FR3062396A1 - Composition de metabolites issus de la fermentation d'ingredients bio-sources a partir de microbiotes de centenaires ayant des proprietes anti-inflammatoires et d'augmentation de l'activite mitochondriale - Google Patents

Abstract

Procédé de fermentation destiné à produire des métabolites possédant des propriétés anti-inflammatoires et d'augmentation de l'activité mitochondriale caractérisée en ce que les bactéries utilisées pour la culture sont extraites de microbiotes d'individus centenaires en bonne santé. Le procédé se déroule en plusieurs étapes pour une durée totale d'au moins 120 heures comprenant une stérilisation préalable des ingrédients fermentés, une inoculation des bactéries et une culture du mélange à une température comprise entre 30°C à 45°C. Les ingrédients fermentés sont d'origine bio-sourcée uniquement et sont obtenus sans utilisation de pesticides.

Description

Titulaire(s) :

NINAPHARM.

O Demande(s) d’extension :

(® Mandataire(s) : NINAPHARM.

FR 3 062 396 - A1 (54) COMPOSITION DE METABOLITES ISSUS DE LA FERMENTATION D'INGREDIENTS BIO-SOURCES A PARTIR DE MICROBIOTES DE CENTENAIRES AYANT DES PROPRIETES ANTI-INFLAMMATOIRES ET D'AUGMENTATION DE L'ACTIVITE MITOCHONDRIALE.

(57) Procédé de fermentation destiné à produire des métabolites possédant des propriétés anti-inflammatoires et d'augmentation de l'activité mitochondriale caractérisée en ce que les bactéries utilisées pour la culture sont extraites de microbiotes d'individus centenaires en bonne santé. Le procédé se déroule en plusieurs étapes pour une durée totale d'au moins 120 heures comprenant une stérilisation préalable des ingrédients fermentés, une inoculation des bactéries et une culture du mélange à une température comprise entre 30°C à 45°C. Les ingrédients fermentés sont d'origine bio-sourcée uniquement et sont obtenus sans utilisation de pesticides.

La présente invention a pour objet un procédé de fermentation destiné à produire des métabolites possédant des propriétés antiinflammatoires et d'augmentation de l'activité mitochondrial caractérisé en ce que les bactéries utilisées pour la culture sont extraites de microbiotes d'individus centenaires en bonne santé. Le procédé se déroule en plusieurs étapes pour une durée totale d'au moins 120 heures comprenant une stérilisation préalable des ingrédients fermentés, une inoculation des bactéries et une culture du mélange à une température comprise entre 30°C à 45°C. La présente invention a également pour objet une composition cosmétique ou pharmaceutique contenant les métabolites issus du procédé de fermentation pour leurs propriétés anti-inflammatoires et d'augmentation de l'activité mitochondriale.

