FR2957086A1 - Boite multi-reacteurs pour culture cellulaire dynamique - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une boîte comprenant au moins un puits et au moins une chambre microstructurée de culture cellulaire dynamique, caractérisée en ce que chaque chambre microstructurée est connectée à un puits en entrée, le fond du puits étant à une altitude supérieure à tout point de la chambre. La présente invention concerne également un système de culture cellulaire dynamique et une méthode d'ensemencement à cet effet.

Description

DOMAINE TECHNIQUE GENERAL

La présente invention concerne la culture in vitro de cellules Plus précisément, elle concerne une boîte multi-bioréacteurs pour culture cellulaire dynamique en milieu nutritif.

ETAT DE L'ART

Les cultures de cellules sont aujourd'hui utilisées comme outil d'évaluation toxicologique de substances. On dispose également de bioréacteurs reproduisant un environnement favorable au développement et à l'organisation de cellules, proche de celui d'un tissu ou d'un organe animal ou humain. Grâce à eux, on peut prévoir la réaction d'un organe vis-à-vis d'une substance comme un xénobiotique, un cosmétique, un médicament ou plus généralement tout principe actif, et développer des modèles in vitro pertinents. Ces modèles sont de plus en plus souvent utilisés dans la recherche pharmaceutique car ils représentent une alternative sérieuse aux modèles in vivo, c'est à dire l'expérimentation animale, contre laquelle des pressions à la fois économiques et éthiques apparaissent au niveau international. La culture de cellules représente également la base de la création d'organes artificiels capables de se substituer aux organes défaillants ou absents, un des enjeux de l'ingénierie tissulaire. Les bioréacteurs comprennent aux deux extrémités d'une chambre microstructurée (une chambre de culture comportant une paroi supérieure et une paroi inférieure présentant des microstructures) un point d'entrée de fluide et un point de sortie de fluide pour permettre le passage d'un fluide nutritif nécessaire au développement des cellules. Le fluide est donc en circulation, mu par exemple par une pompe, c'est ce que l'on appelle une culture cellulaire dynamique. Un tel dispositif a été décrit dans la demande de brevet FR0954288. 1 Ce bioréacteur précurseur offre d'excellents résultats et permet un développement optimal des cellules, mais ne peut tout seul suffire à un usage industriel. Il serait souhaitable de pouvoir augmenter autant que possible la surface de culture des cellules.

Une solution pour cela est d'utiliser des multi-bioréacteurs, c'est-à-dire des bioréacteurs parallélisés. Ces dispositifs devraient en outre présenter un encombrement réduit. Divers systèmes de culture cellulaire intégrée ont été proposés à cet effet. Le système Hprel®, décrit par les brevets US5612188 et US7288405, est constitué de quatre doubles bioréacteurs disposés en parallèle et reliés à une pompe péristaltique. On notera que l'introduction des bioréacteurs dans le circuit de perfusion nécessite une opération longue et délicate dans des conditions stériles pour éviter la formation de bulles potentiellement très néfastes pour les cellules en développement.

L'adjonction d'un piège à bulles dans le circuit est par ailleurs nécessaire. En outre, ces bioréacteurs sont à l'intérieur d'un bloc en verre de plusieurs centimètres d'épaisseur qui ne dispose pas de connectiques. Le branchement se fait donc via des embouts placés dans des trous du bloc de verre.

Ce système assure une étanchéité, mais est problématique lors de l'ensemencement en cellules. En effet les souches de cellules humaines sont extrêmement chères, et doivent être mises en place précautionneusement. Or la seule solution pour l'ensemencement est d'injecter au niveau des embouts, qui représentent un gros volume mort en entrée. Ainsi une partie conséquente des cellules est gâchée, puisqu'elles se déposent sur les parois des conduits et non dans les bioréacteurs. Cela entraîne une incertitude sur la quantité injectée qui force à remplir complètement le bloc de verre par sécurité. Il est estimé que 50% des cellules sont perdues d'avance. De plus la structure de ce dispositif impose d'ensemencer deux bioréacteurs consécutifs avec les mêmes cellules, d'où des redondances.

