcaatgaa ctcgcctcgc tgctgttttt gaaaatgtgt
121 aaagagacTg ggcaggaagc ggaatacctg ccggaaggtt accgctggga tgacctgaaa
181 tcccgcatcg gccaggagca gttgcagttc taccgaaaaa tgctcgtgca tttaggcgaa
241 gatgacaaaa agctggtaca ggcagttttt cataatgtta gtaccaccat caccgagccg
301 aaacaaataa ccgcactggt cagcaatatg gattcactgg actggtacaa cggtgcgcac
361 ggtaagtcgc gcgatgactt cggcgatatg tacgaagggc tgctgcagaa gaacgccaat
421 gaaaccaagt ctggcgcggg ccagtacttc accccgcgtc cgctgattaa aaccattatt
481 catctgctga aaccgcagcc acgtgaagtg gtacaggatc cggcagccgg tacggcgggc
541 tttttgattg aagccgaccg ctacgttaag tcgcagacta acgatctgga cgaccttgat
601 ggcgacacgc aggatttcca gatccaccgc gcgtttatcg gcctcgaact ggtgcccggc
661 acccgtcgtc tggcgctgat gaactgcctg ctgcacgata ttgaaggcaa cctcgaccac
721 ggcggcgcaa tccgtctggg caacaccctg ggcagcgacg gcgaaaacct gccgaaggcg
781 catattgtcg ccactaaccc gccgtttggc agcgccgcag gcaccaacat tacccgcacc
841 tttgttcacc cgaccagcaa caaacagttg tgctttatgc agcatattat cgaaacgctg
901 caccccggcg gtcgtgcggc ggtggtggtg ccggataacg tgctgtttga aggcggcaaa
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1021 ccgaccggta ttttttacgc gcagggcgtg aagaccaacg tgctgttctt taccaaaggg
1081 acggtggcga acccgaatca ggataagaac tgcaccgatg acgtgtgggt gtacgacctg
1141 cggaccaata tgccgagctt tggtaaacgc acgccgttta ccgacgagca tttgcaaccg
1201 tttgagcgcg tgtttggcga agacccgcac ggcttaagcc cgcgcactga aggtgaatgg
1261 agttttaacg ccgaagagac ggaaattgcc gacagcgaag agaacaaaaa caccgaccag
1321 catcttgcta ccagccgctg gcgcaagttc agccgcgagt ggatccgcac cgcgaaatcc
1381 gattcgctgg atatctcctg gctgaaagat aaagacagta ttgatgccga caacctgccg
1441 gagccggatg tattagcggc agaagcgatg ggtgaactgg tacaggcgct gtctgaactg
1501 gatgcgctga tgcgtgaact gggggcgagc gatgaggcgg atgcgcagcg ccagttgctg
1561 gaagaagcat ttggtggggt gaaggaatga gtgctgggTA Attgccggag gggtgggaac
1621 agattgaaat aggcgacatt gctgatgtca tctctggtgg gacaccaaaa tcgggagtcg
1681 ctgaaaattt tgcaccttcg ggtgagggag tcgcctggct tacgcctgcc gatttgagcg
1741 gttataaaga gaaatatatc tcacatggtg ccagagattt aactacacta ggctattcct
1801 cttgttcagc aaaactaatg cccaaaggca ctatactttt tagtagccgg gcaccgattg
1861 gatatgttgc tattgctgca aatgagattg cgactaacca gggtttcaaa agttttgctt
1921 ttccttcaga catttttcct gattatgcat attactttct ccgcaacatc agacatattg
1981 cagaggaaat gggcacagga acaactttta aagaaatttc tggtagttct gcgaaaacat
2041 taccatttgt tcttgtaccg tttgccgaac aaaaaatcat cgctgaaaaa ctcgatacgc
2101 tgctggcaca ggtagacagc accaaagcac gtcttgagca aatcccacaa atcctgaaac
2161 gttttcgtca ggcggttctg ggtgcagcgg tgagaggaaa actaactgaa gactggagag
2221 ataattcaag cctgtctggg tggagagaag gcaaacttgg ggagtttata aaaaaaccaa
2281 gttacggaac gtcatctaag tctaataaag aaggactcat tcctgtatta agaatgggca
2341 atcttcaggg aggaaagttg gactggacgg atctagtcta tacgtcagat accatagaaa
2401 ttgaaaagta taaacttgag tacaatgatg tattattcaa tcgtacaaat agtcctgaac
2461 ttgtcgggaa aacagccata tataaatcag agcaaccagc tatttatgca ggttatttga
2521 ttagggttca atgtttacct gatttaaacc ctgactatct taactaccat ttaaatagca
2581 ttttggggag acaatattgc tattcagtta aatctgatgg ggtcagtcaa tcaaatatta
2641 atgcacagaa attaattgca tacccaataa ctgttccccc ccttcccgaa caagctgaaa
2701 tcgttcgccg cgtcgagcaa ctcttcgcct acgccgacac aatagaaaaa caggtcaaca
2761 acgccttagc ccgcgtcaac aatctgacgc aatccatcct ggcaaaagcg ttccgtggtg
2821 aactcaccgc ccagtggcgg gccgaaaacc cggaattaat cagcggtgaa aacagcgccg
2881 ccgcgttgct ggagaaaatc aaagctgaac gcgcagccag cgggggtaaa aaagcctcgc
2941 gtaaaaagtc ctga
//
LOCUS pM0-Eco0015_R+M+S 6708 bp ds-DNA linear 09-NOV-2021 (SEQ ID NO: 9)
DEFINITION .
FEATURES Location/Qualifiers
misc_feature 1..36
/label="pM0"
misc_feature 41..3553
/label="R"
CDS 41..3553
/label="Translation 41-3553"
misc_feature 3755..5344
/label="M"
CDS 3755..5344
/label="Translation 3755-5344"
misc_feature 5341..6708
/label="S"
CDS 5341..6708
/label="Translation 5341-6708"
ORIGIN
1 ggattaacaa tataagctga ccttcaagta ttgaatTGAC atgatgaata aatccaactt
61 cgaattcctg aagggcgtca acgacttcac ttatgccatc gcctgtgcgg cggaaaataa
121 ctacccggat gatcccaaca cgacgctgat taaaatgcgt atgtttggcg aagctacagc
181 gaaacatctt ggtctgttac tcaacatccc cccttgtgag aatcaacacg atctcctgcg
241 cgaactcggc aaaatcgcct tcgttgatga caacattctc tctgtattcc acaaattacg
301 ccgcattggt aaccaggcgg tgcacgaata ccataacgat ctcgacgatg cccagatgtg
361 cctgcgactc gggttccgcc tggctgtctg gtactaccgt ctggtcacca aagattatga
421 cttcccggtg ccggtatttg tgttgccgga acgtggcgaa aacctctatc accaggaagt
481 gctgacgcta aaacaacagc ttgaacagca ggcgcgagaa aaagcgcaga ctcaggcaga
541 agtcgaagcg caacagcaga agctggttgc cctgaacggc tatatcgcca ttctggaagg
601 caaacagcag gaaacagaag cgcaaaccca ggctcgcctt gcggcgctgg aagcacagct
661 cgccgagaag aacgcggagc tggccaaaca gaccgaacag gaacgtaagg cttaccacaa
721 agaaattacc gatcaggcca tcaagcgcac actcaacctt agcgaagaag agagtcgctt
781 cctgattgac gcgcaactgc gtaaagcagg ctggcaggcc gatagcaaaa ccctgcgctt
841 ctccaaaggc gcacgcccgg aacccggcgt caataaagcc attgccgaat ggccgaccgg
901 gaaagatgaa acgggtaatc agggctttgc ggattatgtg ctgtttgtcg gcctcaagcc
961 catcgcggtg gtagaggcga aacgtaaaaa tatcgacgtt cccggcaagc tcaatgagtc
1021 gtatcgctac agcaaatgct tcgataatgg cttcctgcgg gaaaccttgc ttgagcatta
1081 ctcaccggat gaagtgcatg aagctgtgcc ggagtatgaa actagctggc aggacaccag
1141 cggccaacaa cggtttaaaa tccccttctg ctactccacc aacgggcgcg aatatcgcgc
1201 agcaatgaag actaaaagtg gcatctggta tcgcgacgtg cgtgataccc gcaatatgtc
1261 gaaagcctta cccgagtggc atcgcccgga agagctgctg gaaatgctcg gcagcgaacc
1321 gcaaaaacag aatcagtggt ttgccgataa cccgggcatg agcgagctgg gcctgcgtta
1381 ttaccaggaa gatgccgtcc gcgcggtgga aaaggcaatc gtcaagggtc aacaagagat
1441 cctgctggcg atggcgaccg gtaccggtaa aacccgcacc gcaattgcca tgatgttccg
1501 cctgatccag tcccagcgtt ttaaacgcat tctcttcctt gtcgatcgcc gttctcttgg
1561 cgagcaggca ctgggggcgt ttgaagatac gcgtattaac ggcgacacct tcaacagcat
1621 tttcgacatt aaagggctga cggataaatt ccccgaagac agcaccaaaa ttcacgttgc
1681 caccgtacag tcgctggtga aacgcaccct acaatcagat gaaccgatgc cggtggcccg
1741 ttacgactgt atcgtcgtcg atgaagcgca tcgcggctat attctcgata aagagcagac
