FR3029741A1 - Procede de conservation de micro-organismes a temperature ambiante et composition - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un procédé de conservation de microorganismes à température ambiante, dans lequel : - on prépare une composition, dite composition de conservation, comprenant les micro-organismes à conserver et un milieu de conservation desdits micro-organismes, caractérisé en ce que : ○ le milieu de conservation comprend au moins un composé, dit composé conservateur, choisi dans le groupe formé des composés pour lesquels il existe au moins une proportion inhibitrice prédéterminée du composé conservateur dans la composition de conservation qui est : ▪ inhibitrice de la croissance desdits micro-organismes dans la composition de conservation à température ambiante, et ; ▪ non létale pour lesdits micro-organismes, et en ce que ; ○ ledit composé conservateur est dans la composition de conservation en proportion supérieure à ladite proportion inhibitrice prédéterminée et en proportion non létale pour lesdits micro-organismes ; - et dans lequel on place la composition de conservation à température ambiante aux fins de conserver lesdits micro-organismes. L'invention vise en particulier, un tel procédé dans lequel le composé conservateur est un ester carbonique de glycérol.
Description
1 PROCÉDÉ DE CONSERVATION DE MICRO-ORGANISMES À TEMPÉRATURE AMBIANTE ET COMPOSITION L'invention concerne un procédé de conservation in vitro et à température ambiante de micro-organismes vivants et une composition permettant la conservation de micro-organismes vivants à température ambiante pour la mise en oeuvre d'un tel procédé. L'invention vise aussi un procédé de traitement de plantes dans lequel on utilise une composition de conservation comprenant des micro-organismes vivants utiles pour des plantes. On connait des procédés de conservation de cellules dans lequel on utilise du glycérol et/ou du diméthylsulfoxyde (DMSO) à titre d'additif préservant les cellules vis à vis de la congélation/décongélation lors de leur conservation à basse température (-20°C, -80°C ou -176°C dans l'azote liquide). Un tel procédé de conservation de cellules est complexe dans sa mise en oeuvre et nécessite d'utiliser des dispositifs spécifiques de conservation des cellules à température inférieure à 0°C -notamment inférieure à -20°C-. On connait aussi un procédé de conservation de microorganismes à l'état au moins partiellement déshydraté. Une telle déshydratation est en général réalisée par congélation des cellules à basse température puis sublimation de l'eau à basse pression par lyophilisation. D'une part, de nombreux types cellulaires ne peuvent pas être conservés par lyophilisation, cette déshydratation par lyophilisation n'étant pas compatible avec le maintien de l'intégrité des cellules. D'autre part, un tel procédé nécessite d'utiliser, pour la lyophilisation, un dispositif spécifique de congélation qui peut être un congélateur ou un bain d'azote liquide. La maintenance d'un tel dispositif spécifique de congélation est complexe et coûteuse. L'utilisation de micro-organismes vivants pour combattre des champignons et des bactéries pathogènes des plantes et des maladies provoquées par ces champignons et ces bactéries pathogènes est connue, par exemple de WO 2012/016140, de WO 2009/156688 ou de WO 2009/156687. Ces documents ne traitent pas de la conservation de micro-organismes en vue de leur utilisation en agriculture pour le traitement de plantes.
3029741 2 En effet, une telle utilisation nécessite pour un agriculteur de disposer d'une composition -par exemple, une composition liquide- comprenant de tels micro-organismes vivants prête à être appliquée sur des plantes. Une telle composition liquide comprenant des micro-organismes vivants en phase de 5 croissance ne peut être conservée durablement par l'agriculteur. En effet, une telle composition comprenant des bactéries en phase exponentielle de croissance est susceptible d'entrer rapidement en phase stationnaire puis en phase de décroissance conduisant à la perte de la culture bactérienne. Une telle composition doit donc être préparée de façon extemporanée par l'agriculteur ou mise à disposition de 10 l'agriculteur -par le distributeur ou le fabriquant- au moment où son utilisation est envisagée. Une autre solution est de pouvoir conserver la composition liquide comprenant des micro-organismes vivants à basse température, à +4°C ou à -20°C ou à -80°C dans un congélateur ou à -176°C dans l'azote liquide. De telles conditions de conservation ne peuvent pas en pratique être mises en oeuvre par 15 l' agriculteur. L'invention vise à pallier les inconvénients précédemment évoqués en fournissant un procédé de conservation de micro-organismes à température ambiante et une composition pour conserver des micro-organismes qui ne nécessitent pas un stockage desdits micro-organismes à basse température.
20 L'invention vise ainsi à proposer un procédé de conservation de micro-organismes à température ambiante, c'est-à-dire un procédé qui ne nécessite pas de placer des micro-organismes dans un dispositif spécifique de refroidissement. L'invention vise ainsi à proposer un procédé de conservation 25 de micro-organismes à température ambiante qui soit applicable dans tout domaine technique dans lequel il est nécessaire de conserver des micro-organismes. L'invention vise à proposer un tel procédé qui soit en particulier applicable dans le domaine agricole dans lequel des micro-organismes sont susceptibles de devoir être appliqués sur des plantes, en particulier pour 30 stimuler leur croissance et/ou leurs défenses naturelles (SDN).
3029741 3 L'invention vise de surcroît à proposer un procédé et une composition de conservation qui préservent les habitudes de travail des agriculteurs, soient faciles à utiliser, et n'impliquent pour leur mise en oeuvre que peu de manipulations.
5 L'invention vise également à proposer un procédé et une composition de conservation dans lesquels sont utilisés des composés susceptibles d'être obtenus à partir de ressources végétales renouvelables. Un autre objectif de l'invention est de proposer un tel procédé et une telle composition de conservation qui respectent l'environnement, 10 notamment lors de l'application de ladite composition de conservation de microorganismes sur des plantes. Pour ce faire, l'invention concerne un procédé de conservation de micro-organismes à température ambiante, dans lequel : - on prépare une composition, dite composition de conservation, 15 comprenant les micro-organismes à conserver et un milieu de conservation desdits micro-organismes, caractérisé en ce que : o le milieu de conservation comprend au moins un composé, dit composé conservateur, choisi dans le groupe formé des composés pour lesquels il 20 existe au moins une proportion inhibitrice prédéterminée du composé conservateur dans la composition de conservation qui est : ^ inhibitrice de la croissance desdits micro-organismes dans la composition de conservation à température ambiante, et ; ^ non létale pour lesdits micro-organismes, et en ce que ; 25 o ledit au moins un composé conservateur est dans la composition de conservation en proportion supérieure à ladite proportion inhibitrice prédéterminée et en proportion non létale pour lesdits micro-organismes ; - et dans lequel on place la composition de conservation à température ambiante -notamment à une température supérieure ou égale à +4°C- aux fins de 30 conserver lesdits micro-organismes.
3029741 4 Dans toute la suite, on entend par "conservation de micro-organismes à température ambiante", la conservation de micro-organismes qui ne nécessite aucun moyen spécifique de contrôle et d'ajustement de la température de la composition comprenant les micro-organismes.
5 L'invention consiste donc à proposer un procédé de conservation de micro-organismes in vitro et à température ambiante dans lequel on utilise un milieu de conservation comprenant au moins un composé conservateur admettant au moins une proportion prédéterminée qui est inhibitrice de la croissance d'au moins un micro-organisme et non létale pour ledit au moins un 10 micro-organisme, ledit au moins un composé conservateur étant dans le milieu de conservation en proportion supérieure à sa proportion inhibitrice prédéterminée. La proportion de composé conservateur dans la composition de conservation est choisie pour pouvoir inhiber de façon réversible la croissance de micro-organismes, mais sans être létale pour lesdits micro-organismes. En particulier, le procédé selon 15 l'invention permet, dans une première phase de conservation, d'inhiber la croissance de micro-organismes à température ambiante, mais permet aussi, après dilution appropriée de la composition de conservation, de permettre la croissance des micro-organismes dans une composition de croissance obtenue par dilution de la composition de conservation.
