FR3031112A1 - DNA CONSTRUCTION FOR THE TREATMENT OF OCULAR DISEASES - Google Patents
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Abstract
La présente invention propose une méthode de traitement des pathologies oculaires par thérapie génique non virale. La méthode selon l'invention concerne plus particulièrement une construction d'ADN permettant la production ciblée intraoculaire de protéines thérapeutiques durant une période pouvant aller jusqu'à plusieurs mois. L'utilisation de ladite construction d'ADN pour le traitement de pathologies oculaires par thérapie génique non virale est également décrite. La construction d'ADN et son utilisation selon l'invention sont plus particulièrement adaptées au traitement des pathologies de la rétine par le biais d'une injection de la construction d'ADN dans le muscle ciliaire suivie d'un électrotransfert pour la production durable et intraoculaire d'une protéine thérapeutique d'intérêt.The present invention provides a method of treating ocular pathologies by non-viral gene therapy. The method according to the invention relates more particularly to a DNA construct for the targeted intraocular production of therapeutic proteins for a period of up to several months. The use of said DNA construct for the treatment of ocular pathologies by non-viral gene therapy is also described. The DNA construct and its use according to the invention are more particularly adapted to the treatment of pathologies of the retina by injecting the DNA construct into the ciliary muscle followed by electrotransfer for sustainable production and intraocular lens of a therapeutic protein of interest.
Description
CONSTRUCTION D'ADN POUR LE TRAITEMENT DE PATHOLOGIES OCULAIRES La présente invention propose une méthode de traitement des pathologies oculaires par thérapie génique non virale. La méthode selon l'invention concerne plus particulièrement une construction d'ADN permettant la production ciblée intraoculaire de protéines thérapeutiques durant une période pouvant aller jusqu'à plusieurs mois. L'utilisation de ladite construction d'ADN pour le traitement de pathologies oculaires par thérapie génique non virale est également décrite. La construction d'ADN et son utilisation selon l'invention sont plus particulièrement adaptées au traitement des pathologies de la rétine par le biais d'une injection de la construction d'ADN dans le muscle ciliaire suivie d'un électrotransfert pour la production durable et intraoculaire d'une protéine thérapeutique d'intérêt. La cécité liée aux maladies métaboliques, inflammatoires ou à l'âge est en forte croissance et pose un problème de société de plus en plus significatif en Europe et dans le monde en terme de santé publique. Les causes principales de cécité sont liées à des pathologies de la rétine parmi lesquelles la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), les rétinopathies diabétiques (RD) et l'uvéite. La dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) entrainant une cécité a une prévalence de l'ordre de 8,7%, affecte près de 26% de la population de 50 ans et plus. La DMLA devient un problème majeur de santé publique et social en raison de l'accroissement de l'âge de la population. L'augmentation constante et majeure de l'incidence du diabète est la cause majeure des rétinopathies diabétiques (RD) qui deviennent à leur tour une priorité de santé publique et de recherche scientifique. Les statistiques montrent que le diabète de type II touchera d'ici 2030 plus de 4,5% de la population dont près de 30% souffrira de rétinopathie diabétique. Enfin, l'uvéite représente un groupe de maladies inflammatoires oculaires dont la prévalence est estimée à 1/1000 et l'incidence à 0,5/1000. L'uvéite est responsable de 10% des cas de cécité et a donc, bien que plus rare que les maladies précédentes, un impact social et économique majeur chez de jeunes patients en âge de travailler. Pour traiter ces pathologies, des injections intraoculaires d'agents thérapeutiques ont été développées. En 2006, les premières protéines thérapeutiques de type anti-VEGF (pour Vascular Endothelial Growth Factor ou facteur de croissance de l'endothélium vasculaire) ont été administrées par voie intraoculaire pour le traitement des néovascularisations choroïdiennes de la DMLA. On citera notamment en tant qu'exemple de protéine de type anti-VEGF le Lucentis® (ranibizumab) qui a obtenu une autorisation de mise sur le marché 3031112 2 pour le traitement des néovascularisations choroïdiennes de la DMLA et de l'oedème diabétique maculaire. Les injections intraoculaires de protéines thérapeutiques, et notamment de protéines recombinantes, sont devenues depuis communes pour le traitement des oedèmes maculaires de la DMLA, de la rétinopathie diabétique et des occlusions veineuses.The present invention provides a method for treating ocular pathologies by nonviral gene therapy. The method according to the invention relates more particularly to a DNA construct for the targeted intraocular production of therapeutic proteins for a period of up to several months. The use of said DNA construct for the treatment of ocular pathologies by non-viral gene therapy is also described. The DNA construct and its use according to the invention are more particularly adapted to the treatment of pathologies of the retina by injecting the DNA construct into the ciliary muscle followed by electrotransfer for sustainable production and intraocular lens of a therapeutic protein of interest. Blindness related to metabolic diseases, inflammatory diseases or age is growing rapidly and poses an increasingly significant social problem in Europe and worldwide in terms of public health. The main causes of blindness are related to retinal pathologies including age-related macular degeneration (AMD), diabetic retinopathy (DR) and uveitis. Age-related macular degeneration (AMD) leading to blindness has a prevalence of about 8.7%, affecting nearly 26% of the population aged 50 and over. AMD becomes a major public health and social problem due to the increasing age of the population. The constant and major increase in the incidence of diabetes is the major cause of diabetic retinopathies (DR), which in turn become a priority for public health and scientific research. Statistics show that by 2030, type II diabetes will affect more than 4.5% of the population, nearly 30% of whom will suffer from diabetic retinopathy. Finally, uveitis represents a group of ocular inflammatory diseases whose prevalence is estimated at 1/1000 and the incidence at 0.5 / 1000. Uveitis is responsible for 10% of blindness cases and therefore, although rarer than previous illnesses, has a major social and economic impact on young patients of working age. To treat these pathologies, intraocular injections of therapeutic agents have been developed. In 2006, the first anti-VEGF (for Vascular Endothelial Growth Factor) therapeutic proteins were administered intraocularly for the treatment of choroidal neovascularizations of AMD. In particular, as an example of anti-VEGF protein, Lucentis® (ranibizumab) has been granted marketing authorization 3031112 2 for the treatment of choroidal neovascularizations of AMD and macular diabetic edema. Intraocular injections of therapeutic proteins, including recombinant proteins, have since become common for the treatment of macular edema of AMD, diabetic retinopathy and venous occlusions.
