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FR3128227A1 - Mélange d’au moins un bactériophage et d’au moins une levure et leur procédé de séchage - Google Patents

Mélange d’au moins un bactériophage et d’au moins une levure et leur procédé de séchage Download PDF

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FR3128227A1
FR3128227A1 FR2110984A FR2110984A FR3128227A1 FR 3128227 A1 FR3128227 A1 FR 3128227A1 FR 2110984 A FR2110984 A FR 2110984A FR 2110984 A FR2110984 A FR 2110984A FR 3128227 A1 FR3128227 A1 FR 3128227A1
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Alan Israel
Edith POULAIN
Jean-Bernard Souici
Renaud Toussaint
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Lesaffre et Cie SA
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Abstract

La présente demande concerne un procédé de fabrication d’un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage ledit procédé étant caractérisé en ce qu’il est effectué par le mélange d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage en suspension et le séchage de ce mélange. Elle concerne également un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage, caractérisé en ce qu’il se présente sous forme d’entités solides, chaque entité solide étant composée d’au moins une levure et/ou au moins un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage et éventuellement au moins un excipient de séchage et ses utilisations.

Description

Mélange d’au moins un bactériophage et d’au moins une levure et leur procédé de séchage
La présente invention concerne un procédé de fabrication d’un mélange sec d’au moins un bactériophage et d’au moins une levure et/ou un dérivé de levure, un mélange comprenant des entités solides dont chacune est composée d’au moins un bactériophage et d’au moins une levure et/ou dérivé de levure et différentes utilisations d’un tel mélange.
Tant l’humain que les animaux ou les plantes peuvent jouer le rôle d’hôte pour des bactéries donnant lieu à des infections du type bactérien. L’emploi des bactériophages a été retenu pour traiter des maladies ou des troubles digestifs d’origine bactérienne. Par exemple, le document US20190255122 décrit une méthode de traitement ou de prévention d'une inflammation ou d'une douleur gastro-intestinale chez un être humain comprenant l'administration orale d'une composition comprenant un ou plusieurs bactériophages choisis parmi des bactériophages de la famille desSiphoviridaeou la famille desMyoviridae. En particulier, le ou les bactériophages sont choisis parmi LH01-Myoviridae, LL5-Siphoviridae, T4D-Myoviridaeet LL12-Myoviridae. Les bactériophages joueraient donc un rôle de prébiotiques permettant de protéger la microflore gastrointestinale.
Moyeet al.(A Bacteriophage Cocktail EliminatesSalmonella typhimuriumfrom the Human Colonic Microbiome while Preserving Cytokine Signaling and Preventing Attachment to and Invasion of Human Cells bySalmonellaIn Vitro. J Food Prot. 2019 Aug;82(8):1336-1349) a trait à des cocktails de bactériophages administrés aux patients humains afin d’éliminer les souches deSalmonellade l’intestin sans perturber le microbiote indigène. Ce cocktail permet aussi de prévenir le risque d’invasion de l’épithélium intestinal par lesSalmonella. Le cocktail de bactériophages étudié dans cet article a été préparé à partir de trois préparations de phages commercialisées par Intralytix, Inc. : ListShield™, EcoShield PX™ et SalmoFresh™.
Dissanayake et al. (Bacteriophages Reduce PathogenicEscherichia coliCounts in Mice Without Distorting Gut Microbiota. Front Microbiol. 2019 Sep 10;10:1984) utilise le même cocktail de bactériophages contre la souche d’Escherichia coliO157/H7. A l’issue de cette étude, les chercheurs ont conclu qu’un tel cocktail a un effet antibiotique similaire à celui de l’ampicilline sans montrer un effet aussi néfaste sur le microbiote intestinal que cette dernière.
Par ailleurs, il est connu que les levures ont un rôle bénéfique tant dans la nutrition et la santé humaine, que dans la nutrition et la santé des animaux ou la nutrition et la santé des plantes. Par exemple, certaines souches deSaccharomyces cerevisiaesont considérées comme des levures probiotiques favorisant la santé intestinale. Comme vu plus haut, les bactériophages peuvent quant à eux être utilisés pour prévenir ou traiter une infection bactérienne chez l'homme, l'animal ou la plante. Il convient donc d’associer au moins un bactériophage et au moins une levure pour prévenir ou traiter les infections bactériennes tout en permettant aux levures de se développer et jouer leur rôle nutritionnel, protecteur et stimulant dans la santé humaine, animale ou des plantes.
Un concept d'innovation attractif consiste à associer levure probiotique et phages dans un même produit pour combiner leurs effets respectifs lors de l'application (effet antibactérien des phages et protection offerte par les levures). Par exemple, le document US20180161382 a trait à des compositions comprenant au moins un type de bactériophage en tant qu’agent prébiotique et au moins un agent probiotique pouvant être choisi parmiSaccharomyces boulardiiouSaccharomyces cerevisiae. Le bactériophage a un rôle de promoteur dans le développement des bactéries bénéfiques en diminuant les populations des bactéries néfastes et en libérant des nutriments dans son environnement destinés à être utilisés par les bactéries bénéfiques du système digestif chez un individu. Les agents prébiotiques et probiotiques cités sont rajoutés séparément au sein de la composition. Selon ce document, chaque bactériophage a une spécificité pour une bactérie indésirable. Par conséquent, en tant que tels, les bactériophages n'affectent directement aucun autre organisme dans le tube digestif ni aucun probiotique. Ainsi, des bactéries indésirables spécifiques seraient lysées et leur matériel cellulaire est disponible en tant que nutriments pour l'organisme probiotique ou endogène. En outre, en affaiblissant la population des bactéries indésirables spécifiques, les organismes probiotiques peuvent entrer en compétition avec succès et établir une colonisation produisant un environnement qui leur convient mais inhospitalier pour l'organisme indésirable.
La présentation de microorganismes sous forme sèche favorise la manipulation, la stabilité au stockage à long terme et la possibilité à être utilisée en gélules ou dans d'autres formes de présentation et de dosages adaptées pour des applications spécifiques (aliments pour animaux, denrées alimentaires, etc.).
A l’heure actuelle, différents procédés peuvent être utilisés pour le séchage de micro-organismes vivants mais tous ne permettent pas d’obtenir un taux de viabilité final satisfaisant. Parmi les procédés existants, il y a, par exemple la lyophilisation, le séchage par atomisation (spray drying) et le séchage en lit d’air fluidisé.
La demanderesse possède une grande connaissance des procédés d’obtention de levures sous forme sèche : levure à humidité intermédiaire surgelée, levure sèche active (ADY pouractive dry yeast), levure instantanée active (IDY pourinstant dry yeast).
Un exemple de procédé de séchage de micro-organismes vivants est donné dans le document FR 2708621 dans lequel des bactéries sont co-séchées avec des levures. Les bactéries ont des parois complexes peu sensibles à la dégradation par les protéases de levure, ce qui permet ce co-séchage.
Les bactériophages sont des virus qui infectent des bactéries. Ils présentent des parois constituées uniquement de protéines, parois qui sont plus fines et plus fragiles que celles des bactéries. Ainsi, lorsqu’il s’agit du séchage d’une suspension de bactériophages (une famille ou un mélange de phages), dans la plupart des cas il est nécessaire de mettre en œuvre des supports pour favoriser la survie et/ou l’obtention d’un produit sec final ayant les propriétés requises (forme, granulométrie, extrait sec, porosité, propriété de solubilisation ou d’instantanéité, compressibilité etc.). Il est en effet impossible de sécher en l’état car le taux de matière sèche de la suspension (issue d’une culture de bactéries lysées ou d’une solution saline adaptée à la conservation des phages) est généralement très faible (< 5%). Le séchage dans ces conditions ne serait pas intéressant d’un point de vue économique et surtout trop délétère pour les phages.
Ainsi le support de séchage est intimement lié à la notion de formulation qui revient à mettre en œuvre un ou plusieurs ingrédients ou supports ou excipients avec le micro-organisme pour que le séchage soit possible et facile.
De plus, et à condition de disposer de bactériophages sous forme de poudre, le mélange de poudres de levures et de bactériophages dans un produit industriel fini nécessiterait de surmonter certaines difficultés telles que garantir l'homogénéité de la poudre mélangée ou remplir des gélules ou d’autres formes de présentation et de dosage avec un volume limité. Pour éviter les problèmes liés à une forme poudre, il est possible d’imaginer un mélange de phages avec des levures sous forme de crème de levure ou de levure pressée. Cependant, la crème de levure et la levure pressée sont acides (pH 5,8) et pourraient être associées à une activité protéase qui pourrait modifier à la fois le titre phagique et l’activité lytique des phages sur la cible bactérienne.
Enfin, les phages sont des entités biologiques nécessitant une protection contre les stress généralement rencontrés pendant le stockage et selon leur utilisation (application sur un support inerte ou vivant, en atmosphère protégée ou à l’air libre, ingestion par un humain ou un animal, etc).