On sait que l'être humain dans sa volonté de rester en bonne santé plus longtemps et de prolonger sa durée de vie essaie de comprendre le mieux qu'il peut les mécanismes de vieillissement de l'organisme. Ces mécanismes sont complexes et ne sont actuellement pas tous complétements élucidés. Le vieillissement de l'organisme est décrit par des modifications fonctionnelles de l'organisme se traduisant par une diminution progressive de ses aptitudes et fonctions vitales. Ce processus est naturel et est présent chez chaque être humain. Cependant, il peut être accéléré ou renforcé par les divers stress subis au long de la vie. Les processus de vieillissement de l'organisme sont notamment étroitement liés à un déséquilibre de la balance oxydante. Une surproduction d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) par les mitochondries et une baisse des défenses anti-oxydantes provoque ce déséquilibre. Ce déséquilibre a pour conséquence l'endommagement des mitochondries et la diminution de leur activité. Les mitochondries endommagées n'assurent plus leur rôle ce qui a pour effet d'intensifier le processus qui modifie progressivement avec l'âge l'organisme. Les conséquences de-1'élévation du stress oxydatif avec l'âge sont en particulier le vieillissement cellulaire, la diminution des fonctions de l'organisme et l'augmentation de l'incidence de pathologies. Le stress oxydatif est également très lié avec les phénomènes d'inflammation chronique. L'inflammation survient dans le cas d'une infection ou d'une blessure pour lutter contre les agents pathogènes, c'est un mécanisme vital. Dans le cas d'inflammation, des médiateurs chimiques pro-inflammatoires sont produits par les cellules immunitaires. Lors d'irritation prolongé l'inflammation devient chronique ce qui endommage les tissues de l'organisme à long terme. Cette irritation peut également être induite par divers facteurs extérieur tels que la pollution, le stress, le tabac ou l'alimentation. Le système immunitaire qui devient moins efficace avec l'âge perd de sa capacité à gérer les réponses immunitaires. L'inflammation chronique a tendance à augmenter d'abord sans symptômes apparent mais joue un rôle central dans le vieillissement de l'organisme. Les mitochondries est leur activité sont touchés par les mécanismes inflammatoires. Les mitochondries ont un rôle central dans l'organisme en fournissant l'énergie nécessaire à en l'organisme. Leur bon fonctionnement protège l'organisme contre le vieillissement et l'obésité notamment. Il est donc primordial de les protéger. La structure des mitochondries provient originalement d'une bactérie qui se serait intégré à une cellule eucaryote ancestrale par endosymbiose. Les mitochondries et les bactéries partagent une structure et un mode de reproduction similaire. La mitochondrie possède un génome à ADN sur un chromosome circulaire, dont les gènes ressemblent à ceux portés par les bactéries. Il est à noter que les bactéries ont un rôle très important dans l'organisme par le biais des microbiotes. Le microbiote est défini comme l'ensemble des microorganismes c'est à dire bactéries, levures, champignons ou virus vivant dans un environnement spécifique appelé le microbiome chez un hôte. De nombreux microbiotes existent chez 1'Humain et en particulier le microbiote intestinal. Le microbiote intestinal est plus connu sous le nom flore intestinale. Le microbiote intestinal est constitué de l'ensemble des microorganismes vivant dans l'intestin. L'Humain en possède environ 100 000 milliards. Le microbiote regroupe le génome des différentes espèces qui le colonises c'est le métagénome. La colonisation de l'organisme par les microorganismes formant le microbiote provient essentiellement du microbiote vaginal maternel qui à la naissance va coloniser la peau. Le microbiote sera complété par celui du lait maternel lors de l'allaitement et par l'environnement de l'individu tout au long de sa vie. Plus le microbiote est diversifié espèce particulière et pathogène est limitée. Cela constitue une protection contre les inflammations et infections. Le microbiote est une découverte récente, sa compréhension est sujette à de nombreuses études. Le microbiote fonctionne comme un écosystème possédant un équilibre entre bactéries bénéfiques et bactéries néfastes. Le microbiote permet notamment d'assimiler certains aliments que seules les bactéries savent dégrader, de réguler l'expression de certains de nos gènes. Un déséquilibre du microbiote est appelé dysbiose et peut mener à de nombreuses maladies telles que dans l'obésité, le diabète, les allergies, la dépression, les troubles cardiovasculaires. Des infections virales, bactériennes ou parasitaires, un changement brutal d'environnement ou d'alimentation, un déficit immunitaire, certains médicaments et en premier lieu les antibiotiques peuvent mener à un dysbiose. Des études ont récemment montré que le microbiote communiquait avec les mitochondries par le biais des métabolites et était apte à moduler l'expression génétique des protéines nécessaires au fonctionnement des mitochondries et aussi à moduler directement leur activité. Par ce biais, le microbiote est impliqué également dans le processus de vieillissement (Caroline Heintz and William Mair, You Are What You Host: Microbiome Modulation of the Aging Process, Cell 156, January 30, 2014 Elsevier Inc.). En effet, les personnes âgées et plus particulièrement les individus centenaires ont démontré posséder un microbiote différent contenant des espèces de bactéries non présentes dans le microbiote d'individus classiques. Ces microbiotes de personnes centenaires produisent des métabolites avec des propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires qui contribuent au maintien de la bonne santé de la personne et à sa longévité (Elena Biagil, Lotta Nylund, Marco Candela, Rita Ostan, Laura Bucci, Elisa Pini, Janne Nikkla, Daniela Monti, Reetta Satokari, Claudio Franceschi, Patrizia Brigidi, Willem De Vos, Through Ageing, and Beyond: Gut Microbiota and Inflammatory Status in Seniors and Centenarians, PLoS ONE, May 2010, Volume 5, Issue 5, el0667) . Une solution pour bénéficier des bienfaits du microbiote centenaire et prévenir les effets du vieillissement serait d'effectuer une transplantation de microbiote d'un individu centenaire sur un autre individu. La transplantation de microbiote consiste en l'introduction d'une suspension de matières fécales d'un individu sain c'est-à-dire possédant un microbiote varié dans l'intestin de l'individu cible. La transplantation du Microbiote Fécal (ou TMF) est souvent utilisée à des visées curatives chez des patients souffrants de dysbiose. Le microbiote fécal est utilisé car il est directement relié au microbiote intestinal qui n'est pas disponible directement au prélèvement. L'échantillon fécal du donneur recueillis le jour du transplant est dilué dans une solution telle que l'eau ou le lait. Afin d'éviter l'administration orale, la solution obtenue est transplanter à l'aide de différentes types de sondes gastrique. Cependant, cette technique suscite un fort dégoût tant chez la personne traitée que chez le médecin. La TMF s'applique à partir d'un seul donneur sur l'intégralité de son microbiote fécal. Ses effets sont donc très dépendants de l'état du microbiote du donneur et des espèces le composant. En effet, le donneur peut être sain tout en possédant des espèces nocives pour le receveur. Une fois dans l'intestin de l'individu cible, les micro-organismes issus de la TMF viennent compléter le microbiote du receveur et éventuellement combler un déséquilibre ou lui apporter des espèces manquantes bénéfiques. Ces micro-organismes sont exposés à l'ensemble du bol alimentaire du receveur c'est-à-dire à tout ce que l'individu consomme. Un déséquilibre du microbiote intestinal peut être le résultat d'un déséquilibre alimentaire : un régime trop riche en viandes, en sucres, en graisse ou en féculents par exemple. Dans ce cas, l'efficacité de la transplantation peut être limitée ou être efficace seulement sur une courte période. De plus, la TMF pose comme problème le fait que cette technique coûte cher, qu'elle est compliquée à réaliser et qu'elle nécessite une intervention médicale. Cela explique que son utilisation est peu répandue.