1801 cgaaggcgag ctgcagttcc gcagccagct ggattacgtt tctgcctacc gtcgcattct
1861 cgatcacttc gatgcggtaa aaatcgccct caccgccacc ccggcgctgc atacggtgca
1921 gattttcggc gagccggttt accgttatac ctaccgtacc gcggttatcg acggttttct
1981 gatcgaccag gatccgccga ttcagatcat cacccgcaac gcccaggagg gggtttatct
2041 ctccaagggc gaacaggtag agcgcatcag cccgcaggga gaagtgatca acgataccct
2101 ggaagacgat caggattttg aggtcgccga ctttaaccgt ggcctggtga tcccggcgtt
2161 taaccgcgcc gtctgtaacg agctcaccaa ctaccttgac ccgaccgggt cgcaaaaaac
2221 gctggtcttc tgcgttacca atgcccatgc cgatatggtg gtggaagagt tgcgtaccgc
2281 gttcaagaaa aagtatccgc aactggagca cgacgcgatc atcaagatca ccggtgatgc
2341 cgataaagac gcgcgcaaag tgcagaccat gatcacccgc ttcaataaag agcggctgcc
2401 caatatcgtg gtaaccgtcg acctgctgac aaccggcgtc gatattccgt cgatctgtaa
2461 tatcgtgttc ctgcgtaaag tacgcagccg tattctgtac gagcagatga aaggccgcgc
2521 cacgcgctta tgcccggacg tgaataaaac cagctttaag attttcgact gtgtcgatat
2581 ctacagcacg ctggagagcg tcgacaccat gcgtccggtg gtggtgcgtc cgaaggtgga
2641 actgcaaacg ctggtcaatg aaattaccga ttcagaaacc tataaaatca ccgaagcgga
2701 tggccgtagc tttgccgagc acagccatga acaattggtg gcgaagctcc agcgcatcat
2761 cggcctggcc acgtttaacc gtgaccgcag cgaaacgata gataaacagg tgcgtcgtct
2821 ggatgagcta tgccaggacg cggcgggcgt gaactttaac ggcttcgcct cgcgcctgcg
2881 ggaaaaaggg ccgcactgga gcgccgaagt ctttaacaaa ctgcctggct ttatcgcccg
2941 tctggaaaag ctgaaaacgg acatcaacaa cctgaatgat gcgccgatct tcctcgatat
3001 cgacgatgaa gtggtgagtg taaaatcgct gtacggtgat tacgacacgc cgcaggattt
3061 cctcgaagcc tttgactcgc tggtgcaacg ttccccgaac gcgcagccgg cattgcaggc
3121 ggtgatcaat cgcccgcgcg atctcacccg taaagggctg gtcgagctcc aggagtggtt
3181 tgaccgccag cattttgagg aatcttccct gcgcaaagca tggaaagaga cgcgcaatga
3241 agatatcgcc gcccggctga ttggtcatat tcgccgcgct gcggtgggcg atgcgctgaa
3301 accgtttgag gaacgtgtcg atcacgcgct gacgcgcatt aagggtgaaa acgactggag
3361 cagcgagcaa ttaagctggc tcgatcgttt agcgcaggcg ctgaaagaga aagtggtgct
3421 cgacgacgat gtcttcaaaa ccggcaactt ccaccgccgc ggcggtaagg cgatgctaca
3481 aagaaccttt gacgataatc tcgacaacct gcttgataaa ttcagcgatt atatctggga
3541 cgagctggcc tgacacgtat acacttcatc cttcaggctg cctctgcgtt ggctgcgctc
3601 gttcaccccg gtcacgtact tctgtacgct cccggggatt cactcacttg ccgccttgat
3661 gcaacctgaa tgattttgtg tatattaccc tcggcaattt cttcttctgc ggccccaaac
3721 aatgcgggcc gttgtttaat ttacggaact cacaatgaac aataacgatc tggtcgcgaa
3781 gctgtggaag ctgtgcgaca acctgcgcga tggcggcgtt tcctatcaaa actacgtcaa
3841 tgaactcgcc tcgctgctgt ttttgaaaat gtgtaaagag acTgggcagg aagcggaata
3901 cctgccggaa ggttaccgct gggatgacct gaaatcccgc atcggccagg agcagttgca
3961 gttctaccga aaaatgctcg tgcatttagg cgaagatgac aaaaagctgg tacaggcagt
4021 ttttcataat gttagtacca ccatcaccga gccgaaacaa ataaccgcac tggtcagcaa
4081 tatggattca ctggactggt acaacggtgc gcacggtaag tcgcgcgatg acttcggcga
4141 tatgtacgaa gggctgctgc agaagaacgc caatgaaacc aagtctggcg cgggccagta
4201 cttcaccccg cgtccgctga ttaaaaccat tattcatctg ctgaaaccgc agccacgtga
4261 agtggtacag gatccggcag ccggtacggc gggctttttg attgaagccg accgctacgt
4321 taagtcgcag actaacgatc tggacgacct tgatggcgac acgcaggatt tccagatcca
4381 ccgcgcgttt atcggcctcg aactggtgcc cggcacccgt cgtctggcgc tgatgaactg
4441 cctgctgcac gatattgaag gcaacctcga ccacggcggc gcaatccgtc tgggcaacac
4501 cctgggcagc gacggcgaaa acctgccgaa ggcgcatatt gtcgccacta acccgccgtt
4561 tggcagcgcc gcaggcacca acattacccg cacctttgtt cacccgacca gcaacaaaca
4621 gttgtgcttt atgcagcata ttatcgaaac gctgcacccc ggcggtcgtg cggcggtggt
4681 ggtgccggat aacgtgctgt ttgaaggcgg caaaggtacg gacatccgtc gtgacctgat
4741 ggataagtgt catctgcaca ctattctgcg tctgccgacc ggtatttttt acgcgcaggg
4801 cgtgaagacc aacgtgctgt tctttaccaa agggacggtg gcgaacccga atcaggataa
4861 gaactgcacc gatgacgtgt gggtgtacga cctgcggacc aatatgccga gctttggtaa
4921 acgcacgccg tttaccgacg agcatttgca accgtttgag cgcgtgtttg gcgaagaccc
4981 gcacggctta agcccgcgca ctgaaggtga atggagtttt aacgccgaag agacggaaat
5041 tgccgacagc gaagagaaca aaaacaccga ccagcatctt gctaccagcc gctggcgcaa
5101 gttcagccgc gagtggatcc gcaccgcgaa atccgattcg ctggatatct cctggctgaa
5161 agataaagac agtattgatg ccgacaacct gccggagccg gatgtattag cggcagaagc
5221 gatgggtgaa ctggtacagg cgctgtctga actggatgcg ctgatgcgtg aactgggggc
5281 gagcgatgag gcggatgcgc agcgccagtt gctggaagaa gcatttggtg gggtgaagga
5341 atgagtgctg ggaaattgcc ggaggggtgg gaacagattg aaataggcga cattgctgat
5401 gtcatctctg gtgggacacc aaaatcggga gtcgctgaaa attttgcacc ttcgggtgag
5461 ggagtcgcct ggcttacgcc tgccgatttg agcggttata aagagaaata tatctcacat
5521 ggtgccagag atttaactac actaggctat tcctcttgtt cagcaaaact aatgcccaaa
5581 ggcactatac tttttagtag ccgggcaccg attggatatg ttgctattgc tgcaaatgag
5641 attgcgacta accagggttt caaaagtttt gcttttcctt cagacatttt tcctgattat
5701 gcatattact ttctccgcaa catcagacat attgcagagg aaatgggcac aggaacaact
5761 tttaaagaaa tttctggtag ttctgcgaaa acattaccat ttgttcttgt accgtttgcc
5821 gaacaaaaaa tcatcgctga aaaactcgat acgctgctgg cacaggtaga cagcaccaaa
5881 gcacgtcttg agcaaatccc acaaatcctg aaacgttttc gtcaggcggt tctgggtgca
5941 gcggtgagag gaaaactaac tgaagactgg agagataatt caagcctgtc tgggtggaga
6001 gaaggcaaac ttggggagtt tataaaaaaa ccaagttacg gaacgtcatc taagtctaat
6061 aaagaaggac tcattcctgt attaagaatg ggcaatcttc agggaggaaa gttggactgg
6121 acggatctag tctatacgtc agataccata gaaattgaaa agtataaact tgagtacaat
6181 gatgtattat tcaatcgtac aaatagtcct gaacttgtcg ggaaaacagc catatataaa
6241 tcagagcaac cagctattta tgcaggttat ttgattaggg ttcaatgttt acctgattta
6301 aaccctgact atcttaacta ccatttaaat agcattttgg ggagacaata ttgctattca
6361 gttaaatctg atggggtcag tcaatcaaat attaatgcac agaaattaat tgcataccca
6421 ataactgttc ccccccttcc cgaacaagct gaaatcgttc gccgcgtcga gcaactcttc
6481 gcctacgccg acacaataga aaaacaggtc aacaacgcct tagcccgcgt caacaatctg
6541 acgcaatcca tcctggcaaa agcgttccgt ggtgaactca ccgcccagtg gcgggccgaa
6601 aacccggaat taatcagcgg tgaaaacagc gccgccgcgt tgctggagaa aatcaaagct
6661 gaacgcgcag ccagcggggg taaaaaagcc tcgcgtaaaa agtcctga
//
LOCUS M.EcoMII 2914 bp ds-DNA linear 09-NOV-2021 (SEQ ID NO: 10)
DEFINITION .
