FR3035409A1 - DNA EXTRACTION METHOD COMPRISING AN ENZYMATIC DEGRADATION TREATMENT OF A BIOLOGICAL SAMPLE - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une méthode d'extraction d'ADN à partir d'un échantillon biologique en contenant dans laquelle on réalise un prétraitement comprenant au moins les étapes suivantes de : a) lyse mécanique de l'échantillon biologique, de préférence par broyage, et b) dénaturation protéique, de préférence sans protéinase, et c) mise en contact de l'échantillon avec au moins une enzyme glycosidase, de préférence une pluralité de différentes glycosidases de préférence encore des endoglycosidases.The present invention relates to a method of extracting DNA from a biological sample containing it in which a pretreatment is carried out comprising at least the following steps of: a) mechanical lysis of the biological sample, preferably by grinding, and b) protein denaturation, preferably without proteinase, and c) contacting the sample with at least one glycosidase enzyme, preferably a plurality of different glycosidases, more preferably endoglycosidases.
Description
1 Méthode d'extraction d'ADN comprenant un traitement de dégradation enzymatique d'un échantillon biologique. La présente invention concerne une méthode d'extraction d'ADN à partir d'un échantillon biologique en contenant dans laquelle avant les étapes finales de séparation et purification de l'ADN on réalise un prétraitement de dégradation enzymatique des polysaccharides dudit échantillon biologique dans certaines conditions de mise en oeuvre. Les différentes étapes successives suivantes impliquées dans l'extraction d'ADN sont typiquement effectuées comme résumé ci-10 après. - La lyse des cellules ou tissus pour accéder à l'ADN, se fait par des méthodes physiques et/ou chimiques. La lyse cellulaire pour l'extraction d'ADN bactérien est souvent effectuée par des méthodes chimiques utilisant notamment le lysozyme, l'EDTA et/ou des 15 détergents. - L'élimination des débris cellulaires ou tissulaires se fait généralement à l'aide de détergents comme le sodium dodecyl sulfate et par centrifugation. - La dénaturation des protéines de l'extrait cellulaire ou 20 tissulaire, est effectuée à l'aide d'une protéase telle que la protéinase K. Les protéines sont éliminées à l'aide de solvants organiques tels que le phénol, ou un mélange 1:1 de phénol et de chloroforme, le précipité de protéines étant ensuite séparé par centrifugation. - L'élimination de l'ARN est effectuée par addition de RNase qui 25 dégrade rapidement l'ARN en ribonucléotides. - La séparation de l'ADN par précipitation/agrégation/élution de l'ADN.A DNA extraction method comprising an enzymatic degradation treatment of a biological sample. The present invention relates to a method of extracting DNA from a biological sample containing it in which prior to the final stages of separation and purification of the DNA, enzymatic degradation pretreatment of the polysaccharides of said biological sample is carried out under certain conditions. implementation. The following successive successive steps involved in DNA extraction are typically performed as summarized below. The lysis of the cells or tissues to access the DNA is done by physical and / or chemical methods. Cell lysis for the extraction of bacterial DNA is often carried out by chemical methods including lysozyme, EDTA and / or detergents. - Removal of cellular or tissue debris is usually done with detergents such as sodium dodecyl sulfate and by centrifugation. The denaturation of the proteins of the cell or tissue extract is carried out using a protease such as proteinase K. The proteins are removed using organic solvents such as phenol, or a mixture 1 Of phenol and chloroform, the protein precipitate being subsequently separated by centrifugation. Removal of the RNA is performed by addition of RNase which rapidly degrades the RNA to ribonucleotides. - The separation of the DNA by precipitation / aggregation / elution of the DNA.
3035409 2 Les étapes de séparation de l'ADN communément mises en oeuvre dans les kits d'extraction ou de purification de l'ADN sont rappelées ci-après. - L'extraction organique comprend la séparation et purification 5 de l'ADN généralement récupéré par précipitation à l'aide d'éthanol ou d'isopropanol en présence de cations monovalent tel que Na+, et à une température inférieure à 20°C. L'ADN précipité est généralement resuspendu dans un tampon TE ou de l'eau distillée. - la technologie utilisant la silice comprend l'absorption de l'ADN spécifiquement sur membrane/billes/particules de silice en présence de certains sels et à un pH particulier. Les contaminants cellulaires sont éliminés par différentes étapes de lavage. L'ADN est finalement élué dans un tampon faible en sel ou tampon d'élution. Des sels chaotropes sont inclus pour aider à la dénaturation de protéines et l'extraction d'ADN. Un exemple de kit de ce type est utilisé dans l'exemple 1, à savoir QIAamp DNA mini kit (Qiagen). - la séparation magnétique est basée sur la liaison réversible de l'ADN à une surface solide/billes/ particules magnétiques qui ont été recouvertes d'un anticorps liant l'ADN ou d'un groupe fonctionnel qui interagit spécifiquement avec l'ADN. Après liaison de l'ADN, les billes sont séparées des autres composants cellulaires contaminants, lavées et finalement l'ADN purifié est élué par extraction à l'éthanol. Un exemple de kit de ce type est utilisé dans l'exemple 2, à savoir EZ1 Advanced XL utilisant le kit EZ1 DNA Tissue (Qiagen, Courtaboeuf, France). Comme rapporté dans plusieurs études (1,2), que les méthodes d'extraction et purification d'ADN utilisées ont un impact sur l'abondance et la diversité de l'ADN extrait d'un échantillon contenant une population microbienne. Par exemple, dans les échantillons de selles, la co-purification de sels biliaires et de polysaccharides complexes contaminant l'extraction de l'ADN est fréquente (3, 4).The steps of DNA separation commonly carried out in the DNA extraction or purification kits are given below. Organic extraction comprises the separation and purification of the generally recovered DNA by precipitation with ethanol or isopropanol in the presence of monovalent cations such as Na +, and at a temperature below 20 ° C. The precipitated DNA is usually resuspended in TE buffer or distilled water. - The technology using silica includes the absorption of DNA specifically on membrane / beads / silica particles in the presence of certain salts and at a particular pH. Cell contaminants are removed by different washing steps. The DNA is finally eluted in a low salt buffer or elution buffer. Chaotropic salts are included to help protein denaturation and DNA extraction. An example of a kit of this type is used in Example 1, namely QIAamp DNA mini kit (Qiagen). magnetic separation is based on the reversible binding of DNA to a solid surface / beads / magnetic particles that have been coated with a DNA-binding antibody or a functional group that specifically interacts with DNA. After binding of the DNA, the beads are separated from the other contaminating cellular components, washed and finally the purified DNA is eluted by ethanol extraction. An example of a kit of this type is used in Example 2, namely EZ1 Advanced XL using the EZ1 DNA Tissue kit (Qiagen, Courtaboeuf, France). As reported in several studies (1,2), the DNA extraction and purification methods used have an impact on the abundance and diversity of DNA extracted from a sample containing a microbial population. For example, in stool specimens, the co-purification of bile salts and complex polysaccharides contaminating the extraction of DNA is common (3, 4).
3035409 3 Comme la qualité et la pureté des acides nucléiques comptent parmi les facteurs les plus critiques pour l'analyse PCR, l'optimisation des méthodes d'extraction d'ADN est primordiale. Bien que les inhibiteurs de PCR sont courants dans les échantillons de selles, peu d'attention a 5 été portée sur les biais potentiels provoqués par ces inhibiteurs mal définis (3). Plusieurs études soulignent d'ailleurs la nécessité d'optimiser les méthodes d'extraction d'ADN afin obtenir des résultats précis (5). Le but de la présente invention est d'améliorer l'extraction et la 10 purification d'ADN d'un échantillon biologique, notamment un échantillon contenant des microorganismes et plus particulièrement des bactéries. La plupart des microorganismes s'accumule majoritairement dans un biofilm constitué d'une matrice polymérique extracellulaire riche en 15 polysaccharides pour constituer leur environnement immédiat. Ce biofilm ainsi que les polysaccharides des glycoprotéines et des glycolipides des membranes cellulaires constituent une barrière protectrice qui confère une extraordinaire résistance à une variété d'agression et d'agents antimicrobiens, correspondant à une stratégie 20 de survie partagée par les microorganismes. Ces biofilms bactériens contiennent des polysaccharides complexes (peptidoglycanes, cellulose...) associés à de nombreux composants constitués d'excrétas et de déchets métaboliques. Par exemple, les exopolysaccharides produits dans les biofilms bactérien présents dans les matières fécales 25 présentent des activités inhibitrices pour les enzymes de restriction, des enzymes de modification et des enzymes de polymérisation de l'ADN (6-9). Selon la présente invention, on a découvert que - sous certaines conditions de prétraitement de lyse mécanique et de dénaturation 30 protéique - la dégradation enzymatique des polysaccharides et notamment de la cellulose présentes dans les selles le cas échéant, préalablement à l'extraction et la purification de l'ADN, permettait 3035409 4 d'augmenter le rendement de l'extraction et la quantification subséquente par amplification par PCR de l'ADN. Les résultats comparatifs des expériences réalisées tant sur les bactéries issues d'un biofilm ou isolées et productrices de matrice polysaccharidiques que 5 sur les échantillons de selles ainsi que divers prélèvements cliniques ont permis de démonter l'accroissement du rendement d'extraction de l'ADN et de la détection d'espèces bactériennes diverses. Les résultats montrent une très nette amélioration de la technique d'extraction avec une capacité de détection et de quantification supérieure aux 10 techniques d'extraction sans ledit traitement enzymatique selon la présente invention. Ainsi, le seuil de détection des bactéries dans un échantillon donné se révèle jusqu'à 1000 fois supérieur après un prétraitement avant extraction de l'ADN selon la présente invention en comparaison au même échantillon sans le dit prétraitement.As the quality and purity of nucleic acids are among the most critical factors for PCR analysis, the optimization of DNA extraction methods is paramount. Although PCR inhibitors are common in stool samples, little attention has been paid to potential biases caused by these poorly defined inhibitors (3). Several studies also highlight the need to optimize DNA extraction methods to obtain accurate results (5). The object of the present invention is to improve the extraction and the purification of DNA from a biological sample, in particular a sample containing microorganisms and more particularly bacteria. Most microorganisms accumulate mainly in a biofilm consisting of an extracellular polymeric matrix rich in polysaccharides to constitute their immediate environment. This biofilm as well as the glycoprotein and glycolipid polysaccharides of cell membranes provide a protective barrier that provides extraordinary resistance to a variety of aggression and antimicrobial agents, corresponding to a survival strategy shared by the microorganisms. These bacterial biofilms contain complex polysaccharides (peptidoglycans, cellulose ...) associated with many components consisting of excreta and metabolic waste. For example, exopolysaccharides produced in bacterial biofilms present in faeces exhibit inhibitory activities for restriction enzymes, modifying enzymes, and DNA polymerization enzymes (6-9). According to the present invention, it has been found that - under certain conditions of pretreatment of mechanical lysis and protein denaturation - the enzymatic degradation of the polysaccharides and in particular of the cellulose present in the stools, if appropriate, prior to extraction and purification. DNA, allowed to increase the yield of the extraction and the subsequent quantification by PCR amplification of the DNA. Comparative results of the experiments carried out on biofilm-based or isolated and polysaccharide-matrix-producing bacteria as well as stool samples as well as various clinical samples made it possible to demonstrate the increase in the extraction efficiency of the DNA. and the detection of various bacterial species. The results show a very clear improvement of the extraction technique with greater detection and quantification capacity than the extraction techniques without said enzymatic treatment according to the present invention. Thus, the threshold of detection of bacteria in a given sample is up to 1000-fold higher after pretreatment before extraction of the DNA according to the present invention compared to the same sample without said pretreatment.