C'est en étudiant les propriétés de ces espèces de bactéries particulière aux individus centenaires que la demanderesse a découvert de manière tout à fait inattendue que les problèmes liés à la TMF peuvent être améliorés en même tant que les problèmes d'inflammation et de perte d'activité mitochondriale facilement par l'utilisation de métabolites issu de le fermentation par des bactéries

extraites	de	microbiotes	d'individus	centenaires en	bonne santé.
Pour	se	faire, la	demanderesse	a	développé	un protocole de
collecte	des	bactéries	du microbiote	d'individus	centenaires. La
collecte	des	bactéries	s'effectuent	à	partir du	microbiote fécal

d'individu d'âge compris 90 entre 110 ans. Les donneurs suivent une alimentation de type méditerranéenne et n'ont jamais eu de pathologie digestive au cours de leur vie. Les donneurs ne doivent pas avoir reçu d'antibiotiques pendant une durée d'au moins trois mois avant le prélèvement. Afin d'éviter la réduction du nombre de bactéries dû à la chute du pH après collecte lés échantillons doivent être traité et mis en culture au maximum une heure après la collecte. Les échantillons sont collectés puis mélangé à 20% à un tampon salin phosphaté à pH 7 et à une concentration de 1 mol/L. Après centrifugation, le surnageant est collecté. Le surnageant est mis en culture en présence d'agent stimulant la croissance bactérienne. Les bactéries de la culture sont utilisées dans un procédé de fermentation. L'objet de la présente invention est défini comme un procédé de fermentation destiné à produire des métabolites possédant des propriétés anti-inflammatoires et d'augmentation de l'activité mitochondriale caractérisé en ce que les bactéries utilisées pour la culture sont extraites de microbiotes d'individus centenaires en bonne santé.

La demanderesse a effectué ses études à partir de 15 sujets centenaires en bonne santé. Les espèces en commun au microbiote de tous les sujets sont attribuées comme étant les espèces responsables de la santé et de la longévité des patients. Ces espèces possèdent les propriétés anti-inflammatoires et d'augmentation de l'activité mitochondrial les plus efficaces. Les espèces ont été identifiées par PCR puis séquençage de l'ARNr 16s. La PCR ou réaction en chaîne par polymérase est une technique d'amplification de fragments d'ADN in vitro. L'amplification de l'ADN permet un séquençage plus facile et une meilleure identification des espèces. L'ARNr 16s est un fragment d'ARN que possèdent toutes les espèces de bactéries avec des variations de séquence caractéristiques à chaque espèce. Les séquences obtenues pour les microbiotes des patients sont comparés à une banque de données de séquence ribosomale. Les échantillons utilisés contiennent donc au moins Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis,

Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus Jensenii, Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei, Lactobacillus gasseri, Lactobacilllus reuteri, Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, Lactobacillus helbeticus, Lactococcus lactis, Lactobacillus casei subsp. Casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Delbrueckii, Enterococcus faecium et Steptcoccus thermophiles. Cette sélection permet de maîtriser les espèces utilisées pour la fermentation et donc de contrôler leurs nombres, leurs concentrations et leurs propriétés. Il est également possible de sélectionner les bactéries présentant des propriétés intéressantes de plusieurs individus différents. L'objet de la présente invention est défini aussi comme un procédé de fermentation caractérisé en ce que les micro-organismes utilisés pour la culture comprennent les bactéries communes aux microbiotes des individus centenaires étudiés et sont sélectionnées par PCR puis séquençage de l'ARNr 16s. La demanderesse décrit ci-dessous un procédé de fermentation lente en plusieurs étapes. Les ingrédients fermenté utilisées sont d'abord trempés puis stérilisés à haute température. Cette opération permet , d'éliminer les germes et bactéries potentiellement présents à leur surface afin d'assurer un meilleur contrôle de la fermentation. Les ingrédients fermentés sont mis en culture avec les bactéries issues de microbiote d'individu centenaire collectées comme décrit précédemment à température comprise entre 30°C à 45°C pendant au moins 3 jours. Le résultat ainsi obtenu est une nouvelle fois stérilisé à haute température afin de supprimer les bactéries de la culture. Le produit final de la fermentation est obtenu après filtration et séchage à 40°C pendant 24h. La durée totale du procédé est d'au moins 120 heures. Le résultat obtenu est un mélange d'au moins 200 types de métabolites différents. Ils sont soient créés par la fermentation lente soient leur concentration a été amplifiée lors de ce processus. La fermentation préalable à l'extérieur permet d'éviter le contact direct entre l'échantillon fécal et l'individu. Ce procédé permet de choisir à la fois les espèces de bactéries utilisées pour la fermentation et le substrat de fermentation. On obtient un produit final pratique à la consommation tout en conservant les propriétés des métabolites issus des bactéries de microbiote centenaire avec des conditions contrôlées L'objet de la présente invention est donc en plus caractérisé en ce que le procédé de fermentation se déroule en plusieurs étapes pour une durée totale d'au moins 120 heures comprenant une stérilisation préalable des ingrédients fermentés, une inoculation des bactéries et une culture du mélange à une température comprise entre 30°C à 45°C.

Les ingrédients fermentés utilisé lors du procédé sont tous d'origine bio-sourcée et comestibles c'est-à-dire l'ensemble des végétaux tel que les fruits, les légumes et les algues et également certains composés d'origine animale telle que le lait. Les ingrédients fermentés peuvent être par exemple sans que cela ne soit limitatif les fruits, les feuilles ou les fleurs de Figues, d'Olive, de Romarin, de Thym, de Haricot, de Sauge, de Melon, de Grenade, de Soja, de Pastèque, de Choux, Thé vert ou noir. Les matériaux sont sélectionnés pour être cultivés sans utilisation de pesticides. Un mélange de plusieurs matériaux sans limite de nombre ou un seul peut être utilisé pour la fermentation. Cette liberté de choix de substrat de fermentation permet de sélectionner uniquement des ingrédients favorables à la diversité du microbiote. La variation des ingrédients fermentés va avoir une conséquence sur la composition finale en métabolites et une modification de leur concentration, de leur biodisponibilité. Il est à noter que toutes les compositions fermenté par ledit procédé ont en commun au moins 200 types de métabolites différents avec concentrations variables. Selon l'utilisation désirée, les ingrédients seront choisis pour leur capacité à produire par fermentation les métabolites appropriés. L'avantage de sélectionner un ou plusieurs ingrédients est d'éviter la fermentation in-vivo dans l'estomac de l'intégralité du bol alimentaire et la diminution de la production de métabolites fonctionnels dû à la présence d'aliments infavorable à la fermentation comme des aliments gras. Le procédé de fermentation est donc finalement caractérisé en ce que les ingrédients fermentés sont d'origine bio-sourcée uniquement et obtenus sans utilisation de pesticides.