Ainsi, la prévention des infections bactériennes à l’aide de bactériophages peut être compliquée par les conditions difficiles rencontrées dans l'estomac animal ou humain (pH ~ 2-3), ainsi que par l'exposition à la bile et aux enzymes digestives dans le tractus gastro-intestinal, qui rendent les phages inactifs. De la même manière, la persistance transitoire des phages dans différents environnements végétaux reste une préoccupation majeure dans la lutte biologique mettant en œuvre les phages dirigés contre des agents pathogènes des plantes. En effet, l'irradiation UV de la lumière du soleil peut inactiver le phage pendant le stockage et entraver son application potentielle en tant qu'agent de lutte biologique.
Il est également connu que les aliments et les boissons fermentés à base de levures fraiches peuvent aussi être sujets à des contaminations par des bactéries. Comme vu plus haut, des bactériophages peuvent alors être employés pour lutter contre ces bactéries. Parmi ces aliments et boissons, les produits de panification ou les boissons fermentées type vin ou bière peuvent être cités.
Il y a donc un besoin de mélanges de levures et de bactériophages ayant une résistance aux variations de pH et aux rayons UV tout en assurant l’activité des levures ou des dérivés de levures et l’activité lytique des bactériophages.
Un phage est un virus qui infecte une bactérie. Selon l’invention, les termes « phage » et « bactériophage » sont interchangeables.
L’invention vient améliorer la situation.
Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de fabrication d’un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage ledit procédé étant caractérisé en ce qu’il est effectué par le mélange d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage en suspension et le séchage de ce mélange.
Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage, caractérisé en ce qu’il se présente sous forme d’entités solides, chaque entité solide étant composée d’au moins une levure et/ou au moins un dérivé de levures et d’au moins un bactériophage et éventuellement au moins un excipient de séchage.
De préférence, ledit mélange est obtenu par le procédé selon le premier aspect.
Selon un troisième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect en tant que médicament dans une composition destinée à diminuer l’acidité du jus gastrique.
Selon un quatrième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect dans une composition pour la stimulation, la protection, le biocontrôle et/ou la nutrition des plantes.
Selon un cinquième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect dans une composition alimentaire ou dans un complément alimentaire.
Selon un sixième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect en brasserie et/ou en œnologie.
Selon un septième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect en panification.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de fabrication d’un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage ledit procédé étant caractérisé en ce qu’il est effectué par le mélange d’au moins une levure et/ou dérivé de levure ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage et le séchage de ce mélange.
Un tel procédé permet de produire des formulations stables contenant des phages assurant leur protection optimale et leur acheminement vers les sites d'action, tels que le tractus gastro-intestinal ou la phyllosphère des plantes (parties aériennes). Les formes sèches sont privilégiées en raison de leur facilité de manipulation et de leur stabilité de stockage à long terme, par exemple à des températures ambiantes, évitant ainsi la nécessité d'une chaîne de froid pour le stockage.
Les levures ou dérivés de levure, utilisées comme probiotiques en santé animale, humaine et végétale ont été caractérisées pour leur tolérance et leur résistance à plusieurs facteurs de stress associés à la fois aux procédures de fabrication (processus en aval, par exemple séchage, stockage) et aux conditions stressantes du tractus intestinal (pH gastrique, bile et enzymes digestives).
La combinaison de levure et/ou dérivé de levure et de phage constitue une alternative pour protéger les phages par la levure ou ses dérives et les véhiculer jusqu'au site cible. Ainsi, les levures (ou ses dérivés) ont un double rôle : d’un côté elles jouent le rôle de probiotiques et, d’un autre côté, elles servent de support lors de l’étape de séchage, comme montré par les exemples ci-dessous. Cette solution permet de maximiser les effets bénéfiques de chacun des composants de la combinaison.
Par ailleurs, et notamment dans le cas d’une utilisation pour la protection des végétaux, le mélange obtenu par le procédé de co-séchage de phage avec de la levure et/ou des dérivés de levure permet d’améliorer la protection des phages vis-à-vis des conditions environnementales et des effets UV (conditionsin vitro), tout en conservant l’activité et les propriétés bénéfiques de la levure.
Un tel mélange permet de réduire les coûts associés à l’emploi des compositions comprenant à la fois des levures ou dérivés de levure et des bactériophages en optimisant la gestion des stocks et leur approvisionnement. Il est donc prêt à l’emploi, réduit les risques de pertes et n’engendre pas de surcoûts liés au mélange de levures sèches ou dérivés de levure avec des bactériophages, tout en évitant les risques d’erreurs de manipulation dans la gestion des micro-organismes, comme par exemple les erreurs de dosage. En effet, ces erreurs peuvent survenir notamment lors de la préparation des mélanges de poudres de levures lorsque l’utilisateur doit rajouter les ferments dans des proportions massiques spécifiques. L’emploi de ce mélange facilite la préparation des compositions impliquant l’utilisation des levures ou dérivés de levure.
Un autre avantage notable de ce procédé par rapport à un mélange sec/sec classique entre au moins une levure et un bactériophage réside dans l’homogénéité du mélange obtenu. Ainsi, le risque de perte d’homogénéité est fortement minimisé. Ceci est dû au fait que chaque entité solide composant le mélange sec obtenu grâce au procédé selon l’invention comprend simultanément des levures ou dérivés de levure et des bactériophages. Ce mélange sec permet également de limiter la manipulation de produits pulvérulents et donc de limiter les risques sanitaires. Autrement dit, un mélange sec unique est utilisé.
Ainsi, cette nouvelle approche de mélanger les levures avec des bactériophages avant leur séchage permet l’amélioration de performances, l’élimination des risques d’erreur de manipulation liés à l’emploi de plusieurs poudres ou micro-organismes sur un même site, la praticité et la simplification, la réduction des coûts, la limitation très forte des pertes suite aux changements de commandes et aléas du marché.
Le procédé selon l’invention peut être mis en œuvre en utilisant des levures actives et/ou des dérivés de levure.
Le terme “levure active”, qui est synonyme de “levure vivante” ou « levure fraîche », désigne une population de cellules de levure qui sont métaboliquement actives. Lorsque des levures dites « fraîches » sont employées, l’activité désigne la viabilité de celles-ci.
Un dérivé de levure selon l’invention est défini comme une fraction obtenue lors de la dégradation de la levure par action physique ou chimique, par exemple par plasmolyse, hydrolyse ou autolyse de la levure. Les produits dérivés de levure sont tous les produits susceptibles d'être obtenus à partir de cellules de levure entières ou fractionnées, par action physique ou chimique. Ils comprennent en particulier des extraits de levure obtenus par autolyse ou autolysats, des écorces de levure, des mannoprotéines, des levures inactivées. Ils se présentent le plus souvent sous forme de poudre plus ou moins fine après broyage ou en suspension dans un milieu de réhydratation, sous forme de crème de levure ou de levure pressée. De façon tout à fait avantageuse, le dérivé de levure est de l’écorce de levure ou de l’extrait de levure. De façon encore plus avantageuse, le dérivé de levure est de l’écorce de levure.
Les écorces de levure peuvent être obtenues ou préparées selon des techniques connues de l'homme du métier, notamment par lyse enzymatique ou par lyse mécanique (séparation, concentration, etc.).
Dans un mode de réalisation, les écorces sont produites par lyse enzymatique (autolyse par leurs propres enzymes protéolytiques ou hétérolyse) de cellules de levures suivie d'une séparation des parties solubles et insolubles, par exemple par des moyens physiques, comme la centrifugation, et récupération de la partie insoluble. La partie insoluble est ainsi typiquement récupérée par élimination de la partie soluble par centrifugation. La partie insoluble correspond aux écorces de levures. La partie soluble résultant de ce procède, de couleur claire et de faible turbidité, est appelée extrait de levure.
De préférence, le procédé de fabrication d’un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage est caractérisé en ce qu’il comprend :
- fournir au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure, de préférence sous forme de crème, et au moins un bactériophage en suspension ;
- mélanger ladite levure et/ou dérivé de levure avec ledit au moins un bactériophage de manière à former un mélange;
- effectuer une étape de séchage du mélange de manière à former un mélange sec ;
- récupérer le mélange sec.
De préférence, les bactériophages sont en suspension dans une solution aqueuse, de préférence saline. L’homme du métier saura adapter une telle solution selon ses besoins, par exemple en choisissant une solution saline tamponnée.
Selon certains modes de réalisations, l’étape de séchage s’effectue par lyophilisation ou atomisation ou sur lit d’air fluidisé.
De préférence, le taux de matière sèche de levure et/ou de dérivé de levures au sein du mélange avant l’étape de séchage d’au moins une levure ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage est situé entre 20 à 60% par rapport à la quantité totale de matière sèche dans le mélange à sécher.
De préférence, l’étape de séchage peut être précédée d’une étape de déshydratation permettant d’augmenter le taux de matière sèche. Cette étape de déshydratation est ensuite suivie d’une étape de séchage proprement dit permettant d’obtenir le mélange sec final à récupérer. Autrement dit, l’étape de séchage s’effectuerait en deux temps.
De préférence, l’étape de séchage peut être suivie d’une étape selon laquelle le mélange sec est encore divisé, par exemple, en le broyant.