FEATURES Location/Qualifiers
misc_feature 1..1620
/label="M"
CDS 1..1620
/label="Translation 1-1620"
misc_feature 1610..2914
/label="S"
CDS 1610..2914
/label="Translation 1610-2914"
ORIGIN
1 atggccaaag caccaactaa aaaagccaaa gcaaaaaaag gctttgaaga aacattatgg
61 gataccgcaa accaacttcg cggtagcgtt gagtcctccg aatacaagca cgtggtgtta
121 agcctcgtgt tcctgaaatt catcagcgat aagtttgaag cacgccgcaa aaaaatgatt
181 gccgatgggc aagctgactt ccttgagatg gaagtgttct accagcagga caacattttc
241 tacctgccgg aagaggcgcg ctggtcgttt atcaaacaaa atgccaaaca ggacgatatt
301 gcggttcgta ttgacaccgc cctctcgaca attgagaaac gtaacccaac cctgaaaggc
361 gcgctgccag acaactactt cagccgtcag aatctggaaa ccaaaaaact ggcgtcactg
421 attgatacca tcgacaacat cgaaacgctg gcacacgaaa ctgacgttga aacgttgtcg
481 aaagaagacc tggtcggacg cgtttacgaa tacttcctcg gtaagtttgc cgcaaccgaa
541 ggcaaaggcg gtggagagtt ctacacgccc aaatgtgtgg tcacgctgtt aactgaaatg
601 ctcgaaccct tccagggcaa aatttatgac ccgtgctgcg gctcggcagg gatgttcgtg
661 cagtcggtga agttcgtcga gagccatcag ggtaaaagcc gtgatatcgc gctgtatggt
721 caggaactga cagccacgac gtataaactg gcaaaaatga acctcgccat tcgcggtctt
781 tcagctaacc tcggcgaacg cccggcaaac actttcttta gcgaccagca cccggacctg
841 aaagccgact acattctggc gaacccgccg ttcaacctga aagactggcg caatgaagcc
901 gaattaaccg aagatccacg ctttgccggt tatcgtatgc cgccaaccgg taacgccaac
961 tacggctgga ttttgcatat gctctccaag ctgtcggcta acggcacagc aggttttgtg
1021 ctggcaaacg gttcgatgag ttctaacacc agcggtgaag gcgagatccg tgcacagatg
1081 atcgaaaatg atctgattga ctgcatgatc gccctacctg gacagttgtt ctacaccacg
1141 cagatcccgg tgtgtttatg gtttatgacc aaatcgaagg ctgccgaccc ggccaaaggt
1201 tatcgtgatc gtcagggcga gacgctgttt attgatgcgc gtaacctcgg caccatgatt
1261 agccgcacaa ctaaagagtt aacggcggaa gatattgcca caatcgccga tacctaccat
1321 gcctggcgca gcacgccgga agaactggct gcacggattg cgcgtggtga cagcaagctg
1381 gaaaaatatg aagaccaggc aggcttctgc aaagttgcga ccctgcaaga tattaaagat
1441 aacgactacg ttctgacacc gggccgctat gtgggtgcag ccgagcagga agaagacggc
1501 gtggcatttg agacgaaaat gcgtgaattg tcgaagacgt tgtttgagca gatgaagcag
1561 gcggaagaac tggatcgtgc gattcgccag aatctggagg cgctgggtta tggggagtaa
1621 gtggtgtata tatcgcttag gtgatatagc tgaattttca tacggaaaaa tgcctaaaaa
1681 ggagtttgtt ggtacaggtg actatgtcat tttttcagga tataaataca cagaaagcta
1741 ccctgaaaaa aatacttcgg cCggtgagtt aattgttgtt gcccgaggtg ttggtggaac
1801 tggcgatgtt aaaataacga ctagagattg ttatttaaca aatttgtcca ttaaaataaa
1861 tttggatgaa acaaaagtaa gaaaagaata tttttattat ctgtttctac agagtaattt
1921 acgatatctt gatagcggtt ctgctcaaag ccaaataacc atcaatgatc tagcgaatgt
1981 agaaatatct gctccttcgc taaatgttca agatttaata gtcaagagtc tcaaagcttt
2041 tgatgacaaa atcacaacac tttcatccat gaaccaaacc ttggaacaaa tgtcccaaac
2101 cctgttcaaa tcctggtttg tggattttga tccagtgatt gataacgctc tggatgcagg
2161 aaatccaatc ccggaagccc tgcaaactcg cgccaaattg cgtcaaaaag tacgtaatag
2221 tgcagatttt aaaccgcttc cggcggaaat tcgctcgctt ttcccaagtg aatttgaaga
2281 aacggagttg ggttgggtgc caaaggggtg gaaagaaggg acgcttccag agatagcttt
2341 tataaactcc acatcgtgga ctaataaaaa tcaaccagat tatatcaatt atgtagatct
2401 ctctaatgcg aaagatggca gaatatactc aattgaaaaa ttatcattta atgatgctcc
2461 aagtcgagct cgaagaatat taaaaaaaga tgatctgatt tttggccttg tcagacctgc
2521 taacagatca tttgcatatg tacatgttga tggtctaacg ggtagcacag gctttgccgt
2581 tattagagcc caaaagacga tatataaaaa tttcatttat tactttgtga cctatgataa
2641 aaatatagaa gaactagcga gaattgctga tggtggagca tatcctgcta taaaacctga
2701 tgatatttgt acattacctc taattattcc atcaataaat ataattgaga aatttgatga
2761 attaacaagc aatttcagag agatgatgaa taactcatta attcaaaacg aatatctcac
2821 caacctccga ggcaccttgc tcccgaaact catctccggc gagctatccc tggaagatct
2881 tccggatctc accaccgata cagaagccgc ataa
//
LOCUS M.EcoAI 3251 bp ds-DNA linear 09-NOV-2021 (SEQ ID NO: 11)
DEFINITION .
FEATURES Location/Qualifiers
misc_feature 1..1482
/label="M"
CDS 1..1482
/label="Translation 1-1482"
misc_feature 1482..3251
/label="S"
CDS 1482..3251
/label="Translation 1482-3251"
ORIGIN
1 atggaataca acatgtctat cagctcagta atcaaatcat tacaagatat tatgcgcaaa
61 gatgccggtg tggacggaga tgcgcagcgt ctcggtcagc tctcctggct gctgtttttg
121 aaaatcttcg atgcccagga agaggcgctg gaactggagc aggataacta tcaatatccg
181 atcccacagc gttatttatg gcgcagttgg gccgcaaacg cgcagggcat taccggtgat
241 tccctgctgg aattcgttaa tgatgatctg ttcccggcgt tgaaaaacct cactgcgcct
301 atcgataaaa acccacgcgg ctacgtggtg aagcaggcgt tcagcgatgc ctataactat
361 atgaaaaacg gtacgctact gcgtcaggtg atcaacaagc tgaacgaaat tgactttacc
421 agcgccagcg aacgccatct gtttggtgat atttacgaac agatccttaa agatctgcaa
481 tctgcgggca atgctggcga attctatact ccacgcgccg tcactcgctt tatggtggat
541 cgcgttgatc cgaaactcgg cgaatccatt atggacccgg cctgcggtac gggcggtttt
601 cttgcctgcg catttgatca tgtaaagaac aaatacgtga agagcgtcgc cgatcatcag
661 acgctgcaac aacagatcca cggtgttgag aaaaaacagc ttccgcacct gctggcgacc
721 accaatatgc tgctgcacgg cattgaagta ccagtacaaa ttcgtcacga caacaccctg
781 aacaaaccgc tttcctcctg ggatgagcaa ctggatgtca ttgttaccaa cccgccgttt
841 ggtggcacgg aagaagacgg tattgagaag aactttccgg cagagatgca aacccgcgaa
901 acggcggatc tgttcctgca actgattgtg gaagtactgg cgaaaaacgg tcgtgcggcg
961 gtggtattgc cggatggcac actatttggc gaaggcgtta aaaccaaaat caaaaagcta
1021 cttaccgaag agtgcaacct gcataccatc gtgcgtttac cgaatggtgt gtttaacccc
1081 tataccggca ttaaaaccaa cctgttgttc tttaccaaag gtcagccaac caaagagatt
1141 tggttctatg agcatccgta tccggcgggc gtgaaaaact acagcaaaac caagccgatg
1201 aagtttgaag agtttcaggc ggagatcgac tggtggggta acgaggccga tggttttgcc
1261 agccgcgtcg agaatgagca agcgtggaaa gtcagcattg atgacgtgat tgcgcgtaac
1321 ttcaatctgg atattaaaaa cccacatcag gcggaaaccg tcagccatga tccggacgaa
1381 ctgttagcgc agtatgcaaa gcaacaggcg gagatccaga cgctgcgtaa tcaactgcgc
1441 gatattctcg gcgctgcgct gtctgtcaag gaggttaact gatgagtgtg gaaaagctga
1501 tcgttgatca tatggaaacc tggacctcgg cgttgcaaac ccgttccacc gccgggcgcg
1561 gcagttccgg taaaattgat ttgtatggca ttaagaaatt acgtgagctg attctggaac
1621 tggcagtgcg cggtaaactg gtgccgcagg atccgaacga tgaaccggcg tcggagctgc
1681 tgaagcgtat tgcggcggaa aaagcagagc tggtgaaaca ggggaaaatt aaaaagcaaa
1741 aaccactgcc ggaaattagc gaggaagaga agccgtttga attgccggat ggatgggagt
1801 ggacaacgct aactagaatt gcggaaataa atcctaaaat tgatgtcagt gatgatgagc
1861 aagaaatatc atttattcca atgccactca tatcaactaa atttgatggc tcgcatgaat
1921 ttgaaataaa aaaatggaaa gatgttaaaa aaggttatac acactttgct aatggtgata
1981 tcgctattgc aaaaataaca ccttgctttg aaaatagtaa agcagctatt ttttctggct
2041 taaaaaacgg cattggtgtt ggaacaacag aattacatgt tgcacgccct tttagcgata
2101 taattaatcg aaaatatctt cttttaaact ttaaatcacc taattttctt aagtctggtg
2161 aatcacaaat gactggttct gctggtcaga aacgtgttcc aaggtttttt tttgaaaata
2221 atcctattcc cttccctcca ttgcaagaac aagagcgcat tattattagg tttactcaat
2281 taatgtctct ctgcgaccaa ctggaacagc aatccctaac cagtctggac gcacatcagc
2341 aactggttga aaccctgttg ggaacactta cagacagcca aaacgtcgag gaactggctg
2401 aaaactgggc gcgtattagc gagcatttcg acacactatt taccactgaa gccagcgtgg
2461 atgcgttaaa acagaccatt ctgcaactgg ccgtaatggg taaacttgtg ccgcaggatc
2521 cgaatgacga acccgcctct gaactgctca aacgtattgc gcagaaaaaa gcgcaattgg
2581 tgaaagaagg gaaaataaaa aaacaaaaac cgttgccgcc aattagtgat gaggaaaaac
2641 cgtttgaact gccggaaggg tgggagtggt gtcgattggg ttctatttat aattttttaa
2701 atggatatgc ctttaaaagt gagtggttta cctctgtcgg tttacgttta ttgcggaatg
2761 ctaacattgc tcatggagtt accaattgga aagatgttgt acatatacca aatgacatga
2821 tatccgattt tgaaaattat attttgtcag aaaatgatat tgttatttca ttagacagac
2881 caattattaa taccgggtta aaatatgcta tcattagcaa atcagattta ccctgtttac
2941 tactccaacg agtagcaaaa tttaaaaatt atgcaaacac tgtgtctaac tccttcttga
3001 caatatggtt gcaatcttat ttcttcataa attcaattga tcctggaaga agtaatggag
3061 ttccacatat atctacgaaa cagttagaga tgacactatt tcctcttcta ccgcaaagtg
3121 aacaagatcg cattatttca aaaacggatg aattaataca aacctgtaat aaactgaaat
3181 atattatcaa aaccgccaaa caaacccaac tgcaccttgc agacgcactc actgacgcgg
3241 cgataaacta a
//
LOCUS M.EcoAO83I 3176 bp ds-DNA linear 09-NOV-2021 (SEQ ID NO: 12)
DEFINITION .