15 Plus précisément, la présente invention fournit une méthode d'extraction d'ADN à partir d'un échantillon biologique y compris des microorganismes en contenant dans laquelle on réalise un pré-traitement de l'échantillon comprenant au moins les étapes suivantes de : 20 a) lyse mécanique de l'échantillon biologique, de préférence par broyage, et b) dénaturation protéique, de préférence sans protéinase, et c) mise en contact de l'échantillon avec au moins une enzyme glycosidase, de préférence une pluralité de différentes glycosidases de 25 préférence des endoglycosidases. A l'étape b), on évite la mise en oeuvre de protéinase pour éviter de dégrader les enzymes glycosidases de l'étape c). A l'étape c), les inventeurs considèrent que les dite glycosidases ont pour fonction d'opérer une lyse des liaisons glycosidiques des 30 polysaccharides associés ou non aux protéines ou aux lipides des 3035409 5 cellules et/ou microorganismes de l'échantillon, notamment des glycoprotéines membranaires et/ou exopolysaccharides de matrices extracellulaires de microorganismes notamment de bactéries. Plus particulièrement, le dit prétraitement est réalisé avant des 5 étapes finales de séparation et purification de l'ADN. Une glycosidase ou son terme générique de « sialidase » aussi dénommée glycoside hydrolase catalyse l'hydrolyse de liaisons glycosidiques et libère au moins un composé osidique. Les glycosides hydrolases peuvent aussi être classées en tant 10 que exo-glycosidase ou endo-glycosidase en fonction de leur spécificité à hydrolyser les sucres terminaux d'une chaîne (exo-glycosidases), ou au contraire, à libérer des oligosaccharides (endo-glycosidases) en attaquant une liaisons osidiques au sein d'une chaîne. Les glycosides hydrolases peuvent aussi être classées en fonction 15 du type de liaisons hydrolysées telles que des liaisons 0-glycosidique (o-glycosidase) ou N-glycosidique (N-glycosidase) ou S-glycosidique (Sglycosidase). Enfin, les glycosidases peuvent être définies en fonction du motif spécifique du monosaccharide ou sucre hydrolysé.More specifically, the present invention provides a method of extracting DNA from a biological sample including microorganisms containing it in which pre-treatment of the sample is performed comprising at least the following steps of: a) mechanical lysis of the biological sample, preferably by grinding, and b) protein denaturation, preferably without proteinase, and c) contacting the sample with at least one glycosidase enzyme, preferably a plurality of different glycosidases preferably endoglycosidases. In step b), the use of proteinase is avoided to avoid degrading the glycosidase enzymes of step c). In step c), the inventors consider that the function of said glycosidases is to lyse the glycoside bonds of the polysaccharides associated or not with the proteins or lipids of the cells and / or microorganisms of the sample, in particular membrane glycoproteins and / or exopolysaccharides of extracellular matrices of microorganisms, especially bacteria. More particularly, said pretreatment is carried out before final steps of separation and purification of the DNA. A glycosidase or its generic term "sialidase" also called glycoside hydrolase catalyzes the hydrolysis of glycosidic linkages and releases at least one osidic compound. Glycoside hydrolases can also be classified as exo-glycosidase or endo-glycosidase depending on their specificity to hydrolyze the terminal sugars of a chain (exo-glycosidases), or on the contrary, to release oligosaccharides (endo-glycosidases). ) by attacking an osidic bonds within a chain. Glycoside hydrolases can also be classified according to the type of hydrolysed bonds such as O-glycosidic (o-glycosidase) or N-glycosidic (N-glycosidase) or S-glycosidic (S-glycosidase) linkages. Finally, glycosidases can be defined according to the specific pattern of the monosaccharide or hydrolysed sugar.
20 Une P-N-Acetylglucosaminidase est une glycosidase qui catalyse l'hydrolyse de résidus P-N-Acetylglucosamine des oligosaccharides. Une P-galactosidase est une exoglycosidase de type 0- glycosidase qui hydrolyse des P-galactosides en monosaccharides. Une neuraminidase ou sialidase, est une glycoside hydrolase qui 25 catalyse : - l'hydrolyse d'une liaison 0-osidique a-(2->3)-, a-(2->6)- ou a(2->8)- des résidus d'acide sialique d'oligosaccharides, notamment de glycoprotéines et de glycolipides, pour l'exoneuraminidase, 3035409 6 - l'endohydrolyse d'une liaison (2->8)-a-sialosyle d'acides oligoou polysialiques pour l'endoneuraminidase. On cite parmi les N-acétyl-glucosaminidases: - l'endoglycosidase H ou EndoH qui est une endo 3-N-acétyl- 5 glucosaminidase qui hydrolyse la liaison 0-osidique de l'anomère i3 de la N-acétyl-glucosamine entre deux motifs N-acétyl-glucosamine ; et - l'endoglycosidase F ou PNGase F qui est aussi une endo 13-Nacétyl-glucosaminidase, mais elle hydrolyse une liaison N-osidique entre la dernière N-acétyl-glucosamine d'un oligosaccharide et 10 l'asparagine de la chaîne peptidique. - Une cellulase est une enzyme 0-glycosidase (1,4-(1,3:1,4)-13-DGlucan 4-glucano-hydrolase) qui peut décomposer la cellulose. De préférence, à l'étape c), on met en oeuvre une pluralité d'enzymes glycosidases de différentes spécificités quant aux types de 15 motifs de sucres dont les liaisons sont hydrolysées et/ou quant aux types de liaisons hydrolysées parmi les liaisons 0- glycosidique (oglycosidase) ou N-glycosidique (N-glycosidase) ou S-glycosidique (Sglycosidase) et/ou quant aux modes d'action de l'hydrolyse du type endoglycosidase ou exoglycosidase.P-N-Acetylglucosaminidase is a glycosidase which catalyzes the hydrolysis of P-N-acetylglucosamine residues of oligosaccharides. Β-Galactosidase is an O-glycosidase exoglycosidase which hydrolyzes β-galactosides to monosaccharides. A neuraminidase or sialidase is a glycoside hydrolase which catalyzes: - the hydrolysis of a 0-osidic bond a- (2-> 3) -, a- (2-> 6) - or a (2-> 8 sialic acid residues of oligosaccharides, especially glycoproteins and glycolipids, for the exoneuraminidase, the endohydrolysis of a (2-> 8) -a-sialosyl linkage of oligoou polysialic acids to the endoneuraminidase. N-acetyl glucosaminidases include: endoglycosidase H or EndoH which is an endo 3-N-acetylglucosaminidase which hydrolyzes the O-osidic bond of the N-acetylglucosamine anomer between two N-acetylglucosamine units; and endoglycosidase F or PNGase F, which is also endo-13-N-acetyl-glucosaminidase, but hydrolyzes an N-osidic bond between the last N-acetylglucosamine of an oligosaccharide and the asparagine of the peptide chain. Cellulase is an enzyme O-glycosidase (1,4- (1,3: 1,4) -13-DGlucan 4-glucano-hydrolase) which can decompose cellulose. Preferably, in step c), a plurality of glycosidase enzymes of different specificities are used for the types of sugar units whose bonds are hydrolysed and / or for the types of hydrolysed bonds among the O-bonds. glycosidic (oglycosidase) or N-glycosidic (N-glycosidase) or S-glycosidic (Sglycosidase) and / or the modes of action of hydrolysis endoglycosidase type or exoglycosidase.