Les systèmes BiofluxTM 200 et BiofluxTM 1000, décrits par la demande de brevet US2007/0243523, proposent une boîte étanche utilisant une plaque multi-puits du commerce adaptée. Une plaque multi-puits est une plaque standardisée comportant de nombreux puits ayant le rôle de petites éprouvettes. Il s'agit d'un outil couramment utilisé dans les laboratoires, disponible en de très nombreux modèles. Dans cette plaque adaptée, des microcanaux reliant deux puits servent de support à la croissance des cellules. Cependant ces systèmes ne permettent pas la culture cellulaire dynamique, car la perfusion du milieu de culture se fait par l'application d'une surpression. Le problème des bulles ne se pose plus, mais ce système est bien moins favorable à la culture des cellules. De plus il n'y a pas de microstructures, mais un simple canal entre deux puits. L'adhérence et la surface efficace sont très faibles et le rendement chute. Il faut injecter en aveugle une énorme quantité de cellules pour ensemencer un tel dispositif. Sachant qu'une dose pour ensemencer un seul microbioréacteur, de l'ordre du million de cellules, coûte plusieurs centaines d'euros, il est essentiel d'améliorer les procédés d'ensemencement cellulaire pour pouvoir en faire un outil rentable. En outre, ces dispositifs connus comprennent en série dans le circuit un réservoir de quelques millilitres de milieu nutritif. Ce réservoir sert aussi à faire des prélèvements. En plus de complexifier le réseau de perfusion puisqu'il en faut un de chaque par bioréacteur parallélisé, les éventuels réservoirs et pièges à bulles rallongent les circuits, et augmentent d'autant la surface interne des tuyaux. Or cette surface est le siège d'une adsorption des substances chimiques en solution. Cette adsorption fausse les tests de toxicologie, car un xénobiotique injecté en début de circuit verrait sa concentration chuter, voire tomber à zéro avant même de rencontrer les cellules en culture en fin de circuit. Le risque de faux négatif n'est pas négligeable.

PRESENTATION DE L'INVENTION La présente invention vise à résoudre les difficultés précédemment énoncées en proposant un dispositif qui, par une structure simple, permet de paralléliser des bioréacteurs performants de culture cellulaire dynamique tout en s'affranchissant de réservoirs ou de piège à bulles externes, et en réduisant considérablement la longueur de circuit nécessaire. Un but annexe de l'invention est de parvenir à cet objectif tout en obtenant un produit plus facile à utiliser, et ne présentant plus de risque de destruction du milieu cellulaire par une bulle.

Un but annexe est de permettre un ensemencement cellulaire contrôlé, rapide, et plus économique.

La présente invention se rapporte donc à une boîte comprenant au moins un puits et au moins une chambre microstructurée de culture cellulaire dynamique, caractérisée en ce que chaque chambre microstructurée est connectée à un puits en entrée, le fond du puits étant à une altitude supérieure à tout point de la chambre.

Grâce à cette structure, le ou les puits remplissent une fonction de piège à bulles. La colonne de fluide étant située à une altitude supérieure aux microchambres et chaque puits étant perfusé par au-dessus, les bulles éventuellement emportées s'échappent vers le haut par poussée d'Archimède. L'air ne peut pas être entraîné dans le circuit. Les puits remplissent également une fonction de réservoir. En effet, le volume de chaque puits est de l'ordre du millilitre. En connectant idéalement chaque chambre à deux puits, on est proche du volume classique de 2-3mL dans le circuit, et un réservoir externe devient inutile. Par ailleurs, ce débullage automatique facilite la procédure de remplissage du circuit en début de culture : il n'est plus nécessaire de purger précautionneusement tout le circuit, puisque lors du premier tour de fluide les bulles s'échapperont en amont de la microchambre, il suffit juste de contrôler que le niveau de fluide dans le premier puits est suffisant. Plus d'une heure de travail est ainsi économisée. Et il n'y a plus le risque que la culture soit détruite si ce travail n'avait pas été parfaitement effectué avant l'ensemencement. Enfin, ces puits rendent possible un ensemencement directement dans la chambre sans aucune perte, et qui ne nécessite qu'une pipette. L'opération est donc rapide, précise, et peut être effectuée sur de nombreuses chambres à la suite. Il n'y a plus besoin d'utiliser une seringue comme dans les dispositifs d'art antérieur. Le dispositif est opérationnel en quelques minutes pour un coût minimal.