FEATURES Location/Qualifiers
misc_feature 1..1470
/label="M"
CDS 1..1470
/label="Translation 1-1470"
misc_feature 1470..3176
/label="S"
CDS 1470..3176
/label="Translation 1470-3176"
ORIGIN
1 atgtctatca gttcagtaat caaatcatta caagatatta tgcgcaaaga tgccggtgtg
61 gacggcgatg cgcagcgtct cggtcagctc tcctggctgc tgtttttgaa aatcttcgat
121 gcccaggaag aggcgctgga actggagcag gataactatc aatatccgat cccacagcgt
181 tatttatggc gcagttgggc cgcaaacgct cagggcatta ccggtgattc cctgctggaa
241 ttcgttaatg atgatctgtt cccggcgttg aaaaacctca ctgcgcctat cgataaaaac
301 ccacgcggct acgtggtaaa gcaggcgttc agcgatgcct ataactacat gaaaaacggt
361 acgctactgc gccaggtgat caacaagctg aacgaaattg actttaccag cgccagcgaa
421 cgccatctgt ttggtgatat ttacgaacag atccttaaag atctgcaatc tgcgggcaat
481 gcgggcgaat tctatactcc acgcgccgtc actcgcttta tggtggatcg cattgatccg
541 aaactcggcg aatccattat ggacccggcc tgcggtacgg gcggttttct tgcctgcgcg
601 ttcgatcatg taaagaacaa atacgtgaag agcgtcgccg atcatcagac gctgcaacaa
661 cagatccacg gtgtcgagaa aaaacagctt ccgcacctgc tggcgaccac caatatgctg
721 ctgcacggca ttgaagtgcc tgtacaaatt cgtcacgaca acaccctgaa caaaccgctt
781 tcctcctggg atgagcaact ggatgtcatt gttaccaacc cgccgtttgg tggcacggaa
841 gaagacggta ttgagaagaa ctttccggca gagatgcaaa cccgcgaaac ggcggatctg
901 tttctgcaac tgattgtgga agtactggcg aaaaacggtc gcgcggcggt ggtattgccg
961 gatggcacgc tatttggcga aggcgttaaa accaaaatca aaaagctgct taccgaagag
1021 tgcaatctgc ataccatcgt gcgtttaccg aatggtgtgt ttaaccccta taccggcatt
1081 aaaaccaacc tgttgttttt taccaaaggt cagccaacca aagagatttg gttctatgag
1141 catccgtatc cggcgggcgt gaaaaattac agtaaaacca agccgatgaa gttcgaagag
1201 tttcaggcgg agattgactg gtggggtaac gaggccgatg gttttgccag ccgcatcgag
1261 aatgagcaag cgtggaaagt cagcattgat gacgtgattg cgcgtaactt caatctggat
1321 attaaaaacc cacatcaggc ggaaaccgtc agccatgacc cggacgaact gttagcgcag
1381 tatgcaaaac agcaggcgga gatccagacg ctgcgtaatc aactgcgcga tattcttggc
1441 gctgcgctgt ctggcaagga ggttaactaa tgaatgtgga aaagctgatc gttgatcata
1501 tggaaacctg gacctcggcg ttgcaaaccc gttccaccgc cgggcgcggc agttccggaa
1561 aaattgattt atatggcatt aagaaattac gtgagctgat tctggaactg gctgtgcgcg
1621 gtaaactggt gccgcaggat ccgaatgatg aaccggcgtc ggagctgctg aagcgtattg
1681 cggcggaaaa agccgagctg gtgaaacagg ggaaaattaa aaagcaaaaa ccactgccgg
1741 aaattagcga ggaagagaag ctatttgaat tgccggaggg atgggagtgg gtgcgatttg
1801 gtaatatcta tgaaatggag tacggtaata atttaccaca agaaaaaaga tctaattctg
1861 gtgaatataa tgtttatggc tccaatggag ttgtaggtac acacaatgaa gcatgtatta
1921 aatcaccatg tattattatt ggcagaaaag gttccgcagg agcattaaat ctttcaaatc
1981 agccagcctg ttgggtaaca gacgtagctt atagcactat acccccaatt gctatggttc
2041 ttgaatttgt ctttatacaa tttcatacat tgggcctcga taaattaggg aagggaatta
2101 agccaggctt gaatcgtaac gatgcttata gtttagtaat tgctattcca cctcgaagcg
2161 aacagaaagc catagtgtcg aaagtaaatg aattaatgtc cctatgcgac caactggaac
2221 agcaatcctt gaccagtctg gacgcacatc agcaactggt tgaaaccctg ttgggaacac
2281 ttgcagacag ccagaacgcc gaggaactgg ctgaaaactg ggcgcgtatt agcgagcatt
2341 tcgacacact ttttaccacc gaagccagcg tggatgcgtt aaaacagacc attctgcaac
2401 tggccgtaat gggtaaactt gtgccgcagg atccgaatga cgaacccgcc tctgaactgc
2461 tcaaacgaat tgcgcaggaa aaagctcaac tggtgaaaga agggaaaata aaaaaacaaa
2521 aaccgttgct gccaattagc gatgaggaaa aaccgtttga actgcctaat ggatgggaat
2581 ggtgcaggct cggagagctt attgattcca ttgatgctgg gtggagtcct gcatgttctt
2641 ctgaaccagc cgctccagga gaatgggggg tgttaaaaac gaccgcagtt caatctcttg
2701 aatatagaga gtacgaaaac aaggcgctcc ctaaaaataa agccccaagg ccacaactag
2761 aagtaaaagc aggagatatt cttataacaa gagctggtcc taaaaatcgg gttggtattt
2821 catgccttgt tgaaaacaca agagaaaatt taatgatttc agataaaata atcagatttc
2881 atttgatatc agaggatatc tccgagaaat acatttcctt atgtctaaac tatgggttta
2941 cttcaacata tcttgaaaac tccaaatctg gcatggcaga aagtcagatg aatatttcac
3001 aagatatttt aaaaatggca cctatagcta tcccgactac acatgaacaa ttaaaaataa
3061 cagataaaat aaatgaaatg atggattatt ttataactct aaagagtcaa attcaatctg
3121 cccaacaaac ccaactgcac cttgcagacg cactgactaa cgcggcgata aactaa
//
LOCUS M.EcoMIII 2875 bp ds-DNA linear 09-NOV-2021 (SEQ ID NO: 13)
DEFINITION .