5 Afin d'assurer un effet continu sur les pathologies oculaires, les anti-VEGF décrits ci-dessus sont administrés une fois par mois ou au mieux une fois tous les deux mois selon les patients. Il y a donc une nécessité de suivi de chaque patient afin de déterminer la fréquence d'administration des anti-VEGF pour que le traitement soit pleinement efficace. Par ailleurs, cette méthode de traitement induit des variations du taux de protéine thérapeutique dans la 10 sphère oculaire du patient, à savoir une concentration importante lors de l'injection (un pic) et une concentration qui s'amenuise petit à petit pour tendre vers zéro jusqu'à l'injection suivante. La concentration en protéine thérapeutique n'est donc pas régulière et de nombreux effets secondaires sont reportés avec ce mode d'administration. Parmi les pathologies oculaires, l'uvéite est définie comme un processus inflammatoire qui 15 affecte l'iris, le corps ciliaire ou la choroïde de l'oeil du patient, ces trois éléments formant l'uvée. C'est un terme générique qui couvre plusieurs pathologies différentes dont les causes demeurent inconnues mais sont généralement de deux types : les uvéites infectieuses et les uvéites non infectieuses. On distingue l'uvéite antérieure qui touche l'iris ou le corps ciliaire et est la plus commune des uvéites dans les pays de l'ouest, de l'uvéite intermédiaire qui 20 touche le vitré antérieur, et l'uvéite postérieure qui touche la choroïde et la rétine. L'uvéite non infectieuse a souvent une composante autoimmune. L'uvéite antérieure aigue associée à l'antigène HLA-B27 représente la première cause d'uvéite (Rothova et a 1., Br Jr Ophthalmol. 1992; 76:137-41). Par ailleurs on retrouve des uvéites antérieures associées à de nombreuses maladies rhumatologiques telles la sarcoïdose. L'uvéite postérieure de cause non infectieuse 25 est le plus souvent associée à la maladie de Behçet, à la maladie de Vogt Koyanagi Harada, à la chorio-rétinopathie de Birdshot, etc. Le traitement avec des corticoïdes par voie orale et/ou topique est largement utilisé dans le traitement des uvéites postérieures non infectieuses. De plus, pour les pathologies les plus réfractaires, des immunosuppresseurs peuvent être ajoutés au traitement pour augmenter les 30 effets anti-inflammatoires des corticostéroïdes. Ceci concerne notamment mais pas exclusivement la cyclosporine, le methotrexate, l'azathioprine, le mycophénolate mofétil, le tacrolimus et le chlorambucil. Depuis une dizaine d'années des traitements utilisant des anticorps anti-TNF alpha peuvent également été utilisés hors prescription AMM (hors label).In order to ensure a continuous effect on ocular pathologies, the anti-VEGFs described above are administered once a month or at best once every two months depending on the patients. There is therefore a need for monitoring each patient to determine the frequency of anti-VEGF administration for the treatment to be fully effective. Moreover, this method of treatment induces variations in the level of therapeutic protein in the ocular sphere of the patient, namely a high concentration during the injection (a peak) and a concentration which gradually fades to tend towards zero until the next injection. The therapeutic protein concentration is therefore not regular and many side effects are reported with this mode of administration. Among the ocular pathologies, uveitis is defined as an inflammatory process which affects the iris, ciliary body or choroid of the patient's eye, these three elements forming the uvea. It is a generic term that covers several different pathologies whose causes remain unknown but are generally of two types: infectious uveitis and non-infectious uveitis. There is anterior uveitis which affects the iris or ciliary body and is the most common uveitis in the western countries, intermediate uveitis which affects the anterior vitreous, and posterior uveitis which affects the uveitis. choroid and retina. Noninfectious uveitis often has an autoimmune component. Acute anterior uveitis associated with the HLA-B27 antigen represents the primary cause of uveitis (Rothova et al., Br Jr Ophthalmol, 1992; 76: 137-41). In addition, there are anterior uveitis associated with many rheumatic diseases such as sarcoidosis. Posterior uveitis of non-infectious cause is most commonly associated with Behçet's disease, Vogt Koyanagi Harada's disease, Birdshot chorioretinopathy, etc. Treatment with oral and / or topical corticosteroids is widely used in the treatment of non-infectious posterior uveitis. In addition, for the most refractory conditions, immunosuppressants may be added to the treatment to increase the anti-inflammatory effects of corticosteroids. This includes but is not limited to cyclosporine, methotrexate, azathioprine, mycophenolate mofetil, tacrolimus and chlorambucil. For the past ten years, treatments using anti-TNF alpha antibodies have also been used outside the AMM (out-of-label) prescription.
3031112 3 Des essais cliniques portant sur l'utilisation des composés thérapeutiques suivants : cyclosporine A, rapamycine, tacrolimus, et anti-TNF alpha, ont été menés pour évaluer l'efficacité et la sureté de ces composés et ainsi pouvoir traiter des pathologies oculaires autoimmunes comme la maladie de Behçet. Il a cependant été montré que l'administration 5 systémique de ces composés thérapeutiques conduit à long terme à de nombreux effets secondaires et que pour certains d'entre eux, leur administration locale présente peu d'efficacité ou une mauvaise tolérance par le patient. Les méthodes de traitement décrites ci-dessus présentent donc plusieurs inconvénients. Les composés thérapeutiques administrés par voie systémique et topique entrainent de très 10 nombreux effets secondaires. Les protéines recombinantes administrées par injections intra vitréennes doivent être administrées fréquemment avec des fluctuations importantes des concentrations entre chaque administration. La répétition de ces injections qui restent extremement stressantes pour les patients engendrent également des effets secondaires importants (décollement du vitré, hémmorragies, déchirure rétinienne, etc). Ainsi au final de 15 nombreux patients renoncent à leur traitement. La présente invention propose une construction d'ADN et son utilisation pour le traitement de pathologies oculaires. La présente invention permet de diminuer le nombre et/ou la fréquence des interventions du chirurgien et donc de réduire l'aspect invasif des injections intra oculaires tout en assurant une production stable et constante de protéines thérapeutiques 20 pendant une durée de plusieurs mois. Ainsi l'invention décrit une construction d'ADN destinée au transfert non viral d'acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d'un patient, qui comprend une origine de réplication, un promoteur permettant son expression dans la sphère oculaire du patient, une ou plusieurs séquences favorisant l'expression de l'ADN dans la sphère oculaire du patient, et un polynucléotide codant pour 25 une protéine thérapeutique sélectionnée pour son activité dans le traitement des pathologies oculaires, ladite construction étant amenée dans la sphère oculaire par injection directe dans le muscle ciliaire suivie d'un électrotransfert. La construction d'ADN selon l'invention est de forme linéaire ou circulaire, préférentiellement de forme circulaire. Dans un mode de réalisation particulier, la 30 construction d'ADN selon l'invention est un plasmide circulaire. Dans un mode de réalisation particulier la construction d'ADN est une construction d'ADN nu.Clinical trials involving the use of the following therapeutic compounds: cyclosporin A, rapamycin, tacrolimus, and anti-TNF alpha have been conducted to evaluate the efficacy and safety of these compounds and thus be able to treat autoimmune ocular pathologies. like Behçet's disease. However, it has been shown that the systemic administration of these therapeutic compounds leads in the long term to many side effects and that for some of them, their local administration has little efficacy or poor tolerance by the patient. The treatment methods described above therefore have several disadvantages. Therapeutic compounds administered systemically and topically have many side effects. Recombinant proteins administered by intra vitreous injections should be administered frequently with significant fluctuations in concentrations between each administration. The repetition of these injections, which remain extremely stressful for the patients, also generates significant side effects (vitreous detachment, hemorrhages, retinal tear, etc.). Thus in the end of 15 many patients give up their treatment. The present invention provides a DNA construct and its use for the treatment of ocular pathologies. The present invention makes it possible to reduce the number and / or the frequency of the surgeon's operations and thus to reduce the invasive aspect of the intraocular injections while ensuring stable and constant production of therapeutic proteins for a period of several months. Thus, the invention describes a DNA construct for the non-viral transfer of nucleic acids into muscle cells of the ocular sphere of a patient, which comprises an origin of replication, a promoter allowing its expression in the ocular sphere of the patient. , one or more sequences promoting the expression of the DNA in the ocular sphere of the patient, and a polynucleotide encoding a therapeutic protein selected for its activity in the treatment of ocular pathologies, said construct being brought into the ocular sphere by injection direct in the ciliary muscle followed by electrotransfer. The DNA construct according to the invention is of linear or circular shape, preferably of circular shape. In a particular embodiment, the DNA construct according to the invention is a circular plasmid. In a particular embodiment, the DNA construct is a naked DNA construct.