20 Le milieu de conservation est choisi pour permettre de maintenir la culture de micro-organismes dans une phase stationnaire de croissance -sans dégénérescence de ladite culture- à température ambiante, tout en préservant le potentiel de ladite culture de micro-organismes à reprendre ultérieurement une phase exponentielle de croissance. Les micro-organismes conservés à température 25 ambiante dans la composition de conservation ne sont donc pas en phase de décroissance. La proportion de composé conservateur supérieure à la proportion inhibitrice prédéterminée dans la composition de conservation n'est donc pas létale pour les micro-organismes. Les inventeurs ont en effet constaté qu'il est possible de 30 conserver des micro-organismes à température ambiante -c'est-à-dire de maintenir des micro-organismes en phase de latence (ou dormance) en inhibant leur 3029741 5 croissance tout en préservant leur potentiel de croissance ultérieure- en plaçant ces micro-organismes dans une composition de conservation appropriée comprenant un composé conservateur dans une proportion choisie pour être inhibitrice de la croissance mais non létale pour ces micro-organismes. Un composé conservateur 5 selon l'invention ne présente donc pas de propriété antibiotique -c'est-à-dire qu'il ne conduit pas à la mort de micro-organismes- mais uniquement une propriété inhibitrice réversible de la croissance de micro-organismes. Dans un procédé selon l'invention, on choisit au moins un composé conservateur dans le groupe formé des composés admettant au moins une 10 proportion dans le milieu de conservation qui est inhibitrice de la croissance de micro-organismes, mais non létale pour ces micro-organismes. La proportion inhibitrice prédéterminée d'un composé conservateur dans la composition de conservation est la valeur de la proportion de composé conservateur dans la composition de conservation entrainant l'arrêt total de la croissance d'un micro- 15 organisme sans être létale pour les micro-organismes. On détermine qu'une proportion de composé conservateur supérieure à la proportion inhibitrice prédéterminée est non létale en diluant la composition de conservation -de façon que la proportion de composé conservateur soit inférieure à la proportion inhibitrice prédéterminée- et en constatant la 20 croissance des micro-organismes dans la composition de croissance obtenue par dilution de la composition de conservation. On prédétermine la proportion minimale inhibitrice d'un composé conservateur par des méthodes d'analyse de la croissance de micro-organismes connues en elles-mêmes.
25 Avantageusement, le composé conservateur mis en oeuvre dans un procédé selon l'invention dans une proportion supérieure à la proportion inhibitrice prédéterminée permet d'inhiber la croissance de micro-organismes pendant une durée d'au moins 30 jours, sans être létale pour lesdits micro-organismes. Dans un procédé selon l'invention, la dilution du milieu de 30 conservation -notamment dans un milieu de culture adapté pour la croissance des 3029741 6 micro-organismes- permet en fait de lever l'inhibition de la croissance des micro-organismes par le composé conservateur. L'invention vise donc un procédé dans lequel le milieu de conservation et la composition de conservation comprennent un composé 5 conservateur apte à inhiber la croissance de micro-organismes pour une proportion de composé conservateur supérieure à une valeur de proportion inhibitrice prédéterminée, ladite proportion de composé conservateur étant cependant non létale pour les micro-organismes et apte à permettre la croissance des micro-organismes pour une proportion de composé conservateur inférieure à ladite 10 valeur de proportion inhibitrice prédéterminée. Avantageusement et selon l'invention, on choisit au moins un composé conservateur dans le groupe formé de l'acide undécylénique, des esters de l'acide undécylénique et des esters carboniques de glycérol. Dans tout le texte, on entend par : 15 - "ester carbonique de glycérol", tout composé comprenant au moins une fonction chimique ester carboxylique formée entre un groupement dérivé de l'acide carbonique et un groupement dérivé du glycérol ; - groupement "dérivé de l'acide carbonique", tout groupement de formule suivante : 0 20 -0-g-0- dans laquelle les atomes d'hydrogène de l'acide carbonique sont substitués par un groupement organique qui est donc distinct de l'hydrogène, et par ; - groupement "dérivé de glycérol" tout groupement de formule suivante : 25 dans laquelle au moins un atome d'hydrogène des groupements hydroxyles du glycérol est substitué par un groupement organique distinct de l'hydrogène.
3029741 7 Avantageusement et selon l'invention, on choisit au moins un composé conservateur dans le groupe formé du carbonate de glycérol (cyclique), des esters du carbonate (cyclique) de glycérol et des esters carboniques linéaires de glycérol.
5 Les esters carboniques de glycérol -notamment le carbonate de glycérol, les esters du carbonate (cyclique) de glycérol et les esters carboniques linéaires de glycérol-, l'acide undécylénique et les esters de l'acide undécylénique sont adaptés pour pouvoir être appliqués sur des plantes et satisfont les normes de protection et de préservation de l'environnement. Ils ne présentent pas en eux- 10 mêmes de toxicité pour la santé humaine ou animale. Ils sont biodégradables et ne présentent pas de risque de s'accumuler dans les sols et de contaminer ou de détériorer l'environnement, notamment lors de leur application sur des végétaux et/ou lors de leur introduction dans le sol. Ils ne présentent pas de risque de contaminer l'environnement lorsqu'ils sont appliqués en plein champ et qu'ils sont 15 susceptibles d'être entraînés par ruissellement avec les eaux de pluie ou d'arrosage. Ils peuvent être "biosourcés", c'est-à-dire obtenus à partir de ressources naturelles -notamment de ressources végétales- disponibles et renouvelables. Dans une variante d'un procédé selon l'invention, au moins 20 un composé conservateur est du carbonate de glycérol. Par carbonate de glycérol, on entend le carbonate cyclique de glycérol à cinq chaînons (4-(hydroxyméthyl)- 1,3-dioxolan-2-one) de formule (I) suivante : (3C / x / CH-CH 2 CH2OH (I), référencé sous le numéro CAS 931-40-8 et dont un procédé de synthèse est décrit par exemple dans FR 2 778 182.
25 Dans une autre variante d'un procédé selon l'invention, au moins un composé conservateur est un ester du carbonate de glycérol (ou carbonate de glycérol acylé). Dans cette variante, au moins un composé conservateur est un 3029741 8 ester du carbonate (cyclique) de glycérol a/a'-acylé à 5-chaînons de formule (II) ci-après : (II), dans laquelle R1 est un groupement hydrocarboné aliphatique -saturé, insaturé, linéaire ou ramifié-5 comprenant entre 1 et 30 atomes de carbone. Le groupement R1 peut être choisi dans le groupe formé des groupements hydrocarbonés aliphatiques saturés. Le groupement R1 peut être un méthyle (-CH3), un éthyle (-CH2-CH3), un n-propyle (-CH2-CH2-CH3), un iso-propyle (-CH(CH3)2), un n-butyle (-CH2-CH2-CH2-CH3), 10 un iso-butyle (-CH2-CH(CH3)2), un tertio-butyle (-C(CH3)3), un n-pentyle (-(CH2)4-CH3), un n-hexyle (-(CH2)5-CH3), un n-heptyle (-(CH2)6-CH3), un n-octyle (-(CH2)7-CH3), un n-nonyle (-(CH2)8-CH3), un n-décyle (-(CH2)9-CH3), un n-undécyle (-(CH2)10-CH3), un n-dodécyle (-(CH2)11-CH3), un n-tridécyle (-(CH2)12-CH3), un n-tétradécyle (-(CH2)13-CH3), un n-pentadécyle (-(CH2)14-CH3), 15 un n-hexadécyle (-(CH2)15-CH3), un n-heptadécyle (-(CH2)16-CH3), un n-octadécyle (-(CH2)17-CH3), un n-nonadécyle (-(CH2)18-CH3), un n-dodécadécyle (-(CH2)19-CH3). Le groupement R1 peut être choisi dans le groupe formé des groupements hydrocarbonés aliphatiques insaturés. Le groupement R1 peut être un 20 groupement hydrocarboné aliphatique présentant au moins une double liaison éthylénique. Le groupement R1 peut être un groupement hydrocarboné aliphatique présentant 1, 2, 3, 4 ou 5 doubles liaisons éthyléniques, conjuguées ou non. Avantageusement, le groupement R1 peut aussi être choisi dans le groupe formé : 25 - du 9-ène-decyle de formule CH2=CH-(CH2)7-CH2-. Au moins un composé conservateur est l'ester du carbonate (cyclique) de glycérol et de l'acide undécylénique ; 0,,,... O= C/ C H2 \o Fl 0 R 1 C H2 O 3029741 9 - du 8-ène-pentadecyle CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)7-. Au moins un composé conservateur est l'ester du carbonate (cyclique) de glycérol et de l'acide palmitique ; - du 8-ène-heptadecyle CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-. Au moins un 5 composé conservateur est l'ester du carbonate (cyclique) de glycérol et de l'acide oléique ; - du groupement 12-ène-hénéicosyle CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)ii-. Au moins un composé conservateur est l'ester du carbonate (cyclique) de glycérol et de l'acide docosaénoïque.