FEATURES Location/Qualifiers
misc_feature 1..1638
/label="M"
CDS 1..1638
/label="Translation 1-1638"
misc_feature 1628..2875
/label="S"
CDS 1628..2875
/label="Translation 1628-2875"
ORIGIN
1 atggtagaac tggaatttag agacaaaacc aaagccctga tcgacagcct gaaaagcatc
61 tgtgcgaact acggcctggg caacgacggt aacgaattca aaattatcac tcaggcattc
121 ctgtacaaat tcctgaacga caaattcgct tttgaggcca aacagaaaga taaaagtatc
181 gccagcgccg aaagctggga agatgcgctc agcgcaatga gcgaagatca actgaaaaag
241 ctgcaacagc ggatggcccc ggataccgcc cgcctgaagc cgcaccattt tattcgttac
301 ttgtataacc gacaaaacgc agcggacttt gccagaactt ttgacgacac cctgatggac
361 atcgccgcca ccaacaacga cgtcttcgcg gtcaaaaccg acggcggcgc gaaagtggtg
421 ctgtttgagc gcctcagcca gtacatcgcc gacgaatcaa agcgcgatga tttctgccgc
481 gccatcatca acaagctggc cgatttcagc ttcgaacgca tcttcacgca gaaattcgac
541 ttctacgcca ccatctttga atacctgatc aaagactaca acagcaactc cggcggcaaa
601 tacgcggaat actacacgcc ccacgccgtg gcgcgcatca tggcggaaat cctggtgccg
661 aaagcgcagc agggcgtggt gcgcaacgta agctgttacg acccgtccgc cggttccggc
721 acgctgctga tgaacgtggc gcacgccatt ggggaagatc gttgcagcat ctttgcccag
781 gatatctcgc agaaatcctc cagcctgctg cgtctgaacc tgatcctcaa caacctggtg
841 cattcgatcc ctaacgttat ccagggcaac actattctgc atccgttcca caaggacggc
901 ggcgcgctga aacgctttga ctacatcgtc tccaacccgc cgtttaagat ggatttcagc
961 gactttcgtg acgcgctgga cagcaaggaa aaccagcaac gtttctttgc cgggataccg
1021 aaaatcaaag ccaaagccag ggacaaaatg gagatttacc agttgttcct gcaacacatc
1081 attttctcgc tgaaaccggg tggcaaggcg gcggtcgtcg tgccgaccgg gtttatcacc
1141 gcgcaatcgg gcattgataa aggcattcgc gaacatctgg tgcaaaacaa gatgctggcg
1201 ggcgtggttt ccatgccgtc gaatatcttc gccaccaccg gtaccaacgt gtcgatcctg
1261 tttattgacg ccagcaacaa agagaaagtg gtgctgatcg acgcctcgaa tttaggtgaa
1321 aaggtcaaag acggcaaaaa ccagaaaacg gtgctgacgg agtgcgaaga aaaacggatc
1381 tgcgaagcgt ttaacaacaa gtggagcgaa gaggatttct cggtggtggt cagctatgac
1441 gacatcgccg cgaaaaatta ctcgttcagc gccggacagt attttgatgt gaaaatcgaa
1501 tacaccgaca tgacgccgga acagtttgcc gcgaagatga aaggatttac ggagaatctg
1561 aataatctct ttgaacagtc gcgcgagtta gaagtgcaaa taaaaatgca gatggcagat
1621 atcaaatatg aaatttaatt atctgaaaat taaagatgta tgtgattttg tcggaggaag
1681 tcaacctcca aaatctcaat ttatttatgt atctaaacct ggatatgtca ggttgatcca
1741 gacgcgtgat tacaaaacgg atgcatttcc cacgtatata ccaatatcgt cgacgaagaa
1801 attttgtgat gaattcgata ttatgattgg taggtatggt cccccaattt ttcaaatatg
1861 tcgcggattg aaaggagcat ataacgttgc cttgctgaag gttataccta aagaaggtgt
1921 aagtcgtgat tttttatact attttttgaa gcaagactct gttttccaat atgttgataa
1981 attatctgcc agaaccggag gacaaactgg agttgatcta gtttctttaa aagaatatcc
2041 agtcaggata cctgaagaaa ttgaatgtca agaaaaattg gtgactattc ttagtgttat
2101 tgataaaaaa atcgccctca acaaccgcat caacacggaa ctggaagcga tggcgaaaac
2161 actgtatgac tactggtttg tacagtttga tttccctgat gccaacggaa aaccgtataa
2221 aacctccggc gggaagatgg agtataacgc cacgctgaaa cgggaaattc cggcaggttg
2281 gaatgactcc attcttggta agtttattga gttagatcgt ggcgttactt atagcaaaga
2341 ggatgttcga actcaggatg ataaagatac gataggcatt cttcgcgcta caaatgtgac
2401 gggaaataat gttgatattg atgatttagt cttcattcct tctagtagag taaacgttaa
2461 tcaaatgcta aataaatttg acatattgat cgtgatgtca agtggtagta aggagcatgt
2521 agggaagaat ggcgtgtatt atttcgaaaa aaaacatgca tttggcgcat tttgttcaaa
2581 aattacaccc gtcagaaaat acagatattt tataaataca ttcctgcaat cgaaatggtt
2641 taagtcttat ataaacaatc agtgcttggg aactaatatt aataacctga ccaatacgca
2701 tatcactaat tgtgaaatca tatgccccac tcctgatgtt gtggcgttat tcgagaataa
2761 aatgatgcca atttataata aactggcatc aaacactcaa gagaatagtc atttaatcca
2821 actccgcgac tggctcctcc ctctacttat gaacggacag gtcacggtca aataa
//
LOCUS M.Eco1167 3794 bp ds-DNA linear 09-NOV-2021 (SEQ ID NO: 14)
DEFINITION .
FEATURES Location/Qualifiers
misc_feature 1..2439
/label="M"
CDS 1..2439
/label="Translation 1-2439"
misc_feature 2451..3794
/label="S"
CDS 2451..3794
/label="Translation 2451-3794"
ORIGIN
1 atggctatca aaaaaaccga actctattct tccctgtggg caagctgtga cgaactgcgt
61 ggcgggatgg atgccagcca gtacaaagac tatgtactga ccctgctgtt tatgaagtac
121 gtttccgata agtataaagg cgatccttac gggatgatcg tgatacccaa aggagccagc
181 tttgacgata tggttgcgct gaaaaatgac aaagagatcg gcgacaaaat caacaaaatc
241 atccacaagc tggcggaaga gaacggcctg aagggcgtca tcgacgaagc cgactttaac
301 gacgaagata agctcggcaa aggcaaggaa atgattgacc gcctgagcaa gcttgtcggt
361 atctttgaag ggttaaatct ctccagcaac cgggccgaag gcgacgatct gctgggcgat
421 gcctatgaat atctgatgcg tcacttcgca accgaatccg gtaagagtaa aggacagttt
481 tacactccag cggaggtgtc acgtattctg gcgaaggtga ttggtattac tcccgatact
541 ccgcaagatg caacggttta tgacccaacc tgtggctctg gttcgctgct gttgaaagtg
601 aatgatgaag cccggcgcgg actgtcgatt tttggccagg agatggataa cgctaccagt
661 gcgctggcgc ggatgaacat gattctgcat aacaatgcca ccgcgaaaat ctggcagggc
721 aatacgctga gcgatccgca gtggaaagag gcgaacggca aactgaaagc cttcgatttt
781 gccgtggcga acccgccttt ttccaataaa aactggacca acgggctgac gccgaaaaaa
841 gatccgtttg aacgcttcgg ctggggtatt ccgccggaaa aaaacggcga ttatgctttt
901 ttgttgcata tcattaaaag cctgaaaagt accggcaaag gcgcggtgat cctgccccac
961 ggcgtactgt ttcgcggtaa cgccgaagcg aatatccgtg aaaacctaat caagcagggc
1021 tatatcaaag gcgttattgg tttgccagcc aacctgtttt acggcaccgg catcccggcg
1081 tgcatcattg tgattgataa agagcacgcc cacagccgca aaggcatttt tatgatcgac
1141 gccagccggg gctttatcaa agatggcaac aagaaccgcc tgcgtagccg agatattcac
1201 cgcattgtgg acgtgttcaa ccatcagcga acggtacctg gctacagccg gatggtgccc
1261 tccagcgaga tcgccggaaa tgattacaac ctgaatattc ctcgctatat cgagagcggc
1321 gagccggaag atttacacga tctgaccgcg cacttacagg gcggtattcc ggcacgcgat
1381 gtggatgctt tgcaagatta ctggcgggta ttccctgccc tgcgcaacgt gctgtttgct
1441 gacgaccgtc ccggttactg tcgggcacag gttaacgcgc aacaggtgaa accgatcatt
1501 ctggcgcatc aggagtttaa ggattttgcc acccgcagcc tgctaccgtt taaagcgtgg
1561 gtgaaagagg caagtctgga agagattcgc aaaggtgata aacccaaagc gctaatccac
1621 gatatcagcg aaatgctatt ggcgcagtac gccaacagtg agttgctgaa caaatacagc
1681 gtgtaccaga tcctgatgga ttactggact gatgtcatgc aagacgatgt gtatgcgatt
1741 atgcaggatg gctggcaagc cgccgcgcaa atccgcgagc ttcagccggt gaaaggcaaa
1801 gatggcaaaa acatctggaa agaaacgcac gatttcgagt ttaccaaacg gcgctacaag
1861 gccgatgtgc tgccccgttc gctagtggaa attcgctgtt tcccggaact gctggatgcg
1921 ctgaaccgcg cgcaggagcg cagtgaagaa gccagtcgtc agctagtgga attcatcgag
1981 gagcaggcag gggaagagga tctgctggct gaggcgaaaa acgataaaga taaggtgacg
2041 caaaagctgg tgaatgcccg tctggcacag ttgaagaaaa cccctgccga cccggatgag
2101 ctggcagtgc tgaaccgctg tctggcgctg attaaggccg aggccagtgc gaaaaaagcg
2161 ctgaaagccg cacaggaagc gttggatcga gcggtattta aacattatcc cacgctggat
2221 gaagcagcga ttaaaacgct ggtagtgcag gataagtggc tggcaacgtt gcaggcaggg
2281 atcaaagcgg agatagagcg tattacccag caactggcgt cgcgcgtaaa ggagctggaa
2341 gagcgttatg ctgaaccgtt gccagcactt gaagccgccg ttgaggcgtt gagcgagaaa
2401 gtggccgggc atttgcgggc gatggggctg gagtggtgat ggtggattta atggtgaatg
2461 agcaacggtc gggtacggtg gggaaaggtg tgcctgcggg gtataagctg actgagatgg
2521 agatgattcc tgaggattgg gttgtatcca cgatattaaa cctgacaacc aacataattg
2581 attatcgcgg cagaactccc aaaaaacttg gaatggattg gggggatggg gatatcgttg
2641 ccctttctgc tgctaatgtt aaaaaaggat atatagattt atctactgaa tgctactttg
2701 gttccgaaga actatataag cgctggatga catccggtca tccccaaaaa ggggacatag
2761 ctttcacaat ggaagcccct ctggggaatg cagcatctat tcctgataac agaaaatata
2821 ttcttagcca gagaacaatt cttttacaaa tagatagaga gaatttttct ccatcactaa
2881 tactccaaat cttattatca gagcgttttc aatcatatat ttctgaaagc gcgactggtt
2941 caacggccca agggattaaa cgttcagttt tagagaagtt atacatatct ataccgaaaa
3001 gtatcgtaga gcaaaaggct attgctaatg tattaaccaa tgttgatagc ttgattctat
3061 ccctagaaaa attactctca aaaaaacagt ccatcaaaac tgccacaatg cagcaactac
3121 tgactggtaa aacccgtttg ccacagtttg cgttgcgcaa agatggctct gctaagggat
3181 ataaaaagag cgagttgggg gagattcctg aagattggaa ttgtattaat cttggtgagc
3241 taggtaattg cattattggg ttaacttaca aacctgaaga tacatctgat tatggtacat
3301 tggtattacg ctcatccaac attcaaaata atcacttagc ttatgatgat aacgtcttcg
3361 tcagcataga accacctgag cgcacaattg tgaaagaagg tgatatcttg gtatgtgtaa
3421 gaaatggcag tcgccaactt attggcaaat gcgcattaat tgacaaaaat gcgcagggct
3481 cagcattcgg tgcatttatg tcagtattcc gaactgatat atatggattt acatttcacc
3541 aattccagtc tgatattatt caaaagcaaa tcgctgaagt tatgggtgcc actatcaatc
3601 agataactaa caaagatatg ttgggcttta aaatcccatt acctgaaaat acagaagaac
3661 aagccgccat cgccgccatc ctctccgata tggacaagga aatccaaatc ctgcaacagc
3721 gtctggacaa aacccgccag cttaagcaag ggatgatgca ggaactgtta accgggaaaa
3781 tccgcttaat atag 
Annexe V : Fichier de séquence d'ADN GenBank de p1065
LOCUS p1065 9705 bp ds-DNA circular 01-NOV-2021 (SEQ ID NO: 15)
DEFINITION .