Les produits de fermentation obtenus sont utilisés dans des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques.

Pour la clarté des explications qui suivent nous décidons d'appeler Centibiota une composition cosmétique ou pharmaceutique contenant des métabolites produits par le procédé décrit ici issus de la fermentation de un ou plusieurs ingrédients bio-sourcé par des bactéries extraites de microbiotes d'individus centenaires en bonne santé pendant au moins 120 heures.

Les compositions Centibiota grâce à leurs propriétés possèdent plusieurs utilisations cosmétiques et pharmaceutiques. Les métabolites de Centibiota ont une taille moyenne comprise entre 100

Da et .200 Da ce qui leur permet d'être facilement assimilé par l'organisme sans être endommagés par la digestion. Ils vont donc interagir avec l'organisme, les mitochondries et le microbiote de l'individu. La mitochondrie est un organite central de la cellule eucaryote. Elle est la seule partie des cellules animales à posséder son propre ADN, en plus du noyau. La mitochondrie est le lieu de la respiration cellulaire. Elle convertit grâce aux enzymes ATP synthases les molécules organiques issues de la digestion en énergie directement utilisable par la cellule, l'ATP molécule énergétique. L'ATP est la réserve d'énergie de la cellule. Le processus de respiration cellulaire dans la mitochondrie s'appelle le cycle de Krebs. La production d'ATP diminue parallèlement à l'augmentation des radicaux libres et l'oxydation des mitochondries.

L'objet de la présente invention concerne donc en particulier des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques contenant Centibiota utilisées pour l'augmentation de l'activité mitochondriale en ce qu'elle module la chaîne respiratoire de la mitochondrie et augmente l'énergie produite.

Il existe de nombreux marqueurs pro-inflammatoires dans l'organisme qui sont sécrétés en réponse à certaines réactions immunitaires. Parmi eux, on peut citer la super famille des interleukines. En particulier, l'interleukine IL-18 est une cytokine pro-inflammatoire produite par les macrophages en réponse à une infection microbienne et notamment en réponse aux stimuli des Lipopolysaccharide. Les Lipopolysaccharide ou LPS sont un des composants majeurs de la face externe de la membrane des bactéries pathogènes. Les LPS induisent une forte inflammation. Le sulfure d'hydrogène, H2S, est un composé toxique provoquant des irritations et inflammation. Il est excrété par exemple par la décomposition de la matière organique par les bactéries.

Rappelons que le stress oxydatif est causé par des espèces appelé dérivé réactif de l'oxygène (ROS). Les ROS lorsqu'ils sont présents en trop forte quantité dans l'organisme vont oxyder les molécules et protéines clés des tissus. Par exemple, les lipoprotéines de basse densité (LDL) transportent le cholestérol dans le sang sont des cibles privilégiées de l'oxydation. Un taux élevé de LDL oxydés est un des marqueurs importants de stress oxydatif. La peroxydation des lipides c'est-à-dire l'oxydation des lipides insaturés par des espèces radicalaires de l'oxygène est un autre marqueur important du stress oxydatif. L'organisme possède un mécanisme de défense contre le stress oxydatif. Notamment, la superoxyde dismutases (SOD) est une protéine possédant une activité enzymatique. Elle catalyse la dismutation du superoxyde en dioxygène et peroxyde d'hydrogène. De même le glutathion peroxydase (GPx) assure la transformation des hydroperoxydes organiques. Les métabolites de Centibiota ont la capacité de réguler la production de radicaux libre à la source ce gui permet d'éviter le stress oxydatif. Le mécanisme de défense contre le stress oxydatif est donc moins sollicité, la production de protéines antioxydantes diminue. Les mitochondries ont plus d'énergie disponible et l'organisme est soulagés et peut fonctionner normalement et se défendre contre d'autres menaces. Centibiota aide à diminue les facteurs d'inflammation et d'oxydation et soutient le système de défense de l'organisme contre le stress oxydatif. En particulier, l'objet de la présent invention concerne des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques contenant Centibiota utilisées pour maintenir un taux normal de marqueurs inflammatoires et de stress oxydatif, maintenir la bonne santé de l'individu, diminuer le risque d'inflammation et de stress oxydatif en ce qu'elle diminue l'inflammation des tissus et le stress oxydatif et réduit la concentration plasmique en Lipopolysaccharide, en Interleukine IL-18 et en Sulfure d'hydrogène.

Les utilisateurs de Centibiota ont déclaré constater une diminution des fréquences d'infection ainsi qu'une diminution des symptômes de dysbiose tels que maux de ventre, troubles de la digestion, crampes, diarrhées et inflammations. Centibiota agit comme substitut à la production normale de métabolites du microbiote intestinal lui permettant de se rétablir. Grâce à une bonne diversité du microbiote le développement de micro-organisme pathogène est ralenti. Centibiota est utilisé pour la contribution au maintien de l'équilibre du microbiote en ce qu'elle limite le risque de la colonisation des tissus notamment le tractus intestinal par des agents pathogène et promeut le développement des bonnes bactéries.