10 Dans un mode de réalisation particulier, il est possible de choisir au moins un composé conservateur dans le groupe formé : - des esters du carbonate (cyclique) de glycérol et d'un acide hydrocarboné à nombre pair d'atomes de carbone -ou acide hydrocarboné pair-, et ; - des esters carboniques linéaires de glycérol et d'au moins un acide 15 hydrocarboné à nombre pair d'atomes de carbone -ou acide hydrocarboné pair-. Dans un autre mode de réalisation, avantageusement et selon l'invention, on choisit au moins un composé conservateur dans le groupe formé : - des esters du carbonate (cyclique) de glycérol et d'un acide hydrocarboné à nombre impair d'atomes de carbone -ou acide hydrocarboné impair-, 20 et ; - des esters carboniques linéaires de glycérol et d'au moins un acide hydrocarboné à nombre impair d'atomes de carbone -ou acide hydrocarboné impair-. Avantageusement et selon l'invention, R1 est un groupement hydrocarboné aliphatique linéaire -saturé ou insaturé- présentant une chaine 25 principale carbonée à nombre pair d'atomes de carbone. Le groupement acyle (R1-00-) de l'ester carbonique cyclique de glycérol a/a'-acylé est donc un groupement présentant une chaine principale carbonée à nombre impair d'atomes de carbone. En particulier, R1 est choisi dans le groupe formé du n-hexyle (-(CH2)5-CH3), du n-octyle (-(CH2)7-CH3) et d'un 9-ène-decyle (-(CH2)8-CH=CH2). Au moins un 30 composé conservateur peut être : 3029741 10 - l'ester du carbonate de glycérol et de l'acide heptanoïque (ECG-C7) de formule (III) suivante : 0 0 0 (III) ; - l'ester du carbonate de glycérol et de l'acide nonanoïque (ECG-C9) de 5 formule (IV) suivante : o (IV) ; - l'ester du carbonate de glycérol et de l'acide undécylénique (ECGC11,1) de formule (V) suivante : (V).
10 Dans une autre variante d'un procédé selon l'invention, au moins un composé conservateur peut être un ester carbonique de glycérol cyclique à 6-chaînons. Dans une autre variante d'un procédé selon l'invention, au moins un composé conservateur est un ester carbonique linéaire de glycérol 15 présentant au moins un groupement d'atomes de formule (VI) générale suivante : O (VI) dans laquelle Go est choisi dans le groupe formé : - des groupements propyles a/a'-oxyacylés de formule (VII) générale suivante : 0 H2 C-0--R1 20 CH2 CH- (VII) 3029741 11 - des groupements propyles f3-oxyacylés de formule (VIII) générale suivante : 0 0--R2 -CHFCH-CH (VIII) - du groupement propyle a/a'-hydroxylé de formule (IX) suivante : H2C-OH 5 -CHFH (IX) - du groupement propyle f3-hydroxylé de formule (X) suivante : OH CHFH-CH (X) dans lesquelles R1 et R2 sont choisis indépendamment l'un de l'autre dans le groupe formé des groupements hydrocarbonés aliphatiques -saturés, insaturés, 10 linéaires ou ramifiés- comprenant entre 1 et 30 atomes de carbone. Le groupement R2 d'un ester carbonique linéaire de glycérol peut être choisi, indépendamment de R1, dans le groupe formé des groupements hydrocarbonés aliphatiques saturés. Le groupement R2 peut être un méthyle (-CH3), un éthyle (-CH2-CH3), un n-propyle (-CH2-CH2-CH3), un iso-propyle (-CH(CH3)2), 15 un n-butyle (-CH2-CH2-CH2-CH3), un iso-butyle (-CH2-CH(CH3)2), un tertio-butyle (-C(CH3)3), un n-pentyle (-(CH2)4-CH3), un n-hexyle (-(CH2)5-CH3), un n-heptyle (-(CH2)6-CH3), un n-octyle (-(CH2)7-CH3), un n-nonyle (-(CH2)8-CH3), un n-décyle (-(CH2)9-CH3), un n-undécyle (-(CH2)10-CH3), un n-dodécyle (-(CH2)ii-CH3), un n-tridécyle (-(CH2)12-CH3), un n-tétradécyle (-(CH2)13-CH3), un n-pentadécyle 20 (-(CH2)14-CH3), un n-hexadécyle (-(CH2)15-CH3), un n-heptadécyle (-(CH2)16-CH3), un n-octadécyle (-(CH2)17-CH3), un n-nonadécyle (-(CH2)18-CH3), un n-dodécadécyle (-(CH2)19-CH3). Le groupement R2 d'un ester carbonique linéaire de glycérol peut être choisi, indépendamment de R1, dans le groupe formé des groupements 25 hydrocarbonés aliphatiques insaturés. Le groupement R2 peut être un groupement hydrocarboné aliphatique présentant au moins une double liaison éthylénique. Le 3029741 12 groupement R2 peut être un groupement hydrocarboné aliphatique présentant 1, 2, 3, 4 ou 5 doubles liaisons éthyléniques, au moins deux d'entre elles pouvant être conjuguées ou non. Avantageusement, le groupement R2 peut aussi être choisi dans le groupe formé : 5 - du 9-ène-decyle de formule CH2=CH-(CH2)8- ; - du 8-ène-pentadecyle CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)7- ; - du 8-ène-heptadecyle CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-, et ; - du 12-ène-hénéicosyle CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)11-. Un ester carbonique linéaire de glycérol présentant au moins 10 un groupement d'atomes de formule (VI) peut être choisi dans le groupe formé des esters carboniques linéaires de glycérol de formule (VI') générale suivante : MO-C-0-GO-Q1 (VI') I dans laquelle : 15 G1 est choisi dans le groupe formé : - des groupements propyles a/a'-oxyacylés de formule (VII) ; - des groupements propyles f3-oxyacylés de formule (VIII) ; - du groupement propyle a/a'-hydroxylé de formule (IX) ; - du groupement propyle f3-hydroxylé de formule (X) ; 20 - Qi est choisi dans le groupe formé de l'hydrogène (H) et des groupements organiques formés d'au moins deux atomes liés par des liaisons covalentes et appartenant au groupe formé du carbone (C) et de l'hydrogène (H) -et éventuellement de l'oxygène (0)-, et ; - M1 représente un groupement organique formé d'au moins deux 25 atomes liés par des liaisons covalentes et appartenant au groupe formé du carbone (C) et de l'hydrogène (H) -et éventuellement de l'oxygène (0)-. Dans cette variante d'un procédé selon l'invention, le composé conservateur est un ester carbonique linéaire de glycérol acylé de formule (XI) générale suivante : 3029741 13 M2 O C G20 Q2 0+ O X n (XI) dans laquelle ; - x est un nombre entier égal à 0 ou à 1 pouvant varier dans la formule (XI) selon chaque groupement de formule (XI-a) : C 0*G2 0 X H O (XI-a) 5 x n'étant pas toujours nul ; - n est un nombre entier compris entre 1 et 20 -notamment compris entre 1 et 10-, bornes incluses ; - Q2 est choisi dans le groupe formé de l'hydrogène (H) et des groupements organiques formés d'au moins deux atomes liés par des liaisons 10 covalentes, lesdits atomes appartenant au groupe formé du carbone (C) et de l'hydrogène (H) -et éventuellement de l'oxygène (0)-, et ; - M2 représente un groupement organique formé d'au moins deux atomes liés par des liaisons covalentes, lesdits atomes appartenant au groupe formé du carbone (C) et de l'hydrogène (H) -et éventuellement de l'oxygène (0)-, et ; 15 - G2 représente un groupement d'atomes choisi dans le groupe formé : - des groupements propyles a/a'-oxyacylés de formule (VII) générale, et ; - des groupements propyles f3-oxyacylés de formule (VIII) générale. Avantageusement et selon l'invention, au moins un composé 20 conservateur est un oligocarbonate/oligoglycérol acylé de formule (XII) suivante : 0 Il MO-[-Gii 0 , C O Gi 2 0 m G13 0+03 (XII), dans laquelle : - M3 est un groupement organique choisi dans le groupe formé des groupements de formules suivantes : (XIIA) ; 0 Il yH FI R-C-0-CHFCH-CHFO-C- 3029741 14 0 CH2O H (XIIB) ; H 1 11 (XIIc), et ; R-C-0-CitCH-O-C- (XIID) ; 0 C Il 1 H 2OH R-C-0-CHICH- (1)1 P" R-C-0-CitCH-CHF dans lesquels R est un groupement hydrocarboné -notamment un groupement 5 hydrocarboné saturé, un groupement hydrocarboné insaturé ou un groupement hydrocarboné ramifié- comprenant de 1 à 21 atomes de carbone, et ; - G11 est choisi dans le groupe formé des groupements propyles hydroxylés de formules générales (XIIE) et (IIF) suivantes : OH 1 - CHICH-CHF (XIIE), et ; CH O 2H -CHICH- 10 (XIIF) ; - G12 et G13 sont des groupements propyles a/a'-oxyacylés de formule générale (VII) suivante : 0 I I (VII), et ; CH -0-C- R1 2 -CI-ICH- - Q3 est choisi dans le groupe formé de l'hydrogène et des groupements 15 organiques formés d'au moins deux atomes liés par des liaisons covalentes et appartenant au groupe formé du carbone (C), de l'hydrogène (H) et de l'oxygène (0) ; - n est un nombre entier naturel inférieur à 9 -c'est-à-dire de l'intervalle [0 ; 8]- tel que si n = 0 et m 0, alors M1 est choisi dans le groupe formé de le et ID, et ; 20 - m est un nombre entier naturel inférieur à 5 -notamment de l'intervalle [0 ; 4], et ; - p est un nombre entier naturel inférieur