Le séchage par lyophilisation permet d’obtenir un lyophilisat qui peut être broyé sous forme de paillettes ou d’une poudre fine alors que le séchage par atomisation permet d’obtenir un produit sec finement divisé.
Le principe du séchage par atomisation (en anglais –spray drying) est de déshydrater des gouttelettes de liquide dans un courant de gaz chaud (air par exemple) qui circule dans une tour de séchage. Le liquide à sécher (solution ou suspension ou mélange, avec un extrait sec adapté pour ne pas être trop visqueux) est nébulisé sous forme de fines gouttelettes à l’aide d’un dispositif d’atomisation (buse ou turbine) qui est placé généralement en haut de la tour. Il s’agit d’un séchage par entraînement, les gouttelettes se transforment presque instantanément en particules solides qui sont séparées de l’air en fin de séchage pour obtenir une poudre fine ou une poudre micro-granulée, selon la configuration du séchoir (simple, double ou multiple effet).
Si les températures d’entrée d’air sont généralement élevées, par exemple comprises entre 100 et 300°C, préférentiellement entre 120 et 250°C, la température de l’air de sortie et surtout la température du produit à l’intérieur de la tour est plus basse de plusieurs dizaines de degrés car les particules, qui sont entourées d’un film d’eau, se refroidissent lors du changement d’état de l’eau liquide en vapeur. L’homme du métier saura adapter ces températures en fonction de ses besoins.
Néanmoins même si la température du produit est plus basse, cette technique peut être destructrice pour la déshydratation de produits vivants comme les micro-organismes. Il est cependant possible de préserver partiellement la viabilité en mettant en œuvre des conditions opératoires (notamment ajout d’un support ou d’additifs de séchage dans la formulation du mélange initial et choix du barème de température) adaptées et plus ménageantes. Par ailleurs le temps de séjour des particules dans la tour de séchage peut aussi impacter la viabilité, il sera donc nécessaire de le minimiser mais en prenant soin de viser une humidité finale de la poudre qui soit compatible avec la durée de vie souhaitée du produit (conservation).
Le séchage par atomisation de la suspension de phages seule telle qu’elle est obtenue (lysat bactérien) n’est pas possible car l’extrait sec est trop faible et l’opération ne serait pas intéressante d’un point de vue économique mais pourrait être aussi délétère pour les micro-organismes (mise en œuvre de températures d’air élevées). Afin d’augmenter l’extrait sec, selon l’invention on utilise les levures et/ou dérivés de levure, et éventuellement des ingrédients ou excipients secondaires ayant un effet particulier (protecteur par exemple).
Une attention particulière sera apportée à l’extrait sec visé de la préparation à sécher : il faut en effet que le liquide ne dépasse pas une certaine viscosité pour pouvoir être pompé et transformé en fines gouttelettes par le dispositif d’atomisation.
La préparation du mélange se fait jusqu’à dissolution ou dispersion complète des ingrédients ou supports et celui-ci sera séché en tour d’atomisation le plus rapidement possible pour éviter toute dégradation du produit ou prolifération microbienne. De préférence le mélange sera maintenu à basse température pendant toute la durée du séchage. L’homme du métier saura choisir la température nécessaire.
Les paramètres de séchage sont adaptés en fonction de la configuration de la tour et du dispositif d’atomisation mais aussi des caractéristiques du mélange (viscosité, extrait sec), le but étant d’obtenir une poudre fine avec une humidité finale maximum de 10%, de préférence maximum 8%, de préférence encore 6%.
En plus des levures et/ou dérivés de levures, des supports complémentaires de séchage peuvent être cités : tels que la maltodextrine, l’amidon natif, le tréhalose, la L-leucine.
D’une manière générale, la lyophilisation (en anglais –freeze drying) est une technique de séchage permettant la dessiccation sous vide de produits liquides ou semi pâteux qui ont été préalablement congelés. Cette technique est souvent utilisée pour des produits fragiles qui ne supportent pas un séchage direct, elle permet ainsi d’assurer la stabilité de produits périssables, de stopper le métabolisme des produits biologiques et d’obtenir des produits pulvérulents facilement réhydratables. Ainsi un produit lyophilisé possède une très grande affinité pour le solvant qu’il contient (généralement de l’eau).
D’un point de vue pratique, cette opération comporte 3 phases importantes et on parle ainsi de cycle de lyophilisation.
La première phase est une opération de congélation du produit qui permet de solidifier la matrice et surtout de cristalliser l’eau qu’il contient sous forme de glace. Pour cela il est nécessaire d’abaisser suffisamment la température du produit en dessous de sa température de solidification totale. L’homme du métier saura choisir la température nécessaire.
La deuxième phase est une étape de dessiccation primaire ou sublimation. Pendant cette phase il est nécessaire d’abaisser la pression dans la chambre de lyophilisation donc de réaliser un vide poussé. Ainsi la pression devra être inférieure à la tension de vapeur de la glace, à la température considérée. Par ailleurs la température du produit devra rester inférieure à la température de fusion commençante.
La troisième phase est une étape de dessiccation secondaire qui permet de terminer la déshydratation en éliminant les dernières traces d’eau par désorption. Elle se caractérise par une pression dans la chambre la plus basse possible et par une température de produit élevée mais qui restera en dessous de sa température de dénaturation.
Ainsi avec cette dernière phase il sera possible d’obtenir des produits secs présentant une humidité résiduelle très basse (par exemple < 1%).
Enfin les opérations annexes du cycle de lyophilisation sont :
- la préparation du produit à lyophiliser qui consiste généralement à l’associer à un mélange d’excipients ou de supports à effet protecteur et cryoprotecteur ;
- la protection du produit lyophilisé final qui est souvent instable et peut reprendre rapidement le solvant qu’il contenait (hygroscopicité si produit aqueux) du fait de sa structure fortement poreuse. Dans ce cas il s’agit d’isoler le lyophilisat de l’environnement extérieur en le conditionnant de façon adaptée.
- la suspension de phages est formulée avec des adjuvants ou des excipients qui auront un rôle de support et/ou d’agent cryoprotecteur. Il est nécessaire d’augmenter l’extrait sec (par exemple autour de 25-30 %) pour concentrer la suspension de phages et réduire ainsi la quantité d’eau à éliminer. Selon l’invention, cette augmentation de la matière sèche est rendue possible par le mélange avec les levures et/ou dérivés de levures. L’homme du métier saura choisir un ratio « bactériophage/levure et/ou dérivé de levure » afin d’obtenir la meilleure viabilité des phages après séchage.
- la préparation du mélange se fait jusqu’à dissolution ou dispersion complète des excipients ou de la levure et/ou du dérivé de levure.
En plus des levures et dérivés de levures, d’autres supports de séchage peuvent être cités : tels que la maltodextrine, l’amidon natif, le tréhalose, la L-leucine.
Lors de cette étape le mélange sera complètement refroidi (par exemple < 8°C) et réparti dans des plateaux ou des flacons en respectant une certaine hauteur de couche (par exemple 15 mm), avant de subir la phase de congélation à au moins -20°C dans un congélateur ou un surgélateur.
Après contrôle de la solidification du mélange qui doit être totale (eau complètement cristallisée), les récipients ou flacons sont placés sur les étagères du lyophilisateur préalablement refroidies par la mise en route du piège frigorifique (par exemple - 55°C).
L’homme de métier saura choisir comment mettre en œuvre les étapes de dessication et adapter les températures en conséquence.
A la fin du cycle de lyophilisation, le lyophilisat a généralement l’aspect d’une meringue poreuse. Selon les cas cette meringue est réduite en poudre fine par broyage doux et de préférence cette opération sera menée dans une enceinte à hygrométrie contrôlée (pour éviter sa reprise en eau), avant le conditionnement rapide sous vide ou sous atmosphère inerte.
De préférence, le procédé selon l’invention comprend en outre une étape d’extrusion du mélange déshydraté de manière à former un mélange extrudé, l’étape de séchage s’effectuant en lit fluidisé sur le mélange extrudé de manière à former un mélange sec.
Le séchage en lit fluidisé permet d’obtenir un produit sec granulaire ou sous forme de vermicelles.
De manière générale, le principe du séchage en lit fluidisé est de déshydrater des particules solides humides dans un courant d’air chaud. Ces particules humides solides sont obtenues dans ce cas après une étape de granulation qui permet d’obtenir une forme et une densité de solide appropriées pour la mise en fluidisation dans l’air. Les particules (appelées encore granules) se retrouvent ainsi en suspension dans l’air chaud sans se toucher et c’est toute leur surface de contact avec l’air qui peut être séchée de façon uniforme. Les granules secs se caractérisent par une humidité résiduelle inférieure à 10%, de préférence à 8%, de préférence encore à 5%, ce qui assure une bonne stabilité dans le temps des produits (conservation).
L’avantage de cette technique est de pouvoir réaliser des séchages ménageants à basse température ce qui en fait une méthode de choix pour le séchage des micro-organismes vivants ou des produits biologiques fragiles. La taille des particules à sécher, après l’étape de granulation, est importante et plus celle-ci sera petite, plus le produit séchera vite. Le temps d’exposition à la chaleur du produit sera également réduit ce qui favorisera un meilleur taux de viabilité après séchage.