3031112 4 La construction d'ADN selon l'invention est injectée dans un muscle oculaire où elle est soumise à un électrotransfert. La technique connue de thérapie génique non virale utilisée dans la présente invention est l'injection de la construction d'ADN dans un muscle oculaire puis l'électrotransfert pour induire une perméabilisation transitoire des cellules du muscle 5 ciliaire et une migration de l'ADN pour optimiser la transfection de la construction d'ADN. Cette technique d'électrotransfert d'ADN (appelée aussi électroporation ou électroperméabilisation) est la plus simple et sûre des méthodes de thérapie génique car elle est facile à mettre en oeuvre, fiable et sûre pour le patient. On lui préfère souvent d'autres méthodes car le taux de transfection de l'ADN est faible par rapport au taux d'expression des 10 vecteurs viraux par exemple. L'un des inconvénients de l'utilisation de vecteurs viraux est l'induction de réponses immunitaires auxdits vecteurs viraux ce qui diminue leur efficacité ultérieure. De plus, les études menées sur les lentivirus et les rétrovirus montrent que ces derniers sont susceptibles d'induire des mutations d'insertion durant leur intégration dans le génome hôte. Les constructions d'ADN ne présentent pas ce type d'inconvénients, sont 15 faciles à produire et à manipuler et n'induisent pas de réponse immunitaires les rendant ainsi parfaitement adaptés à la thérapie génique de patients humains. Selon la présente invention, l'injection de la construction d'ADN se fait dans le muscle ciliaire car ce dernier est capable de produire les protéines de façon homogène et constante et du fait de sa position, favorise la diffusion de ces protéines dans l'ensemble de la sphère 20 oculaire (Bloquel et al. "Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis", FASEB 1 2006 Feb;20(2):389-91; Touchard "The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potetial for sustained intraocular production of therapeutic proteins", J Gene Med.The DNA construct according to the invention is injected into an ocular muscle where it is subjected to electrotransfer. The known nonviral gene therapy technique used in the present invention is the injection of the DNA construct into an ocular muscle and then the electrotransport to induce transient permeabilization of the ciliary muscle cells and migration of the DNA to optimize transfection of the DNA construct. This technique of electrotransfer of DNA (also called electroporation or electropermeabilization) is the simplest and safest method of gene therapy because it is easy to implement, reliable and safe for the patient. Other methods are often preferred because the rate of transfection of the DNA is low relative to the level of expression of the viral vectors, for example. One of the disadvantages of using viral vectors is the induction of immune responses to said viral vectors which decreases their subsequent effectiveness. In addition, studies on lentiviruses and retroviruses show that they are likely to induce insertion mutations during their integration into the host genome. DNA constructs do not have such disadvantages, are easy to produce and manipulate, and do not induce an immune response thereby making them well suited to gene therapy of human patients. According to the present invention, the DNA construct is injected into the ciliary muscle because the latter is able to produce the proteins in a homogeneous and constant manner and, because of its position, promotes the diffusion of these proteins into the ciliary muscle. whole of the ocular sphere (Bloquel et al., "Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis", FASEB 1 2006 Feb; 20 (2): 389-91; Touchard "The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potency for sustained intraocular production of therapeutic proteins ", J Gene Med.
2010 Nov;12(11):904-19). Les cellules musculaires lisses ont un taux de renouvellement faible et 25 sont bien réparties de part et d'autre du cristallin. La quantité de protéine à produire est proportionnelle à la surface du muscle transfecté (Touchard "The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potetial for sustained intraocular production of therapeutic proteins", J Gene Med.2010 Nov; 12 (11): 904-19). The smooth muscle cells have a low turnover rate and 25 are well distributed on both sides of the lens. The amount of protein to be produced is proportional to the area of the transfected muscle (Touchard "The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potency for sustained intraocular production of therapeutic proteins", J Gene Med.
2010 Nov;12(11):904-19). Ainsi, la production de protéines thérapeutiques sera homogène et constante dans l'ensemble de la sphère oculaire et 30 sera limitée à cette sphère oculaire. On citera à titre d'exemple la méthode d'électrotransfert décrite dans la demande de brevet EP2266656 qui traite d'une méthode d'injection d'une composition pouvant contenir de l'ADN au niveau des tissus du corps ciliaire et/ou des tissus musculaires extraoculaires. Dans un mode de réalisation préféré, l'électrotransfert selon la présente invention se fait à l'aide d'un dispositif oculaire (tel que décrit dans le brevet 3031112 5 EP2266656) et d'un générateur électrique délivrant une séquence de 8 pulses électriques de 10ms et de 200V/cm à 700V/cm ou 1 pulse de 100ns à 10ms et de 200V/cm à 700V/cm suivi de 1 à 5 pulses de 50 à 200V/cm et de 10ms. Le muscle ciliaire fait partie du corps ciliaire, proche du limbe et juste derrière la sclère.2010 Nov; 12 (11): 904-19). Thus, the production of therapeutic proteins will be homogeneous and constant throughout the ocular sphere and will be limited to this ocular sphere. By way of example, mention may be made of the electrotransfer method described in patent application EP2266656, which deals with a method for injecting a composition that may contain DNA at the tissues of the ciliary body and / or tissues. extraocular muscle. In a preferred embodiment, the electrotransport according to the present invention is carried out by means of an ocular device (as described in patent 3031112 EP2266656) and an electrical generator delivering a sequence of 8 electrical pulses of 10ms and 200V / cm at 700V / cm or 1 pulse of 100ns at 10ms and 200V / cm at 700V / cm followed by 1 to 5 pulses of 50 to 200V / cm and 10ms. The ciliary muscle is part of the ciliary body, close to the limb and just behind the sclera.
5 L'injection de la construction d'ADN dans celui-ci est donc très faiblement invasive contrairement aux injections sous-rétiniennes et constitue donc le lieu préféré d'injection de la construction d'ADN selon l'invention. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, l'invention porte sur une construction d'ADN nu destinée au transfert non viral d'acides nucléiques dans les cellules du muscle ciliaire d'un patient, qui comprend une origine de réplication, un 10 promoteur permettant son expression dans les cellules du muscle ciliaire du patient, et/ou une ou plusieurs séquences favorisant l'expression de l'ADN dans le muscle ciliaire du patient, et un polynucléotide codant pour une protéine thérapeutique sélectionnée pour son activité dans le traitement des pathologies oculaires, ladite construction étant amenée dans le muscle ciliaire par injection directe suivie d'un électrotransfert.Injection of the DNA construct therein is therefore very weakly invasive in contrast to subretinal injections and thus is the preferred injection site for the DNA construct according to the invention. Thus, in a preferred embodiment, the invention relates to a naked DNA construct for non-viral transfer of nucleic acids into ciliary muscle cells of a patient, which comprises an origin of replication, a promoter allowing expression thereof in the ciliary muscle cells of the patient, and / or one or more sequences promoting the expression of DNA in the patient's ciliary muscle, and a polynucleotide encoding a therapeutic protein selected for its activity in the treatment of ciliary muscle. ocular pathologies, said construct being brought into the ciliary muscle by direct injection followed by electrotransfer.