à 4 -notamment de l'intervalle [0 ; 3]-- Dans toute la suite, les groupements G11 de formule (XIIF), 3029741 15 G12 et G13 de formule (VII) peuvent être présents dans l'oligomère selon l'un et/ou l'autre de leurs deux sens d'insertion possible dans l'oligomère. Avantageusement et selon l'invention, la proportion de composé conservateur dans le milieu de conservation est choisie pour être une 5 proportion volumique comprise entre 0,01 % et 100 %. Il est possible que le composé conservateur soit à l'état pur dans le milieu de conservation. Avantageusement et selon l'invention, la proportion de composé conservateur dans le milieu de conservation est une proportion volumique comprise entre 0,01 % et 10 % -de préférence comprise entre 0,01 % et 1 %, plus 10 préférentiellement comprise entre 0,01 % et 0,10 %, en particulier comprise entre 0,03 % et 0,07 %, notamment de l'ordre de 0,05 %-. Avantageusement, le procédé selon l'invention est un procédé de conservation de micro-organismes in-vitro. Avantageusement et selon l'invention, le composé 15 conservateur et sa proportion dans la composition de conservation sont choisis pour permettre une conservation de micro-organismes à température ambiante pendant une durée de conservation au moins égale à 30 jours. On entend par "température ambiante", une température -notamment une température de la composition de conservation- qui est atteinte 20 sans nécessiter l'utilisation de moyens de chauffage et/ou de refroidissement. On entend en particulier par "température ambiante", une température supérieure ou égale à +4°C -notamment comprise entre 15°C et 60°C, en particulier entre 20°C et 40°C-. Le procédé de conservation de micro-organismes à température ambiante est donc un procédé de conservation de micro-organismes à une température supérieure 25 ou égale à +4°C. Avantageusement et selon l'invention, le milieu de conservation est un milieu aqueux. Avantageusement, le milieu de conservation de micro-organismes est un milieu aqueux qui ne permet pas en lui-même la croissance et le développement de micro-organismes. Avantageusement et selon l'invention, le 30 milieu de conservation est choisi dans le groupe formé de l'eau et des milieux aqueux salins.
3029741 16 Avantageusement et selon une variante de l'invention, le milieu de conservation est à l'état liquide à température ambiante. Il peut s'agir d'un milieu de conservation essentiellement aqueux comprenant au moins un composé conservateur. Le micro-organisme est donc conservé dans un milieu 5 liquide susceptible de pouvoir être dilué ultérieurement dans un liquide de dilution, notamment dans de l'eau, ou dans tout milieu de culture du micro-organisme permettant son développement ultérieur. Cependant, selon une autre variante de l'invention, le milieu de conservation peut être à l'état solide à température ambiante. Il peut s'agir d'une 10 composition comprenant une proportion d'au moins un gélifiant tel que par exemple de l'agar-agar. Le milieu de conservation est donc un milieu de conservation gélosée comprenant au moins un composé conservateur et qui est à l'état solide à température ambiante. Avantageusement et selon l'invention, le milieu de 15 conservation comprend des micro-organismes choisis dans le groupe formé des bactéries, des champignons unicellulaires, des levures et des protozoaires. L'invention concerne aussi un procédé de traitement de plantes dans lequel on utilise un milieu de conservation selon l'invention. L'invention s'étend aussi à un procédé de traitement de 20 plantes dans lequel : - on prépare une composition de conservation par un procédé selon l'invention, puis : - on conserve à température ambiante ladite composition de conservation, puis : 25 - on dilue ladite composition de conservation de façon que la proportion de composé conservateur dans la composition diluée soit inférieure à la proportion inhibitrice prédéterminée et permette la croissance des micro-organismes, et - on applique ladite composition diluée sur des plantes. L'invention concerne donc aussi un procédé de traitement de 30 plantes dans lequel on prépare une composition de conservation de micro-organismes qui permette à l'agriculteur de disposer d'une composition de 3029741 17 conservation comprenant des micro-organismes concentrée et stable, qui est susceptible de pouvoir être diluée -notamment dans de l'eau- en vue de l'application de ladite composition diluée sur des plantes. Avantageusement et selon l'invention, on conserve la 5 composition de conservation pendant une durée au moins égale à 30 jours. On conserve la composition de conservation à température ambiante sans variation significative du nombre de micro-organismes vivants dans la composition de conservation. Avantageusement et selon l'invention, au moins un micro-10 organisme est choisi dans le groupe formé des micro-organismes utiles pour la croissance et le développement de plantes. Avantageusement et selon l'invention, au moins un microorganisme à conserver est choisi dans le groupe formé des bactéries à Gram positif, en particulier du genre Streptomyces.
15 En particulier, avantageusement et selon l'invention, au moins un micro-organisme à conserver est une bactérie du genre Streptomyces conforme à la souche déposée et enregistrée à la CNCM sous le numéro I-4667. Au moins un micro-organisme est une bactérie Streptomyces conforme à la souche déposée et enregistrée en date du 7 avril 2011 sous le n° I-4467 auprès de la Collection 20 Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur (dont l'adresse est 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15) ayant le statut d'autorité de dépôt internationale selon le traité de Budapest. Avantageusement et selon l'invention, au moins un microorganisme est choisi dans le groupe formé des micro-organismes aptes à stimuler de 25 défenses naturelles de plantes. La composition diluée est adaptée pour stimuler les défenses naturelles de plantes en culture. En particulier, l'application d'une composition diluée selon l'invention présente une activité stimulatrice des défenses naturelles des plantes, c'est-à-dire qu'elle permet d'activer l'expression chez des plantes de gènes de défense -par exemple PR-1- vis-à-vis d'organismes pathogènes 30 des plantes. L'invention s'étend aussi à une composition comprenant : 3029741 18 - au moins un micro-organisme ; - un milieu de conservation d'au moins un micro-organisme, et - au moins un composé, dit composé conservateur, choisi dans le groupe formé des composés pour lesquels il existe une proportion inhibitrice 5 prédéterminée du composé conservateur dans le milieu de conservation qui est : o inhibitrice de la croissance d'au moins un micro-organisme dans le milieu de conservation à température ambiante, et ; o non létale pour ledit au moins un micro-organisme, ladite composition de conservation étant adaptée pour conserver ledit au moins un 10 micro-organisme à température ambiante. Une composition de conservation selon l'invention s'entend : - d'une composition qui comprend des micro-organismes à l'état latent -c'est-à-dire dans laquelle le composé conservateur présente dans la composition une proportion supérieure à la proportion minimale inhibitrice prédéterminée et 15 inhibe la croissance de micro-organismes et est non létal pour lesdits micro-organismes-, ou - d'une composition qui comprend des micro-organismes en phase de croissance -c'est-à-dire dans laquelle le composé conservateur présente dans la composition une proportion inférieure à la proportion minimale inhibitrice 20 prédéterminée et permet la croissance de micro-organismes-. L'invention concerne donc en particulier une composition de conservation de micro-organismes qui permette de conserver des micro-organismes vivants, ladite composition de conservation étant susceptible de pouvoir être diluée -notamment dans de l'eau- en vue de l'application de ladite composition diluée sur 25 des plantes. Avantageusement et selon l'invention, au moins un composé conservateur est choisi dans le groupe formé de l'acide undécylénique, des esters de l'acide undécylénique et des esters carboniques de glycérol. Avantageusement et selon l'invention, au moins un micro-30 organisme est du genre Streptomyces et conforme à la souche déposée et enregistrée à la CNCM sous le numéro I-4667.