20 Plus particulièrement, les dites glycosidases comprennent au moins une endoglycosidase et de préférence au moins une exoglycosidase. Plus particulièrement encore, les dites glycosidases comprennent au moins une pluralité d'endoglycosidases, de préférence au moins 3 25 endoglycosidases, de préférence encore au moins 5 endoglycosidases, de spécificités différentes en fonction du type de liaisons hydrolysées choisies parmi des liaisons 0-glycosidique, N-glycosidique et Sglycosidique, de préférence parmi les 0-glycosidases et N-glycosidases.More particularly, said glycosidases comprise at least one endoglycosidase and preferably at least one exoglycosidase. More particularly, said glycosidases comprise at least a plurality of endoglycosidases, preferably at least 3 endoglycosidases, more preferably at least 5 endoglycosidases, with different specificities depending on the type of hydrolyzed bonds chosen from 0-glycosidic bonds, N-glycosidic and glycosidic, preferably from 0-glycosidases and N-glycosidases.
3035409 7 Plus particulièrement encore, les dites glycosidases comprennent au moins trois enzymes choisies parmi les enzymes a-(2->3,6,8,9)-Neuraminidase, 13-(1->4)-Galactosidase, endo-a-N- acetylgalactosaminidase, P-N-Acetylglucosaminidase et la cellulase.More particularly, said glycosidases comprise at least three enzymes chosen from the α- (2-> 3,6,8,9) -Neuraminidase, 13- (1-> 4) -Galactosidase, endo-aN- acetylgalactosaminidase, PN-Acetylglucosaminidase and cellulase.
5 On cite en particulier, les P-N-Acetylglucosaminidase de type 0- glycosidase telle que l'EndoH ou de type N-glycosidase telle que la PNGase F. Plus particulièrement encore, les dites glycosidases sont mises en oeuvre à une température de 37°C pendant au moins 3 heures de 10 préférence au moins 8 heures (une nuit) dans un tampon de lyse tel que un tampon comprenant 0.5% Sodium Dodecyl sulfate(SDS) ; 40 mM dithiothréitol (DTT); 50 mM Citrate ou actétate de Sodium, pH=6. On entend ici par «échantillon biologique», des échantillons contenant des tissus et/ou cellules humaines ou animales ou végétales 15 ou microbiennes, plus particulièrement des échantillons de prélèvements cliniques humain ou animal, des prélèvements environnementaux ou des prélèvements d'aliments ou encore des cultures de microorganismes. Plus particulièrement encore, le dit échantillon biologique est un 20 prélèvement clinique humain ou animal choisi parmi les échantillons de selles et échantillons de fluides tel que urine, sang, lavages bronchoalvéolaires, échantillons de sécrétion corporelles tel que salives, selles, sécrétions de muqueuses et sécrétions d'organes sexuels, échantillons de tissus tels que des sections de tissu ou biopsies duodénales, 25 biopsies des valves cardiaques, des végétations et des biopsies pulmonaires ou autres organes. Plus particulièrement encore, le dit échantillon biologique est un échantillon contenant ou susceptible de contenir des bactéries.In particular, α-acetylglucosaminidase O-glycosidase type such as EndoH or N-glycosidase type such as PNGase F is mentioned. More particularly, the said glycosidases are used at a temperature of 37 ° C. for at least 3 hours preferably at least 8 hours (overnight) in lysis buffer such as a buffer comprising 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS); 40 mM dithiothreitol (DTT); 50 mM Sodium citrate or actetate, pH = 6. Here, the term "biological sample" is intended to mean samples containing human or animal or plant or microbial tissues and / or cells, more particularly samples of human or animal clinical samples, environmental samples or samples of foodstuffs or even microorganism cultures. More particularly, said biological sample is a human or animal clinical sample selected from stool samples and fluid samples such as urine, blood, bronchoalveolar lavage, body secretion samples such as saliva, stool, secretions of mucous membranes and secretions. sexual organs, tissue samples such as tissue sections or duodenal biopsies, cardiac valve biopsies, veins and lung biopsies or other organs. More particularly, said biological sample is a sample containing or likely to contain bacteria.
3035409 8 Plus particulièrement encore, le dit échantillon biologique est un échantillon de selles et de préférence les glycosidases comprennent au moins une cellulase. Plus particulièrement encore, le dit échantillon biologique 5 comprend des bactéries isolées. Plus particulièrement encore, à l'étape a) de lyse mécanique, on réalise un broyage comprenant le mélange et agitation d'une dudit échantillon avec des billes de verres ou un produit pulvérisant abrasif, de préférence de la poudre de verre de préférence lavée à l'acide.More particularly, said biological sample is a stool sample and preferably the glycosidases comprise at least one cellulase. Even more particularly, said biological sample comprises isolated bacteria. Even more particularly, in step a) of mechanical lysis, grinding comprising mixing and stirring of one of said sample with glass beads or an abrasive spraying product, preferably glass powder preferably washed with water, is carried out. acid.
10 Plus particulièrement encore, à l'étape b) de dénaturation protéique, on réalise un chauffage, de préférence à 100°C, dans un milieu acide, notamment dans un tampon. 0.5% Sodium Dodecyl sulfate(SDS) ; 40 mM dithiothréitol (DTT)-15 min à 100°C. Plus particulièrement encore, avant l'étape c), on réalise une 15 étape de centrifugation, de préférence de 10000 à 20000g, et on récupère le culot contenant l'ADN, notamment l'ADN bactérien, que l'on met en contact de l'échantillon avec un tampon de lyse contenant au moins une dite enzyme glycosidase pour réaliser l'étape c). Plus particulièrement encore, après l'étape c), on sépare et 20 purifie l'ADN par fixation sur une colonne contenant du silicate ou des particules magnétiques, notamment des billes, puis lavage pour éluer ledit ADN en le séparant de la colonne ou des particules magnétiques par lavage et centrifugation pour récupérer lesdits fragments d'ADN. La présente invention fournit aussi une méthode de détection et 25 quantification d'ADN d'un échantillon biologique caractérisé en ce qu'on quantifie par PCR l'ADN extrait par une méthode d'extraction d'ADN selon l'invention.Even more particularly, in step b) of protein denaturation, heating is carried out, preferably at 100 ° C., in an acid medium, in particular in a buffer. 0.5% Sodium Dodecyl Sulphate (SDS); 40 mM dithiothreitol (DTT) -15 min at 100 ° C. Even more particularly, before step c), a centrifugation step is carried out, preferably from 10,000 to 20000 g, and the pellet containing the DNA, in particular the bacterial DNA, is brought into contact. the sample with a lysis buffer containing at least one said glycosidase enzyme to perform step c). Even more particularly, after step c), the DNA is separated and purified by fixing on a column containing silicate or magnetic particles, in particular beads, and then washing to elute said DNA by separating it from the column or columns. magnetic particles by washing and centrifugation to recover said DNA fragments. The present invention also provides a method for detecting and quantifying DNA from a biological sample characterized in that the DNA extracted by a DNA extraction method according to the invention is quantitated by PCR.
3035409 9 La présente invention fournit aussi une trousse de mise en oeuvre d'une méthode d'extraction ou de détection et quantification d'ADN selon l'invention caractérisée en ce qu'elle comprend au moins : - des réactifs pour l'extraction d'ADN et/ou des réactifs pour 5 l'amplification d'ADN, et - des dites glycosidases. D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre de différents exemples de réalisation en référence aux figures 1 à 5 suivantes. 10 - La figure 1 représente la diversité des espèces représentées par le nombre d'UTO par échantillon en ordonnée par rapport aux nombres de séquences d'amplifiats par échantillon en abscisses obtenus par les méthodes d'extraction 1 à 10 (M1 à M10) de l'exemple 1. - La figure 2 est une représentation de l'analyse en coordonnées 15 principale pour les méthodes d'extractions 1 à 10 (M1 à M10) discutée à l'exemple 1. - La figure 3 représente la diversité des espèces représentées par le nombre d'UTOs par échantillon pour les méthodes d'extraction 1 à 10 de l'exemple 1. Les espèces communes aux 10 méthodes étant 20 regroupées au centre de la figure et reliées entre elles par un trait ; la spécificité et la diversité du nombre d'espèces pour chaque méthode de M1 à M10 étant regroupé autour de chaque noeud périphérique. - Les figures 4A et 4B représentent la quantification par RT-qPCR des séquences de T. whipplei des échantillons traités par un cocktail de 25 glycosidases de 5 biopsies duodénales qui avaient été précédemment analysées et présentaient une réactivité positive en immunohistochimie et négative pour l'amplification de la séquence whi2 de T. whipplei par PCR sans prétraitement de déglycosylation (DB1 à DB5), un échantillon IHC négatif et PCR négatif, ainsi qu'un témoin positif en IHC et en PCR 3035409 10 (Figure 4A) et de 13 lavages broncha-alvéolaires (Cl à C13 , Figure 4B) de l'exemple 2. - La figure 5 représente les effets du traitement enzymatique sur l'extraction d'ADN à l'exemple 3 mesuré par la quantification de l'ADN 5 par RT-qPCR des gènes whi2 de T. whipplei, et le gène de p-actine mammifère sur des échantillons traités et non traités (NT). Exemple 1 : Extraction d'ADN de la flore intestinale d'échantillons de 1 selle. A) Méthodes d'extraction.The present invention also provides a kit for implementing a method for extracting or detecting and quantifying DNA according to the invention, characterized in that it comprises at least: reagents for the extraction of d DNA and / or reagents for DNA amplification, and - said glycosidases. Other features of the present invention will become apparent in the light of the following detailed description of various embodiments with reference to Figures 1 to 5 below. FIG. 1 represents the diversity of species represented by the number of OTUs per sample on the ordinate relative to the number of amplification sequences per sample in abscissas obtained by the extraction methods 1 to 10 (M1 to M10) of Example 1 - Figure 2 is a representation of the main coordinate analysis for extractive methods 1-10 (M1-M10) discussed in Example 1. - Figure 3 represents species diversity represented by the number of UTOs per sample for the extraction methods 1 to 10 of Example 1. The species common to the methods are grouped together in the center of the figure and linked together by a line; the specificity and the diversity of the number of species for each method of M1 to M10 being grouped around each peripheral node. FIGS. 4A and 4B show the RT-qPCR quantification of the T. whipplei sequences of samples treated with a glycosidase cocktail of 5 duodenal biopsies which had previously been analyzed and had a positive reactivity in immunohistochemistry and a negative reactivity for amplification. of the T. whipplei whi2 sequence by PCR without deglycosylation pretreatment (DB1 to DB5), an IHC negative and PCR negative, as well as a positive IHC and PCR control (Figure 4A) and 13 broncha washes. (Figure 5 shows the effects of the enzymatic treatment on the extraction of DNA in Example 3 as measured by the quantification of the DNA by RT-2). qPCR of T. whipplei whi2 genes, and the mammalian p-actin gene on treated and untreated (NT) samples. Example 1: Extraction of DNA from the intestinal flora of samples of 1 stool. A) Extraction methods.