D’un point de vue applicatif cette technique est couramment utilisée pour le séchage de levure de boulangerie et on obtient dans ce cas de la levure sèche instantanée sous forme de granules poreux qui sont capables de se réhydrater très rapidement dans de l’eau ou dans un mélange pulvérulent (farine) auquel de l’eau est ajoutée.
La granulation, appelée aussi l’extrusion, est l’étape précédant le séchage en lit fluidisé et ne peut se faire que sur des produits pâteux ou semi-pâteux ayant un extrait sec compatible avec cette opération de passage à travers une filière. Par exemple la filtration d’une crème de levure donne de la levure pressée qui a cette propriété.
En effet la masse à sécher est mise en forme dans un granulateur (appelé aussi extrudeur) qui produit des filaments fins continus, qui sont ensuite fragmentés en courts vermicelles pour obtenir les granules. Si la masse à extruder est un peu trop humide, les filaments ont tendance à se coller entre eux après l’extrusion et il ne sera plus possible de les sécher sous forme individualisée : on obtiendra en fin de séchage de gros agrégats qui conserveront une certaine humidité.
L’homme du métier saura adapter l’humidité de la masse à extruder selon ses besoins.
Par exemple, un moyen de contrer à cette difficulté est l’ajout d’un excipient de séchage. De préférence, l’excipient de séchage est choisi parmi la maltodextrine, le tréhalose, l’amidon natif ou la L-leucine.
De préférence, l’étape de séchage s’effectue en présence d’un excipient de séchage, de préférence la maltodextrine.
La levure peut être issue d’une souche choisie parmi les espècesSaccharomyces cerevisiaeetSaccharomyces boulardii, de préférence la levure est issue d’une souche choisie parmi la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée le 17 octobre 2007 sous le numéro CNCM I-3856, la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée le 22 mars 2018 sous le numéro CNCM I-5298, la souche deSaccharomyces boulardiidéposée le 21 aout 2007 sous le numéro CNCM I-3799, la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée le 31 août 2016 sous le numéro CNCM I-5129, la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée le 31 août 2016 sous le numéro CNCM I-5130 ou la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée le 9 février 2011 sous le numéro CNCM I-4444.
De préférence, la levure est issue d’une souche choisie parmi les espècesSaccharomyces cerevisiaeetSaccharomyces boulardii, de préférence la levure est issue d’une souche choisie parmi la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée le 17 octobre 2007 sous le numéro CNCM I-3856, la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée le 22 mars 2018 sous le numéro CNCM I-5298 et la souche deSaccharomyces boulardiidéposée le 21 aout 2007 sous le numéro CNCM I-3799.
De préférence, le ou les bactériophages sont choisis parmi ceux ayant une activité antibactérienne contre des souches de bactéries choisies parmiE scherichia coli , Listeria monocytogenes , Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringensou des souches du genreSalmonella. Par activité antibactérienne, on comprend une activité lytique de la part du bactériophage sur la bactérie suite à l’infection de la bactérie par celui-ci.
Des bactériophages connus et susceptibles d’être utilisés sont choisis parmi T4 commercialisé par DSMZ sous la référence DSM 4505 et appartenant à la famille desMyoviridae, T5 commercialisé par DSMZ sous la référence DSM 16353 et appartenant à la famille desSiphoviridaeou T7 commercialisé par DSMZ sous la référence DSM 4623 et appartenant à la famille desPodoviridae, ou un mélange de ceux-ci ou parmi les mélanges de phages SalmoFresh™ ou FOP™ commercialisés par Intralytix Inc. Les bactériophages T4, T5 et T7 présentent une activité antibactérienne contre l’E scherichia coli. Le cocktail de 6 bactériophages appartenant à la famille desMyoviridaecommercialisé sous la référence SalmoFresh™ présente une activité antibactérienne contre des souches pathogènesdu genre Salmonella,par exempleSalmonella entericaou bienSalmonella typhimurium , Salmonella Heidelberg, Salmonella Newport, Salmonella Kentucky, Salmonella infantis .FOP™ est un mélange unique et exclusif de quinze phages lytiques individuels qui offrent une large protection contre les souches pathogènes deSalmonella enterica, Escherichia colietListeria monocytogenes.
Selon un deuxième aspect, l’invention concerne un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage, caractérisé en ce qu’il se présente sous forme d’entités solides, chaque entité solide étant composée d’au moins une levure et/ou au moins un dérivé de levures et d’au moins un bactériophage et éventuellement au moins un excipient de séchage.
De préférence, le mélange est obtenu selon un procédé décrit selon le premier aspect.
De préférence, les dérivés de levures sont des écorces de levure.
De préférence, le mélange sec est divisé sous forme pulvérulente qui comprend des entités solides et, éventuellement un excipient de séchage.
De préférence, les entités solides se présentent sous forme de paillettes, de grains, de vermicelles ou de granules.
De préférence, l’excipient de séchage est choisi parmi la maltodextrine, le tréhalose, l’amidon natif ou la L-leucine.
De préférence, les levures et bactériophages sont choisis parmi ceux décrits précédemment.
Selon un troisième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect en tant que médicament dans une composition destinée à diminuer l’acidité du jus gastrique.
Selon un quatrième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect dans une composition pour la stimulation, la protection, le biocontrôle et/ou la nutrition des plantes.
Plus particulièrement, celle-ci est pour le traitement ou la protection des plantes contre les maladies produites ou provoquées par des agents pathogènes, notamment fongiques, bactériens ou viraux, pour l'induction ou la stimulation chez une plante de défenses naturelles contre des agents pathogènes.
Selon un cinquième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect dans une composition alimentaire ou dans un complément alimentaire.
Selon un sixième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect en brasserie et/ou en œnologie.
Selon un septième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect en panification.
Matériel et méthodes
Bactériophage T4 ou Phage T4 appartenant à la famille desMyoviridaequi ont une longue queue contractile
Bactériophage T5 ou Phage T5 appartenant à la famille desSiphoviridaequi ont une longue queue non contractile
Bactériophage T7 ou Phage T7 appartenant à la famille desPodoviridaequi ont une petite queue non contractile
Ces 3 phages sont des phages lytiques qui infectentEscherichia coli.
SalmoFresh™ est un mélange unique et exclusif de six phages lytiques individuels qui offrent une large protection contre des souches pathogènes du genreSalmonella, par exempleSalmonella entericaou bienSalmonella typhimurium , Salmonella Heidelberg, Salmonella Newport, Salmonella Kentucky, Salmonella infantis.
FOP™ est un mélange unique et exclusif de quinze phages lytiques individuels qui offrent une large protection contre les souches pathogènes deSalmonella enterica, Escherichia coli et Listeria monocytogenes.
La liste des microorganismes utilisés est donnée dans le Tableau 1 ci-dessous.
Noms Type Référence
Phage T4 Bactériophage DSMZ 4505
Phage T5 Bactériophage DSMZ 16353
Phage T7 Bactériophage DSMZ 4623
SalmoFresh™ Bactériophages Mélange de 6 phages produit par Intralytix ciblant des souches pathogènes du genreSalmonella
FOP™ Bactériophages Mélange de 15 phages produit par Intralytix ciblantSalmonella enterica, Escherichia colietListeria monocytogenes
Salmonella enterica Bactérie SN388
Escherichia coli Bactérie Escherichia coliDSMZ 613 (Migula 1895) Castellani and Chalmers 1919
Escherichia coli Bactérie Escherichia coli342-5
Listeria monocytogenes Bactérie LM114 000689
Saccharomyces cerevisiae Levure CNCM I-4444 (déposée le 9 février 2011)
Saccharomyces cerevisiae Levure CNCM I-3856 (déposée le 17 octobre 2007)
Saccharomyces boulardii Levure CNCM-I-3799 déposée le 21 août 2007
La liste des réactifs utilisés est donnée dans le Tableau 2 ci-dessous.
Nom Référence N° CAS
Chlorure de sodium Merck 31434 7647-14-5
Sulfate de magnésium heptahydrate Merck M2773 10034-99-8
Cycloheximide 1% 66-81-9
Phosphate de potassium monobasique Merck P0662-500G-M 7778-77-0
Tris-HCl 1M (pH7.5) Merck T2319
Gélatine 2% Merck G1393 9000-70-8
Acide chlorhydrique 37 % Sigma 320331-500ml
Hydroxyde de sodium Merck 30620-1KG-M
Extrait de levure Procel 351 pw
Bouillon Trypto caséine soja bioMérieux 51019
Trypto caséine soja Agar bioMérieux 51044
Agar BD 214530
Difco YM Agar BD 271210
Extrait de bile porcine Sigma B88631-100G 8008-63-7
Pancréatine obtenue à partir de pancréas de porc 4X USP Sigma P1750-100G 8049-47-6
Pepsine 500U/mg Sigma 77160-100G
Liquide Gastrique Simulé (SGF)
Du liquide gastrique simulé est préparé selon les travaux de Ma et al. (2008), Colom et al. (2015) et Vinner et al. (2018) (pour 100ml) :
- 0,2g NaCl
- 0,4g pepsine (500 U/mg)
- Eau distillée QSP 100 ml
- pH ajusté avec HCl ou NaOH gamme de pH réalisée : 2,5, 3,0, 3,5, 4,0
Les activités enzymatiques (U/ml) ont été reproduites selon les travaux de Adouard et al.2019. Une fois préparé le liquide est préchauffé à 37°C.