15 La protéine thérapeutique encodée par la construction d'ADN selon l'invention est une protéine connue pour son effet sur les pathologies oculaires et notamment les uvéites en combinaison ou non avec des corticostéroïdes et/ou des immunosuppresseurs. La protéine thérapeutique est sélectionnée pour son effet particulier sur les pathologies oculaires humaines.The therapeutic protein encoded by the DNA construct according to the invention is a protein known for its effect on ocular pathologies and in particular uveitis in combination or not with corticosteroids and / or immunosuppressants. The therapeutic protein is selected for its particular effect on human ocular pathologies.
20 Comme évoqué ci-dessus, les pathologies oculaires peuvent être de type inflammatoire et la cytokine TNF-alpha (Tumor Nectosis Factor ou facteur de nécrose tumorale, de type alpha) joue un rôle important dans le développement de ces pathologies inflammatoires. La stratégie connue de l'art antérieur consistant à utiliser des anti-corps anti-TNF-alpha et des récepteurs solubles au TNF-alpha semble efficace pour diminuer 25 voir enrayer le développement de l'inflammation liée au TNF-alpha (Greiner et al. IOVS, 2004, 45:170-176 and Hale et al. Cytokine 33(2006):231-237). Ainsi, la protéine thérapeutique encodée par la construction d'ADN selon l'invention est de type anti TNFalpha. Dans un mode de réalisation préféré, la protéine thérapeutique est une protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé 30 via une charnière au fragment constant de l'immunoglobuline humaine IgG1 (Peppel et al., J Exp Med, 174 :1483-1489 - Murphy et al., Arch Ophtalmol, 22 :845-851). La SEQ ID NO 1 détaille la séquence protéique du domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF-a, ou récepteur soluble de type I du TNF-a, qui est compris dans la 3031112 6 construction d'ADN selon l'invention, cette séquence est nommée hTNFR-Is dans la présente invention. La SEQ ID NO 2 détaille la séquence protéique du fragment constant de l'immunoglobuline humaine de type G1 (IgG1) qui est compris dans la construction d'ADN selon l'invention, cette séquence est nommée hIgG1 dasns la présente invention.As mentioned above, ocular pathologies can be of inflammatory type and the cytokine TNF-alpha (Tumor Nectosis Factor or tumor necrosis factor, alpha type) plays an important role in the development of these inflammatory diseases. The known prior art strategy of using anti-TNF-alpha antibodies and soluble TNF-alpha receptors appears effective in decreasing or preventing the development of TNF-alpha-related inflammation (Greiner et al. IOVS, 2004, 45: 170-176 and Hale et al., Cytokine 33 (2006): 231-237). Thus, the therapeutic protein encoded by the DNA construct according to the invention is of the anti TNFalpha type. In a preferred embodiment, the therapeutic protein is a fusion protein comprising the extracellular domain of the human p55 TNF alpha receptor coupled via a hinge to the constant fragment of human immunoglobulin IgG1 (Peppel et al., J. Exp Med, 174: 1483-1489 - Murphy et al., Arch Ophthalmol, 22: 845-851). SEQ ID NO: 1 details the protein sequence of the extracellular domain of the human p55 receptor TNF-a, or soluble receptor type I TNF-a, which is included in the DNA construct according to the invention, this sequence is named hTNFR-Is in the present invention. SEQ ID NO: 2 details the protein sequence of the constant fragment of human immunoglobulin G1 (IgG1) which is included in the DNA construct according to the invention, this sequence is named hIgG1 dasns the present invention.
5 La présente invention décrit une nouvelle construction d'ADN destinée au transfert non viral d'acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d'un patient pour le traitement de pathologies oculaires caractérisée en ce qu'elle est constituée de : - une origine de réplication de type mammifère, - un promoteur permettant son expression dans la sphère oculaire du patient, et 10 - une ou plusieurs séquences favorisant l'expression de l'ADN dans la sphère oculaire du patient, - un polynucléotide codant pour une protéine de fusion comprenant les versions humaines du récepteur soluble de type I du TNF-a (hTNFR-Is) et de la chaîne lourde l'immunoglobuline G1 (hIgG1) ainsi qu'un site de clivage à la thrombine, 15 ladite construction étant amenée dans la sphère oculaire par injection directe dans le muscle ciliaire suivie d'un électrotransfert. Dans la présente invention, la construction d'ADN comprend un polynucléotide codant pour une protéine de fusion comprenant les versions humaines du récepteur soluble de type I du TNF-a (hTNFR-Is) et de la chaîne lourde l'immunoglobuline G1 (hIgG1) ainsi qu'un site de 20 clivage à la thrombine. Comme évoqué ci-dessus, il est connu de l'art antérieur d'utiliser la thérapie génique non virale pour le traitement de l'uvéite (Touchard et al., Effects of ciliary muscle plasmid electrotransfer of TNF-alpha soluble receptor variants in experimental uveitis, Gene Ther.The present invention discloses a novel DNA construct for the non-viral transfer of nucleic acids into the muscle cells of the ocular sphere of a patient for the treatment of ocular pathologies characterized in that it consists of: mammalian origin of replication, a promoter allowing its expression in the ocular sphere of the patient, and one or more sequences promoting the expression of the DNA in the ocular sphere of the patient; a polynucleotide encoding a protein of fusion comprising the human versions of the soluble TNF-α receptor type I (hTNFR-Is) and the immunoglobulin G1 heavy chain (hIgG1) as well as a thrombin cleavage site, said construct being brought into the ocular sphere by direct injection into the ciliary muscle followed by electrotransfer. In the present invention, the DNA construct comprises a polynucleotide encoding a fusion protein comprising human versions of the TNF-a soluble receptor type I (hTNFR-Is) and the immunoglobulin G1 heavy chain (hIgG1). as well as a thrombin cleavage site. As mentioned above, it is known from the prior art to use non-viral gene therapy for the treatment of uveitis (Touchard et al., Effects of ciliary muscle plasmid electrotransfer of TNF-alpha soluble receptor variants in experimental uveitis, Gene Ther.