3029741 19 L'invention concerne également un procédé de conservation de micro-organismes, un procédé de traitement de plantes et une composition pour la mise en oeuvre d'au moins l'un de ces procédés caractérisés en combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-dessus ou ci-après.
5 D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description et des exemples non limitatifs suivants qui se réfèrent aux figures annexées, et dans lesquelles : - la figure 1 est une représentation graphique en histogramme de la viabilité (PFU/mL) de la bactérie Streptomyces I-4467 en début (J+0) de 10 conservation (histogramme plein/grisé) et après 28 jours de conservation (histogramme hachuré) à température ambiante en absence (H2O) ou en présence de composé conservateur (ECG-C7, ECG-C9, ECG-C11:1, OECG-C7, OECG-C9 et OECG-C11:1) en proportion massique de 0,05 % selon l'invention, - la figure 2 est une représentation graphique en histogramme de la 15 viabilité (PFU/mL) de la bactérie Streptomyces I-4467 en début de conservation (histogramme plein/grisé) et après 28 jours de conservation (histogramme hachuré) à température ambiante en absence (H2O) ou en présence de composé conservateur (ECG-C7, ECG-C9, ECG-C11:1, OECG-C7, OECG-C9 et OECG-C11:1) en proportion massique de 1 %, 20 - la figure 3 est une représentation graphique en histogramme de la viabilité (PFU/mL) de la bactérie Streptomyces I-4467 en début de conservation (histogramme ouvert) et après 28 jours de conservation (histogramme hachuré) à température ambiante en présence de glycérol, de carbonate de glycérol ou d'acide undécylénique en proportion massique de 0,05 %, 25 - la figure 4 est une représentation graphique de courbes de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en présence d'ECG-C7 à titre de composé conservateur selon l'invention en proportion de 0,01 % ; 0,05 % et 0,10 % dans l' eau, - la figure 5 est une représentation graphique de courbes de croissance 30 de la levure Saccharomyces cerevisiae en présence d'ECG-C9 à titre de composé 3029741 20 conservateur selon l'invention en proportion de 0,01 % ; 0,05 % et 0,10 % dans l'eau, - la figure 6 est une représentation graphique de courbes de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en présence d'ECG-C11:1 à titre de composé 5 conservateur selon l'invention en proportion de 0,01 % ; 0,05 % et 0,10 % dans l'eau, - la figure 7 est une représentation graphique de courbes de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en présence d'OECG-C7 à titre de composé conservateur selon l'invention en proportion de 0,01 % ; 0,05 % et 0,10 % dans 10 l'eau, - la figure 8 est une représentation graphique de courbes de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en présence d'OECG-C9 à titre de composé conservateur selon l'invention en proportion de 0,01 % ; 0,05 % et 0,10 % dans l' eau.
15 Une composition de conservation selon l'invention, comprend - des micro-organismes ; - un milieu de conservation desdits micro-organismes comprenant au moins un composé, dit composé conservateur, choisi pour : o être inhibiteur de la croissance d'au moins un micro-organisme 20 in-vitro et à température ambiante, et ; o être non létal pour ledit au moins un micro-organisme, dans une proportion du composé conservateur dans la composition supérieure à une proportion minimale inhibitrice prédéterminée, et pour permettre la croissance d'au moins un micro-organisme, dans une proportion du composé conservateur dans la 25 composition inférieure à ladite proportion minimale inhibitrice prédéterminée. Une telle composition de conservation permet de conserver des micro-organismes in vitro à température ambiante. Une telle composition selon l'invention, lorsqu'elle est mise en contact avec des micro-organismes, permet de limiter la croissance desdits micro-organismes à température ambiante, sans pertes 30 significatives de micro-organisme et sans épuiser le milieu de culture.
3029741 21 Un milieu de conservation permet, lorsqu'il est mis en contact avec des micro-organismes dans une composition de conservation permet aux micro-organismes de reprendre leur croissance dès lors que la proportion de composé conservateur dans la composition de conservation devient inférieure -par 5 exemple par dilution de la composition de conservation- à la valeur de proportion minimale inhibitrice prédéterminée du composé conservateur. Une composition selon l'invention peut comprendre du carbonate de glycérol. On obtient du carbonate de glycérol par un procédé décrit dans FR 2 778 1821 dans lequel on fait réagir de l'urée et du glycérol en présence 10 d'un catalyseur solide sous forme de poudre et constitué par un sel métallique ou un mélange de sels métalliques, contenant des sites acides de Lewis. Une composition selon l'invention peut aussi comprendre un ester du carbonate de glycérol a/a'-acylé (5-chaînons) ou un ester carbonique cyclique de glycérol 13'-acylé (6 chaînons). On obtient de tels esters du carboante 15 (cyclique) de glycérol a/a'-acylés par des procédés de synthèse tels que décrits aux exemples 1, 2 et 3 ci-après. EXEMPLE 1 - Synthèse d'esters du carbonate de glycérol (carbonate de glycérol a/a'-acylé) On réalise la synthèse d'esters du carbonate de glycérol 20 choisis dans le groupe formé : - de l'ester du carbonate de glycérol et de l'acide heptanoïque (ECG- C7), et ; - de l'ester du carbonate de glycérol et de l'acide nonanoïque (ECG-C9), et ; 25 - de l'ester du carbonate de glycérol et de l'acide undécylénique (ECG- C11:1), et ; - de l'ester carbonique cyclique de glycérol et de l'acide oléique (ECG- C18:1) par estérification du carbonate de glycérol (cyclique a/a'-hydroxylé) par l'acide 30 gras correspondant. Dans un réacteur de 500 mL équipé d'un dispositif d'agitation 3029741 22 mécanique, d'un dispositif de mise sous pression réduite et d'un dispositif "Dean-Stark" d'élimination de l'eau formée, on place 1,64 moles d'acide gras et 0,0078 moles d'acide 4-méthylbenzènesulfonique (CAS n° 6192-52-5, acide para-toluène- sulfonique, ApTs). On porte la température du mélange à la 5 température de 110°C sous une pression de 800 hPa pendant une durée de 15 min. On ajoute ensuite goutte à goutte dans le réacteur 0,84 moles de carbonate de glycérol sous agitation mécanique à 800 rotations par minutes (rpm) pendant 15 min. On place le réacteur dans un bain d'huile porté à la température de 110°C et sous agitation mécanique (800 rpm) pendant 3 heures.
10 EXEMPLE 2 - Purification des esters du carbonate de glycérol. On dilue le milieu réactionnel dans 150 mL d'éther éthylique et on place le mélange obtenu dans une ampoule à décanter de 1 L. On lave le mélange successivement avec 4 volumes d'eau saturée en NaC1 jusqu'à neutralité 15 de la phase aqueuse. La phase organique lavée est séchée sur du sulfate de magnésium, puis est séparée du sulfate de magnésium hydraté par filtration. L'éther de la phase organique est éliminé par évaporation sous pression réduite. On obtient une masse de produit sec de 277g. L'ester du carbonate de glycérol est séparé des acides gras en excès par distillation en film mince sous pression réduite à une 20 température inférieure à la température d'ébullition de l'acide gras sous cette pression réduite et inférieure à 155°C. On obtient l'ester du carbonate de glycérol dont la pureté évaluée par chromatographie en phase gazeuse est comprise entre 85 % et 95 %. EXEMPLE 3 - Synthèse du carbonate de glycérol 25 a/a'-acétylé (ECG-C2). On réalise la synthèse du carbonate de glycérol a/a'-acetylé de formule ci-après : 0,,,,,. / CH2 OC i \o.....----CH 0 R1 CH2 C 1 1 0 3029741 23 dans laquelle R1 est un groupement méthyle. Dans un ballon tricol en verre de 2 L équipé d'un agitateur mécanique et d'un dispositif "Dean-Stark" d'élimination de l'eau formée comprenant un réfrigérant et placé dans un bain d'huile, on introduit 472 g de 5 carbonate de glycérol cyclique (4-(hydroxyméthyle)-1,3-dioxolan-2-one, CAS 931-40-8) et 4 g de résine Lewatit K2431. On ajoute 6 moles d'anhydride acétique goutte à goutte dans le réacteur de façon à contrôler et maintenir la température du réacteur à 150°C sous agitation mécanique de 800 rpm pendant 4 heures.