Lors de l'alimentation, l'organisme stocke l'énergie dont il n'a pas besoin et notamment les lipides. La combustion des lipides fournit de l'énergie sous forme d'ATP. Le mécanisme de brûlage des graisses est dépendant de l'activité mitochondriale. Ainsi, les utilisateurs de Centibiota ont ressentis une perte de masse graisseuse et ont déclaré se sentir en meilleur forme. L'objet de la présente invention est définit comme pouvant s'utiliser pour la contribution à la santé globale de l'individu en ce qu'elle promeut le brûlage des graisses et réduit le stockage des lipides.

Le produit final obtenu après filtration se présente sous la forme d'un liquide. Il peut être soit séché, soit être utilisé tel quel. Il est à utiliser directement seul pour des applications à haute concentration ou en mélange avec d'autres liquides ou additifs dans des produits à une seule phase ou à phases multiples avec en présence de tensioactifs. La création de mélange contenant divers types d'émulsion selon les propriétés stériques et électromagnétiques du ou des tensioactifs en solution. Dans le cas où le produit final est séché, une poudre est obtenue. Cette poudre est utilisé soit telle quelle ou en mélange dans des formulations sèches. Ces propriétés permettent aux compositions de types Centibiota une grande variété de mise en forme accessible selon l'utilisation souhaitée. La composition cosmétique ou pharmaceutique contenant Centibiota se présente sous la forme d'une émulsion huile dans eau ou eau dans huile, d'émulsion multiple, de microémulsion, de nano-émulsion, d'émulsion à phase gémellaires, d'émulsion PIT, de dispersion stable de deux phases non miscibles au moyen de gélifiant, de dispersion stable de deux phases non miscibles au moyen d'un ou plusieurs tensioactifs, d'un liquide, de gel aqueux, de gel gras, de gel hydroalcoolique, de phase grasse, de suspension, de solution moussante ou non, de gel, d'émulsion lyophilisée ou de poudre.

Selon la mise en forme choisie et les propriétés de la formulation finale, Centibiota peut être inclus dans diverses compositions cosmétiques et pharmaceutiques pour les utilisations citées précédemment. Centibiota se présente sous la forme de liquides, mousses, pâtes, boisson prête à l'emploi, lotions, émulsions, huiles, gels, sirops, solides, poudres, masques, stick, comprimés, capsules, sprays, aérosol, gélules, gelées, sirops, crèmes, patches, gels douche, shampoings.

Ces compositions sont soit consommées par voie oral soit appliquées par voie topique. De plus, la voie orale et la voie topique peuvent être utilisées conjointement, successivement ou séparément selon les utilisations souhaitées.

La demanderesse va maintenant donner à titre d'exemple des études sur des compositions suivant l'objet de l'invention ainsi que des exemples de formulations sans que ces exemples ne soient limitatifs. Rappelons que pour la clarté des explications qui suivent nous décidons d'appeler Centibiota une composition cosmétique ou pharmaceutique contenant des métabolites produits par le procédé décrit ici issus de la fermentation de un ou plusieurs ingrédients bio-sourcé par des bactéries extraites de microbiotes d'individus centenaires en bonne pendant au moins 120 heures.

Exemple 1 : Listes des métabolites

Les différents types de compositions Centibiota comme cités dans la présente invention ont été analysés par chromatographie HPLC. L'analyse des résultats a démontré que les compositions Centibiota formulés avec différents ingrédients fermentés contiennent tous au moins en commun les métabolites suivants : glycine, acetoacetamide (3-oxobutanamide), l-amino-2-propanol, galactosamine (chondrosamine), alanine, palmitoylethanolamide, L-noradrenaline glucosamine, serine stearoylethanolamide, cyclohexylamine mannosamine, acide proline pyroglutamique, acétylcholine, acetylglucosamine, baline, acide 5aminolevulinique, phytosphingosine, ethylglucuronide, treonine, Nacetyl-B-aranine, oleoylethanolamine, acide D-glucuronique, Lcystéine, acide N- acetyl-L-aspartique, cadavérine, sucroseëphosphate, acide isoleucine N-carbamoyl-L-aspartique, Nacetylputrescine, eleutheroside E, leucine, acide N- acetylglutamique, N8-acetylspermidine, acide myoinositol diophosphate aspartique, 2methylserine, 3,5-dihydroxy-4-hydroxy-acetophenone, acide phytique, lysine, N-methylproline, sphingenine (sphingosine), methylthioadenosine, acide L-glutamique, thioproline, acide cholique(coralyne), uridine diphosphate glucose, L-methionine, 0acetyl - L- serine, acide glycodeoxycholique, xanthine, histidine, N6methyllysine, androstane-3,17-diol, 7-methylguanine, phenylalanine, L-theanine, campesterol thiamine, arginine, acide D-glucosamique, sitosterol thiamine, monophosphate, tyrosine, carboxyméthyl-lysine, cycloarténol, riboflavine, tryptophane, 5-hydroxy-L-tryptophane, sphingomyéline, nicotinamide (niacinamin), glutathione disulfide, acide 2-azetidinecarboxylique, acide hexanoique, acide nicotinique (niacin), glutathione (GHS),acide glycochenodeoxycholique, acide octanoique, acide pantothenique, 4-hydroxy-L-proline, O-succinyl-Lhomosérine, trilaurine, pyridoxine, L-asparagine, D-alanyl-D-alanine, acide citraconique, pyridoxamine, L-glutamine, cystathionine, acide glutaconique, acide glutarique, L-citrulline, acide ophthalmique, dihydrotachystérol, acide pelargonique, β-alanine, glutamylglycine, α-tocopherol, acide α-lipoique, acide Y-aminobutyrique, S-Dlactoylglutathione, acetate de tocopherol, acide malronique, bétaine, N-acetyl-L-leucine biotine, trigonelline, L-homosérine, acide 2aminobutanoique, acide palmitoléique, lobéline, ornithine, acide