10 On a comparé 10 méthodes extractions d'ADN différentes dont plusieurs disponibles dans le commerce, publiées dans la littérature ou précédemment utilisées dans le laboratoire des inventeurs. L'ADN est extrait en duplicata à partir du même échantillon de selles d'une femme obèse de 36 ans avec un indice de masse corporelle (IMC) de 15 30,4 pour toutes les méthodes. La quantité, la pureté de l'ADN et l'amplification par PCR ont été évaluées. Les extraits d'ADN ont été répartis en aliquotes de 10 à 20 pl et congelés à -20 °C pour éviter la répétition des cycles de congélation-décongélation avant l'analyse. 1) Méthode d'extraction comparative 1.10 different DNA extraction methods were compared, several of which were commercially available, published in the literature or previously used in the inventors' laboratory. The DNA is duplicated from the same stool sample of a 36-year-old obese woman with a body mass index (BMI) of 30.4 for all methods. The quantity, the purity of the DNA and the amplification by PCR were evaluated. The DNA extracts were divided into 10 to 20 μl aliquots and frozen at -20 ° C to avoid repetition of the freeze-thaw cycles prior to analysis. 1) Comparative extraction method 1.
20 L'ADN fécal a été extrait à partir de 0,25 g de selles en utilisant le protocole selles de Qiagen modifié [selles QIAampC) DNA Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, France)], comme décrit précédemment (10) et rappelé ci-dessus. 2) Méthode d'extraction comparative 2. 25 0,25 g de selles ont été lyophilisés en utilisant un appareil Lyovac GT2 (GEA Process Engineering, Maryland, USA). Les produits lyophilisés ont été dilués dans 500 pl de tampon de phosphate salin PBS (Phosphate Buffered Saline) et exposés à des ultrasons pendant 1 heure. Par la suite, 25 pl de trypsine (5%) ont été ajoutés aux produits 3035409 11 soniques et ces mélanges ont été incubés 15 minutes à 37°C. L'ADN de ces échantillons a ensuite été extrait en utilisant la méthode d'extraction 1. 3) Méthode d'extraction comparative 3. 5 0,25 g de selles ont été lyophilisés en utilisant un appareil lyophilisateur Lyovac GT2 (de Leybold-Heraeus GmbH,DE ) 220 V.The fecal DNA was extracted from 0.25 g of stool using the modified Qiagen stool QIAampC stool DNA Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, France) as described previously (10) and recalled here. -above. 2) Comparative extraction method 2. 0.25 g of stool was lyophilized using a Lyovac GT2 apparatus (GEA Process Engineering, Maryland, USA). The freeze-dried products were diluted in 500 μl phosphate buffered saline (PBS) phosphate buffer and exposed to ultrasound for 1 hour. Subsequently, 25 μl of trypsin (5%) was added to the sonic products and these mixtures were incubated for 15 minutes at 37 ° C. The DNA of these samples was then extracted using extraction method 1. 3) Comparative extraction method 3. 0.25 g of stool was lyophilized using Lyovac GT2 freeze dryer (from Leybold-Heraeus) GmbH, DE) 220 V.
50 Hz. Max 2,2 kW. Les produits lyophilisés ont été dilués dans 12 ml de tampon PBS, récoltés et broyés en utilisant sous haute pression (30Kpsi) par un dispositif connu sous le nom de « French press » 10 pendant 20 minutes suivant les recommandations du fournisseur (Constant Systems Ltd). L'ADN de ces échantillons a ensuite été extrait en utilisant la méthode d'extraction 1. 4) Méthode d'extraction comparative 4. L'ADN fécal a été extrait à partir de 0,25 g de selles en utilisant 15 le kit d'extraction PowerBiofilmTM DNA Isolation Kit (Mobio, Carlsbad, États-Unis), suivant les recommandations du fabricant. Le principe repose sur la technologie de lyse cellulaire associée à la suppression d'inhibiteurs pour l'augmentation des rendements d'extraction de l'ADN et de l'ARN libre de tous les types de biofilms, y compris les tapis 20 microbiens. 5) Méthode d'extraction 5 selon l'invention. On a ajouté 500 pl de tampon PBS à 0,25 g de selles, qui ont ensuite été homogénéisés en utilisant un dispositif de rupture mécanique par broyage connu sous le nom FastPrepC) (Biomedicals, 25 Santa Ana, Californie, USA), (à 6.5m/s) comme décrit par le fabricant. 200 pl de ce mélange ont été centrifugés à 17.000 rpm (12000g) pendant 10 minutes. Le surnageant a été éliminé. Le culot a été dénaturé dans 200 pl de tampon de dénaturation (New England Biolabs, USA) 10 min à 100°C. On a ensuite ajouté 160 pl de H20, 40 30 pl de tampon de réaction G5 10X suivis de 5 pl d'enzyme EndoHf (New 3035409 12 England Biolabs, USA), 5 pl de cellulase (Sigma, France) et 5 pl de PNGase F (SIGMA). Le mélange a été incubé une nuit à 37°C puis l'ADN a été extrait en utilisant la méthode d'extraction 1). 6) Méthode d'extraction comparative 6.50 Hz. Max 2,2 kW. The lyophilized products were diluted in 12 ml of PBS buffer, harvested and milled using high pressure (30 Kpsi) by a device known as "French press" for 20 minutes according to the supplier's recommendations (Constant Systems Ltd) . The DNA of these samples was then extracted using extraction method 1. 4) Comparative extraction method 4. The fecal DNA was extracted from 0.25 g of stool using the kit. Extraction PowerBiofilmTM DNA Isolation Kit (Mobio, Carlsbad, USA), following the manufacturer's recommendations. The principle is based on cell lysis technology associated with the suppression of inhibitors for increasing the yields of DNA and RNA extraction free of all types of biofilms, including microbial mats. 5) extraction method 5 according to the invention. 500 μl of PBS buffer was added to 0.25 g of stool, which was then homogenized using a mechanical mill breaker known as FastPrepC) (Biomedicals, Santa Ana, California, USA), (to 6.5m / s) as described by the manufacturer. 200 μl of this mixture was centrifuged at 17,000 rpm (12000g) for 10 minutes. The supernatant was removed. The pellet was denatured in 200 μl of denaturation buffer (New England Biolabs, USA) for 10 min at 100 ° C. 160 μl of H 2 O, 40 μl of 10X G5 reaction buffer followed by 5 μl of EndoHf enzyme (New England Biolabs, USA), 5 μl of cellulase (Sigma, France) and 5 μl of PNGase were then added. F (SIGMA). The mixture was incubated overnight at 37 ° C and then the DNA was extracted using extraction method 1). 6) Comparative extraction method 6.
5 On a ajouté 500 pl de tampon PBS à 0,25 g de selles et traité l'échantillon par ultrasons pendant 2 heures, avec des pulses de 15 secondes pendant 2 minutes avec un dispositif 800 R de Qsonica LLC (USA). On a ensuite ajouté 1 mmole d'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) et 0,1 mmol de dodécylsulfate de sodium (SDS), 10 l'ADN a été extrait à partir de ce mélange en utilisant la méthode d'extraction 1. 7) Méthode d'extraction comparative 7. Un total de 0,25 g de selles a été lyophilisé en utilisant un Lyovac GT2. Les produits lyophilisés ont été dilués dans 1 ml de 15 tampon PBS contenant 10 pl de Tween (1%). Ce mélange a été placé dans de l'azote liquide pendant 30 minutes, puis concassé. 500 pl de PBS ont été ajouté et le mélange a été traité aux ultrasons pendant 1 heure. On a ensuite ajouté 25 pl de trypsine (5%), et incubé le mélange pendant 15 minutes à 37 °C. L'ADN a été extrait à partir de ce 20 mélange en utilisant la méthode d'extraction 1. 8) Méthode d'extraction comparative 8. A partir de 0,25 g de selles, ont été ajouté 500 pl de tampon PBS, 1 mmole d'EDTA et 0,1 mmol de SDS ainsi que les enzymes EndoHf (endoglycosidase recombinante de Sigma-Aldrich)(5 pl), la 25 cellulase (5 pl), la PNGase (endoglycosidase recombinante de Sigma- Aldrich (5 pl) et de la proteinase K (12 pl). Ce mélange a été incubé pendant 2 heures à 37°C, et l'ADN a ensuite été extrait en utilisant la méthode d'extraction 1.500 μl of PBS buffer was added to 0.25 g of stool and the sample was sonicated for 2 hours, with pulses of 15 seconds for 2 minutes with a 800 R device from Qsonica LLC (USA). 1 mmol of ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) and 0.1 mmol of sodium dodecyl sulfate (SDS) were then added, the DNA was extracted from this mixture using extraction method 1. 7 Comparative extraction method 7. A total of 0.25 g of stool was lyophilized using a Lyovac GT2. The lyophilized products were diluted in 1 ml of PBS buffer containing 10 μl Tween (1%). This mixture was placed in liquid nitrogen for 30 minutes and then crushed. 500 μl of PBS was added and the mixture was sonicated for 1 hour. 25 ul of trypsin (5%) was then added, and the mixture was incubated for 15 minutes at 37 ° C. DNA was extracted from this mixture using extraction method 1. 8) Comparative extraction method 8. From 0.25 g of stool was added 500 μl of PBS buffer, 1 mmol of EDTA and 0.1 mmol of SDS as well as the enzymes EndoHf (recombinant Sigma-Aldrich endoglycosidase) (5 μl), cellulase (5 μl), PNGase (recombinant Sigma-Aldrich endoglycosidase (5 μl)) and proteinase K (12 μl) This mixture was incubated for 2 hours at 37 ° C, and the DNA was then extracted using extraction method 1.