KEYWORDS "Plasmid_p1065:P2 test construct for methylation
protection" "Résistance:Spc"
FEATURES Location/Qualifiers
misc_feature 1..92
/label="Promoter"
CDS 93..881
/label="aadA"
terminator 1066..1153
/label="rrnBT2 term"
misc_feature 1164..1197
/label="J23100"
misc_feature 1205..1218
/label="rbsJ6110"
misc_feature 1225..1941
/label="sGFP"
misc_feature 1946..1997
/label="terminator BBa_K864600"
misc_feature 2936..2949
/label="Eco0015"
misc_feature 2936..4322
/label="Test Block"
misc_feature 2971..2984
/label="Eco1167"
misc_feature 3010..3020
/label="EcoMIII"
misc_feature 3053..3063
/label="EcoMII"
misc_feature 3103..3115
/label="EcoKI"
misc_feature 3149..3162
/label="EcoAI"
misc_feature 3179..3193
/label="EcoAO83I"
misc_feature 4038..4052
/label="EcoAO83I"
misc_feature 4083..4096
/label="EcoAI"
misc_feature 4141..4153
/label="EcoKI"
misc_feature 4186..4196
/label="EcoMII"
misc_feature 4226..4236
/label="EcoMIII"
misc_feature 4265..4278
/label="Eco1167"
misc_feature 4309..4322
/label="Eco0015"
terminator 5716..5787
/label="rrnB T1 terminator"
CDS complement(5814..6692)
/label="araC"
promoter 6719..7003
/label="araBAD promoter"
misc_feature 7004..8559
/label="P4"
cds 7039..7535
/label="delta (P2 activation)"
cds 7609..8181
/label="psu"
misc_feature 8246..8472
/label="Essential P4 packaging signal"
misc_feature 8920..9658
/label="CloDF13 ori"
ORIGIN
1 tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat
61 aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgaggga agcggtgatc gccgaagtat
121 cgactcaact atcagaggta gttggcgtca tcgagcgcca tctcgaaccg acgttgctgg
181 ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg gcggcctgaa gccacacagt gatattgatt
241 tgctggttac ggtgaccgta aggcttgatg aaacaacgcg gcgagctttg atcaacgacc
301 ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga gcgagattct ccgcgctgta gaagtcacca
361 ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc gttatccagc taagcgcgaa ctgcaatttg
421 gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag gtatcttcga gccagccacg atcgacattg
481 atctggctat cttgctgaca aaagcaagag aacatagcgt tgccttggta ggtccagcgg
541 cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac aggatctatt tgaggcgcta aatgaaacct
601 taacgctatg gaactcgccg cccgactggg ctggcgatga gcgaaatgta gtgcttacgt
661 tgtcccgcat ttggtacagc gcagtaaccg gcaaaatcgc gccgaaggat gtcgctgccg
721 actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt atcagcccgt catacttgaa gctagacagg
781 cttatcttgg acaagaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg
841 tccactacgt gaaaggcgag atcaccaagg tagtcggcaa ataatgtcta acaattcgtt
901 caagccgagg ggccgcaaga tccggccacg atgacccggt cgtcggttca gggcagggta
961 ccaggcacgc ctaaccgtca gtgagattgg atgagtgaac gatattgatc gagaagagcc
1021 ctgcgcagcc gctgccgtgc ctgcaggaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc
1081 ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga tggccttttt
1141 gcgtttctac aaactctgct agcttgacgg ctagctcagt cctaggtaca gtgctagctc
1201 tagagaaaga ggcgaattac tagtatgcgt aaaggcgaag aactgttcac gggcgtagtt
1261 ccgattctgg tcgagctgga cggcgatgtg aacggtcata agtttagcgt tcgcggtgaa
1321 ggtgagggcg acgcgaccaa cggcaaactg accctgaagt tcatctgcac caccggtaaa
1381 ctgccggtgc cttggccgac cttggtgacg acgttgacgt atggcgtgca gtgttttgcg
1441 cgttatccgg accacatgaa acaacacgat ttcttcaaat ctgcgatgcc ggagggttac
1501 gtccaggagc gtaccatttc cttcaaggat gatggctact acaaaactcg cgcagaggtt
1561 aagtttgaag gtgacacgct ggtcaatcgt atcgaattga agggtatcga ctttaaagag
1621 gatggtaaca ttctgggcca taaactggag tataacttca acagccataa tgtttacatt
1681 acggcagaca agcaaaagaa cggcatcaag gccaatttca agattcgcca caatgttgag
1741 gacggtagcg tccaactggc cgaccattac cagcagaaca ccccaattgg tgacggtccg
1801 gttttgctgc cggataatca ctatctgagc acccaaagcg tgctgagcaa agatccgaac
1861 gaaaaacgtg atcacatggt cctgctggaa tttgtgaccg ctgcgggcat cacccacggt
1921 atggacgagc tgtataagta atgagttgtt cagaacgctc ggtcttgcac accgggcgtt
1981 ttttctttgt gagtccaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa
2041 tttattggcg caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc
2101 agatgctatt ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct
2161 atcagcttca atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc
2221 tttagttcga caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa
2281 cggatatgca ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa
2341 accaatttta gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga
2401 tttgctgcgc aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg
2461 tgagctgcat gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg
2521 tgagaagatt gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg
2581 tggcaatagt cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa
2641 ttttgaagaa gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa
2701 ctttgataaa aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta
2761 ttttacggtt tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc
2821 agcatttctt tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg
2881 aaaagtaacc gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttccatc
2941 gattgcttct taccgcgtgc gagatagcca ttcatgaatc gttcagcctg cagtcaggtc
3001 tattagttta aaggtcagtt gtaacgttga tgcccctaag aacctctcgg tggtaccatt
3061 gtgcgacgca agcgattaca ctcctgtcac atcataatcg ttaacacgtc agtgcgtttg
3121 ctattcaggg cttgaccaac actggattga gataactagt catggtaaac actccacagg
3181 aattcttaca tgcttgatgc tacggcgatt cttggagagc cagcagcgac tgcaaatgtg
3241 agatcagagt aatattagca agcgataagt ccctaactgg ttgtggcctt ttgtagagtg
3301 aacttcataa catatgctgt ctcaggcacg tggatggttt ggacaaatca gattcaagtc
3361 tgatcaacct tcatacagat ctagagtcta aagcagtgat ctcaaaatac taggtaacta
3421 gagggactgc gacgttctaa acgttggtcc gtcagaagcg ccatccagga tcacgttacc
3481 ccgaaaaaaa gatatcagga gctctcctcc tcagaaacta caggactaac cttcctggca
3541 accgggaggt gggaatccgt cacatatgag aaggtatttg cccgataatc aatactgcct
3601 taagccggct tgccctttct gcctgtagat ccattggact ggtgccaacg cgcaggcata
3661 gttcgaggag aattatccgg gggcaatgac aaccagcatc tcgggtcttg cccaacccgt
3721 ctacacgctc cttaactctg gcaggcaatt aaagggaacg tatatataac gcaaagaagc
3781 tggaaaattg gcgagagaat cttctctctg tctatcgaag aatggccacg cggtggcaac
3841 cgtcatgcta gcgtgcgggg tacacttgct aaccatttgg gacacgggac actcgctgtt
3901 ttcgaaatta ccctttatgc gcgggtattg aaccacgctt atgcccagca tcgttacaag
3961 cagactcata ctagatgtat tatgcccgcc atgcagacga aaccagtcgg agattaccga
4021 gcattctatc acgtcgggga attcttacat gccgaccata agtgagctac tggagccgag
4081 gggagataac tagtcagctt ttcacttaaa gtattatgca cgacagggtg cgtgtacgtt
4141 aacacgtcag tgccatgtaa acctgttata acttacctca gttaggtacc attgtgttgg
4201 aagtgtggct agatcttagc tttttaaagg tcagttttcc ggtgccacgc gatggaacga
4261 gccattcatg aatcgttcta ttgttatagc gaatcagcgg gaacgcaacc atcgattgct
4321 tctttatgat gttcgtaaaa tgattgctaa gtctgagcaa gaaataggca aagcaaccgc