Pour les échantillons de co-séchage 50ml de SGF sont versés dans un pot de 180ml et 0,5g de l’échantillon est ajouté, ce qui correspond à une dilution 1E-02.
Pour les phages en solution (contrôles) 9,9 ml de SGF sont versés dans un pot de 60ml dans lequel 100µl de solution de phage sont ajoutés, ce qui correspond à une dilution 1E-02, la solution de phages est diluée pour obtenir une concentration de phages la plus proche de celle de l’échantillon co-séché.
Les pots sont ensuite mis à incuber à 37°C avec agitation (100rpm) pour mimer le passage dans l’estomac. Aux temps 0 (juste après ajout de l’échantillon), 15, 30, 60, 120 min des dénombrements de phages par spots selon la méthode décrite plus bas sont réalisés sans oublier d’agiter le pot avant prélèvement de l’aliquote pour dilution.
Des dénombrements levures sont aussi réalisés dans le liquide gastrique à pH 2,5 au début (T0) et en fin (T120) d’expérience selon la méthode décrite.
Le pH est remesuré à la fin de l’expérience.
Liquide intestinal simulé (SIF)
Du liquide intestinal simulé est préparé selon les travaux de Ma et al.2008, Colom et al.2015 et Vinner et al.2018 (pour 100ml) :
- 0,68g KH2PO4
- 1g de bile porcine
- 2,16g de pancréatine
- Eau distillée QSP 100 ml
- pH ajusté à 6,8 avec NaOH
Les activités enzymatiques ont été reproduites selon les travaux de Adouard et al.2019. Une fois préparé le liquide est préchauffé à 37°C.
Pour les échantillons de co-séchage 50ml de SIF sont versés dans un pot de 180ml dans lequel 0,5g de l’échantillon est ajouté, ce qui correspond à une dilution 1E-02.
Pour les phages en solution (contrôles) 9,9 ml de SIF sont versés dans un pot de 60ml dans lequel 100µl de solution de phage sont ajoutés, ce qui correspond à une dilution 1E-02, la solution de phages est diluée pour obtenir une concentration de phages la plus proche possible de la concentration de l’échantillon co-séché. Les pots sont ensuite mis à incuber à 37°C avec agitation (100rpm) pour mimer le passage dans l’intestin. Aux temps 0 (juste après ajout de l’échantillon), 30, 60, 120 min (Minekus et al. 2014) des dénombrements de phages par spots selon la méthode décrite plus bas ci-après au paragraphe 141 sont réalisés sans oublier d’agiter le pot avant prélèvement de l’aliquote pour dilution.
Des dénombrements de levures sont aussi réalisés au début (T0) et en fin (T120) d’expérience selon la méthode décrite.
Le pH est remesuré à la fin de l’expérience.
Dénombrement des phages et levures co-sechées
Les dénombrements des phages co-séchés avec la levure se font après une étape de réhydratation de la poudre dans l’homogénéisateur Stomacher et sont réalisés selon une méthode adaptée d’une procédure interne : Dénombrement de bactériophages par PFU.
Réhydratation des échantillons de co-séchage
- peser 1g d’échantillon de co-séchage phage-levure à l’aide d’une balance de précision et le placer dans un sac de Stomacher ;
- ajouter 9ml d’eau distillée stérile à 37°C dans le sac puis le passer 3 min dans l’homogénéisateur Stomacher à vitesse moyenne.
Technique de dénombrement des phages en profondeur
- faire fondre la gélose TSA+YE (Trypto caseine Soja Agar (TSA) + Extrait de levure (YE) à 6g/L d’agar + cycloheximide (0,5%) et la maintenir en surfusion ;
- préparer des boîtes de Pétri 90 mm avec environ 15 ml du milieu TSA+YE + cycloheximide (0,5%), les mettre sécher sous hotte pendant 30min ;
- à partir d’une colonie provenant d’une culture fraiche, ensemencer 20ml de bouillon TSB+YE (Trypto caseine Soja bouillon (TSB) + Extrait de levure (YE);
- incuber sous agitation jusqu’à obtenir une culture en début de phase exponentielle de croissance (exemple : arrêter la culture à une DO comprise entre 0,2 et 0,7 pourE. coli,SalmonellaetListeria) ;
- relever la valeur de DO.
Préparer des dilutions décimales de l’échantillon de co-séchage réhydraté dans des tubes Eppendorf contenant 900µL de solution SM
Dans un tube 13ml contenant 100µl de solution de bactérie hôte (DO comprise entre 0,2 et 0,7), ajouter 100µl de la dilution de phage voulue et laisser en contact 10 min
Ajouter 3ml de milieu TSA+YE 6g/l d’agar + cycloheximide et couler sur une boite de gélose précédemment coulée et séchée. Laisser solidifier.
Incuber à la température de croissance de la bactérie hôte pendant 24h.
Technique de dénombrement des phages par spots
Préparation des boites gélosées
- faire fondre la gélose à 6g/L d’agar puis ajouter 0.5% d’cycloheximide, la maintenir en surfusion.
- à partir d’une colonie provenant d’une culture fraiche, ensemencer 20ml de bouillon TSB+YE. Incuber sous agitation jusqu’à obtenir une culture en début de phase exponentielle de croissance (exemple : arrêter la culture à une DO comprise entre 0,2 et 0,7 pourE. coli,SalmonellaetListeria). Préparer les boites de Petri carrées avec 25 ml du milieu TSA+YE + cycloheximide (0.5%), les mettre à sécher sous hotte pendant 30 min.
- relever la valeur de DO.
- dans un tube 13ml contenant 300µl de solution de bactérie hôte (DO comprise entre 0,2 et 0,7), ajouter 9ml de milieu TSA+YE 6g/l d’agar + cycloheximide et couler sur une boite de gélose précédemment coulée et séchée ;
- laisser solidifier.
Préparation des dilutions décimales de la solution de phages
- remplir des colonnes de puits de microplaques 96 puits avec 180 µl de tampon SM en commençant à la colonne 3 et en sautant 1 colonne sur 2 afin de permettre l’ensemencement par spot.
- ajouter dans les puits de la première colonne 100µl de solution provenant de la réhydratation de l’échantillon qui constituent ici la première dilution au 10e (1E-01).
- à l’aide d’une pipette multicanaux, prélever 20µl dans la première colonne et transférer dans les puits de la colonne de dilutions suivantes et ainsi de suite jusqu’à la dernière dilution.
Dépôt sur boite
Il est nécessaire de prélever 10µl sur une ligne de microplaque (96 puits) avec une pipette multicanaux adaptée.
Ensuite, diviser la boite de Petri carrée préalablement ensemencée avec la bactérie hôte en 4 colonnes et déposer les spots de 10µl des dilutions de phages/levures, laisser sécher et incuber à la température de croissance de la bactérie hôte pendant 24h.
Le dénombrement des levures est réalisé en parallèle.
Une fois l’échantillon réhydraté, 100µl sont prélevés pour réaliser des dilutions décimales dans des tubes Eppendorf remplis avec 900µl d’eau distillée stérile.
100µl de la dilution d’intérêt sont prélevés, déposés sur boite de gélose YM et étalés.
Les boites sont ensuite mises à incuber 3 jours à 25°C.
Indépendamment de la technique, les résultats sont exprimés comme suit :
Titre théorique PFU/g MS (avant séchage) - ce titre est calculé à partir du titre dosé en phage de la suspension de phages et de la composition réelle de la formulation réalisée au laboratoire qui tient compte de tous les ingrédients ajoutés (levure, fraction, protecteurs, additifs etc.). Pour éviter les biais, ce titre est ramené à la matière sèche du mélange (avant séchage).
Titre dosé PFU/g MS (après séchage) - c’est le titre réel tel qu’il est dosé sur le produit fini sec et ramené à l’extrait réel du produit fini sec.
Pertes en phages (Log10 PFU/g) sont égales à la différence entre :
Log10 (titre théorique PFU/g MS avant séchage) – Log10 (titre dosé PFU/g MS après séchage) et exprimées en Log10 PFU/g.
Tests de gastro résistance
Des tests de résistance gastro-intestinalin vitrosimplifiés ont été réalisés sur les échantillons de co-séchage. Ces tests ont pour but d’analyser la survie des phages et des levures par dénombrements à différents points au cours du temps dans des liquides gastro-intestinaux simulés. Ces tests reprennent la méthode de dénombrement décrite plus haut sans la phase de réhydratation avec l’homogénéisateur Stomacher qui ici se fait directement dans le liquide simulé.