3035409 13 Cette méthode 8 se distingue essentiellement de la méthode 5 en ce que le traitement de déglycosilation enzymatique n'est pas précédée d'une lyse mécanique et comprend une dénaturation des protéines par protéinase. 5 9) Méthode d'extraction comparative 9. On a ajouté 500 pl de tampon PBS à 0,25 g de selles, qui ont ensuite été homogénéisés en utilisant un appareil de par rupture mécanique FastPrepC) (Biomedicals, Santa Ana, Californie, USA), (à 6.5m/s) suivant les recommandations du fabricant. L'ADN a été extrait 10 en utilisant la méthode d'extraction 1. 10) Méthode d'extraction 10. Un aliquote (- 500 mg) congelé de chaque échantillon a été suspendu dans une solution contenant 500 pl de tampon d'extraction [Tris 200 mM (pH 8,0), NaCI 200 mM, EDTA 20 mM], 210 pl de SDS à 15 20%, 500 pl d'un mélange de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25: 24: 1, pH 7,9) et 500 pl d'une suspension épaisse de 0,1 mm de diamètre zircone/perles de silice (Biospec Products, Bartlesville). Les cellules microbiennes ont ensuite été lysées par rupture mécanique avec un appareil FastPrepC) à pendant 2 min à température ambiante 20 (à 6.5m/s), puis l'ADN a été extrait avec un mélange de phénol/chloroforme/alcool isoamylique et précipitation à l'isopropanol, comme décrit précédemment (11). B) Méthodes d'amplification d'ADN et de séquençage. Les PCR temps réel ont été réalisées en triplicata sur des 25 appareils CFX96 (Bio-Rad clinical Diagnostics, Marnes-la-Coquetter, France). La qualité de l'extraction a été quantifiée par PCR temps réel en ciblant de l'ADN humain à savoir la séquence codant pour le gène de la 13-globine. Un cycle seuil (Ct : cycle threshold) inférieur à 34 Ct était considéré comme positif. Une PCR universelle vis-à-vis des 30 bactéries ciblant la séquence codant pour l'ADNr 165 (13) a été 3035409 14 réalisée avec le Kit Takyon NoRox Probe MasterMix UNG (Eurogentec, Seraing, Belgique) sur tous les ADN extraits. Séquençage : Les échantillons positifs en PCR temps réel ciblant l'ADNr 165 ont été séquences par la méthode Sanger avec un 5 séquenceur ABI 3130x1 Genetic Analyser (Applied Biosystems, Villebond Sur Yvette, France). Les séquences ont été assemblées avec le logiciel CodonCode Aligner et alignés contre la banque nucléotidique GenBank (nr/nt). C) Résultats. 10 1) Analyse d'une population microbienne par le pyroséquençage à haut débit de la région V6 de l'ADN ribosomique 165 (15). Les échantillons comprenaient des bactéries principalement des phyla actinobacteria, pro teobacteria, verrucornicrobia, bacteroidetes et firrnicutes. Au sein d'une même espèce, ou d'une communauté 15 bactérienne, il existe une diversité génétique (déterminée par la séquence nucléotidique de la région variable du gène 165). Une UTO (Unité Taxonomique Opérationnelle, OTU en anglais) est un regroupement d'individus d'une même espèce dont les séquences d'ADNr 165 présentent une similitude de plus de 97,5%. Sur la figure 1 20 est présentée les résultats des courbes de raréfaction des différentes méthodes d'extraction. Chaque point représente en ordonnée le nombre d'UTO différent correspondant à la diversité des échantillons en fonction de l'abondance des séquences en abscisse mesuré en log10. Le plus grand nombre d'UTO différentes est obtenu avec la méthode 25 d'extraction 5 qui se distingue largement des autres méthodes d'extraction. Toutes les autres méthodes réalisent un score moins élevé d'UTO, donc une faible représentation de la diversité de l'échantillon, alors que l'abondance de séquences est significativement plus élevée. La méthode d'extraction 8 donnant la plus faible diversité 30 d'espèces comme montré figure 1 et tableau 1 ci-après ce qui s'explique du fait de la présence de l'action de la protéinase qui 3035409 15 dégrade les enzymes glycosidases d'une part et d'autre part l'absence de lyse mécanique préalable. Tableau 1 Méthodes d'extraction Genres. détectes Sensibilité (0/0) Espèces détectés Sensibilité (0/0) Méthode 1 68 20 111 15 Méthode 2 62 18 100 13 Méthode 3 110 33 155 19 Méthode 4 98 29 181 24 Méthode 5 258 77 522 70 Méthode 6 107 32 175 23 Méthode 7 55 16 98 13 Méthode 8 78 23 109 15 Méthode 9 47 14 103 14 Méthode 10 70 21 159 21 TOTAL 336 746 5 2) On a utilisé la méthode dite d'analyse en coordonnées principales (en anglais, Principal Coordinate Analysis ou PCoA) qui a pour but de représenter graphiquement une matrice de ressemblance/différence entre les méthodes d'extraction. La comparaison révèle les différences de la composition apparente des 10 communautés microbiennes obtenues avec les différentes méthodes d'extraction d'ADN. On a constaté que la part des populations microbiennes communes aux méthodes d'extraction, représente une faible partie des populations séquencées. Les différents UTOs obtenus pour chaque méthode ne sont pas toujours les mêmes indiquant que 15 chaque méthode présente une efficacité différentielle préjudiciable à une analyse fine de la composition effective de la communauté bactérienne. La sensibilité de chaque méthode est la mesure du rapport du nombre de genre ou d'espèces détectées par chacune des méthodes sur le nombre total de genres et espèces détectées. La méthode 5, 3035409 16 avec une sensibilité de 77% des genres différents détectés et 70% d'espèces différentes détectées, est la plus représentative de la diversité de l'échantillon initial (tableau 1). 3) Diversité et abondance de l'ADN selon les différentes 5 méthodes d'extraction. La richesse est définie par le nombre de genres différents ou d'espèces différentes présents dans notre échantillon de selle étudié selon l'étude statistique décrite ci-après. 3.1) Etude statistique : 10 Les indices de la richesse et de la biodiversité des différents OTU ont été calculés en utilisant le logiciel mothur, avec la mise en oeuvre de l'indice de Chao1 et la formule non-paramétrique Shannon. La richesse est estimée par l'indice Chao1, alors que la diversité, dépendant de façon dont les séquences se répartissent de façon 15 uniforme sur les différents OTU, a été estimée en utilisant la formule de Shannon non paramétrique. Les courbes de raréfaction ont été calculées et tracées avec une combinaison de progiciels statistiques : mothur et R. A des analyses coordonnées principales (PCoA) au niveau du genre selon les dissemblances de Bray-Curtis a été réalisée en 20 utilisant les corrélations de QIIME. Les coefficients de Pearson entre les différentes méthodes d'extraction d'ADN ont été calculés au niveau du genre utilisant R. Ces matrices de corrélation ont ensuite été transformées dans des matrices de distance, où la distance = (1 - corrélation). Les essais ANOVA ont été utilisés pour identifier les 25 différences significatives entre les paramètres mesurés en fonction des différentes méthodes d'extraction de l'ADN. Pour comparer les méthodes d'extraction, les corrélations entre les différentes méthodes ont été calculées pour l'abondance relative aux niveaux phylum, de la famille et du genre en utilisant des méthodes statistiques non 30 paramétriques (test de Kruskal-Wallis). Enfin, nous avons calculé la sensibilité de chaque méthode d'extraction d'ADN au niveau des genres 3035409 17 et d'espèces par comparaison le nombre d'espèces détectées par chacune des méthodes d'extraction sur le nombre total de genres et espèces détectées. A titre de comparaison de données, nous avons utilisé le Logiciel Epi Info, version 6.0 (Centers for Disease Control and 5 Prevention, Atlanta, GA, USA 394). Une valeur de p <0,05 a été considérée comme significative. 3.2) On a comparé la diversité et l'abondance microbienne, selon les estimations de l'indice de Chaol (C du tableau 2), et évalué la biodiversité en utilisant l'indice de Shannon non paramétrique (D du 10 tableau 2), pour les différentes méthodes d'extraction d'ADN. On a constaté de grandes différences à la fois dans l'abondance de l'ADN des espèces et la diversité des espèces parmi les différentes méthodes (tableau 2 ci-après). Seules neuf espèces ont été détectées par toutes les méthodes d'extraction utilisées dans cette étude, soulignant la 15 difficulté d'obtenir une représentation de l'échantillon. La méthode d'extraction d'ADN 5 permet d'obtenir une abondance d'ADN associée à la diversité microbienne la plus élevée avec 129 espèces bactériennes séquencées (Figure 3). En revanche, la méthode d'extraction 8 n'a permis de détecter aucune espèce qui n'a pas été trouvé par 20 l'utilisation d'autres méthodes d'extraction d'ADN (figure 3). Tableau 2 extraction ADN A B C D Méthode 1 49,719 683 927 2.46 Méthode lb 13,016 320 448 2.42 Méthode 2 21,828 245 321 2.41 Méthode 3 35,648 437 609 1.37 Méthode 4 117,228 1,555 2,396 3.03 Méthode 5 46,059 1,841 2,714 3.81 Méthode 6 74,516 805 1,055 2.44 Méthode 7 9,322 231 344 2.31 Méthode 8 47,104 202 280 1.49 Method 9 273,155 2,127 2,349 3.79 Méthode 10 259,861 998 1,479 3.17 3035409 18 Exemple 2 : Extraction d'ADN d'un échantillon bactérien de Tropheryrna whipplei dans des sections de biopsie duodénale et lavages broncho-alvéolaire. La maladie de Whipple est une maladie infectieuse systémique 5 associée à la bactérie Tropheryrna whipplei. Le diagnostic repose sur la coloration acide périodique Schiff (en abrégé coloration PAS ») de sections de biopsie duodénale des patients. Toutefois, des discordances de résultats existent entre les méthodes d'analyse. En étudiant ces discordances par la technique de fluorescence in situ, les inventeurs 10 ont découvert selon la présente invention qu'une partie des bactéries étaient « imperméables » ou non réactives vis-à-vis des sondes nucléiques et/ ou anticorps du fait de la présence d'un biofilm bactérien. Les études selon la présente invention ont montré qu'un traitement enzymatique avec des enzymes glycosidases améliore la 15 détection de cette bactérie par des sondes nucléiques et/ou anticorps. On a sélectionné différents types de prélèvements humains de patients ayant la maladie de Whipple, pour lesquels on observait une discordance entre les analyses d'anatomopathologie qui se révélaient positives et celles de biologie moléculaire qui donnaient des résultats 20 négatifs. Ces échantillons regroupaient des biopsies duodénales et des lavages broncho-alveolaires. 