2009 Jul;16(7):862-73). Il est également connu d'utiliser des compositions thérapeutiques 25 contenant des corticoïdes, seuls ou en combinaison avec des immunomodulateurs, dans le traitement de certaines uvéites non infectieuses. Dans un mode de réalisation préféré la protéine de fusion présente une séquence dans laquelle la version humaine du récepteur soluble de type I du TNF-a (hTNFR-Is) est lié à la chaine lourde de l'immunoglobuline G1 humaine (hIgG1) par un site de clivage à la thrombine. Le 30 site de clivage à la thrombine correspond typiquement à la SEQ ID NO 3. Dans un mode de réalisation plus préféré la protéine de fusion correspond à la SEQ ID NO 4. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention décrit une construction d'ADN dans laquelle le polynucléotide code pour une protéine de fusion de type hTNFR-Is/hIgG1 3031112 7 présentant au moins 90% de similarité avec la SEQ ID NO 4. Dans un autre mode de réalisation, la présente invention décrit une construction d'ADN dans laquelle le polynucléotide code pour une protéine de fusion de type hTNFR-Is/hIgG1 qui présente 91% de similarité avec la SEQ ID NO 4, préférentiellement 92%, préférentiellement 93%, 5 préférentiellement 94%, préférentiellement 95%, préférentiellement 96%, préférentiellement 97%, plus préférentiellement 98%, et encore plus préférentiellement 99% de similarité avec la SEQ ID NO 4. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention décrit une construction d'ADN dans laquelle la protéine de fusion, ou protéine thérapeutique, correspond à la séquence protéique décrite 10 dans la SEQ ID NO 4 (voir Liste des Séquences) correspondant à la protéine dénommée hTNFR-Is/hIgG1 dans la présente invention. Dans un mode de réalisation particulier la construction d'ADN selon l'invention est de forme circulaire. Dans un autre mode de réalisation de l'invention la construction d'ADN est une construction 15 d'ADN nu dans laquelle la protéine de fusion, ou protéine thérapeutique, correspond à la séquence protéique décrite dans la SEQ ID NO 4 (voir Liste des Séquences) correspondant à la protéine dénommée hTNFR-Is/hIgG1 dans la présente invention. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la construction d'ADN comprend une origine de réplication de type pUC, un promoteur de type CMV permettant son expression 20 dans la sphère oculaire du patient, et une ou plusieurs séquences activatrices favorisant l'expression de l'ADN dans la sphère oculaire du patient, et un polynucléotide codant la protéine de fusion de SEQ ID NO 4. Le plasmide est de façon préférée un vecteur de type pEVO6 correspondant au plasmide NTC8685-EGFP (Nature Technology Corporation®), dont on élimine la séquence codant pour la EGFP (« Enhanced Green Fluorescent Protein » ou 25 protéine fluorescente de couleur verte), comprenant une origine de réplication pUC, des séquences promotrices de type CMV et des séquences activatrices de type CMV et SV40, et la séquence codant pour la protéine d'intérêt est clonée dans la cassette prévue à cet effet en position 2938-2944 de pEVO6 (voir Fig. 1). Cette construction est utilisée dans la partie exemples ci-dessous.2009 Jul; 16 (7): 862-73). It is also known to use therapeutic compositions containing corticosteroids, alone or in combination with immunomodulators, in the treatment of certain non-infectious uveitis. In a preferred embodiment, the fusion protein has a sequence in which the human version of the TNF-a soluble receptor type I (hTNFR-Is) is bound to the heavy chain of human immunoglobulin G1 (hIgG1) by a thrombin cleavage site. The thrombin cleavage site typically corresponds to SEQ ID NO 3. In a more preferred embodiment the fusion protein corresponds to SEQ ID NO 4. In a particular embodiment, the invention describes a construction of DNA in which the polynucleotide encodes a hTNFR-Is / hIgG1 fusion protein having at least 90% similarity to SEQ ID NO 4. In another embodiment, the present invention discloses a construct of DNA in which the polynucleotide encodes a hTNFR-Is / hIgG1 fusion protein which has 91% similarity with SEQ ID NO 4, preferably 92%, preferentially 93%, preferentially 94%, preferentially 95%, preferentially 96%. %, preferentially 97%, more preferably 98%, and even more preferably 99% similarity with SEQ ID NO 4. In a preferred embodiment, the invention describes a construction DNA in which the fusion protein, or therapeutic protein, corresponds to the protein sequence described in SEQ ID NO 4 (see Sequence Listing) corresponding to the protein named hTNFR-Is / hIgG1 in the present invention. In a particular embodiment, the DNA construct according to the invention is circular in shape. In another embodiment of the invention the DNA construct is a naked DNA construct in which the fusion protein, or therapeutic protein, corresponds to the protein sequence described in SEQ ID NO: Sequences) corresponding to the protein named hTNFR-Is / hIgG1 in the present invention. In a preferred embodiment of the invention, the DNA construct comprises a pUC-like origin of replication, a CMV-type promoter allowing its expression in the patient's ocular sphere, and one or more enhancer promoting sequences. expression of the DNA in the ocular sphere of the patient, and a polynucleotide encoding the fusion protein of SEQ ID NO 4. The plasmid is preferably a pEVO6-type vector corresponding to plasmid NTC8685-EGFP (Nature Technology Corporation®), of which the coding sequence for EGFP ("Enhanced Green Fluorescent Protein" or "Green Fluorescent Protein"), comprising a pUC origin of replication, CMV promoter sequences and CMV and SV40 enhancer sequences, and the The coding sequence for the protein of interest is cloned into the cassette provided for this purpose in position 2938-2944 of pEVO6 (see Fig. 1). This construction is used in the examples section below.
30 Dans un mode de réalisation particulier, la construction d'ADN selon la présente invention présente au moins 90% de similarité avec la SEQ ID NO 5, préférentiellement 91% de similarité avec la SEQ ID NO 5, préférentiellement 92%, préférentiellement 93%, 3031112 8 préférentiellement 94%, préférentiellement 95%, préférentiellement 96%, préférentiellement 97%, plus préférentiellement 98%, et encore plus préférentiellement 99% de similarité avec la SEQ ID NO 5. Dans un mode de réalisation préféré, la construction d'ADN selon l'invention correspond à la 5 séquence n°5 u SEQ ID NO 5. Cette construction d'ADN correspond à la représentation schématique de la Fig. 2. La présente invention décrit également l'utilisation d'une construction d'ADN selon l'invention, destinée au transfert non viral d'acides nucléiques dans les cellules du muscle ciliaire d'un patient pour le traitement de pathologies oculaires par injection dans le muscle 10 ciliaire suivi d'un électrotransfert. Les pathologies oculaires ciblées sont les uvéites non infectieuses et particulièrement les uvéites antérieures, intermédiaires et postérieures et plus particulièrement les uvéites chroniques. L'invention porte plus particulièrement sur l'utilisation d'une construction d'ADN destinée au transfert non viral d'acides nucléiques dans les cellules musculaires ciliaires de la sphère 15 oculaire d'un patient, qui comprend - une origine de réplication de type mammifère, - un promoteur permettant son expression dans la sphère oculaire du patient, et - une ou plusieurs séquences favorisant l'expression de l'ADN dans la sphère oculaire du patient, 20 - un polynucléotide codant pour une protéine de fusion comprenant les versions humaines du récepteur soluble de type I du TNF-ct (hTNFR-Is) et de la chaîne lourde l'immunoglobuline G1 (hIgG1) ainsi qu'un site de clivage à la thrombine, ladite construction étant amenée dans la sphère oculaire par injection directe dans le muscle ciliaire suivie d'un électrotransfert.In a particular embodiment, the DNA construct according to the present invention has at least 90% similarity with SEQ ID NO 5, preferably 91% similarity with SEQ ID NO 5, preferentially 92%, preferentially 93%. Preferably 94%, preferably 95%, preferentially 96%, preferentially 97%, more preferably 98%, and even more preferably 99% similarity with SEQ ID No. 5. In a preferred embodiment, the construction of DNA according to the invention corresponds to sequence No. 5, SEQ ID No. 5. This DNA construct corresponds to the schematic representation of FIG. 2. The present invention also describes the use of a DNA construct according to the invention, for the non-viral transfer of nucleic acids into the cells of the ciliary muscle of a patient for the treatment of ocular pathologies by injection into the ciliary muscle followed by electrotransfer. Targeted ocular pathologies are non-infectious uveitis and particularly anterior, intermediate and posterior uveitis and more particularly chronic uveitis. More particularly, the invention relates to the use of a DNA construct for the non-viral transfer of nucleic acids into ciliary muscle cells of the ocular sphere of a patient, which comprises - a type of replication origin. mammal, - a promoter allowing its expression in the ocular sphere of the patient, and - one or more sequences promoting the expression of the DNA in the ocular sphere of the patient, - a polynucleotide coding for a fusion protein comprising the human versions soluble TNF-ct type I receptor (hTNFR-Is) and immunoglobulin G1 heavy chain (hIgG1) and a thrombin cleavage site, said construct being delivered to the ocular sphere by direct injection into the ocular sphere. the ciliary muscle followed by electrotransfer.