Selon d'autres caractéristiques avantageuses et non limitatives : - chaque chambre microstructurée est connectée directement à un puits via un trou au fond du puits ; - la boîte comprend un microsystème, des connectiques d'interface dudit microsystème venant s'insérer dans le ou les trous ; - le microsystème est constitué d'une plaque inférieure comprenant l'empreinte de ladite au moins une chambre microstructurée, et d'une plaque supérieure ; - la connectique est un tube déformable faisant partie de ladite plaque supérieure, par lequel on peut insérer la pointe d'une pipette d'ensemencement dans la chambre ; - la connectique est un connecteur fixé au trou perfusant la chambre à travers des trous de la plaque supérieure ; - chaque chambre microstructurée est connectée à un puits d'entrée et un puits de sortie perfusés chacun par une connectique respectivement d'entrée et de sortie ; - la boîte est constituée d'un boitier inférieur recouvert d'un capot étanche maintenu par des moyens de serrage ; - le boitier inférieur comprend le microsystème et une plaque multi-puits, les puits étant des puits de ladite plaque multi-puits ; - le capot comprend des connectiques mâle perfusant les puits et des connectiques femelle d'entrée ; - la boîte comprend un connecteur male et un connecteur femelle par puits d'entrée et un connecteur male et deux connecteurs femelle par puits de sortie ; - le microsystème est constitué de polydimethylsiloxane ; - la plaque multi-puits est une plaque jetable en polystyrène ; - la plaque multi-puits est une plaque autoclavable en polycarbonate ; - un insert à membrane est disposé dans au moins l'un des puits.

L'invention propose également, selon un deuxième aspect de l'invention, un système de culture cellulaire dynamique caractérisé en ce qu'il comprend : - une boîte selon le premier aspect de l'invention, et - au moins un circuit de fluide comprenant une tuyauterie de circulation munie d'un moyen de circulation et connectée à au moins une chambre microstructurée. Selon d'autres caractéristiques avantageuses et non limitatives : - le moyen de circulation est une pompe péristaltique multicanaux.

Grâce à la suppression des trappes à bulles et des réservoirs, il est possible de réduire la longueur de circuit de perfusion de moitié. Les résultats d'études toxicologiques sur un système de culture cellulaire selon le deuxième aspect de l'invention en seront d'autant plus fiables vis-à-vis de tests similaires effectués sur des dispositifs connus.

L'invention propose enfin, selon un troisième aspect, une méthode d'ensemencement cellulaire d'une boîte selon le premier aspect de l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend des étapes de : a) Ouverture du capot ; b) Introduction de cellules à ensemencer dans une pipette ; c) Insertion de la pointe de la pipette dans une connectique ; d) Injection de cellules directement dans la chambre microstructurée depuis la pipette ; e) Fermeture étanche du capot et verrouillage par les moyens de serrage. Selon d'autres caractéristiques avantageuses et non limitatives : - la pipette est une micropipette jaugée, calibrée pour contenir une quantité prédéterminée de cellules correspondant à l'ensemencement optimal d'une chambre microstructurée ; - les étapes b), c) et d) sont répétées autant de fois qu'il y a de chambres dans le microsystème ; - la pipette est une pipette multicanaux à écartement adapté à la plaque multi-puits.