1) 200 pl de lavage broncho-alvéolaires (BAL) et environ 100 pg de biopsies duodénales ont été congelés rapidement dans l'azote liquide.This method 8 differs essentially from the method 5 in that the enzymatic deglycosilation treatment is not preceded by mechanical lysis and comprises denaturation of proteins by proteinase. 9) Comparative extraction method 9. 500 μl of PBS buffer was added to 0.25 g of stool, which was then homogenized using a FastPrep ™ mechanical breaker (Biomedicals, Santa Ana, California, USA). ), (at 6.5m / s) according to the manufacturer's recommendations. The DNA was extracted using extraction method 1. 10) Extraction method 10. A frozen (-500 mg) aliquot of each sample was suspended in a solution containing 500 μl of extraction buffer [ 200 mM Tris (pH 8.0), 200 mM NaCl, 20 mM EDTA, 210 μl of 20% SDS, 500 μl of a mixture of phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1, pH 7). 9) and 500 μl of a slurry of 0.1 mm diameter zirconia / silica beads (Biospec Products, Bartlesville). The microbial cells were then lysed by mechanical rupture with a FastPrepC) apparatus for 2 min at room temperature (at 6.5m / sec), then the DNA was extracted with a mixture of phenol / chloroform / isoamyl alcohol and precipitation. with isopropanol, as previously described (11). B) Methods of DNA amplification and sequencing. Real-time PCRs were performed in triplicate on CFX96 devices (Bio-Rad Clinical Diagnostics, Marnes-la-Coquetter, France). The quality of the extraction was quantified by real-time PCR targeting human DNA, namely the sequence coding for the 13-globin gene. A threshold cycle (Ct: cycle threshold) below 34 Ct was considered positive. Universal PCR to bacteria targeting the 165 rDNA coding sequence (13) was performed with the Takyon NoRox Probe MasterMix UNG kit (Eurogentec, Seraing, Belgium) on all extracted DNAs. Sequencing: Real-time PCR-positive samples targeting 165 rDNA were sequenced by the Sanger method with an ABI 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Villebond Sur Yvette, France). The sequences were assembled with the CodonCode Aligner software and aligned against the GenBank nucleotide library (nr / nt). C) Results. 1) Analysis of a microbial population by high throughput pyrosequencing of V6 region of ribosomal DNA 165 (15). The samples included bacteria mainly phyla actinobacteria, pro teobacteria, verrucornicrobia, bacteroidetes and firrnicutes. Within the same species, or a bacterial community, there is genetic diversity (determined by the nucleotide sequence of the variable region of gene 165). An OTU (Operational Taxonomic Unit, OTU) is a grouping of individuals of the same species whose 165 rDNA sequences show a similarity of more than 97.5%. FIG. 1 shows the results of the rarefaction curves of the various extraction methods. Each point represents on the ordinate the number of different OTUs corresponding to the diversity of the samples as a function of the abundance of sequences in abscissa measured in log10. The largest number of different UTOs is obtained with extraction method 5 which differs widely from other extraction methods. All other methods achieve a lower UTO score, thus a lower representation of sample diversity, while sequence abundance is significantly higher. Extraction method 8 gives the lowest species diversity as shown in FIG. 1 and Table 1 below, which is explained by the presence of the action of proteinase which degrades the glycosidase enzymes. on the one hand and on the other hand the absence of prior mechanical lysis. Table 1 Extraction methods Genres. Sensitivity (0/0) Species detected Sensitivity (0/0) Method 1 68 20 111 15 Method 2 62 18 100 13 Method 3 110 33 155 19 Method 4 98 29 181 24 Method 5 258 77 522 70 Method 6 107 32 175 23 Method 7 55 16 98 13 Method 8 78 23 109 15 Method 9 47 14 103 14 Method 10 70 21 159 21 TOTAL 336 746 5 2) The Principal Coordinate Analysis method was used. or PCoA) which aims to graphically represent a resemblance / difference matrix between the extraction methods. The comparison reveals the differences in the apparent composition of the microbial communities obtained with the different methods of DNA extraction. It has been found that the share of microbial populations common to extraction methods represents a small portion of the sequenced populations. The different UTOs obtained for each method are not always the same, indicating that each method has a differential efficiency detrimental to a fine analysis of the effective composition of the bacterial community. The sensitivity of each method is the measurement of the ratio of the number of genus or species detected by each method to the total number of genera and species detected. Method 5, with a sensitivity of 77% of the different genera detected and 70% of different species detected, is the most representative of the diversity of the initial sample (Table 1). 3) Diversity and abundance of DNA according to the different extraction methods. Wealth is defined by the number of different genera or different species present in our stool sample studied according to the statistical study described below. 3.1) Statistical study: The indices of the wealth and biodiversity of the different OTUs were calculated using the mothur software, with the implementation of the Chao1 index and the non-parametric Shannon formula. The richness is estimated by the Chao1 index, while the diversity, depending on how the sequences are distributed uniformly over the different OTUs, was estimated using the non-parametric Shannon formula. The rarefaction curves were calculated and plotted with a combination of statistical packages: mothur and R. A Bray-Curtis gender-disaggregated principal co-ordinate analyzes (PCoA) were performed using QIIME correlations. The Pearson coefficients between different DNA extraction methods were calculated at the genus level using R. These correlation matrices were then transformed into distance matrices, where the distance = (1 - correlation). ANOVA assays were used to identify significant differences between the measured parameters as a function of different methods of DNA extraction. To compare the extraction methods, the correlations between the different methods were calculated for relative abundance at the phylum, family and genus levels using non-parametric statistical methods (Kruskal-Wallis test). Finally, we calculated the sensitivity of each DNA extraction method at the genus and species level by comparing the number of species detected by each of the extraction methods on the total number of genera and species detected. . As a comparison of data, we used Epi Info Software, version 6.0 (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA 394). A value of p <0.05 was considered significant. 3.2) Diversity and microbial abundance were compared, according to estimates of the Chaol index (C in Table 2), and biodiversity was assessed using the non-parametric Shannon index (D of Table 2), for different methods of DNA extraction. There were large differences in both the abundance of species DNA and species diversity among the different methods (Table 2 below). Only nine species were detected by all the extraction methods used in this study, highlighting the difficulty of obtaining a representation of the sample. The DNA extraction method achieves an abundance of DNA associated with the highest microbial diversity with 129 sequenced bacterial species (Figure 3). In contrast, extraction method 8 failed to detect any species that was not found by use of other DNA extraction methods (Figure 3). Table 2 DNA extraction ABCD Method 1 49,719 683 927 2.46 Method lb 13,016 320 448 2.42 Method 2 21,828 245 321 2.41 Method 3 35,648 437 609 1.37 Method 4 117,228 1,555 2,396 3.03 Method 5 46,059 1,841 2,714 3.81 Method 6 74,516 805 1,055 2.44 Method 7 9,322 231 344 2.31 Method 8 47.104 202 280 1.49 Method 9 273,155 2,127 2,349 3.79 Method 10 259,861 998 1,479 3.17 3035409 18 Example 2: Extraction of DNA from a bacterial sample of Tropheryrna whipplei in sections of duodenal biopsy and bronchoalveolar lavage. Whipple's disease is a systemic infectious disease associated with the bacterium Tropheryrna whipplei. Diagnosis is based on periodic acid staining Schiff (abbreviated PAS staining) of duodenal biopsy sections of patients. However, discrepancies of results exist between the methods of analysis. By studying these discrepancies by the in situ fluorescence technique, the inventors have discovered according to the present invention that some of the bacteria were "impermeable" or non-reactive with respect to the nucleic probes and / or antibodies because of the presence of a bacterial biofilm. The studies according to the present invention have shown that enzymatic treatment with glycosidase enzymes improves the detection of this bacterium by nucleic and / or antibody probes. Different types of human samples of patients with Whipple's disease were selected, for which there was a discrepancy between positive and negative molecular pathology analyzes that gave negative results. These samples included duodenal biopsies and bronchoalveolar lavage. 1) 200 μl of bronchoalveolar lavage (BAL) and approximately 100 μg of duodenal biopsies were rapidly frozen in liquid nitrogen.