10 On élimine l'excès d'anhydride acétique par évaporation à la température de 60°C et sous pression réduite de 55 hPa. On purifie l'ester carbonique linéaire de glycérol a/a'-acétylé par la technique du film mince conduite dans un évaporateur/séparateur à la température de 170°C et sous pression réduite de 0,33 hPa. On obtient l'ester carbonique de glycérol a/a'-acétylé dont la pureté 15 évaluée par chromatographie en phase gazeuse est comprise entre 98 % et 99 %. Le taux de pureté des esters du carbonate de glycérol obtenus aux exemples 1, 2 et 3 et l'ion moléculaire (m/z) analysé par spectrométrie de masse sont donnés au tableau 1 ci-après. Pureté, % Spectrométrie de masse, m/z ECG-C2 98 160,1 ECG-C7 94 230,2 ECG-C9 95 258,3 ECG-Cii :1 85 284,3 ECG-C18:1 96 382,5 Tableau 1 20 Une composition selon l'invention peut aussi comprendre des esters carboniques linéaires de glycérol. On obtient de tels esters carboniques linéaires de glycérol par condensation/oligomérisation à partir d'esters carboniques cycliques de glycérol, notamment d'esters carboniques cycliques de glycérol a/a'-acylés, en présence d'un amorceur organique -par exemple du glycérol- et d'un 25 catalyseur métallique, par exemple du sulfate de zinc ou du stéarate de zinc comme 3029741 24 décrits aux exemples 4 et 5. EXEMPLE 4 - Oligomérisation du carbonate de glycérol cyclique a/a'-acétylé (ECG-C2). On réalise l'oligomérisation de l'ester du carbonique de 5 glycérol a/a'-acétylé (ECG-C2) obtenu à l'exemple 3 en présence d'un catalyseur métallique, de glycérol à titre d'amorceur organique, et dans les conditions décrites au tableau 2 ci-après. Masse Catalyseur métallique Amorceur Glycérol, Conditions TC, % Masses ECG-C2, g g molaires en nombre Nature Masse, mg 8,5 Zn(Ci8H3502) 25 1,5 160°C, 95 970, 688, 2 Pat., 2h 352, 274, 202, 190 21,25 Zn(Ci8H3502) 125 3,75 160°C, 84 714, 336, 2 Pat., 2h 206, 139, 92 160°C, 431, 160, 9 ZnS 04 50 1,7 55 Pat., 30h 83 Tableau 2 La valeur TC ( %) indique le taux de conversion de l'ester du 10 carbonique de glycérol a/a'-acétylé de départ. Les valeurs de masse molaire en nombre de produits de la réaction sont obtenues par analyse du milieu de réaction en chromatographie par perméation de gel sur colonne PL-GelTM 3 ium MIX-E. Les esters carboniques linéaires de glycérol a/a'-acétylés sont détectés en sortie de colonne par réfractométrie et les masses moléculaires sont déterminées par 15 comparaison avec des standards de polystyrène. Le spectre de masse réalisé sur un milieu de réaction obtenu par mise en oeuvre d'un procédé d'oligomérisation de l'ester du carbonate de glycérol a/a'-acétylé (ECG-C2) tel que décrit dans le présent exemple comporte des signaux correspondant à des ions moléculaires et fragments de valeurs m/z 20 comprises entre 180,9 et 761,4 et correspondant à des oligomères de formules (A), 3029741 25 (B) et (C) suivantes : o o H3C 00 o o C CH3 OH 0 HO CH3 OH (A) dans laquelle c peut prendre la valeur 1, 2 ou 4 et d peut prendre la valeur 1, 2, 3 ou 4 ; o o H3C 00 0 b CH3 OH OH (B) ; 5 dans laquelle b peut prendre la valeur 1, 2, ou 3; O OH H3C00 1a (1)F10 (C) dans laquelle a est 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, et ; O CH3 O OH H3C 0 0 OH (D) dans laquelle g peut prendre la valeur 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
10 EXEMPLE 5 - Synthèse d'esters carboniques linéaires de glycérol a/a'-acylés (OECG-C2, OECG-C7, OECG-C9 et OECG-Cita) à partir d'esters du carbonate de glycérol (cyclique) a/a'-acylés (ECG-C2, ECG-C7, ECG-C9 et ECG-Cita). On réalise une oligomérisation d'esters du carbonate de 15 glycérol (cycliques a/a'-acylés) selon l'invention dans les conditions décrites au tableau 3 ci-après.
3029741 26 ECG, Catalyseur métallique Amorceur Glycérol, Conditions TC, % Masses masse g molaires en nombre Nature Masse, mg ECG-C2, Zn(Ci8H3502) 125 3,75 160°C, Pat., 98 714, 335, 21,25 g 2 2h 206, 139, 92 ECG-C7, 200°C, Patm, 639, 420, ZnSO4 113 2,42 64 20 g 2h 252, 96 ECG-C9, 180°C, Patm, 992, 541, ZnSO4 110 2,15 88 20 g 2h 303, 90 ECG- ZnSO4 86 1,3 190°C, Pat., 98 7632, C11:1, 2h 2113,1084 10g , 750, 486 Tableau 3 La valeur TC ( %) indique le taux de conversion de l'ester du carbonate de glycérol de départ. Les valeurs de masse molaire apparente sont 5 obtenues par analyse du milieu de réaction par chromatographie par perméation de gel. On obtient des oligomères de masse molaire apparente atteignant 7600 Da. EXEMPLE 6 - Souche Streptomyces I-4467 La souche Streptomyces, dite Streptomyces I-4467, objet du présent exemple a été déposée et enregistrée en date du 7 avril 2011 sous le numéro 10 I-4467 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur (dont l'adresse est 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15) ayant le statut d'autorité de dépôt internationale selon le traité de Budapest. La souche de Streptomyces I-4467 présente une séquence d'ADN, dit ADN, 16S, codant pour l'ARN ribosomal 16S qui présente la SEQ ID_NO1.
15 La séquence SEQ ID_NO1 est décrite ci-après : tagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggc aatctgccct gcactctggg acaagccctg 60 gaaacggggt ctaataccgg atatgacacg ctcccgcatg ggatgcgtgt ggaaagctcc 120 ggcggtgcag gatgagcccg cggcctatca gcttgttggt ggggtgatgg cctaccaagg 180 3029741 27 cgacgacggg tagccggcct gagagggcga ccggccacac tgggactgag acacggccca 240 gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgaaagcc tgatgcagcg 300 acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt tgtaaacctc tttcagcagg gaagaagcga 360 gagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 420 5 gtagggcgca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaaga gctcgtaggc ggcttgtcgc 480 gtcggatgtg aaagcccggg gcttaacccc gggtctgcat tcgatacggg caggctagag 540 ttcggtaggg gagatcggaa ttcctggtgt agcggtgaaa tgcgcagata tcaggaggaa 600 caccggtggc gaaggcggat ctctgggccg atactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg 660 agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgttgggaac taggtgtggg 720 10 cgacattcca cgtcgtccgc gccgcagcta acgcattaag ttccccgcct ggggagtacg 780 gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac ggggggcccg cacaagcggc ggagcatgtg 840 gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg acatacaccc ggaaacctct 900 ggagacaggg gccccccttg tggtcggtgt acaggtggtg catggcttgt cgtcagctcg 960 tgtcgtgaga tgttgggtta agtccccgca acgagcgcaa cccttgttct gtgttgccag 1020 15 catgcctttc gggggntgat ggggacttnc acaggagact gccggggtca actcggagga 1080 aggtggggac gacgtcaagt catcatgccc cttatgtctt gggctgcaca cgtgctacaa 1140 tggccggtac aatgagctgc gaagccgtga ggtggagcga atctcaaaaa gccggtctca 1200 gttcggattg gggtctgcaa ctcgacccca tgaagtcgga gtcgctagta atcgcagatc 1260 agcattgctg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca cgtcacgaaa 1320 20 gtcggtaaca cctgaa 1336. Dans la séquence SEQ ID_NO1 ci-dessus, le symbole "n" en positions 1036 et 1049 de la séquence SEQ ID_NO1 désigne, selon l'IUPAC ("International Union of Pure and Applied Chemistry"), l'un quelconque des quatre nucléotides a, t, c ou g. Ainsi, le nucléotide n en position 1036 est choisi dans le 25 groupe formé du nucléotide "a", du nucléotide "t", du nucléotide "g" et du nucléotide "c", et le nucléotide n en position 1049 est choisi, indépendamment du nucléotide en position 1036, dans le groupe formé du nucléotide "a", du nucléotide "t", du nucléotide "g" et du nucléotide "c". La souche Streptomyces I-4467 est une bactérie à Gram 30 positif.