0.5g d’échantillon sont mis dans 50ml de liquide. Une gamme de pH a été réalisée pour le test gastrique allant de 2,5 à 4,0.
Potentiel d’alcalinisation
Dans le but de définir quel excipient est responsable de la remontée du pH gastrique, des échantillons de co-séchage ont été produits par lyophilisation de la solution SalmoFreshTMavec chaque excipient individuellement dans les mêmes proportions (99%MS excipientversus1%MS phage). Les échantillons ont été réalisés au laboratoire.
0.5g de chaque échantillon a été mis en contact avec 50ml de liquide gastrique simulé à pH 2,5. Après homogénéisation, le pH de chaque préparation a été mesuré au pHmètre après homogénéisation.
Tests de résistance aux UV
Des tests de résistance aux UV ont été réalisés sur les échantillons de co-séchage réhydratés 3 min avec un homogénéisateur Stomacher (1g dans 9ml d’eau distillée stérile) et sur les phages en solution dans la chambre UV BS-03 +UV-MA avec des ampoules UV-C. L’irradiation mesurée est de 12mW/cm2. Pour chaque forme d’échantillon, trois aliquotes identiques sont réalisées pour être exposées pendant 3 temps différents (5, 15, 30 min). Ces tests sont adaptés d’après les tests réalisés par l’équipe de Ramirez et al. 2018. La survie des phages et des levures est mesurée par la méthode de dénombrement.
Le dénombrement à T0 est identique pour l’échantillon de co-séchage et pour sa forme réhydratée, il se fait selon la méthode des spots décrite plus haut, le dénombrement du phage en solution se fait selon une procédure interne.
Pour les échantillons de co-séchage, environ 1.5g sont pesés et étalés dans une boite de Petri ouverte au centre de la chambre. Après exposition aux UV, 1g est pesé à la balance de précision puis réhydraté 3 min dans un homogénéisateur Stomacher pour que les phages soient dénombrés selon la méthode des spots décrite plus haut.
Pour les échantillons de co-séchage réhydratés, 1ml sont déposés dans une boite de Petri ouverte au centre de la chambre. Après exposition aux UV, 100µl sont prélevés pour dénombrer les phages selon la méthode des spots décrite plus haut.
Pour les phages en solution, 1ml sont déposés dans une boite de Petri ouverte au centre de la chambre. La concentration de phage de la solution est le plus possible approchée de la concentration de phage dans l’échantillon de co-séchage par dilutions. Après exposition aux UV, 100µl sont prélevés pour dénombrer les phages selon une procédure interne.
Le dénombrement des levures se fait à T0 et à T30 selon la méthode décrite.
Tests de stabilité
La stabilité des produits de co-séchage phages-levures stockés dans des sachets ou des piluliers sous vides a été étudiée sur 3 mois dans 3 conditions de température et d’humidité :
- 25°C/60%HR
- 30°C/65%HR
- 40°C/75%HR
Des dénombrements de phages selon la technique de dénombrement en profondeur sont réalisés à différents points dans le temps : 0, 15, 30, 60, 90 jours. L’aw(activité de l’eau) est mesurée à 25°C aux temps T0, 30 et 90j à l’aide d’un hygromètre à point de rosée AquaLab Série 4TEV.
L'activité de l'eau est un paramètre important lié à la qualité des produits secs. Les valeurs de awsont un indicateur de la possibilité de croissance de micro-organismes et de production de toxines. La valeur de l'activité de l'eau varie entre 0 (produit sec au point que toute l'eau est liée au produit, et donc sans qualité réactive) et 1 (eau pure et sans soluté).
En effet, l’awindique la part de l’eau libre dans un produit, c’est à dire disponible par exemple pour la croissance de micro-organismes. Plus l’awest élevée, plus il y a d’eau disponible pour le développement de ces micro-organismes. Des valeurs d'activité de l'eau supérieures à 0,6 pourraient favoriser la croissance des microorganismes.
Exemples
Exemple 1 : procédé général d’obtention d’un mélange sec levure-bactériophage en séchant en lit d’air fluidisé
Les étapes du procédé :
- contrôle du pH de la crème de levure ou des dérivés de levure et éventuellement ajustement du pH à 7,0 avec de la soude à 10 % ;
- filtration de la crème de levure sur un filtre à plaques sous pression : obtention de levure pressée (LP)
- malaxage de la LP avec la suspension de phages et les agents dessiccant ou protecteurs (aussi appelé excipients de séchage)
- granulation et mise en forme par extrusion
- séchage des granules dans un séchoir à lit d’air fluidisé
- contrôle de l’humidité finale des granules secs et conditionnement sous vide ou sous atmosphère inerte
Ainsi, 16,5 g d’une suspension de phages SalmoFreshTM(0,6 % matière sèche), 2 g de tréhalose dihydraté, 2 g de maltodextrine et 0,065 g de L-Leucine sont ajoutés à 200 g de levure pressée (30 % extrait sec). Après avoir malaxé pendant 1 min dans un batteur mélangeur Alphamix Matfer 5 L équipé d’une palette comme mobile de mélange, 60 g d’amidon (fécule de pomme de terre) sont ajoutés et le mélange est malaxé pendant 1 min. La masse malaxée contenant environ 40 % d’extrait sec est ensuite extrudée sur extrudeuse DRC i10 équipée d’une grille d’extrusion avec des orifices de 1 mm. Les filaments obtenus sont recueillis dans un bécher de 5L et fragmentés manuellement par de fortes secousses. Le séchage est réalisé sur un Fluid Bed Dryer Tornado M501 (Sherwood) équipé d’un support multichambre. 2 x 80 g de granules humides sont placés dans 2 chambres de séchage en verre (de diamètre 60 mm et longueur 400 mm) équipées à leur base d’un tamis inox 250 mesh (entrée air fluidisation). Le programme de séchage est lancé et comprend deux étapes, chacune menée à une température entre 40 et 60°C. L’air de fluidisation et de chauffage est déshydraté par un déshumidificateur d’air (Munters ComDry M190Y).
Le séchage est terminé quand l’extrait sec des granules atteint au moins 94 %. Le conditionnement des granules se fait sous vide pour assurer la meilleure stabilité du produit dans le temps.
Exemple 2 : procédé général d’obtention d’un mélange sec levure-bactériophage en séchant par atomisation
Les étapes du procédé :
- préparation du mélange par ajout de la levure ou des dérivés de levures et, éventuellement, des ingrédients de séchage dans la suspension de phages
- mélange vigoureux jusqu’à dissolution ou dispersion complète de tous les ingrédients
- contrôle du pH du mélange et éventuellement ajustement à 7,0 avec de la soude à 10 %
- séchage du mélange dans une tour d’atomisation
- contrôle de l’humidité finale et conditionnement sous vide ou sous atmosphère inerte de la poudre fine
Ainsi, une suspension d’écorces de levure est partiellement reconstituée en dispersant 75,3 g d’écorces sèches Safmannan® dans 336 g d’eau déminéralisée (préparation 1). Le pH de la suspension d’écorces de levure est éventuellement ajusté à 7,0 par de la soude à 10 %. La préparation 1 est refroidie à une température comprise entre 2 et 10 °C.
Ensuite, 42 g de tréhalose dihydraté et 2,7 g de L-leucine sont dissous à chaud dans 112 g d’eau déminéralisée (préparation 2). Après refroidissement de la préparation 2, 39 g d’une suspension de phages SalmoFreshTM(2,5 % extrait sec) sont ajoutés et mélangés sous forte agitation. Puis ce mélange est ajouté à la préparation 1 sous une forte agitation pour obtenir le mélange à sécher comprenant les phages, les levures ou les dérivés de levures et les différents supports ou ingrédients. Ce mélange est maintenu sous agitation à basse température pendant toute la durée du process.
Le séchage est réalisé sur une tour Mini Spray Dryer B-290 (Büchi) équipée d’une buse bi-fluide à air comprimé, d’une pompe péristaltique, d’un cyclone de séparation des particules sèches de l’air humide et d’un filtre de sortie en polyester. L’équipement est complété par un déshumidificateur d’air (Munters ComDry M190Y) qui traite l’air en entrée de la tour d’atomisation.
Les paramètres opératoires (température et débit d’air, taux d’alimentation de la solution à sécher…) sont ajustés pour sécher les phages dans des conditions ménageantes en les exposant à des températures modérées, ainsi la température de sortie est contrôlée pour ne pas dépasser 60°C.
Le séchage est terminé quand l’humidité de la poudre est inférieure à 6%. La poudre atomisée est conditionnée sous vide.
Exemple 3 : procédé général d’obtention d’un mélange sec levure-bactériophage en séchant par lyophilisation
Les étapes du procédé :
- préparation du mélange par ajout de levures ou dérivés de levure et, éventuellement, d’autres ingrédients dans la suspension de phages
- mélange vigoureux jusqu’à dissolution ou dispersion complète de tous les ingrédients
- contrôle du pH du mélange et éventuellement ajustement à 7,0 avec de la soude à 10 %
- refroidissement et congélation rapide à au moins -20°C
- séchage du mélange congelé dans un lyophilisateur sous pression réduite
- broyage du lyophilisat et contrôle de l’humidité finale
- conditionnement sous vide ou sous atmosphère inerte du produit sec finement divisé.