25 Dans un mode de réalisation préféré, l'invention décrit l'utilisation d'une construction d'ADN qui comprend une origine de réplication de type pUC, un promoteur de type CMV permettant son expression dans la sphère oculaire du patient, une ou plusieurs séquences favorisant l'expression de l'ADN dans la sphère oculaire du patient, et un polynucléotide codant pour la protéine de fusion de SEQ ID NO 4. Le plasmide pEVO6 semble particulièrement bien adapté 30 à la réalisation d'une construction d'ADN selon l'invention et à son utilisation pour le traitement des pathologies oculaires par injection puis électrotransfert.In a preferred embodiment, the invention describes the use of a DNA construct which comprises a pUC-like origin of replication, a CMV-type promoter allowing its expression in the ocular sphere of the patient, one or more sequences promoting the expression of DNA in the ocular sphere of the patient, and a polynucleotide encoding the fusion protein of SEQ ID No. 4. The plasmid pEVO6 seems particularly well suited to the realization of a DNA construct according to the invention and its use for the treatment of ocular pathologies by injection and electrotransfer.
3031112 9 Une fois la séquence codant pour la protéine de fusion hTNFR-Is/hIgG1 insérée dans la cassette de clonage du plasmide pEV06, on obtient la séquence ADN décrite dans la liste des séquences sous SEQ ID NO 5. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention décrit également l'utilisation d'une 5 construction d'ADN selon la présente invention qui présente au moins 90% de similarité avec la SEQ ID NO 5, préférentiellement 91% de similarité avec la SEQ ID NO 5, préférentiellement 92%, préférentiellement 93%, préférentiellement 94%, préférentiellement 95%, préférentiellement 96%, préférentiellement 97%, plus préférentiellement 98%, et encore plus préférentiellement 99% de similarité avec la SEQ ID NO 5.Once the coding sequence for the hTNFR-Is / hIgG1 fusion protein inserted into the cloning cassette of the plasmid pEV06, the DNA sequence described in the sequence listing is obtained under SEQ ID No. 5. In a particular embodiment the invention also discloses the use of a DNA construct according to the present invention which exhibits at least 90% similarity with SEQ ID NO 5, preferably 91% similarity with SEQ ID NO 5, preferentially 92. %, preferably 93%, preferentially 94%, preferably 95%, preferentially 96%, preferably 97%, more preferably 98%, and even more preferably 99% similarity with SEQ ID NO 5.
10 Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention décrit l'utilisation d'une construction d'ADN selon l'invention qui correspond à la SEQ ID NO 5. Cette construction d'ADN correspond à la représentation schématique de la Fig. 2. L'utilisation de la construction d'ADN selon l'invention a pour objectif de traiter les uvéites, et particulièrement les uvéites infectieuses. Dans un mode de réalisation préféré la 15 construction d'ADN selon l'invention est utilisée pour le traitement d'une uvéite, préférentiellement une uvéite non infectieuse. EXEMPLE 20 A. Le choix du squelette de la construction d'ADN a été fait suite à différents tests qui ont amené à la sélection de pEV06. Dans un premier temps on a mis en évidence l'expression de la Luciférase encodée dans 4 plasmides différents et dépourvus d'un gène de sélection aux antibiotiques (pEV02, pEV05, pEVO6 et pEV06-NP). Ces 4 plasmides, commercialement disponibles, ont été évalués en 25 parallèle. Les résultats détaillés en Fig. 7 montrent l'expression de la Luciférase dans le vitré de l'oeil de lapins 31 jours après électroporation du muscle ciliaire selon la méthode décrite dans EP2266656. Il en résulte que le plasmide pEVO6 (cf Fig. 1) permet d'obtenir la meilleure expression du transgène dans l'oeil de lapin.In a preferred embodiment, the present invention describes the use of a DNA construct according to the invention which corresponds to SEQ ID No. 5. This DNA construct corresponds to the schematic representation of FIG. 2. The purpose of using the DNA construct according to the invention is to treat uveitis, and particularly infectious uveitis. In a preferred embodiment, the DNA construct according to the invention is used for the treatment of uveitis, preferably non-infectious uveitis. EXAMPLE 20 A. The choice of the backbone of the DNA construct was made following various tests which led to the selection of pEV06. In a first step, the expression of the luciferase encoded in 4 different plasmids and devoid of an antibiotic selection gene (pEV02, pEV05, pEVO6 and pEV06-NP) was demonstrated. These 4 plasmids, commercially available, were evaluated in parallel. The detailed results in FIG. 7 show the expression of luciferase in the vitreous of the eye of rabbits 31 days after electroporation of the ciliary muscle according to the method described in EP2266656. As a result, the plasmid pEVO6 (cf Fig. 1) makes it possible to obtain the best expression of the transgene in the rabbit eye.
30 Parmi les 4 plasmides testés, pEVO6 a été sélectionné pour évaluer la durée de l'expression d'un transgène dans un modèle murin.Of the 4 plasmids tested, pEVO6 was selected to evaluate the duration of expression of a transgene in a murine model.