4381 aaaatatttc ttttactcta atatcatgaa cttcttcaaa acagaaatta cacttgcaaa
4441 tggagagatt cgcaaacgcc ctctaatcga aactaatggg gaaactggag aaattgtctg
4501 ggataaaggg cgagattttg ccacagtgcg caaagtattg tccatgcccc aagtcaatat
4561 tgtcaagaaa acagaagtac agacaggcgg attctccaag gagtcaattt taccaaaaag
4621 aaattcggac aagcttattg ctcgtaaaaa agactgggat ccaaaaaaat atggtggttt
4681 tgatagtcca acggtagctt attcagtcct agtggttgct aaggtggaaa aagggaaatc
4741 gaagaagtta aaatccgtta aagagttact agggatcaca attatggaaa gaagttcctt
4801 tgaaaaaaat ccgattgact ttttagaagc taaaggatat aaggaagtta aaaaagactt
4861 aatcattaaa ctacctaaat atagtctttt tgagttagaa aacggtcgta aacggatgct
4921 ggctagtgcc ggagaattac aaaaaggaaa tgagctggct ctgccaagca aatatgtgaa
4981 ttttttatat ttagctagtc attatgaaaa gttgaagggt agtccagaag ataacgaaca
5041 aaaacaattg tttgtggagc agcataagca ttatttagat gagattattg agcaaatcag
5101 tgaattttct aagcgtgtta ttttagcaga tgccaattta gataaagttc ttagtgcata
5161 taacaaacat agagacaaac caatacgtga acaagcagaa aatattattc atttatttac
5221 gttgacgaat cttggagctc ccgctgcttt taaatatttt gatacaacaa ttgatcgtaa
5281 acgatatacg tctacaaaag aagttttaga tgccactctt atccatcaat ccatcactgg
5341 tctttatgaa acacgcattg atttgagtca gctaggaggt gactgaccgg ctgataaatt
5401 tctttgaatt tctccttgat tatttgttat aaaagttata aaataatctt gttggaacca
5461 ttcaaaacag catagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca
5521 ccgagtcggt gctttttttg atacttctat tctactctga ctgcaaacca aaaaaacaag
5581 cgctttcaaa acgcttgttt tatcattttt agggaaatta atctcttaat ccttttatgc
5641 gatcgcgggc catcgccctg atagactata aacgcagaaa ggcccacccg aaggtgagcc
5701 agtgtgactc tagtagagag cgttcaccga caaacaacag ataaaacgaa aggcccagtc
5761 tttcgactga gcctttcgtt ttatttgatg cctggagatc cttactcgag ttattatgac
5821 aacttgacgg ctacatcatt cactttttct tcacaaccgg cacggaactc gctcgggctg
5881 gccccggtgc attttttaaa tacccgcgag aaatagagtt gatcgtcaaa accaacattg
5941 cgaccgacgg tggcgatagg catccgggtg gtgctcaaaa gcagcttcgc ctggctgata
6001 cgttggtcct cgcgccagct taagacgcta atccctaact gctggcggaa aagatgtgac
6061 agacgcgacg gcgacaagca aacatgctgt gcgacgctgg cgatatcaaa attgctgtct
6121 gccaggtgat cgctgatgta ctgacaagcc tcgcgtaccc gattatccat cggtggatgg
6181 agcgactcgt taatcgcttc catgcgccgc agtaacaatt gctcaagcag atttatcgcc
6241 agcagctccg aatagcgccc ttccccttgc ccggcgttaa tgatttgccc aaacaggtcg
6301 ctgaaatgcg gctggtgcgc ttcatccggg cgaaagaacc ccgtattggc aaatattgac
6361 ggccagttaa gccattcatg ccagtaggcg cgcggacgaa agtaaaccca ctggtgatac
6421 cattcgcgag cctccggatg acgaccgtag tgatgaatct ctcctggcgg gaacagcaaa
6481 atatcacccg gtcggcaaac aaattctcgt ccctgatttt tcaccacccc ctgaccgcga
6541 atggtgagat tgagaatata acctttcatt cccagcggtc ggtcgataaa aaaatcgaga
6601 taaccgttgg cctcaatcgg cgttaaaccc gccaccagat gggcattaaa cgagtatccc
6661 ggcagcaggg gatcattttg cgcttcagcc atacttttca tactcccgcc attcagagaa
6721 gaaaccaatt gtccatattg catcagacat tgccgtcact gcgtctttta ctggctcttc
6781 tcgctaacca aaccggtaac cccgcttatt aaaagcattc tgtaacaaag cgggaccaaa
6841 gccatgacaa aaacgcgtaa caaaagtgtc tataatcacg gcagaaaagt ccacattgat
6901 tatttgcacg gcgtcacact ttgctatgcc atagcatttt tatccataag attagcggat
6961 cctacctgac gctttttatc gcaactctct actgtttctc cataattttc ttaacctgaa
7021 gtgacgagga gccggaaatt tactgtccgt cgtgtggaca tgttgctcac acccgtcgcg
7081 cacatttcat ggacgatggc accaagataa tgattgcaca gtgccggaat atttattgct
7141 ctgcgacatt tgaagcgagt gaaagctttt tctctgacag taaagattca ggaatggaat
7201 acatttcagg caaacagaga taccgcgatt cactgacgtc agcctcctgc ggtatgaaac
7261 gcccgaaaag aatgcttgtt accggatatt gttgtcggag atgtaaaggc cttgcactgt
7321 caagaacatc gcggcgtctg tctcaggaag tcaccgagcg tttttatgtg tgcacggatc
7381 cgggctgtgg tctggtgttt aaaacgcttc agaccatcaa ccgcttcatt gtccgcccgg
7441 tcacgccgga cgaactggca gaacgcctgc atgaaaaaca ggaactgccg ccagtacggt
7501 taaaaacaca atcatattcg ctgcgtctgg aatgagggct gccggttaac accggccgtc
7561 gccgcacacc gtatttttat tcttcagcat gatgagaaag agataacgat ggaaagcaca
7621 gccttacagc aggcctttga cacctgtcag aataacaaag cagcatggct gcaacgcaaa
7681 aatgagctgg cagcggccga acaggaatat ctgcggcttc tgtcaggaga aggcagaaac
7741 gtcagtcgcc tggacgaatt acgcaatatt atcgaagtca gaaaatggca ggtgaatcag
7801 gccgccggtc gttatattcg ttcgcatgaa gccgttcagc acatcagcat ccgcgaccgg
7861 ctgaatgatt ttatgcagca gcacggcaca gcactggcgg ccgcactggc accggagctg
7921 atgggctaca gtgagctgac ggccattgcc cgaaactgtg ccatacagcg tgccacagat
7981 gccctgcgtg aagcccttct gtcctggctt gcgaagggtg aaaaaattaa ttattccgca
8041 caggatagcg acattttaac gaccatcgga ttcaggcctg acgtggcttc ggtggatgac
8101 agccgtgaaa aattcacccc tgcgcagaac atgatttttt cgcgtaaaag tgcgcaactg
8161 gcatcacgtc agtcagtgta aaattccccg aaaatccgcc cgtttttact gaaaaaagcc
8221 atgcatcgat aaggtgcatg gctttgcatg cgttttcctg cctcattttc tgcaaaccgc
8281 gccattcccg gcgcggtctg agcgtgtcag tgcaactgca ttaaaaccgc cccgcaaagc
8341 gggcgggcga ggcggggaaa gcaccgcgcg caaaccgaca agttagttaa ttatttgtgt
8401 agtcaaagtg ccttcagtac atacctcgtt aatacattgg agcataatga agaaaatcta
8461 tggcctatgg tccaaaactg tcttttttga tggcactatc ctgaaaaata tgcaaaaaat
8521 agattgatgt aaggtggttc ttgtcagtgt cgcaagatcg ggccccattc tacattttta
8581 cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcagcgc
8641 gggtgtggtt gtgcttgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt
8701 atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttg gcgctgccat cttggcggcc
8761 taaggcgatg ccccctcgac ctcgatcagg gaggcgttca ggacgactca caaagaaagc
8821 cgggcaatgc ccggcttttt ccacgcctcc tgggctgact tcaggtgcta catttgaaga
8881 gataaattgc actgaaatct agagcggttc agtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga
8941 tccttttttt ctgcgcgtaa tcttttgccc tgtaaacgaa aaaaccacct ggggaggtgg
9001 tttgatcgaa ggttaagtca gttggggaac tgcttaaccg tggtaactgg atttcgcaga
9061 gcacagcaac caaatctgtc cttccagtgt agccggactt tggcgcacac ttcaagagca
9121 accgcgtgtt tagctaaaca aatcctctgc gaactcccag ttaccaatgg ctgctgccag
9181 tggcgtttta ccgtgctttt ccgggttgga ctcaagtgaa cagttaccgg ataaggcgca
9241 gcagtcgggc tgaacgggga gttcttgctt acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac
9301 cgagccgaga taccagtgtg tgagctatga gaaagcgcca cacttcccgt aagggagaaa
9361 ggcggaacag gtatccggta aacggcaggg tcggaacagg agagcgcaag agggagcgac
9421 ccgccggaaa cggtggggat ctttaagtcc tgtcgggttt cgcccgtact gtcagattca
9481 tggttgagcc tcacggctcc cacagatgca ccggaaaagc gtctgtttat gtgaactctg
9541 gcaggagggc ggagcctatg gaaaaacgcc accggcgcgg ccctgctgtt ttgcctcaca
9601 tgttagtccc ctgcttatcc acggaatctg tgggtaactt tgtatgtgtc cgcagcgccc
9661 gccgcagtct cacgcccgga gcgtagcgac cgagtgagct agcta
//

Claims (22)

  1. Cellule bactérienne support comprenant un plasmide conjugatif, le plasmide codant pour une enzyme méthyltransférase.
  2. Cellule bactérienne support selon la revendication 1 dans laquelle la cellule bactérienne support est choisie parmi une cellule deBacteriodes , Escherichia, Clostridium, Caulobacter , Lactobacillus, Pseudomonas, Bifidobacterium , Salmonella, Listeria, ProteusouStreptococcus.