25 Plus précisément, les échantillons ont été incubés une nuit à 56°C avec un mélange de 10 pL protéinase K et 190 pL de tampon de lyse G2 (Qiagen, Courtaboeuf, France). De la poudre de verre (Glass beads acid-washed 106 pm, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) a ensuite ajoutée et le mélange obtenu a été vigoureusement 30 broyé en utilisant un appareil FastPrep (MP Biomedicals, illkirch, France) pendant 60 sec à 6.5m/s. Les échantillons ont été centrifugés 3035409 19 30 sec à 13000 rpm (12000 g) avec une centrifugeuse 5424 (Eppendorf, Montesson, France) puis aliquotes en 4 tubes de 50 pL. 2) 2 protocoles différents ont été testés pour un traitement de déglycolysation additionnel ainsi qu'un protocole contrôle d'extraction 5 sans enzyme. a) Méthode d'extraction de contrôle Les échantillons ont été incubés 10min à 100°C puis extraits avec l'automate d'extraction EZ1 Advanced XL utilisant le kit EZ1 DNA Tissue (Qiagen, Courtaboeuf, France) selon les recommandations du fabricant, 10 en choisissant un volume d'élution d'ADN de 100 pl. b) Méthode de déglycosylation 1 Les aliquots ont subis une première étape d'incubation de 10min à 100°C avec 5,5 pL de 10X Glycoprotein Denaturing Buffer (New England BioLabs, Evry, France). Les enzymes suivantes ont ensuite été 15 ajoutées dans les échantillons: 2.5 pl d'EndoH (New England BioLabs), 0.5 pl de PNGase F, 0.5 pl d'a-(2->3,6,8,9)-Neuraminidase, 0.5 pl d'Oglycosidase, 0.5 pl de B-(1->4)-Galactosidase, 0.5 pl de B-NAcetylglucosaminidase et 9.5 pl 10X G5 Reaction Buffer issus du kit Enzymatic Protein Deglycosylation (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, USA) et 20 les mélanges ont été incubés sur la nuit à 37°C. Les ADN ont été extraits avec le protocole d'extraction de la méthode contrôle. Les enzymes ci-dessus étaient les suivantes : - EndoHf (Endo-N-Glycosidase recombinante) (New England Biolabs, catalog number= P07035) 25 - PNGase F (Endo-N-Glycosidase recombinante ) (Sigma= Catalog Number P2619) - 0-Glycosidase (endo-a-N-acetylgalactosaminidase de Streptococcus pneumonia) (Sigma= Catalog Number G1163) 3035409 20 -a-(2->3,6,8,9)-Neuraminidase (Sialidase A, exo-glycosidases de Arthrobacter ureafaciens recombinant, expressed in E. cou)) (Sigma= Catalog Number N8271) -13-(1->4)-Galactosidase (exo et endo activités from 5 Streptococcus pneumoniae expressed in E. cou i (Sigma= Catalog Number G0413) B-N-Acetylglucosaminidase (exo-glycosidases, Streptococcus pneumoniae recombinant expressed in E. cou) (Sigma= Catalog Number A6805) 10 3) PCR : Les PCR temps réel ont été réalisées en triplicata sur des appareils CFX96 (Bio-Rad clinical Diagnostics, Marnes-la-Coquetter, France). La qualité de l'extraction a été quantifiée par PCR temps réel en ciblant un ADN de référence, le gène humain de la 13-globine. Un 15 cycle seuil (Ct : cycle threshold) inférieur à 34 Ct était considéré comme acceptable. Les ADN extraits des patients présentant maladie de Whipple ont été testés pour la détection et la quantification de Tropheryrna whipplei (14) avec un système principal un système principal d'amplification du gène whi2 et un système secondaire de 20 confirmation du gène whi3 en cas de résultat positif (14). 4) Résultats La charge bactérienne totale des échantillons a été obtenue après une PCR quantitatvie en temps réel avec le système CFX96TM PCR en temps réel (Bio-Rad). On a utilisé un ensemble amorce-sonde 25 spécifique ciblant les gènes de T. whipplei, et d'un gène rapporteur de référence, la B-actine humaine. La sensibilité d'analyse de la PCR en temps réel ciblant ces gènes ont été déterminés dans des réactions en triplicata en utilisant des dilutions en série de raison 10 d'un titrage connu de T. whipplei produit en culture axénique.Specifically, the samples were incubated overnight at 56 ° C with a mixture of 10 μl proteinase K and 190 μl G2 lysis buffer (Qiagen, Courtaboeuf, France). Glass powder (Glass beads acid-washed 106 μm, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) was then added and the resulting mixture was vigorously milled using a FastPrep apparatus (MP Biomedicals, Illkirch, France). for 60 sec at 6.5m / s. The samples were centrifuged at 13000 rpm (12000 g) with a 5424 centrifuge (Eppendorf, Montesson, France) then aliquots into 4 tubes of 50 .mu.l. 2) 2 different protocols were tested for additional deglycolysis treatment as well as an extraction control protocol without enzyme. a) Control extraction method The samples were incubated for 10 min at 100 ° C. and then extracted with the EZ1 Advanced XL extraction automaton using the EZ1 DNA Tissue kit (Qiagen, Courtaboeuf, France) according to the manufacturer's recommendations, 10 choosing a DNA elution volume of 100 μl. b) Deglycosylation Method 1 The aliquots underwent a first incubation step of 10 min at 100 ° C. with 5.5 μl of 10X Glycoprotein Denaturing Buffer (New England BioLabs, Evry, France). The following enzymes were then added to the samples: 2.5 μl of EndoH (New England BioLabs), 0.5 μl of PNGase F, 0.5 μl of α- (2-> 3,6,8,9) -Neuraminidase, 0.5 μl of Oglycosidase, 0.5 μl of B- (1-> 4) -Galactosidase, 0.5 μl of B-NAcetylglucosaminidase and 9.5 μl of 10X G5 Reaction Buffer from the Enzymatic Protein Deglycosylation Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) and the mixtures were incubated overnight at 37 ° C. The DNAs were extracted with the extraction protocol of the control method. The above enzymes were as follows: EndoHf (recombinant Endo-N-Glycosidase) (New England Biolabs, catalog number = P07035) PNGase F (Recombinant Endo-N-Glycosidase) (Sigma = Catalog Number P2619) Glycosidase (Streptococcus pneumonia endo-α-acetylgalactosaminidase) (Sigma = Catalog Number G1163) -α- (2-> 3,6,8,9) -Neuraminidase (Sialidase A, recombinant Arthrobacter ureafaciens exo-glycosidases, expressed in E. coli)) (Sigma = Catalog Number N8271) -13- (1-> 4) -Galactosidase (exo and endo activities from Streptococcus pneumoniae expressed in E. coli (Sigma = Catalog Number G0413) BN-Acetylglucosaminidase (exo-glycosidases, recombinant Streptococcus pneumoniae expressed in E. coli) (Sigma = Catalog Number A6805) 3) PCR: Real-time PCRs were performed in triplicate on CFX96 devices (Bio-Rad clinical Diagnostics, Marnes-la- Coquetter, France). The quality of the extraction was quantified by real-time PCR by targeting a reference DNA, the human gene of 13-globin. A threshold cycle (Ct: cycle threshold) below 34 Ct was considered acceptable. DNAs extracted from patients with Whipple's disease were tested for the detection and quantification of Tropheryrna whipplei (14) with a main system a major system of amplification of the whi2 gene and a secondary system of confirmation of the whi3 gene in case of positive result (14). 4) Results The total bacterial load of the samples was obtained after real-time quantitative PCR with the real-time CFX96TM PCR system (Bio-Rad). A specific primer-probe set targeting T. whipplei genes, and a reference reporter gene, human B-actin, were used. Real-time PCR assay sensitivity targeting these genes was determined in triplicate reactions using serial dilutions from a known T. whipplei assay produced in axenic culture.
3035409 21 On a travaillé sur des échantillons de patients atteints de la maladie de Whipple, préalablement analysés dans notre laboratoire et qui présentaient une réactivité positive en immunohistochimie (IHC) et une réactivité négative en PCR standard (DB1 à DB5) en parallèle d'un 5 échantillon contrôle positif (IHC+, PCR+) et d'un échantillon contrôle négatif (IHC -, PCR-). La détection et la quantification par RT-qPCR des séquences de T. whipplei dans 5 biopsies duodénales DB1 à DB5 (Figure 4A) et 13 lavages broncho-alvéolaires Cl à C13 (Figures 4B) des échantillons de patients effectuées après glycosidases ont été 10 comparées à celles des mêmes échantillons non traités (témoin négatif Tneg et témoin positif Tpos). Les résultats rapportés sur les figures 4A et 4B montrent que le traitement par glycosidases des échantillons cliniques favorise la détection de l'ADN de T. whipplei de manière très significative (p=0.0003).3035409 21 We studied samples of patients with Whipple's disease, previously analyzed in our laboratory, who had positive immunohistochemistry (IHC) reactivity and negative reactivity in standard PCR (DB1 to DB5) in parallel with 5 positive control sample (IHC +, PCR +) and a negative control sample (IHC-, PCR-). The RT-qPCR detection and quantification of T. whipplei sequences in 5 duodenal biopsies DB1 to DB5 (FIG. 4A) and 13 bronchoalveolar lavages C1 to C13 (FIG. 4B) of the patient samples performed after glycosidases were compared. to those of the same untreated samples (Tneg negative control and Tpos positive control). The results reported in FIGS. 4A and 4B show that the glycosidase treatment of clinical samples promotes the detection of T. whipplei DNA very significantly (p = 0.0003).