Ainsi, le pH d’une crème de levure fraîchement récoltée (extrait sec de 21,3%) est ajusté à 7,0 par de la soude à 10 %. Une solution protectrice comprenant les supports ou excipients est préparée : 18,9 g de tréhalose dihydraté, 18,9 g de maltodextrine et 0,63 g de L-leucine sont dissous à chaud dans 51,1 g d’eau déminéralisée. 7,9 g d’une suspension de phages T5 (2,3 % d’extrait sec) sont ajoutés à cette solution protectrice, après son refroidissement. Le mélange est maintenu sous agitation et refroidi. Ce mélange est ajouté à 113 g de la crème de levure précédente, toujours sous agitation et refroidi. Il contient environ 27,4 % d’extrait sec.
Le mélange liquide levure/phages/protecteurs est réparti dans des plateaux ou des flacons en verre de telle façon que la hauteur de couche dans le récipient ne dépasse pas 15 mm. Tous les récipients sont refroidis et congelés rapidement au congélateur à une température ≤ -20°C.
Après congélation de quelques heures, les récipients sont introduits dans un lyophilisateur de laboratoire (Lyovapor L-200 Büchi) dont les étagères et la chambre de lyophilisation auront été préalablement refroidies.
Comme évoqué précédemment, une dessiccation primaire suivie d’une dessiccation secondaire sont mises en route et le process de lyophilisation est arrêté au bout de 80 à 96 h. Les lyophilisats sont finement réduits en poudre de façon douce à l’aide d’un broyeur à mortier et éventuellement passés au tamis à maille 500 µm. L’humidité finale est contrôlée et doit être < 3 %. Un conditionnement sous vide est réalisé rapidement pour éviter l’altération du produit au cours du temps.
Les mélanges utilisés dans les tests décrits ci-après ont été séchés selon l’un des trois procédés décrits en Exemples 1-3.
Dans le cadre des tests de stabilité, les dénombrements ont été réalisés avec la technique des phages en profondeur. Dans le cadre des autres tests, les dénombrements ont été réalisés avec la technique des spots et avec un échantillon de départ qui constitue la dilution 1E-02, la limite de détection de cette méthode est donc de 4 Log (nommé ci-après ND).
Confrontés à des conditions acides, les phages semblent s’inactiver brutalement sous un certain seuil qui se situerait aux alentours de pH 3,5 (Ma et al. 2008, Davis et al. 1985). Une gamme de quatre pH (2.5, 3,0, 3.5, 4,0) a donc été testée pour encadrer ce seuil et analyser l’ensemble du spectre que l’on peut retrouver dans l’estomac à jeûn ou après absorption d’un bol alimentaire (test gastro-résistance en liquide gastrique).
Quel que soit le mode de séchage employé, les bactériophages T5 ou le cocktail de bactériophages SalmoFreshTMconservent une activité tout à fait satisfaisante pour un usage industriel. Des résultats analogues ont été obtenus avec les bactériophages T4 et T7 et le cocktail FOP.
Exemple 4. Test gastro résistance en liquide gastrique avec un mélange issu du co-séchage par atomisation d’une levure S. cerevisiae CNCM I-3856 ou écorces de levures avec le bactériophage T5 ou avec le cocktail de bactériophages SalmoFresh TM
pH 0 30 min 120 min Temps et mélange testé
2,5 ND ND ND Log PFU/G levure CNCM I-3856 + bactériophage T5
3 6,6 5,58 <4
3,5 6,73 6,72 6,09
4 6,55 6,67 6,55
2,5 ND ND ND Log PFU/G bactériophage T5 seul
3 ND ND ND
3,5 ND ND ND
4 6,28 6,15 4,88
Le phage seul en solution est inactivé sous pH4 tandis qu’il est possible de dénombrer les phages co-séchés avec de la levure à partir de pH 3.
A pH 2.5, aucune des formes de phage testées n’est restée active.
A pH 3, les phages T5 co-séchés avec la levure CNCM I-3856 restent actifs pendant au moins 30 min avant de passer sous le seuil de détection.
A pH 3.5, après 2h, une perte en phages T5 co-séchés avec la levure CNCM I-3856 est observée en Log PFU/g plus importante.
A pH 4, les phages T5 co-séchés avec la levure CNCM I-3856 sont dans un environnement plus stable. A noter que la concentration en PFU/g des échantillons peut augmenter entre les temps T0 et T30. Cela est très certainement dû au fait que la poudre (notamment la poudre atomisée) peut former des agglomérats qui ne se dissolvent pas toujours très rapidement.
Les levures des échantillons mis en contact avec le liquide gastrique à pH 2.5 ont été dénombrées au début (T0) puis à la fin (T120) de l’expérience. Les résultats sont similaires sur tous les essais, après 2h dans un environnement acide, la concentration de levure est très faiblement diminuée.
temps 0 120 min
Log CFU/g 9,01 8,91
Exemple 5. Test gastro résistance en liquide gastrique avec un mélange issu du co-séchage par atomisation d’une levure avec le cocktail de bactériophages SalmoFresh TM
pH 0 30 min 120 min Temps et mélange testé
2,5 6,19 5,11 <4 Log PFU/G levure CNCM I-3856 + cocktail bactériophage SalmoFresh™
3 7,72 7,59 5,70
3,5 7,95 8,08 7,63
4 8,03 8,03 7,92
2,5 ND ND ND Log PFU/G cocktail bactériophage SalmoFresh™ seul
3 ND ND ND
3,5 5,90 5,31 ND
4 7,53 6,80 6,19
En comparant les résistances gastrique des solutions de phages seuls (T5 et SalmoFresh™) entre elles, une meilleure survie est observée des phages présents dans la solution SalmoFreshTM. Il est également à noter que la solution de SalmoFreshTMcontient un cocktail de phages et que la sensibilité au pH de chacun des phages le composant peut être différente.
Il est à noter que le co-séchage avec des levures par atomisation permet aux phages de rester actifs pendant 30 min même à pH 2,5 avant de passer sous le seuil de détéction.
A pH 3,0, 3,5 et 4,0, les échantillons restent actifs pendant les 2h de l’expérience.
De même, les levures des échantillons mis en contact avec le liquide gastrique à pH 2,5 ont été dénombrées au début (T0) puis à la fin (T120) de l’expérience. Les résultats sont similaires sur tous les essais, après 2h dans un environnement acide, la concentration de levure est très faiblement diminuée.
temps 0 120 min
Log CFU/g 9,75 9,46
Exemple 6. Test gastro résistance en liquide gastrique avec un mélange issu du co-séchage d’écorces de levure soit avec le bactériophage T5 soit avec le cocktail de bactériophages SalmoFresh TM .
pH 0 30 min 60 min 120 min Temps et mélange testé
2,5 ND ND ND ND Log PFU/G écorces de levure + bactériophage T5
3 7,7’ 7,60 6,57 ND
3,5 8,02 8,33 8,19 7,81
4 8,23 8,43 8,34 8,19

2,5 ND ND ND ND Log PFU/G écorces de levure + cocktail bactériophage SalmoFresh™
3 7,09 8,34 7,79 6,78
3,5 8,67 8,29 7,53 7,25
4 9,09 8,83 8,40 7,41
Ces échantillons ont été réalisés par co-séchage par atomisation. La survie des phages semble identique pour les pH 3,0, 3.5, et 4,0 malgré une acidité plus faiblement neutralisée par les échantillons comparée aux autres essais atomisés utilisant la levure CNCM I-3856.
Il a été observé à pH3 que les phages T5 survivent 60 min et les phages de la solution SalmoFreshTMsurvivent durant les 120 min de l’expérience. L’hypothèse probable est que la poudre obtenue avec ces essais étant encore moins soluble que la poudre atomisée obtenues avec des levures vivantes, la diffusion des phages se ferait plus tardivement, ce qui pourrait participer à leur protection. Cette hypothèse pourrait aussi expliquer pourquoi plus de phages sont dénombrés après 30 min d’exposition comparé aux dénombrements réalisés à T0 min.