5-aminovalerique, acide linolénique, papavérine, choline, acide L2,4-diaminobutyrique, acide linoleique, acide imidazoleacetique, putrescine, acide L-pipecolique, acide oléique, acide imidazolelactique, spermidine, acide 6-aminohexanoique, acide ricinoléique, imazaquine, spermine, stachydrine (proline bétaine), acide Y-homolinolénique, indole-3-carboxaldehyde, tyramine, acide guanidobutyrique (acide Y-guanidobutyrique), acide icosadiénoique, lumichrome, D- glucose-l-phosphate L-carnitine, acide 11-oicéicosanoique, acide 5-Oxo2-tetrahydrofurane, glucose-6-phosphate, 5hydroxylysine, acide érucique, acide chélidonique, fructose-6phosphate, méthionine sulfoxide, acide linolélaidique, acide méthyl kojique, cytosine 3-méthylhistidine, acide laurique, pyridine, cytidine, N-acetylornithine, acide myristique, acide 4-pyridoxique, uridine, homoarginine, acide pentadécanoique, éctoine, adenosine, homocitrulline, acide palmitique, l-méthyl-2-pyrrolidone, guanosine, acide 2-6-diaminopimélique, acide heptadécanoique, syringaldéhyde, cytidine 5'-phosphate, saccharopine, acide stéarique, rhaponticine (rhapontine), uridine phosphate, acide argininosuccinique, acide éicosanoique, syringine (éleutheroside B) , acide cyclique adenylique, N-acétyl-tyrosine-éthyl, acide heneicosanoique, acide syringique, 3'5-cyclique guanyl diphosphate, thyroxine, acide trico, 1phenylethylamine, adenosine 5'-phosphate, triméthylamine, acide gras de à chaîne hydrocarbonnée de 24 carbone, 2-phenylethylamine, guanosine pentaphosphate, phosphocholine (choline phosphate), acide gras de à chaîne hydrocarbonnée de 25 carbone, gemfibrozile, uridine diphosphate, O-acetylcarnitine, acide gras de à chaîne hydrocarbonnée de 26 carbone, diéthyltoluamide, adenosine diphosphate, éthanolamine, sphinganine, acide benzoique, guanosine diphosphate, glycérol, amonoamine N-acylsphingosine, céramide, acide 3hydroxybenzoique,uracil, urée, palmityl carnitine, acide p-coumarique, adénine, isobutylamine (paramine) , glycérophosphocholine, acide téréphthalique, hypoxanthine, triethanolamine, lécithine,acide phlorétique, guanine, trimethylamine-N-oxide, linoleyléthanolamide, acide vanillique, acide 3-methyl-2-oxobutanoique, néoeriocitrine, acide D-galacturonique, cyanidin3-rutinoside, acide fumarique, vitexine (apigenin-8-glucoside), acide 3-hydroxymyristique, peonidin3-glucoside, acide 2-oxoglutarique, chrysoériol, prostaglandine B2, biochanine A, acide cis - aconitique, Datiscentine, 2-butenoique, cupressuflavone, acide glycolique, acide 5methoxyindoleacetique, acide 2-hydroxyglutarique, formononétine, acide pyruvique, diméthoxyflavone, puerarine, acide mévalonique, 5,7tartarique, acide acide

3-hydroxy-3apigenine-7acide butyrique, acide acide L-lactique, saponarine, 3hydroxybutyrique, lutéorine, ononine, acide 2-hydroxybutyrique, shikimique, isoorientine (homoorientine), acide homovanillique, dalbergine, myricitrine, acide quinique, acide thréonique, citrique, liquiritigenine, acide D-galaturonique, acide citramalique, acide isocitrique, acacetine, acide galactarique (acide mucique), methylglutarique, glucoside, acide succinique, glucoluteoline, L-malic, myricitrine, acide acide acide acide acide glucarique, acide D-gluconique, prunine (naringenine7-0-B-D-

glucoside),	acide D-glycerique, acide abiétique, acide 3-phospho-D-
glycerique,	ériodictyol, acide 2-hydroxyvalérique, acide trans-
aconitique,	acide glycérophosphorique, rutine, baicaline, acide

isovalérique (acide méthylbutyrique), saikosaponine A, resveratrol, kaempferol, naringenine.

Exemple 2 : Activité mitochondriale

Une étude a été réalisée pour montrer que la supplémentation de Centibiota décrit dans la présente invention augmente l'activité mitochondriale. Cette étude a été réalisée à partir de Centibiota obtenu à partir de fruits d'Olive, Romarin et Haricot. Cette étude a été réalisée avec 30 volontaires en bonne santé sans distinction de sexe d'âge compris entre 30 ans et 60 ans, sans aucune maladie connue.