3029741 28 La souche Streptomyces I-4467 peut être utilisée pour la protection de plantes et la stimulation de leur vitalité par des moyens et procédés naturels (biocontrôle), visant notamment à contrôler l'équilibre entre les plantes et les populations d'agresseurs plutôt qu'à éradiquer ces populations d'agresseurs. En 5 particulier, la souche Streptomyces I-4467 est apte à : - promouvoir la solubilisation d'éléments nutritionnels solides -notamment du phosphore- et sa mise à disposition de plantes. La souche Streptomyces I-4467 permet de favoriser la dissolution -dans la rhizosphère de végétaux- de produits de fertilisation solide inassimilable par lesdits végétaux et 10 d'améliorer la nutrition de végétaux ; - stimuler la croissance de plantes -en particulier la croissance des parties aériennes de plantes- par exemple telles que le tournesol et le maïs. Pour ce faire, on applique par pelliculage sur des graines de tournesol et sur des graines de maïs une composition liquide selon l'invention comprenant entre 1 et 2 g (masse de 15 bactéries humides) de bactéries de la souche Streptomyces I-4467 par litre de composition. On sème des graines de tournesol et de maïs traitées avec la composition liquide selon l'invention et à titre de contrôles des graines de tournesol et de maïs non traitées. On observe une stimulation de la croissance initiale des plants de tournesol et de plants de maïs par rapport aux plants de tournesol et de 20 maïs non traités ; - ralentir la croissance : o de certaines bactéries telles que Micrococcus luteus et Bacillus subtilis ; o de certains micro-organismes cible phyto-pathogènes tels que 25 Botrytis cinerea, Streptomyces scabies, Botrytis cinerae, Fusarium culmorum, Pythium ultimum, Phaeomoniella chlamydospora, Phaeomoniella aelophilum, Eutypa tata, Fomitiporia mediterranea et Botryosphaeria obtusa ; - stimuler les défenses naturelles de plantes en culture. L'application d'une composition de traitement selon l'invention présente une activité stimulatrice 30 des défenses naturelles des plantes, c'est-à-dire qu'elle permet d'activer 3029741 29 l'expression chez des plantes de gènes de défense -par exemple PR-1- vis-à-vis d'organismes pathogènes des plantes. La souche Streptomyces I-4467 peut être cultivée dans un milieu de culture liquide aqueux, notamment dans un milieu choisi dans le groupe 5 formé des milieux complets et des milieux riches comprenant tous les éléments minéraux et des précurseurs organiques nécessaires à la croissance des bactéries selon l'invention, en particulier une source de carbone, une source d'azote, une source de phosphore, des vitamines et des oligoéléments. Un tel milieu complet peut comprendre du D-glucose, un extrait de levure, du phosphate de potassium 10 dibasique (K2HPO4), du sulfate d'ammonium ((NH4)2SO4), du chlorure de potassium (KCI) et du glycérol à pH 2. La souche Streptomyces I-4467, lorsqu'elle est cultivée sur milieu ISP-2 ou sur milieu Bennett solide, forme des amas ou "colonies" bactériennes présentant : 15 - un mycélium, dit mycélium de substrat, ramifié se développant dans l'épaisseur du milieu solide de couleur variant du jaune-brun au gris-brun selon la composition du milieu solide, et - un mycélium aérien se développant à l'interface air/solide qui est de couleur blanche.
20 La température optimale de croissance de la souche Streptomyces I-4467 est comprise entre 12°C et 37°C. Elle est de préférence comprise entre 28°C et 30°C. La température optimale de conservation de la souche Streptomyces I-4467 dans son milieu de culture est de +4°C. EXEMPLE 7 - Conservation de la souche Streptomyces 25 I-4467 à température ambiante (28°C) On prépare une suspension de bactérie Streptomyces I-4467 comprenant 800 UFC (Unité Formant Colonie) par mL d'eau. On ajoute 0,05 % (v/v) d'un composé conservateur choisi dans le groupe formé des esters du carbonate de glycérol (ECG-C7, d'ECG-C9, d'ECG-Cita) et des esters carboniques linéaires de 30 glycérol (OECG-C7, d'OECG-C9, et d'OECG-Cii,i). On place la composition de conservation ainsi obtenue à la température de 28°C pendant 28 jours. À titre de 3029741 30 contrôle, on prépare une suspension de bactérie Streptomyces I-4467 comprenant 800 UFC par mL de milieu de culture et on ajoute 0,05 % d'eau. À l'issue de la période de 28 jours, on évalue la viabilité des bactéries dans chacune des compositions de conservation par étalement de 200 id de la composition ou de 5 dilutions sériées de la composition sur un milieu de culture Bennet solide (10 g de glucose, 1 g d'extrait de levure, 1 g d'extrait de viande, 2 g de bactopeptone, 18 g d'agar-agar dans 1 L d'eau osmosée), incubation à 28°C et dénombrement des colonies bactériennes formées après 7 jours. Les résultats sont représentés en figure 1 dans laquelle les 10 histogrammes pleins (grisés) représentent le nombre de bactéries (UFC/mL) ensemencées à J+0 et les histogrammes hachurés représentent le nombre de bactéries (UFC/mL) mesuré à J+28. En comparaison avec le contrôle (H2O), la croissance de la souche Streptomyces I-4467 est fortement limitée voire empêchée par les composés 15 conservateurs ECG-C9, ECG-Cita, OECG-C7 et OECG-Cita et, dans une moindre mesure avec les composés conservateurs ECG-C7 et OECG-C9. Les composés conservateurs permettent de conserver les bactéries Streptomyces I-4467 pendant 28 jours en inhibant leur croissance tout en conservant leur potentiel ultérieur de croissance. Ils permettent de conserver les bactéries Streptomyces I-4467 pendant 20 28 jours sans nécessiter de dilution et de repiquages réguliers de la souche Streptomyces I-4467 et sans épuiser le milieu de culture. À titre de contrôle, un essai similaire est réalisé avec une proportion des mêmes composés conservateurs de l'ordre de 1 % (v/v) et des suspensions de bactérie Streptomyces I-4467 comprenant 400 UFC par mL de 25 milieu de culture. Les résultats sont représentés en figure 2 dans laquelle les histogrammes pleins (grisés) représentent le nombre de bactéries (UFC/mL) ensemencées à JO et les histogrammes hachurés représentent le nombre de bactéries (UFC/mL) mesuré à J+28. Dans une proportion de 1 % dans le milieu, les composés 30 conservateurs ECG-C7, ECG-C9, ECG-Cii:i, OECG-C7, OECG-C9 et OECG-Cita présentent un comportement bactéricide.