PRESENTATION DES FIGURES

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre d'un mode de réalisation préférentiel. Cette description sera donnée en référence aux dessins annexés dans lesquels : - La figure 1 est une vue éclatée en perspective d'une boîte selon l'invention ; - les figures 2a et 2b sont deux coupes transversales de la boîte selon l'invention, décapotée dans la première et capotée dans la seconde. La figure 2a montre l'ensemencement d'une chambre microstructurée, et la figure 2b met en évidence le chemin fluidique dans la boite ; - la figure 3 est une vue éclatée en perspective du boitier inférieur de la boîte selon l'invention ; - la figure 4 est une vue éclatée en perspective du microsystème de la boîte selon l'invention ; - la figure 5 est une vue en perspective d'une autre réalisation possible du boitier inférieur de la boîte selon l'invention, dans lequel le microsystème est détachable ; - la figure 6 est une vue éclatée en perspective du capot de la boîte selon l'invention ; - les figures 7a-7c représentent trois types possibles d'une plaque multi-puits utilisables dans divers modes de réalisation de la boîte selon l'invention ; - les figures 8a-8b sont des exemples d'observations au microscope de cellules en culture dans divers modes de réalisation de la boîte selon l'invention ; - la figure 9 est un schéma d'un système de culture cellulaire dynamique selon l'autre aspect de l'invention.

DESCRIPTION DETAILLEE

Architecture générale

La boîte 1 conforme à l'invention vise préférentiellement la parallélisation des bioréacteurs. Elle sera ainsi désignée dans certains modes de réalisation en tant que boîte multi-réacteurs. Toutefois, l'invention n'est pas limitée à ce mode de réalisation et peut ne comprendre qu'un puits 10, et qu'une chambre microstructurée 15. Dans le mode de réalisation préféré illustré par les figures, la boîte 1 est constituée d'un boitier inférieur 100 que vient recouvrir un capot étanche 200 maintenu par un système de serrage 20, par exemple quatre vis le traversant, comme représenté sur la figure 1. Ce boitier 100, que l'on voit mieux en détail sur la figure 3, comprend une plaque multi-puits 110, parmi lesquels on va trouver le ou les puits 10, et un microsystème 150. Des entretoises filetées 21 peuvent être disposées entre les puits 10 de façon complémentaire avec les moyens de serrage 20. Ces entretoises 21 peuvent être partie intégrante de certaines plaques multi-puits 110, ou être des tubes insérés dans des orifices percés dans le boitier, et collés.

La plaque multi-puits 110 est un objet bien connu de l'homme du métier qui peut ainsi se décliner sous de nombreuses formes, et qui est parfois appelé plaque microtitre, en référence aux petits volumes calibrés des puits. Par convention, ceux-ci sont disposés selon une matrice de rapport 2 :3, et on trouve généralement des plaques de 6, 12, 24, 96 ou 384 puits dans le commerce. Avantageusement, pour des considérations liées au volume des puits, la plaque multi-puits 110 conforme à l'invention est une plaque 24 puits. Une telle boîte contient six rangées de quatre puits 10 agencés comme le montrent la figure 2a ou 2b. Au fond des puits 10, sont percés des trous 11 par lesquels s'effectuent les communications de fluide entre les puits 10 et les chambres microstructurées 15. Chaque trou 11 permet d'ensemencer efficacement, puisque les souches de cellules injectées dans ce trou tombent par gravité dans la chambre microstructurée 15 à laquelle il est relié. Il n'y a pas de volume mort dans lequel les cellules viendraient se déposer avant d'atteindre la chambre, comme dans l'art antérieur. Le microsystème 150 s'adapte avantageusement à une plaque mufti- puits 110 en étant constitué de douze chambres 15 de dimensions identiques dont la surface est microstructurée, disposées de façon à ce qu'il y en ait deux par rangée, chacune reprenant de façon particulièrement préférée mais sans y être limitée un bioréacteur suivant la demande de brevet FR0954288. En choisissant le ratio une chambre pour deux puits, on obtient un volume de liquide stocké de 2-3mL par chambre, ce qui équivaut à celui des réservoirs supplémentaires nécessaires dans les dispositifs antérieurs. L'invention n'est cependant par limitée à cette architecture, et il est seulement nécessaire d'avoir au moins un puits par chambre, ce puits étant disposé en entrée. Par exemple, dans un autre mode de réalisation, une boîte selon l'invention peut comprendre six chambres microstructurées et une plaque six puits. Deux pièces visibles sur la figure 4 peuvent composer le microsystème 150: une plaque inférieure 152 portant l'empreinte du fond des chambres 15, et une plaque supérieure 151.