Les 30 patients ont été répartis par randomisation en 2 groupes de 15 personnes. Le premier groupe a ingéré une dose de 500mg de Centibiota décrite par la présente invention et le deuxième groupe un placebo chaque jour pendant 60 jours. Les participants ont subi au début et à la fin de l'étude un prélèvement d'adipocyte. Les échantillons prélevés ont été observés au microscope optique afin de visualiser la taille des adipocyte. Il a été observé que dans le cas du groupe placebo la taille des adipocytes reste du même ordre de grandeur entre le début et la fin de l'étude. Dans le cas du groupe Centibiota, on observe une diminution de la taille des adipocytes à la fin de l'étude comparé à la taille observé en début d'étude. Les échantillons ont ensuite été marqués par 2 différents marqueurs et observé par microscope à fluorescence. Le premier marqueur est le MitoTracker Vert qui marque sélectivement les mitochondries. Le second marqueur est le MitoTracker rouge qui colore les mitochondries viables en activité. L'observation résultant du MitoTracker vert montre un volume de mitochondrie sensiblement similaire au début et à la fin de l'étude et entre les deux groupes. Cependant, l'observation résultant du MitoTracker rouge montre une quantité de mitochondries viable en activité significativement supérieur à la fin de l'étude dans le groupe Centibiota par rapport au groupe placebo alors qu'ils étaient similaires au début de l'étude. On conclut de ces observations que Centibiota cible les mitochondries et augmente efficacement leur activité ce qui résulte en une augmentation de la production d'énergie et une augmentation de la combustion de graisse.

Exemple 3 : Diminution de l'inflammation

Une étude a été réalisée afin d'évaluer l'effet de l'ingestion de supplément alimentaire contenant Centibiota sur les marqueurs d'inflammation TNF-α, H₂S et IL-18. Cette étude a été réalisée à partir de Centibiota obtenu à partir de fruits de Grenade avec 40 volontaires en bonne santé sans distinction de sexe d'âge compris entre 40 ans et 60 ans, sans aucune maladie connue. Les 40 patients ont été répartis par randomisation en 2 groupes de 20 personnes. Le premier groupe a ingéré une seule dose de 600mg de Centibiota décrite par la présente invention et le deuxième groupe un placebo chaque jour pendant 60 jours. Les participants ont subi au début et à la fin de l'étude un prélèvement sanguin et une analyse des marqueurs d'inflammation cité précédemment. Il est à noter qu'aucune variation significative n'a été notée dans le groupe placebo. Uniquement, les résultats moyens pour le groupe Centibiota sont donc présentés dans le tableau suivant :

	Jour 0	Jour 60	Variation (%)
H2S (μΜ)	31.9±9.4	18,4+5,7	-42,3
IL-18 (pg/ml)	5,21±0,23	2,55±0,14	-51,1
TNF-ot (pg/ml)	2,12±0,10	0,84±0,09	-60,3

On observe que les niveaux sanguins de TNF-α, H2S et IL-18 diminuent de manière significative à la fin de l'étude. Ces résultats montrent que Centibiota aide efficacement à réduire les marqueurs de l'inflammation et en parallèle réduit les effets néfastes de la production de LPS par les agents pathogène.

Exemple 4 : Activité antioxydante

Une étude a été réalisée afin d'évaluer l'effet de l'ingestion de supplément alimentaire contenant Centibiota sur les marqueurs d'oxydation (Peroxydation lipidique et LDL oxydation) et sur les enzymes responsable de l'activité antioxydante (SOD et GPx). Cette étude a été réalisée à partir de Centibiota obtenu à partir de fruits de Grenade avec 40 volontaires en bonne santé sans distinction de sexe d'âge compris entre 40 ans et 60 ans, sans aucune maladie connue. Les 40 patients ont été répartis par randomisation en 2 groupes de 20 personnes. Le premier groupe a ingéré une seule dose de 600mg de Centibiota décrite par la présente invention et le deuxième groupe un placebo chaque jour pendant 60 jours. Les participants ont subi au début et à la fin de l'étude un prélèvement sanguin et une analyse des marqueurs d'oxydation et sur les enzymes responsable de l'activité antioxydante. Il est à noter qu'aucune variation significative n'a été observée dans le groupe placebo. Uniquement, les résultats moyens pour le qroupe Centibiota sont donc présentés dans le tableau suivant :

UI/gHb	Jour 0	Jour 60	Variation (%)
SOD	1502,9±3,3	925,7±3,1	-38,4
GPx	46,2±0,9	29,6±l,0	-35,9
LDL oxydé	305,2±l,3	234,5+1,5	-23,2
Peroxydation des lipides	75,l±0,8	58,5+0,9	-22,1

On sait que la valeur de référence du SOD chez un patient ne souffrant pas de stress oxydatif est comprise entre 758 et 1570 UI/gHb et celle de GPx entre 20 et 58 UI/gHb. On observe que les patients au début de l'étude sont dans la limite supérieure de ces valeurs de références c'est-à-dire que leur système de défense antioxydant est actif et qu'ils souffrent d'un léger stress oxydatif ce qui montre que le système de défense est moins actif. A la fin de l'étude, on remarque que les niveaux sanguins de SOD et GPx diminuent de manière significative vers un niveau bas des valeurs de référence. On observe également à la fin de l'étude que les niveaux de LDL oxydé et de peroxydation des lipides diminuent de manière significative. La diminution simultanée des enzymes antioxydantes et des marqueurs du stress oxydatifs montre que Centibiota cible la production de radicaux libre à la source avant la nécessité de réaction du système de défense antioxydant. Centibiota aide efficacement à l'équilibre de la balance oxydative.