15 Exemple 3 : Extraction d'ADN de T. whipplei cultivé à partir de culture axénique. On a utilisé un ensemble de T. whipplei cultivé à partir de culture axénique et une aliquot de l'ADN humain purifié pour servir de témoin externe et l'étalonnage de référence. De ce mélange, on a fait trois 20 aliquotes; la première a été traitée avec un cocktail de glycosidases selon la méthode de glycosylation 1, la seconde avec le lysozyme, le dernier n'a reçu aucun traitement. De chacune des trois aliquotes on a généré trois aliquotes supplémentaires, une de chaque pour l'amplification spécifique par PCR 25 quantitative en temps réel (qPCR) du gène whi2 gène de T. whipplei, une amplification pour le gène p-actine humain. Toutes les amplifications ont été réalisées en triple. La méthode de détermination de la concentration d'un échantillon d'ADN, ou AACt, est l'un des moyens les plus populaires pour déterminer les différences de 30 concentrations entre des échantillons et est basé sur la normalisation avec un gène de référence unique. Le AACt est la différence entre les valeurs de Ct (ACt ech) des échantillons traités ou non, normalisé avec 3035409 22 les valeurs du gène de référence unique le gène p-actine humain traité ou non (ACt actine). L'analyse statistique: Le niveau tout au long de l'étude de signification a été fixé à la valeur P <0,01 en utilisant un logiciel 5 statistique standard pour les analyses (Logiciel Epi Info). La figure 5 représente l'efficacité du traitement mesurée par la quantification de l'ADN par RT-qPCR. L'axe y du graphique représente la variation de la détection du seuil ou le 2AACT (obtenu l'amplification whi2 de T. whipplei, et le gène de p-actine sur les échantillons traités 10 ou non comme indiqué dans le panneau de droite. Les traitements sont réalisés directement sur les échantillons avant extraction (directe) soit après extraction de l'ADN (EZ1), comme indiqué dans l'axe X-. Comme le montre la figure 5, la détection de T. whipplei par qPCR du gène whi2 est amélioré par le prétraitement de 15 déglycosylation avec le cocktail de glycosidase par rapport aux témoins non traités (moyenne de Ct: 13,23 ± 0,93 vs 20,46 ± 0,13 ; -1(2-<0.05). L'amélioration de la sensibilité de la PCR whi2 est de 274 fois (= 2-AACT). L'amplification de la cible de référence, p-actine humaine, était quasi identique entre les échantillons traités avec les 20 glycosidases (moyenne: 27,73 ± 0,37), et ceux non traités (26,99 ± 0,03), indiquant une bonne reproductibilité entre chaque essai d'une part et confirmant que l'amélioration pour Wh12 résulte bien d'une meilleure extraction et non d'une meilleure amplification (-1(2->0.05). Pour chaque gène, on n'a observé aucune différence significative entre 25 chacune des trois réactions individuelles de qPCR (moins de 0,5 de cycles, p <0,01). Comme montré précédemment avec qPCR directe, l'élimination des glycanes facilite la lyse de T. whipplei et l'extraction de l'ADN, ce qui augmente par conséquent la détection de plus de 2 log de base10 (>200) (figure 5).Example 3: Extraction of T. whipplei DNA grown from axenic culture. A set of T. whipplei grown from axenic culture and an aliquot of the purified human DNA were used as external control and reference calibration. From this mixture, three aliquots were made; the former was treated with a glycosidase cocktail according to glycosylation method 1, the second with lysozyme, the latter received no treatment. From each of the three aliquots were generated three additional aliquots, one of each for the specific quantitative real-time PCR amplification (qPCR) of the whi2 gene of T. whipplei, an amplification for the human p-actin gene. All amplifications were performed in triplicate. The method of determining the concentration of a DNA sample, or AACt, is one of the most popular means for determining the differences in concentrations between samples and is based on normalization with a single reference gene. The AACt is the difference between the Ct (ACt ech) values of the samples treated or not, normalized with the values of the single reference gene, the human p-actin gene treated or not (ACt actin). Statistical Analysis: The level throughout the significance study was set at P <0.01 using standard statistical software for analysis (Epi Info Software). FIG. 5 represents the efficiency of the treatment measured by the quantification of the DNA by RT-qPCR. The y-axis of the graph represents the change in threshold detection or 2AACT (obtained whi2 amplification of T. whipplei, and the p-actin gene on samples treated or not as indicated in the right panel. The treatments are carried out directly on the samples before extraction (direct) or after extraction of the DNA (EZ1), as indicated in the axis X. As shown in Figure 5, the detection of T. whipplei by qPCR of the gene whi2 is enhanced by the pretreatment of deglycosylation with the glycosidase cocktail compared to untreated controls (Ct average: 13.23 ± 0.93 vs 20.46 ± 0.13; -1 (2- <0.05). The sensitivity enhancement of whi2 PCR is 274 fold (= 2-AACT) .The amplification of the reference target, human p-actin, was almost identical between samples treated with glycosidases (mean: 27 , 73 ± 0.37), and untreated (26.99 ± 0.03), indicating good reproducibility between each test on the one hand and confirming that the improvement for Wh12 results from a better extraction and not a better amplification (-1 (2-> 0.05). For each gene, no significant difference was observed between each of the three individual reactions of qPCR (less than 0.5 cycles, p <0.01). As previously shown with direct qPCR, removal of glycans facilitates lysis of T. whipplei and DNA extraction, thereby increasing detection of more than 2 log base (> 200) (Figure 5). .
30 3035409 23 Références Bibliographiques 1. Henderson,G. et al. Effect of DNA extraction methods and sampling techniques on the apparent structure of cow and sheep rumen microbial communities. PLoS. One. 8, e74787 (2013). 5 2. McOrist,A.L., Jackson,M., & Bird,A.R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. J. Microbiol Methods 50, 131139 (2002). 3. Schrader,C., Schielke,A., Ellerbroek,L., & Johne,R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012). 10 4. Ariefdjohan,M.W., Savaiano,D.A., & Nakatsu,C.H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutr J. 9, 23 (2010). 5. Oikarinen,S. et al. PCR inhibition in stool samples in relation to age of infants. J. Clin. Virol. 44, 211-214 (2009). 15 6. Costerton,J.W., Stewart,P.S., & Greenberg,E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science 284, 1318-1322 (1999). 7. Furukawa,K. & Bhavanandan,V.P. Influences of anionic polysaccharides on DNA synthesis in isolated nuclei and by DNA polymerase alpha: correlation of observed effects with properties of the polysaccharides. Biochim. Biophys. Acta 740, 20 466-475 (1983). 8. Monteiro,L. et al. Complex polysaccharides as PCR inhibitors in feces: Helicobacter pylori model. J. Clin. Microbiol. 35, 995-998 (1997). 9. Cavallini,A., Notarnicola,M., Berloco,P., Lippolis,A., & De,L.A. Use of macroporous polypropylene filter to allow identification of bacteria by PCR in human 25 fecal samples. J. Microbiol. Methods 39, 265-270 (2000). 3035409 24 10. Zoetendal,E.G. et al. Isolation of RNA from bacterial samples of the human gastrointestinal tract. Nat. Protoc. 1, 954-959 (2006). 11. Turnbaugh,P.J. et al. A core gut microbiome in obese and lean twins. Nature 457, 480-484 (2009). 5 12. Mediannikov,O., Fenollar,F., Socoloyschi,C., Diatta,G., Bassene,H., Molez,JF., Sokhna,C., Trape,JF., RaoultD. Coxiella burnetii in humans and ticks in rural Senegal. PLoS Negl Trop Dis.3035409 23 Bibliographic References 1. Henderson, G. et al. Effect of DNA extraction methods and sampling techniques on the apparent structure of cow and sheep rumen microbial communities. PLoS. One. 8, e74787 (2013). 2. McOrist, A. L., Jackson, M., & Bird, A.R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. J. Microbiol Methods 50, 131139 (2002). 3. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., & Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012). 4. Ariefdjohan, M.W., Savaiano, D.A., & Nakatsu, C.H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutr J. 9, 23 (2010). 5. Oikarinen, S. et al. PCR inhibition in stool samples in relation to age of infants. J. Clin. Virol. 44, 211-214 (2009). 6. Costerton, J.W., Stewart, P.S., & Greenberg, E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science 284, 1318-1322 (1999). 7. Furukawa, K. & Bhavanandan, V.P. Influence of anionic polysaccharides on DNA synthesis in isolated nuclei and by DNA polymerase alpha: correlation of observed effects with properties of polysaccharides. Biochim. Biophys. Acta 740, 466-475 (1983). 8. Monteiro, L. et al. Complex polysaccharides as PCR inhibitors in feces: Helicobacter pylori model. J. Clin. Microbiol. 35, 995-998 (1997). 9. Cavallini, A., Notarnicola, M., Berloco, P., Lippolis, A., & De, L.A. Use of macroporous polypropylene filters to allow identification of bacteria by PCR in human 25 fecal samples. J. Microbiol. Methods 39, 265-270 (2000). 3035409 24 10. Zoetendal, E.G. et al. Isolation of RNA from bacterial samples of the human gastrointestinal tract. Nat. Protoc. 1, 954-959 (2006). 11. Turnbaugh, P.J. et al. A core gut microbiome in obese and lean twins. Nature 457, 480-484 (2009). 12. Mediannikov, O., Fenollar, F., Socoloyschi, C., Diatta, G., Bassene, H., Molez, JF., Sokhna, C., Trape, JF, RaoultD. Coxiella burnetii in humans and ticks in rural Senegal. PLoS Negl Trop Dis.
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