3031112 10 La Fig. 8 montre les résultats obtenus chez le rat sur une durée de 150 jours. Il en résulte que l'expression du transgène encodé dans le plasmide pEVO6 perdure au delà de 150 jours. L'ensemble de ces résultats a conduit à la sélection du plasmide pEVO6 pour la mise en oeuvre d'un développement préclinique et clinique du plasmide pEVO6 encodant une protéine de 5 fusion ou protéine thérapeutique, selon la présente invention. B. Une construction d'ADN sous la forme d'un plasmide selon la présente invention est testée dans un modèle d'uvéite induite par une endotoxine (EIU pour endotoxin induced uveitis) chez le rat. Sont également testés un plasmide encodant une protéine de fusion chimérique 10 hTNFR-Is/mIgG1 (version humaine pour TNFR-Is et version murine pour IgG1) et une protéine monomérique hTNFR-Is. Les conditions expérimentales sont les mêmes pour les trois types de plasmides. Cette expérience permet de vérifier s'il y a une différence d'efficacité entre l'injection et l'électrotransfert d'une protéine de fusion dimérique sous forme humaine hTNFR-Is/hIgGl, sous forme chimérique hTNFR-Is/mIgGl, ou d'une 15 protéine monomérique hTNFR-Is dans ce modèle d'uvéite. Plasmides Les constructions d'ADN sont réalisées à partir du plasmide pEVO6 contenant une origine de réplication de type pUC, un marqueur de sélection, des séquences promotrices de type CMV 20 et favorisant l'expression de type CMV et SV40 et la séquence codant pour la protéine d'intérêt est clonée dans la cassette prévue à cet effet en position 2938-2944 (voir Fig. 1 pour la représentation schématique de pEV06). Les plasmides pEV06-hTNFR-Is/mIgGl, pEV06- hTNFR-Is/hIgG1 et pEV06-hTNFR-Is encodent respectivement pour la protéine de fusion hTNFR-Is/mIgGl, la protéine de fusion hTNFR-Is/hIgGl et la forme monomérique hTNFR- 25 Is. Animaux Des rats Lewis femelle âgées de 6 à 8 semaines et pesant 130 à 170 g sont utilisés conformément aux dispositions du protocole ARVO (for Association for Research in Vision 30 and Ophtalmology). Les rats sont anesthésiés par injection d'une dose de kétamine (75 mg/kg) et de Largactil (0,5 mg/kg) avant injection des plasmides et électrotransfert. À la fin de l'expérience, les rats sont anesthésiés par injection intrapéritonéale de pentobarbital (30 3031112 11 mg/kg) avant prélèvement de sang par ponction intracardiaque, puis les rats sont euthanasiés par administration d'une dose létale de pentobarbital. Électrotransfert au niveau du muscle ciliaire du rat 5 L'électrotransfert est réalisé comme décrit dans Bloquel et al. « Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis » (FASEB J2006; 20: 389-391) en modifiant la voie d'injection par une approche transsclérale (Touchard "The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potetial for sustained intraocular production of therapeutic proteins", J Gene Med.3031112 10 FIG. 8 shows the results obtained in rats over a period of 150 days. As a result, the expression of the transgene encoded in the plasmid pEVO6 persists for more than 150 days. All these results led to the selection of the plasmid pEVO6 for the implementation of a preclinical and clinical development of the plasmid pEVO6 encoding a fusion protein or therapeutic protein, according to the present invention. B. A DNA construct in the form of a plasmid according to the present invention is tested in an endotoxin-induced uveitis (EIU) model in the rat. Also being tested is a plasmid encoding a hTNFR-Is / mIgG1 chimeric fusion protein (human version for TNFR-Is and murine version for IgG1) and a hTNFR-Is monomeric protein. The experimental conditions are the same for the three types of plasmids. This experiment makes it possible to check whether there is a difference in efficiency between the injection and the electrotransfer of a dimeric fusion protein in human form hTNFR-Is / hIgG1, in the chimeric form hTNFR-Is / mIgG1, or hTNFR-Is monomeric protein in this model of uveitis. Plasmids The DNA constructs are made from the plasmid pEVO6 containing a pUC-type replication origin, a selection marker, CMV and CMV type promoting promoter sequences and the coding sequence for the pUC type. The protein of interest is cloned into the cassette provided for this purpose in position 2938-2944 (see Fig. 1 for the schematic representation of pEV06). The plasmids pEV06-hTNFR-Is / mIgG1, pEV06-hTNFR-Is / hIgG1 and pEV06-hTNFR-Is respectively encode the hTNFR-Is / mIgG1 fusion protein, the hTNFR-Is / hIgG1 fusion protein and the monomeric form hTNFR Animals Female female rats 6 to 8 weeks old and weighing 130 to 170 g are used in accordance with the provisions of the ARVO protocol (for Association for Research in Vision and Ophthalmology). The rats are anesthetized by injecting a dose of ketamine (75 mg / kg) and Largactil (0.5 mg / kg) before plasmid injection and electrotransfer. At the end of the experiment, the rats were anesthetized by intraperitoneal injection of pentobarbital (11 mg / kg) prior to blood collection by intracardiac puncture, and the rats were euthanized by administering a lethal dose of pentobarbital. Electrotransfer to the Ciliary Muscle of the Rat Electrotransfer was performed as described in Bloquel et al. "Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis" (FASEB J2006; 20: 389-391) by modifying the injection route by a transscleral approach (Touchard "The ciliary smooth muscle electrotransfer : Gene med., Principles of potency for sustained intraocular production of therapeutic proteins.
2010 10 Nov;12(11):904-19). Le plasmide est injecté à raison de 15 lag dans 10 [1,1 de solution saline, dans le muscle ciliaire des animaux à l'aide d'une seringue adaptée. Les impulsions électriques sont administrées à l'aide d'une électrode spécifique iridium/platine de 250 iam de diamètre. Cette électrode interne est introduite dans le tunnel transscléral existant. L'électrode externe est une feuille de platine courbée pour épouser la 15 forme de l'oeil et placée au niveau du limbe face à l'électrode interne. L'électrotransfert est réalisé à raison de 8 impulsions électriques carrées unipolaires (200V/cm, 10 ms, 5 Hz) générées par un électroporateur (Genetronics) comme décrit dans Touchard et al (J Gene Med.2010 Nov 10; 12 (11): 904-19). The plasmid is injected at a rate of 15 μl into 10 μl of saline solution into the ciliary muscle of the animals using a suitable syringe. The electrical pulses are administered using a specific iridium / platinum electrode 250 μm in diameter. This internal electrode is introduced into the existing transscleral tunnel. The outer electrode is a platinum sheet curved to conform to the shape of the eye and placed at the blade facing the inner electrode. Electrotransfer is carried out at the rate of 8 unipolar square electric pulses (200 V / cm, 10 ms, 5 Hz) generated by an electroporator (Genetronics) as described in Touchard et al (J. Gene Med.
2010 Nov;12(11):904-19). Lesdites conditions ayant été prédéterminées spécifiquement pour transfecter de façon optimale de l'ADN plasmidique dans le muscle ciliaire de rat.2010 Nov; 12 (11): 904-19). Said conditions having been predetermined specifically to optimally transfect plasmid DNA into the rat ciliary muscle.