Exemple 5 : Emulsion gel H/E pour le corps anti-inflammation

- Carbopol 981................................................0,6g

- Alcool éthylique.............................................15g

- Huile de silicone volatile ...................................3g

- Huile de purcellin............................................3g

- Centibiota Olive..............................................1g

- Parfum......................................................0,4g

- Triéthanolamine.............................................0,2g

- Conservateurs ..............................................0,3g

- Eau déminéralisée qsp.......................................100g

Cette émulsion gel, appliquée une fois par jour permet de soulager les inflammations de la peau.

Exemple 6 : Gélules pour la forme

- Centibiota raisins..........................................0,6g

- Proto-lait..................................................2,0g

- Jus de raisin concentré.....................................0,7g

- Poudre de lait écrémé .....................................0,05g

- Oligosaccharides de glucose ................................0,5g

- Fibres alimentaires0,1g

Ce complément alimentaire se présente sous forme de gélules à utiliser 2 fois par jour. Les utilisateurs ont remarqué après un mois d'utilisation une perte de la masse graisseuse et déclare se sentir plus énergétiques.

Exemple 7 : Boisson anti-infectieuse

- Centibiota Figue.........................................0,2-0,8g

- Proto-lait...............................................0,2-6,0g

- Jus d'orange concentré.....................................0,1-1g

- Acide citrique ............................................0,5-2g

- Fibres alimentaires.....................................0,01-0,1g

- Oligosaccharides de glucose ............................0,05-0,5g

- Arôme................................................. 0,30-0,40g

- Eau.......................................................20-30g

Cette formule se. présente sous la forme d'une boisson à consommer 1 fois par jour. Les utilisateurs ont noté après 1 mois d'utilisation une diminution des infections et un meilleur transit.

Claims (10)

1. REVENDICATIONS

   1. ) Procédé de fermentation destiné à produire des métabolites possédant des propriétés anti-inflammatoires et d'augmentation de l'activité mitochondrial caractérisé en ce qu'il s'effectue en plusieurs étapes comprenant :

   i. une étape d'extraction des bactéries de microbiotes fécaux d'individus centenaires en bonne santé d'âge compris entre 90 et 110 ans, n'ayant jamais eu de maladies digestives et n'ayant pas consommé d'antibiotiques pendant une durée d'au moins trois mois, ii. une étape de fermentation d'un ou plusieurs ingrédients à une température comprise entre 30°C et 45°C pendant une durée totale d'au moins 120 heures par les bactéries obtenues à l'étape i.
2. 2. ) Procédé de fermentation selon la revendication 1 caractérisé en ce que les bactéries utilisées pour la culture comprennent celles communes aux microbiotes des individus centenaires sélectionnées par PCR puis séquençage de l'ARNr 16s en particulier comprennant au moins Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei.

   Lactobacillus acidophilus,

   Bifidobacterium longum,

   Bifidobacterium bifidum,

   Bifidobacterium adolescentes,

   Bifidobacterium infantis,

   Lactobacillus acidophilus,

   Lactobacillus brevis, Lactobacillus Jensenii,

   Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei, Lactobacillus gasseri.

   Lactobacilllus reuteri,

   Lactobacillus delbrueckii subsp.

   Bulgaricus,

   Lactobacillus helbeticus, Lactococcus lactis, Lactobacillus casei subsp. Casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Delbrueckii, Enterococcus faecium et Steptcoccus thermophiles.
3. 3.) Procédé de fermentation selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que le ou les ingrédients fermentés à l'étape (ii) sont d'origine bio-sourcée uniquement, sont obtenus sans utilisation de pesticides et sont préalablement stérilisé.
4. 4. ) Composition pharmaceutique comprenant les métabolites issus du procédé de fermentation selon l'une des revendications 1 à 3.
5. 5. ) Composition pharmaceutique selon la revendication 4 pour son utilisation pour l'augmentation de l'activité mitochondriale en ce qu' elle module la chaîne respiratoire de la mitochondrie et augmente l'énergie produite.
6. 6. ) Composition pharmaceutique selon la revendication 4 pour son utilisation pour le maintien d'un taux normal des marqueurs inflammatoires et du stress oxydatif, un maintien de la bonne santé de l'individu et la diminution du risque d'inflammation et de stress oxydatif en ce qu'elle diminue l'inflammation des tissues et le stress oxydatif et réduit la concentration plasmique en Lipopolysaccharide, en Interleukine IL-18 et en Sulfure d'hydrogène.
7. 7. ) Composition pharmaceutique selon la revendication 4 pour son utilisation pour la contribution de l'équilibre du microbiote en ce qu'elle modifie la qualité, la diversité et la quantité du microbiote.
8. 8. ) Composition cosmétique comprenant les métabolites issus du procédé de fermentation selon l'une des revendications 1 à 3.
9. 9. ) Composition selon l'un des revendications 4 et 8 caractérisée en ce que la composition est sous la forme d'une émulsion huile dans eau ou eau dans huile, d'émulsion multiple, de microémulsion, de nano-émulsion, d'émulsion à phase gémellaires, d'émulsion PIT, de dispersion stable de deux phases non miscibles au moyen de gélifiant, de dispersion stable de deux phases non miscibles au moyen d'un ou plusieurs tensioactifs, d'un liquide, de gel aqueux, de gel gras, de gel hydro-alcoolique, de phase grasse, de suspension, de solution moussante ou non, de gel, d'émulsion lyophilisée ou de poudre.
10. 10. ) Composition selon l'une des revendications 4 et 8 caractérisée en ce la composition se présente sous la forme de liquides,

    J mousses, pâtes, boisson prête à l'emploi, lotions, émulsions, huiles, gels, sirops, solides, poudres, masques, stick, comprimés, capsules, sprays, aérosol, gélules, gelées, sirops, crèmes, patches, gels douche, shampoings.