Une fois ces deux plaques assemblées hermétiquement, les cavités qui apparaissent sont les chambres 15. Celles-ci sont des petits volumes dans lesquels les cellules vont se développer dans des conditions très favorables. En effet les microstructures forment des canaux complexes offrant une grande surface de contact avec le fluide. La présence d'un microsystème 150 est toutefois optionnelle, d'autres structures pouvant abriter une chambre 15 de culture cellulaire étant connues de l'homme de l'art.

Modes de réalisation de la plaque supérieure du microsystème

La plaque supérieure 151 peut faire l'objet de deux modes de réalisation avantageux. On remarquera que l'invention n'est limitée ni à l'un ni à l'autre de ces modes de réalisation, la plaque supérieure 151 étant un élément facultatif. Toutefois chacun de ces deux modes de réalisation se combine parfaitement avec l'ensemble des caractéristiques décrites précédemment.

Un matériau, le PolyDiMéthylSiloxane (PDMS), se prête tout particulièrement à l'un comme l'autre de ces modes de réalisation, ainsi qu'au reste du microsystème 150. En effet, il est transparent, poreux à l'oxygène et aux gaz en général, et très adapté à la microstructuration, d'où son intérêt pour la culture cellulaire. En outre il est légèrement déformable.

Dans le premier mode de réalisation, la plaque supérieure 151 comprend des connectiques 16 d'entrée et de sortie du microsystème 150, visibles sur la plupart des figures et particulièrement sur la figure 4. Ces petits tubes s'insèrent dans les trous 11 des puits 10, et assurent la communication fluidique en fonctionnement normal. Si les puits 10 sont des puits d'une plaque multi-puits 110, l'étanchéité peut être éventuellement renforcée par exemple par un joint en matériau siliconé coulé au fond de chaque puits 10. Si le matériau qui compose les connectiques 16 est souple, comme c'est le cas des matériaux siliconés, ces connectiques 16 vont pouvoir accueillir par élasticité la pointe d'une pipette 2 utilisée comme outil d'ensemencement. En effet une pipette est un instrument classique de prélèvement et de transfert d'une quantité précise de fluide, généralement par aspiration grâce à une sorte de pompe appelée propipette surmontant celle-ci. On utilise le terme micropipette pour désigner un système de précision utilisée préférentiellement dans l'invention, dans lequel est intégré le mécanisme pneumatique. Dans un tel système, seule la pointe (qui est un cône jetable) est en contact avec le fluide, mais on parlera improprement de pipette de façon générique comme étant le réceptacle de fluide dans la suite de la description. La pipette 2, ou plus précisément la pointe de la pipette 2, peut donc être remplie de liquide d'ensemencement cellulaire. Ainsi insérée dans une connectique 16, la pointe de la pipette 2 a son extrémité à la base de la plaque supérieure 151, c'est-à-dire au niveau du plafond d'une des chambres 15. Un accès direct à l'intérieur de la chambre est permis. De plus grâce à la tension due à la déformation conique de la connectique 16, l'étanchéité entre la connectique 16 et la pointe de la pipette 2 insérée est assurée. Un piston permet à un opérateur de vider la colonne de liquide de la pipette par compression. Le volume éjecté peut être contrôlé très précisément, en particulier si la pipette que l'on utilise est une micropipette. Puisque injecté directement au plafond des chambres microstructurées, le fluide ne touche aucun autre organe que cette chambre dans laquelle il se répand. Le fluide initialement présent, qui peut être par exemple du milieu de culture ou une solution salée, est chassé par poussée d'Archimède et s'échappe par une autre connectique 16 de la chambre. Grâce à ces connectiques 16, un ensemencement optimal est possible.