Exemple 7. Test de résistance en liquide intestinal avec un mélange issu du co-séchage de levures soit avec le bactériophage T5 soit avec le cocktail de bactériophages SalmoFresh TM
Méthode de séchage 0 30 min 60 min 120 min Temps et mélange testé
Contrôle 6,87 6,95 6,85 6,90 bactériophage T5
Lit fluidisé 6,18 5,78 6,11 6,20 Log PFU/G levure L13 + bactériophage T5
Atomisation 6,92 7,24 7,29 7,37 Log PFU/G levure CNCM I-3856 + bactériophage T5
Lyophilisation 7,58 7,66 7,68 7,75

Contrôle 8,04 8,04 8,10 7,92 cocktail bactériophage seul
Lit fluidisé 6,56 6,39 6,36 6,48 Log PFU/G levure CNCM I-3856 + cocktail bactériophage SalmoFresh™
Atomisation 8,34 8,57 8,68 8,70
Lyophilisation 8,01 8,05 8,15 8,19
Les tests de résistance intestinale reposent sur le même principe que les tests gastriques, à la différence que seul un pH est testé (pH 6,8). Il en ressort qu’il n’y a pas d’incidence sur la survie des phages ou des levures du liquide intestinal.
temps 0 120 min Mélange testé
Log CFU/g 8,79 8,70 levure CNCM I-3856 + bactériophage T5
Log CFU/g 9,40 9,57 levure L47 + cocktail bactériophage SalmoFresh™
Exemple 8. Test potentiel d’alcalinisation
Pour déterminer quels ingrédients des formulations avaient cet effet d’alcalinisation qui permet de protéger les phages dans un mileu acide, cinq échantillons ont été réalisés tous composés de 1% de phages de SalmoFreshTM en MS(matière sèche)/MST(matière sèche totale) et 99% d’un seul excipient utilisé. 0,5g de ces échantillons a été mis en contact avec 50ml de liquide gastrique à pH 2,5. Après dissolution des poudres, le pH a été mesuré.
Les échantillons séchés avec la levure et la L-leucine ont provoqué des variations de pH significatives. Avec un pH mesuré à 3,59, l’échantillon avec de la levure a même permis de dépasser le seuil d’inactivation de 3,5. Il est possible d’observer que c’est la levure qui constitue le support de séchage le plus efficace et donc qui est présente en quantité significative dans les différentes formulations contrairement à la L-leucine.
Séchage Phages séchés Formule pH apres ajout dans 50ml de SGF à pH 2,5
Lyophilisation
 SalmoFresh™
 L-leucine 3,40
Tréhalose 2,50
maltodextrine 2,48
fécule 2,49
levure 3,59
Exemple 9. Test résistance aux rayons UV
0 5 min 15 min 30 min Temps et mélange testé
6,22 5,06 ND ND Log PFU/G bactériophage T5 seul (contrôle)
6,54 6,51 5,90 5,55 Log PFU/G levure CNCM I-3856 + bactériophage T5
8,03 8,03 7,92
8,75 ND ND ND Log PFU/G cocktail bactériophage SalmoFresh™seul
6,27 5,88 5,90 5,70 Log PFU/G levure CNCM I-3856 + cocktail bactériophage SalmoFresh™
temps 0 30 min Mélange testé
Log CFU/g 9,41 9,29 levure CNCM I-3856 + bactériophage T5
Log CFU/g 9,50 9,57 levure CNCM I-3856 + cocktail bactériophage SalmoFresh™
Les phages en solution et les phages co-séchés par atomisation avec de la levure ont été exposés aux UV-C pendant 30 min avec des points à 0, 5, 15, 30 minutes pour dénombrer les phages. Les dénombrements sont réalisés par spot comme pour les tests de gastrorésistance et avec les mêmes échantillons. La première dilution disponible étant la dilution 1E-01 (venant de la réhydratation au Stomacher) la limite de détection de la technique est de 3 Log.
Il est possible d’observer que les phages en solution (T5 et phages de SalmoFresh™) sont très sensibles aux UV-C. Les phages de la solution SalmoFresh™ne sont plus actifs dès 5 min d’exposition et les phages T5 ne résistent que 5 min. A l’inverse, les phages co-séchés avec de la levure ne sont que très légèrement affectés par les UV-C.
Le dénombrement des levures avant et après 30 min d’exposition a permis de démontrer que pour toutes les configurations testées, l’exposition aux UV-C n’avait aucune incidence sur leur survie
Exemple 10. Test stabilité dans le temps
Des tests de stabilité sur 3 mois ont été réalisés à 25°C/60%HR , 30°C/65%HR et 40°C/75%HR sur les échantillons co-séchés par atomisation. L’aw(activité de l’eau) et la perte de phages ont été mesurés en début (T0 jour) au milieu (T30 jours) et en fin (T90 jours) d’expérience.
Temps et conditions 0 30 j 90 j Mélange testé
25°C/60%HR 8,35 7,24 6,63 Log PFU/GS. boulardii+ bactériophage T5
30°C/65%HR 8,35 7,12 6,23
40°C/75%HR 8,35 6,51 6,23
25°C/60%HR 8,83 8,54 8,37 Log PFU/GS. boulardii+ cocktail bactériophage SalmoFresh™
30°C/65%HR 8,83 8,52 8,19
40°C/75%HR 8,83 8,17 6,93
0 30 j 90 j temps
25°C/60%HR 0,05 0,07 0,09 aw S. boulardii+ bactériophage T5
30°C/65%HR 0,05 0,06 0,08
40°C/75%HR 0,05 0,07 0,18
25°C/60%HR ND 0,07 0,09 aw S. boulardii+ cocktail bactériophage SalmoFresh™
30°C/65%HR ND 0,06 0,08
40°C/75%HR ND 0,08 0,19
Les valeurs très faibles d’awindiquent que la part de l’eau libre dans le produit obtenu est très faible, suffisamment pour empêcher la croissance des microorganismes et donc pour assurer la stabilité du produit dans le temps.

Claims (19)

  1. Procédé de fabrication d’un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage, ledit mélange se présentant sous forme d’entités solides, chaque entité solide étant composée d’au moins une levure et/ou au moins un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage et éventuellement au moins un excipient de séchage,
    ledit procédé étant caractérisé en ce qu’il est effectué par le mélange d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage en suspension et le séchage de ce mélange.
  2. Procédé de fabrication d’un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage, ledit procédé étant caractérisé en ce qu’il comprend :
    - fournir au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure, de préférence sous forme de crème et au moins un bactériophage en suspension ;
    - mélanger ladite au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure avec ledit au moins un bactériophage de manière à former un mélange;
    - effectuer une étape de séchage du mélange de manière à former un mélange sec ;
    - récupérer le mélange sec.
  3. Procédé selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l’étape de séchage s’effectue par lyophilisation ou atomisation ou sur lit d’air fluidisé.
  4. Procédé selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l’étape de séchage s’effectue en présence d’un excipient de séchage, de préférence la maltodextrine.
  5. Procédé selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la levure est issue d’une souche choisie parmi les espècesS accharomyces cerevisiaeetS accharomyces boulardi i, de préférence la levure est issue d’une souche choisie parmi la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée le 17 octobre 2007 sous le numéro CNCM I-3856, la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée le 22 mars 2018 sous le numéro CNCM I-5298 et la souche deSaccharomyces boulardiidéposée le 21 aout 2007 sous le numéro CNCM I-3799.
  6. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le ou les bactériophages sont choisis parmi ceux ayant une activité antibactérienne contre des souches de bactéries choisies parmiE scherichia coli, Listeria monocytogenes , Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringensou des souches du genreSalmonella.
  7. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les dérivés de levure sont des écorces de levure.
  8. Mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage, caractérisé en ce qu’il se présente sous forme d’entités solides, chaque entité solide étant composée d’au moins une levure et/ou au moins un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage et éventuellement au moins un excipient de séchage.
  9. Mélange sec selon la revendication 8, caractérisé en ce que les entités solides se présentent sous forme de paillettes, de grains, de vermicelles ou de granules.
  10. Mélange sec selon l’une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que la levure est issue d’une souche choisie parmi les espècesSaccharomyces cerevisiaeetSaccharomyces boulardii, de préférence la levure est issue d’une souche choisie parmi la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée le 17 octobre 2007 sous le numéro CNCM I-3856, la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée le 22 mars 2018 sous le numéro CNCM I-5298 et la souche deSaccharomyces boulardiidéposée le 21 aout 2007 sous le numéro CNCM I-3799.
  11. Mélange sec selon l’une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que le ou les bactériophages sont choisis parmi ceux ayant une activité antibactérienne contre des souches de bactéries choisies parmiE scherichia coli, Listeria monocytogenes , Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringensou des souches du genreSalmonella .
  12. Mélange sec selon l’une des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que les dérivés de levure sont des écorces de levure.
  13. Mélange sec selon l’une des revendications 8 à 12 pour utilisation comme médicament.
  14. Mélange sec selon l’une des revendications 8 à 12 pour utilisation dans le traitement de l’acidité du jus gastrique.
  15. Mélange sec selon l'une des revendications 8 à 12 ou mélange sec obtenu à partir du procédé selon l'une des revendications 1 à 7 pour utilisation dans une composition pour le traitement de l'acidité du jus gastrique.
  16. Utilisation du mélange sec selon l’une des revendications 8 à 12 ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon l’une des revendications 1 à 7 dans une composition pour la stimulation, la protection, le biocontrôle et/ou la nutrition des plantes.
  17. Utilisation du mélange sec selon l’une des revendications 8 à 12 ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon l’une des revendications 1 à 7 dans une composition alimentaire ou dans un complément alimentaire.
  18. Utilisation du mélange sec selon l’une des revendications 8 à 12 ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon l’une des revendications 1 à 7 en brasserie et/ou en œnologie.
  19. Utilisation du mélange sec selon l’une des revendications 8 à 12 ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon l’une des revendications 1 à 7 en panification.
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