3029741 31 EXEMPLE 8 - Conservation de la souche Streptomyces I-4467 à température ambiante (28°C) On procède comme à l'exemple 7 en utilisant du carbonate de glycérol et de l'acide undécylénique à titre de composés conservateurs. On prépare 5 une suspension de bactérie Streptomyces I-4467 comprenant de l'ordre de 400 UFC (Unité Formant Colonie) par mL d'eau. On ajoute 0,05 % (v/v) de composé conservateur choisi parmi le carbonate de glycérol ou l'acide undécylénique. On place la composition de conservation ainsi obtenue à la température de 28°C pendant 28 jours. A titre de contrôle, on prépare une suspension de bactérie 10 Streptomyces I-4467 comprenant 400 UFC par mL de milieu de culture et on ajoute 0,05 % de glycérol. A l'issue de la période de 28 jours, on évalue la viabilité des bactéries dans chacune des compositions de conservation par étalement de 200 id de la composition ou d'une dilution sériée de la composition sur un milieu de culture Bennet solide (10 g de glucose, 1 g d'extrait de levure, 1 g d'extrait de viande, 2 g 15 de bactopeptone, 18 g d'agar-agar dans 1 L d'eau osmosée), incubation des boites à 28°C et dénombrement des colonies bactériennes formées après 7 jours. Les résultats sont représentés en figure 3 dans laquelle les histogrammes pleins (grisés) représentent le nombre de bactéries (UFC/mL) ensemencées à J+0 et les histogrammes hachurés représentent le nombre de 20 bactéries (UFC/mL) mesuré à J+28. En comparaison avec le contrôle (glycérol), la croissance de la souche Streptomyces I-4467 est fortement limitée par les composés conservateurs carbonate de glycérol et acide undécylénique. Ces composés conservateurs permettent de conserver les bactéries Streptomyces I-4467 pendant 28 jours en 25 inhibant leur croissance tout en conservant leur potentiel ultérieur de croissance. Ils permettent de conserver les bactéries Streptomyces I-4467 pendant 28 jours sans nécessiter de dilution et de repiquages réguliers de la souche Streptomyces I-4467 et sans épuiser le milieu de culture EXEMPLE 9 - Courbe de croissance de la levure 30 Saccharomyces cerevisiae en milieu liquide à température ambiante (28°C) en présence d'ester du carbonate de glycérol et de l'acide heptanoïque (ECG-C7) 3029741 32 On réalise une pré-culture de levure Saccharomyces cerevisiae pure dans 3 mL de milieu YPD (comprenant 2 % de bactopeptone, 1 % d'extrait de levure, 2 % de glucose et de l'eau osmosée qsp) sous agitation (220 rpm) à 28°C pendant 12 heures. La densité optique (DO à 600 nm) de la 5 pré-culture est de l'ordre de 0,4 à 0,5. On prélève 100 iaL de cette pré-culture que l'on introduit dans un tube contenant 5 mL de milieu frais à titre de contrôle. On introduit aussi 100 iaL de cette pré-culture dans des tubes contenant 5 mL de milieu frais et une proportion volumique de 0,01, 0,05 et 0,1 % d'ester carbonique cyclique de glycérol ECG-C7. On place les tubes à 28°C et on mesure l'évolution de la 10 densité optique à 595 nm de la culture au cours du temps. Les résultats sont représentés en figure 4. On observe à partir de 0,1 % d'ECG-C7 une inhibition de la croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae. EXEMPLE 10 - Courbe de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en milieu liquide à température ambiante (28°C) en 15 présence d'ester du carbonate de glycérol et de l'acide nonanoïque (ECG-C9) On procède de façon identique à l'exemple 9. On introduit 100 Lat de pré-culture dans des tubes contenant 5 mL de milieu frais et une proportion volumique de 0,01, 0,05 et 0,1 % d'ester du carbonate de glycérol ECG-C9. On place les tubes à 28°C et on mesure l'évolution de la densité optique 20 de la culture au cours du temps. Les résultats sont représentés en figure 5. On observe à partir de 0,1 % d'ECG-C9 une inhibition de la croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae. EXEMPLE 11 - Courbe de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en milieu liquide à température ambiante (28°C) en 25 présence d'ester du carbonate de glycérol et de l'acide undécylénique (ECG-Cii:i) On procède de façon identique à l'exemple 9. On introduit 100 Lat de pré-culture dans des tubes contenant 5 mL de milieu frais et une proportion volumique de 0,01, 0,05 et 0,1 % d'ester du carbonate de glycérol ECG-Ci Li. On place les tubes à 28°C et on mesure l'évolution de la densité optique 30 de la culture au cours du temps. Les résultats sont représentés en figure 6. On 3029741 33 observe une inhibition de la croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae à partir de 0,05 % d'ECG-Cita. EXEMPLE 12 - Courbe de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en milieu liquide à température ambiante (28°C) en 5 présence d'ester carbonique linéaire de glycérol et de l'acide nonanoïque (OECG-C9). On procède de façon identique à l'exemple 9. On introduit 100 Lat de pré-culture dans des tubes contenant 5 mL de milieu frais et une proportion volumique de 0,01, 0,05 et 0,1 % d'OECG-C9. On place les tubes à 28°C 10 et on mesure l'évolution de la densité optique de la culture au cours du temps. Les résultats sont représentés en figure 7. On observe à partir de 0,05 % d'OECG-C9 une inhibition de la croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae. EXEMPLE XIII - Courbe de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en milieu liquide à température ambiante (28°C) en 15 présence d'ester carbonique linéaire de glycérol et de l'acide heptanoïque (OECG-C7) On procède de façon identique à l'exemple 9. On introduit 100 Lat de pré-culture dans des tubes contenant 5 mL de milieu frais et une proportion volumique de 0,01, 0,05 et 0,1 % d'OECG-C7. On place les tubes à 28°C 20 et on mesure l'évolution de la densité optique de la culture au cours du temps. Les résultats sont représentés en figure 8. On observe à partir de 0,05 % d'OECG-C7 une inhibition de la croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae. Il va de soi que l'invention peut faire l'objet de nombreuses variantes de réalisation et applications. En particulier, une composition, un procédé 25 de conservation de micro-organisme et un procédé de traitement de plantes dans lequel on utilise une telle composition sont sujets à une infinité de variantes tant dans la formulation de la composition que dans les modes de mise en oeuvre des procédés.
Claims (2)
- REVENDICATIONS1/ Procédé de conservation de micro-organismes à température ambiante, dans lequel : - on prépare une composition, dite composition de conservation, comprenant les micro-organismes à conserver et un milieu de conservation desdits micro-organismes, caractérisé en ce que : o le milieu de conservation comprend au moins un composé, dit 10 composé conservateur, choisi dans le groupe formé des composés pour lesquels il existe au moins une proportion inhibitrice prédéterminée du composé conservateur dans la composition de conservation qui est - inhibitrice de la croissance desdits micro-organismes dans la composition de conservation à température ambiante, et ; 15 ^ non létale pour lesdits micro-organismes, et en ce que ; o ledit au moins un composé conservateur est dans la composition de conservation en proportion supérieure à ladite proportion inhibitrice prédéterminée et en proportion non létale pour lesdits micro-organismes ; - et dans lequel on place la composition de conservation à température 20 ambiante aux fins de conserver lesdits micro-organismes.
- 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on choisit au moins un composé conservateur dans le groupe formé de l'acide undécylénique, des esters de l'acide undécylénique et des esters carboniques de glycérol. 25 3/ Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on choisit au moins un composé conservateur dans le groupe formé du carbonate de glycérol, des esters du carbonate de glycérol et des esters carboniques linéaires de glycérol. 4/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé 30 en ce qu'on choisit au moins un composé conservateur dans le groupe formé : 3029741 35 - des esters du carbonate de glycérol et d'un acide hydrocarboné à nombre impair d'atomes de carbone, et ; - des esters carboniques linéaires de glycérol et d'au moins un acide hydrocarboné à nombre impair d'atomes de carbone. 5/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la proportion de composé conservateur dans la composition de conservation est choisie pour être une proportion volumique comprise entre 0,01 % et 100 %. 6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé 10 en ce que le composé conservateur et ea proportion dans la composition de conservation sont choisis pour permettre une conservation de micro-organismes à température ambiante pendant une durée de conservation au moins égale à 30 jours. 7/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu de conservation est un milieu aqueux. 15 8/ Procédé de traitement de plantes dans lequel : - on prépare une composition de conservation par un procédé selon l'une des revendications 1 à 7, puis : - on conserve à température ambiante ladite composition de conservation, puis : 20 - on dilue ladite composition de façon que la proportion de composé conservateur dans la composition diluée soit inférieure à la proportion inhibitrice prédéterminée et permette la croissance des micro--organismes, et - on applique ladite composition diluée sur des plantes. 9/ Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'au 25 moins un micro-organisme est choisi dans le groupe formé des micro-organismes aptes à stimuler de défenses naturelles de plantes. 10/ Procédé selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu'au moins un micro-organisme à conserver est choisi dans le groupe formé des bactéries à Gram positif. 30 11/ Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce qu'au moins un micro-organisme à conserver est une bactérie de 3029741 36 genre Streptomyces conforme à la souche déposée et enregistrée à la CNCM sous le numéro I-4667. 12/ Composition comprenant - au moins un micro-organisme ; 5 - un milieu de conservation d'au moins un micro-organisme, et ; - au moins un composé, dit composé conservateur, choisi dans le groupe formé des composés pour lesquels il existe une proportion inhibitrice prédéterminée du composé conservateur dans la composition de conservation qui est o inhibitrice de la croissance d'au moins un micro-organisme dans la composition de conservation à température ambiante, et ; o non létale pour ledit au moins un micro-organisme, le composé conservateur présentant dans la composition une proportion supérieure à la proportion inhibitrice prédéterminée, ladite composition de conservation étant adaptée pour conserver ledit au moins un micro-organisme à température ambiante. 13/ Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'au moins un composé conservateur est choisi dans le groupe formé de l'acide undécylénique, des esters de l'acide undécylénique et des esters carboniques de 20 glycérol. 14/ Composition selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisée en ce qu'au moins un micro-organisme est du genre Streptomyces et conforme à la souche déposée et enregistrée à la CNCM sous le numéro I-4667. 25
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| BAKI HAZER ET AL: "Synthesis of microbial elastomers based on soybean oil. Autoxidation kinetics, thermal and mechanical properties", JOURNAL OF POLYMER RESEARCH, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS-CONSULTANTS BUREAU, NL, vol. 17, no. 4, 13 October 2009 (2009-10-13), pages 567 - 577, XP019824705, ISSN: 1572-8935 * |
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