Dans l'architecture représentée sur les dessins, on trouve une connectique 16 à l'entrée et à la sortie de chaque chambre 15, les connectiques centrales étant des entrées de fluide, et les latérales des sorties de fluide. Par analogie, les puits 10a au centre des rangées sont des puits d'entrée, et les puits 10b sur les bords des rangées sont des puits de sortie. On notera que même si préférentiellement on a deux connectiques 16 par chambre, il suffit qu'une seule de ces connectiques soit connectée comme précédemment décrit à un puits pour permettre un ensemencement cellulaire direct. Les connectiques d'entrée et de sortie peuvent de plus être utilisées indifféremment.

Dans le second mode de réalisation, représenté figure 5, la plaque supérieure 151 est pourvue de trous en lieu et place des connectiques 16 du premier mode de réalisation. Celles-ci ne sont plus intégrantes au microsystème 150, mais sont des connecteurs en dur, fixés dans les trous 11 des puits 10, par exemple par vissage, mais encore par collage, moulage, ou toute autre technique connue. Ces connecteurs 16 s'insèrent de façon amovible dans les trous pour désolidariser facilement le microsystème 150 du reste de la boîte 1. Leur matériau est préférentiellement le polycarbonate ou le polypropylène. La souplesse du PDMS est à nouveau très appréciable pour la plaque 152. En jouant sur le diamètre des trous, une jonction hermétique entre le microsystème et les connecteurs 16 est possible, de façon similaire à la jonction entre les connectiques 16 et la pipette 2 dans le précédent mode de réalisation. Cela permet un fonctionnement sans risque de fuite, même après des désolidarisations et resolidarisations successives du microsystème 150.

Structure du capot

On rappelle que le capot étanche 200 est un élément facultatif de l'invention qui peut faire l'objet de nombreux modes de réalisation. Il est compatible avec n'importe lequel des modes de réalisation du boitier inférieur 100 évoqués précédemment. Un capot 200 avantageux, détaillé figure 6, est préférentiellement constitué d'une plaque de Polycarbonate de 10 mm d'épaisseur dans laquelle 24 connecteurs de Polypropylène mâle 204 et 36 connecteurs de Polypropylène femelle 201 sont vissés (04 mm 10-32 UNF). 24 de ces connecteurs femelle 201 a et 201 c sont situés sur le dessus du capot 200, et sont alignés avec les connecteurs male 201. Les douze autres 201b sont sur le flanc du capot 200. Ainsi, lorsque la boîte est refermée, l'étanchéité étant assurée par un joint plat de PDMS 203 de 2 mm d'épaisseur, il y a un connecteur mâle 204 et un ou deux connecteurs femelle 201 par puits 10 : - pour les puits d'entrée 10a, il y a un seul connecteur de chaque type (201 a et 204). L'entrée de fluide est sur le dessus du capot 200. - Pour les puits de sortie 10b, on retrouve les deux connecteurs femelle 201 b-c. Seul le connecteur latéral 201b sert au passage du fluide. Le connecteur femelle 201 c sert en fait de trappe d'accès pour faire des prélèvements.