  3. Cellule bactérienne support selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le plasmide comprend une OriT et optionnellement un ou plus ou tous les gènes tra nécessaires à la conjugaison bactérienne.
  4. Procédé d'apport d'ADN depuis une cellule bactérienne support à une bactérie cible ou une cellule archéale par conjugaison, le procédé comprenant la mise en contact de l'espèce bactérienne cible avec la cellule bactérienne support selon l’une quelconque des revendications 1-3, dans lequel la bactérie cible comprend un système de restriction modification qui clive l'ADN qui est non méthylé en un site cible de méthylation de l'enzyme méthyltransférase.
  5. Bactériophage codant pour une enzyme méthyltransférase, optionnellement dans lequel l'enzyme méthyltransférase protège contre un système de restriction modification trouvé dans une bactérie cible qui est pathogène chez les humains ou animaux, et/ou dans une bactérie cible qui est associée à un encrassement biologique ou à une corrosion microbienne.
  6. Mélange d'au moins 2 bactériophages de la revendication 5, chaque bactériophage codant pour une enzyme méthyltransférase différente.
  7. Bactériophage ou mélange selon la revendication 5 ou 6 respectivement, dans lequel le bactériophage est d'un genre sélectionné parmi lesDhakavirus , Gaprivervirus , Gelderlandvirus , Jiaodavirus , Karamvirus , Krischvirus , Moonvirus , Mosigvirus , Schizotequatrovirus , SlopekvirusetTequatrovirus. Chaque phage mentionné ici peut être un phage d’entérobactérie, un phage d’E coli, un phage deMyoviridae, un phage deTevenvirinae, un phage deTequatrovirus, un phage deCaudovirales, des virus adéno-associés (AAV), des virus herpès simplex, des rétrovirus ou des lentivirus ou peut être un phage de Klebsiella (par ex. phage de Klebsiella PMBT1, phage de Klebsiella PKO111, phage de Klebsiella phi KpNIH-6, phage de Klebsiella Miro, phage de Klebsiella vB_KpnM_Kp_V477, phage de Klebsiella KP27, phage de Klebsiella KP15, phage de Klebsiella KP1 ou phage de Klebsiella JD18), un phage d’Acinetobacter (par ex. virus d’Acinetobacter 133), un phage d’Aeromonas (par ex. virus d’Aeromonas 65 ou virus d’Aeromonas Aeh1), un phage d’Escherichia (par ex. virus d’Escherichia RB16, virus d’Escherichia RB32 ou virus d’Escherichia RB43) ou un phage de Pseudomonas (par ex. virus de Pseudomonas 42) ou peut être un phage deTevenvirinae, par ex. un phage choisi dans le Tableau D.
  8. Procédé d'apport d'ADN de bactériophage à une bactérie cible, le procédé comprenant la mise en contact de l'espèce bactérienne cible avec un bactériophage codant pour une enzyme méthyltransférase, dans lequel la bactérie cible comprend un système de restriction modification qui clive l'ADN qui est non méthylé en un site cible de méthylation de l'enzyme méthyltransférase.
  9. Procédé de méthylation d'un ADN de bactériophage ou d'un ADN de plasmide ou de phagémide, le procédé comprenant :
    l’introduction dans une bactérie de production (i) d’un polynucléotide codant pour une pluralité de méthyltransférases, ou (ii) de polynucléotides qui codent ensemble pour une pluralité de méthyltransférases,
    la production, par cela, d’une bactérie de production modifiée exprimant au moins 2 méthyltransférases introduites ;
    l’infection de la bactérie de production modifiée avec une particule de bactériophage comprenant de l'ADN de bactériophage ou de l'ADN de phagémide ou de l'ADN de plasmide, méthylant ainsi ledit ADN de bactériophage ou ADN de phagémide ou de plasmide ; et
    la production d’une particule de bactériophage comprenant de l'ADN de bactériophage ou de l'ADN de phagémide ou de l'ADN de plasmide ayant un motif de méthylation modifié, optionnellement la purification de la particule de bactériophage comprenant de l'ADN de bactériophage ou de l'ADN de phagémide ou de l'ADN de plasmide.
  10. Procédé selon la revendication 9 dans lequel l'ADN de bactériophage ou l'ADN de plasmide ou l'ADN de phagémide produit code pour une méthyltransférase.
  11. Procédé, cellule bactérienne support, bactériophage, mélange, plasmide ou phagémide selon ou divulgué dans l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel/laquelle
    (i) la MTase est une MTase de type I, II ou III ; ou
    (ii) La MTase est sélectionnée parmi Eco0015, EcoK1, EcoAI, M.EcoAO83I, M.EcoMII, M.EcoMIII, M1 M2 Eco31I et M.Eco1167 ; ou
    (iii) La MTase méthyle au sein d’une séquence de reconnaissance choisie parmi
    GAGNNNNNNNGTCA
    GGANNNNNNNNATGC
    AACNNNNNNGTGC
    RTACNNNNGTG
    AAAGNNNNGTT
    GGT CTC
    CCANNNNNNNCTTC
    YTCANNNNNNGTTY ; ou
    (iv) le phage, le phagémide ou le plasmide, par exemple l'ADN du plasmide de conjugaison de la cellule bactérienne support, code pour plusieurs MTases, par exemple comprenant une MTase de type I et une MTase de type II, ou une MTase de type I et de type III, ou une MTase de type II et III MTase, ou toutes les MTases de type I, II et III,
    ou dans lequel la bactérie de production code pour de multiples MTases qui ne sont pas natives de la bactérie de production, telles qu'une MTase de type I et de type II, ou une MTase de type I et de type III, ou une MTase de type II et III, ou la toutes les MTases de type I, II et III.
  12. Procédé, cellule bactérienne support, mélange bactériophage, phagémide ou plasmide selon ou tel que divulgué dans l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel le plasmide de cellule bactérienne support, le bactériophage ou le phagémide comprend un réseau CRISPR de modification de bactéries cibles pour modifier une séquence cible dans la bactérie cible.
  13. Procédé, cellule bactérienne support, mélange, bactériophage, phagémide ou plasmide selon la revendication 12, dans lequel le plasmide, le bactériophage ou le phagémide code en outre pour :
    (i) une endonucléase cas, et/ou
    (ii) une séquence d’ARNtracr ou une séquence d'ADN exprimant une séquence d’ARNtracr.
  14. Composition pharmaceutique comprenant une cellule bactérienne support ou un bactériophage, un mélange, un phagémide ou un plasmide selon ou divulgué dans l'une quelconque des revendications 1 à 13 en combinaison avec un support ou un excipient pharmaceutiquement acceptable.
  15. Procédé, bactériophage de cellule bactérienne support, mélange, phagémide ou plasmide selon ou divulgué dans l'une quelconque des revendications 4 à 8 et 11 à 14 lorsqu'elles dépendent des revendications 4 à 8, dans lequel la bactérie cible est pathogène chez l’humain ou l’animal.
  16. Procédé de prévention ou de traitement d'une maladie provoquée par une bactérie cible pathogène chez l’humain ou l’animal, le procédé comprenant l'apport d'un bactériophage, d'un mélange, d'un phagémide, d'un plasmide ou d'une cellule bactérienne support selon ou divulgué dans l'une quelconque des revendications 1 à 13 ou une composition pharmaceutique selon la revendication 14 à un humain ou un animal en ayant besoin.
  17. Bactériophage, mélange, phagémide, plasmide ou cellule bactérienne support selon ou divulgué dans les revendications 1 à 13 ou composition pharmaceutique selon la revendication 14, destiné(e) à être utilisé(e) dans un procédé de prévention ou de traitement d'une maladie provoquée par une bactérie cible pathogène chez l'humain ou l’animal, le procédé comprenant l'apport du bactériophage, du phagémide ou de la cellule bactérienne support ou de la composition pharmaceutique à l'homme ou à l'animal en ayant besoin.
  18. Procédé selon la revendication 16 ou un bactériophage, phagémide, mélange, plasmide ou cellule bactérienne support pour utilisation selon la revendication 17, dans lequel/laquelle la bactérie pathogène est choisie parmi toutes les bactéries répertoriées dans le Tableau 1 de WO 2017/211753A1, laquelle liste est spécifiquement incorporée ici par référence, ou peut être Salmonella, Clostridium, Bifidobacterium, Lactobacillus, Escherichia, Pseudomonas, Caulobacter, Listeria, Proteus et Streptococcus.
  19. Procédé de destruction d'une bactérie cible ou de modification ciblée du génome d'une bactérie cible, le procédé comprenant l'apport d'un bactériophage, phagémide, plasmide ou d'une cellule bactérienne support selon ou divulgué dans les revendications 1 à 13, ou une composition pharmaceutique selon la revendication 14, à la bactérie cible, la bactérie cible étant comprise dans une population naturelle et associée à une corrosion microbienne ou à un encrassement biologique d'un substrat ou fluide dans un système industriel ou domestique.
  20. Procédé de destruction d'une bactérie cible ou de modification ciblée du génome d'une bactérie cible selon la revendication 19, la bactérie cible étant choisie parmi un Bacillus (par ex. thuringiensis), un E. coli, une Salmonella, une Listeria, un Clostridium (par ex. botulique), une bactérie sulfato-réductrice, par ex. un Desulfovibrio, un Lactobacillus, une Legionella, un Streptococcus, un Lactococcus ou une Listeria.
  21. Procédé de modification ciblée d'une espèce ou souche bactérienne cible, le procédé comprenant la mise en contact d'une bactérie cible avec un/une cellule bactérienne support, plasmide, bactériophage, mélange ou phagémide selon la revendication 12, de sorte que la séquence cible de l'espèce bactérienne cible est modifiée par modification d'ADN médiée par CRISPR.
  22. Procédé ou procédé d'utilisation selon l'une quelconque des revendications 16-18 et 21, dans lequel la bactérie cible est comprise dans le microbiome d'un humain ou animal.
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