20 Induction et évaluation du score clinique sur une uvéite induite par endotoxine (EIU) L'uvéite induite par endotoxine est provoquée par injection dans le coussinet plantaire de 0,1 ml d'une solution saline stérile et apyrogène contenant 200 lag de lipopolysaccharide (LPS) de type Salmonella typhimurium. Les yeux des animaux sont examinés par biomicroscopie à la 25 lampe à fente durant la période de sévérité maximale de l'uvéite induite dans ce modèle, soit 24h après l'injection. L'intensité de l'inflammation oculaire est évaluée pour chaque oeil selon trois critères (estimé en « unités arbitraires » ou UA) : i) la rougeur de l'oeil est évaluée de 0 à 3 : (0) indique une vasodilatation normale au niveau de l'iris et de la conjonctive, (1) 30 indique la présence d'une dilatation minimale des vaisseaux de l'iris et de la conjonctive, (2) indique la présence d'une dilatation modérée des vaisseaux de l'iris et de la conjonctive, et (3) indique la présence d'une dilatation intense des vaisseaux de l'iris et de la conjonctive. ii) la présence de cellules dans la chambre antérieure est évaluée de 0 à 2 : 3031112 12 (0) indique l'absence de cellules dans la chambre antérieure de l'oeil, (1) indique la présence de cellules dans la chambre antérieure et (2) indique la présence de cellules dans la chambre antérieure avec formation d'un hypopion. iii) la présence de fibrine est évaluée de 0 à 2 : 5 (0) indique l'absence de fibrine dans la chambre antérieure, (1) indique la formation de fibrine dans la chambre antérieure et (2) indique la formation de fibrine dans la chambre antérieure avec isolement total de la pupille (bouchon de fibrine). Cette évaluation clinique est réalisée en aveugle par un ophtalmologiste. Pour chaque paramètre, le score clinique est donné en unités arbitraires (UA). L'intensité de 10 l'inflammation oculaire (ou score global de l'uvéite) est évaluée sur une échelle de 0 à 7 pour chaque oeil et est obtenue en additionnant les scores cliniques mesurés sur chacun des trois paramètres et exprimés en UA. Analyse des résultats 15 Les expériences sont menées avec une construction dont le plasmide non codant est pEV06.00, correspondant au plasmide pEVO6 circularisé. Les séquences codant pour des protéines de fusion dimériques hTNFR-Is/mIgG1 et hTNFR-Is/hIgG1 ou la forme monomérique de hTNFR-Is sont insérées dans la cassette de clonage du plasmide pEVO6 selon le protocole indiqué ci-dessus. Les résultats sont résumés dans le tableau 1 : 20 Rougeur Cellules CA Fibrine Score global Témoin 2,7 1,5 1,6 5,8 hTNFR-Is/mIgG1 2,3 1,0 1,5 4,8 hTNFR-Is 2,2 0,8 1,8 4,8 hTNFR-Is/hIgG1 1,6 0,6 1,0 3,2 Tableau 1 : scores cliniques Ces résultats exprimés en unités arbitraires (UA) sont présentés dans les Fig. 3 à 6.Induction and Endotoxin Induced Uveitis (EIU) Clinical Induction Endotoxin-induced uveitis is caused by injection into the plantar pad of 0.1 ml sterile, pyrogen-free saline solution containing 200 lg of lipopolysaccharide (LPS). ) of Salmonella typhimurium type. The eyes of the animals are examined by slit lamp biomicroscopy during the maximum severity period of uveitis induced in this model, ie 24 hours after the injection. The intensity of the ocular inflammation is evaluated for each eye according to three criteria (estimated in "arbitrary units" or AU): i) the redness of the eye is evaluated from 0 to 3: (0) indicates a normal vasodilation at level of the iris and conjunctiva, (1) 30 indicates the presence of minimal dilatation of the vessels of the iris and conjunctiva, (2) indicates the presence of moderate dilatation of the vessels of the iris and conjunctiva, and (3) indicates the presence of intense dilatation of the vessels of the iris and conjunctiva. ii) the presence of cells in the anterior chamber is evaluated from 0 to 2: 30 (0) indicates the absence of cells in the anterior chamber of the eye, (1) indicates the presence of cells in the anterior chamber and (2) indicates the presence of cells in the anterior chamber with formation of a hypopion. iii) the presence of fibrin is evaluated from 0 to 2: 5 (0) indicates the absence of fibrin in the anterior chamber, (1) indicates the formation of fibrin in the anterior chamber and (2) indicates the formation of fibrin in the anterior chamber with total isolation of the pupil (fibrin plug). This clinical evaluation is performed blind by an ophthalmologist. For each parameter, the clinical score is given in arbitrary units (AU). The intensity of ocular inflammation (or overall score of uveitis) is evaluated on a scale of 0 to 7 for each eye and is obtained by adding the clinical scores measured on each of the three parameters and expressed in AU. Analysis of the Results The experiments are conducted with a construct whose non-coding plasmid is pEV06.00, corresponding to the circularized plasmid pEVO6. The sequences coding for dimeric fusion proteins hTNFR-Is / mIgG1 and hTNFR-Is / hIgG1 or the monomeric form of hTNFR-Is are inserted into the cloning cassette of plasmid pEVO6 according to the protocol indicated above. The results are summarized in Table 1: Redness AC Cells Fibrin Overall Score Control 2.7 1.5 1.6 5.8 hTNFR-Is / mIgG1 2.3 1.0 1.5 4.8 hTNFR-Is 2 , 2 0.8 1.8 4.8 hTNFR-Is / hIgG1 1.6 0.6 1.0 3.2 Table 1: Clinical scores These results expressed in arbitrary units (AU) are presented in Figs. 3 to 6.
25 La Fig. 3 montre les résultats du score clinique global de l'uvéite induite par une endotoxine (LPS) dans notre modèle. La colonne de gauche est un contrôle correspondant à l'injection puis l'électrotransfert du plasmide vide. La deuxième colonne montre le score obtenu en utilisant un plasmide codant pour la protéine chimère hTNFR-Is/mIgGl. La troisième colonne montre le score obtenu en administrant un plasmide encodant le hTNFR-Is seul et la dernière 3031112 13 colonne correspondant à l'administration d'un plasmide selon l'invention encodant la protéine de fusion hTNFR-Is/hIgGl. On obtient un effet thérapeutique potentiel bien supérieur en utilisant une construction d'ADN selon l'invention par comparaison avec la forme monomérique de hTNFR-Is ou la 5 protéine de fusion hTNFR-Is/mIgGl. Les Fig. 4 à 6 montrent les composantes du score clinique illustré par la Fig. 3 à savoir, la rougeur (Fig. 4), la présence de cellules dans a chambre antérieure (Fig. 5) et la présence de fibrine (Fig. 6). Pour les trois critères observés, les constructions injectées sont les mêmes que celles décrites ci-dessus. Pour le caractère rougeur, la protéine de fusion hTNFR-Is/hIgGl 10 montre une meilleure activité que la forme monomérique de hTNFR-Is ou la protéine de fusion hTNFR-Is/mIgG1 (voir Fig. 4). De même pour la présence de cellules dans la chambre antérieure (voir Fig. 5) et la présence de fibrine (voir Fig. 6). Par ailleurs la protéine de fusion secrétée par le muscle ciliaire est dosée dans l'oeil mais n'est pas retrouvée dans le sérum (données non illustrées).FIG. Figure 3 shows the results of the overall clinical score of endotoxin-induced uveitis (LPS) in our model. The left column is a control corresponding to the injection and electrotransfer of the empty plasmid. The second column shows the score obtained using a plasmid encoding the hTNFR-Is / mIgG1 chimeric protein. The third column shows the score obtained by administering a plasmid encoding hTNFR-Is alone and the last column corresponding to the administration of a plasmid according to the invention encoding the hTNFR-Is / hIgG1 fusion protein. A much higher potential therapeutic effect is achieved by using a DNA construct according to the invention as compared to the monomeric form of hTNFR-Is or hTNFR-Is / mIgG1 fusion protein. Figs. 4-6 show the components of the clinical score illustrated in FIG. Ie, redness (Fig. 4), the presence of cells in the anterior chamber (Fig. 5) and the presence of fibrin (Fig. 6). For the three criteria observed, the injected constructions are the same as those described above. For redness, the hTNFR-Is / hIgG1 fusion protein shows better activity than the monomeric form of hTNFR-Is or the hTNFR-Is / mIgG1 fusion protein (see Fig. 4). The same is true for the presence of cells in the anterior chamber (see Fig. 5) and the presence of fibrin (see Fig. 6). Moreover, the fusion protein secreted by the ciliary muscle is measured in the eye but is not found in the serum (data not shown).
15 Ces résultats montrent le potentiel thérapeutique de la protéine de fusion hTNFR-Is/hIgG1 par rapport aux autres constructions testées dans le traitement de l'uvéite. D'autre part, en raison de l'absence de cette protéine de fusion dans le sérum, aucun effet secondaire indésirable n'est attendu contrairement à ce qui a pu être constaté dans le cas de traitement aux anticorps anti-TNF alpha administrés par voie intraveineuse ou sous-cutanée.These results show the therapeutic potential of the hTNFR-Is / hIgG1 fusion protein relative to the other constructs tested in the treatment of uveitis. On the other hand, because of the absence of this fusion protein in serum, no undesirable side effects are expected contrary to what could be found in the case of treatment with anti-TNF alpha antibodies administered by intravenous or subcutaneous.
20 Ainsi la construction selon la présente invention et son mode d'administration constituent une voie de traitement des pathologies oculaires par thérapie génique non virale et notamment de l'uvéite.Thus, the construction according to the present invention and its mode of administration constitute a pathway for treating ocular pathologies by nonviral gene therapy and especially uveitis.
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