Système débulleur intégré

La figure 2b permet de visualiser le chemin fluidique. Le fluide pénètre par le connecteur femelle 201a. Il est transmis dans le puits d'entrée 10a par un connecteur mâle 204. Le fluide contenu dans ce puits d'entrée 10a est ensuite perfusé par la connectique 16 d'entrée de la chambre microstructurée 15, pour être recueilli dans le puits de sortie 10b via la connectique 16 de sortie de la chambre 15. L'excédent de fluide contenu dans le puits de sortie 10b est alors aspiré par un connecteur mâle 204 et acheminé vers le connecteur femelle 201b du capot. En prenant garde au volume utilisé, il est ainsi possible de perfuser en continu la chambre de culture. Chaque puits 10 ayant un volume de l'ordre du mL, les deux puits 10a-b par chambre 15 sont donc équivalent à un réservoir externe de 3mL.

De plus, comme on le voit encore sur la figure 2b, tout point du puits 10a est situé à une altitude supérieure à un point de la chambre. Par altitude supérieure, on sous-entend des conditions telles que toute goutte de fluide de la chambre 15 possède moins d'énergie potentielle de pesanteur que toute goutte du puits 10a. Cela est le cas en plaçant la boîte 1 selon l'invention dans une position de fonctionnement normale, c'est-à-dire avec le fond du boitier inférieur 100 posé sur une surface proche de l'horizontale.

Grâce à cette différence d'altitude, quand bien même une bulle d'air viendrait sortir du connecteur 204, la poussé d'Archimède la ramènerait en haut du puits 10a. Il serait contraire à la mécanique qu'elle puisse atteindre le fond du puits, et entrer dans la chambre 15. Comme il a déjà été dit, grâce à cette structure il est donc possible de débuller automatiquement le circuit à condition seulement de prendre garde au volume de fluide dans le puits 10a. Cela est valable aussi lors du remplissage initial du circuit, lors duquel il fallait purger précautionneusement les tuyaux de toute bulle d'air pour les dispositifs d'art antérieur. Dans la boîte selon l'invention, il y a une communication directe entre les puits 10 et la chambre 15 via la connectique 16. Une fois que cette dernière a été ensemencée et donc remplie par un opérateur, il suffit de remplir chaque puits 10 de liquide nutritif pour avoir l'assurance qu'il n'y a pas de bulle d'air enfermée dans le boitier inférieur 100, par simple gravité. Le capot 200 est refermé, et les bulles d'air éventuellement présentes dans le reste du circuit seront capturées par les puits 10a. Des tests ont été effectués, et il apparaît qu'un opérateur n'a besoin que de sept minutes pour mettre en perfusion après ensemencement une boîte multi-réacteurs complète, c'est-à-dire douze bioréacteurs. Cette opération prenait auparavant entre une heure et une heure trente, durant lesquelles l'opérateur devait injecter doucement du fluide dans chaque bioréacteur au moyen d'une seringue, remplir lentement le circuit de perfusion, puis le dégazer, ce qui n'a plus lieu d'être.

Observation au microscope des cellules pendant la culture

Grâce à leurs matériaux, le capot 200 et le microsystème 150 sont autoclavables : selon les besoins des utilisateurs, il est possible de les réutiliser dans certains cas pour une nouvelle culture après les avoir nettoyés et stérilisés. Pour la plaque multi-puits 110, de nombreux matériaux existent. Il est tout d'abord possible de choisir une plaque en Polystyrène, comme celle de la figure 7a. Une plaque 110 en ce matériau est à usage unique et doit être jetée en fin de culture. Elle est par contre peu chère et parfaitement transparente, rendant facile l'observation des cellules pendant la culture : l'encombrement de la boîte multi-réacteurs totale selon l'invention n'étant pas plus grand que celui d'une boîte de Pétri, on peut la placer en entier sous un microscope. Il est en effet souhaitable de pouvoir surveiller à tout moment les cellules sans les perturber, aussi bien pour s'assurer de la bonne croissance que pour observer l'impact toxicologique direct d'une substance. Alternativement on peut choisir une plaque 110 en Polycarbonate, c'est-à-dire le même matériau que le capot 200. L'ensemble est alors autoclavable, mais le Polycarbonate possède l'inconvénient de devenir opaque lorsqu'il est usiné, ce qui est problématique pour l'observation des parties de chambre sous les puits. Une première solution, si l'on choisit une plaque multi-puits 110 en Polycarbonate comme celle représentée figure 7b, consiste à découper le fond des puits 10, et à interposer entre la boîte 110 et le microsystème 150 une fine plaque supplémentaire 111 de polycarbonate et un joint de PDMS assurant une étanchéité identique à celle entre le boitier 100 et le capot 200. Un moyen de serrage similaire au moyen 20 maintient alors le boitier inférieur uni. Grâce à cette plaque supplémentaire 111 parfaitement transparente car non usinée, l'observation au microscope est parfaite et en même temps l'ensemble est autoclavable. Une seconde solution, plus astucieuse, consiste à choisir une plaque 110 avec des puits demi-lune, représentée figure 6c. En effet on remarque par exemple sur la figure 4 que la zone la plus intéressante d'observation est la partie centrale des chambres 15. En effet c'est là qu'est le coeur de la culture cellulaire, les parties latérales d'une chambre 15 étant plutôt des canaux de répartition de fluide. Et cette zone centrale ne se situe pas sous les puits 10, mais entre un puits 10a et un puits 10b. Dans le cas d'une boîte demi-lunes, c'est une zone rectangulaire dégagée qui correspond au « plat » des puits demi-lune. Une plaque avec des puits demi-lune est donc parfaitement adaptée à l'observation, sans qu'il y ait besoin de modifier le fond des puits.

Les images obtenues en observant les cellules à travers la totalité de la boîte multi-bioréacteurs sont ainsi d'une précision remarquable, malgré l'épaisseur de plastique traversée. La figure 8a en est un exemple, une précision d'une dizaine de microns est atteinte, largement suffisante pour compter les cellules. Il est toutefois possible d'atteindre une précision optique encore supérieure dans le cas d'une boîte à microsystème 150 détachable (figure 5) décrite précédemment. Pendant la culture cellulaire, il suffit ainsi d'arrêter la circulation de fluide, et de désolidariser les bioréacteurs du boîtier 100 en tirant doucement sur le microsystème 150 en PDMS. Ce dernier peut être introduit dans une enceinte stérile transparente et observé avec un niveau de détail et de contraste inégalé, puisque la vision est directe, à travers seulement quelques millimètres de plastique. On peut alors observer jusqu'à l'intérieur des cellules, comme le montre la figure 8b, pour par exemple analyser de façon très poussée certains effets d'une substance testée. Pendant la phase de désolidarisation, le boitier supérieur 100 reste rempli de liquide : la circulation étant arrêtée, le fluide est maintenu dans les fins canaux des connecteurs vissés 16 par simple capillarité à condition que le capot 200 ne soit pas ouvert. Le microsystème 150 est ensuite reconnecté au reste de la boîte 1 via les connecteurs 16, pour continuer et reprendre la perfusion. Il a été testé expérimentalement qu'il suffit de placer une goutte de milieu de culture dans chaque trou d'entrée et de sortie des chambres 15 avant de reconnecter l'ensemble pour éviter le risque d'introduction d'une bulle d'air dans une chambre 15.

Système de culture cellulaire dynamique

Selon un autre aspect, l'invention concerne un système de culture cellulaire dynamique comprenant une boîte 1 selon le premier aspect de l'invention, au moins un circuit 300 de fluide et une pompe 320, préférentiellement une pompe péristaltique, ou toute autre moyen de circulation de fluide connu de l'homme de l'art. Les différents organes sont liés sur le circuit 300 par une tuyauterie 310 constituée de tubes, préférentiellement des tubes les plus courts possibles, et à la surface interne la moins adsorbante possible afin de limiter toute variation de concentration d'une substance injectée dans le circuit 300. Le fait que la culture soit dynamique signifie qu'il y a recirculation en circuit fermé du fluide. Dans une telle configuration les conditions de développement des cellules sont plus proches de celles de l'organisme que dans les systèmes d'art antérieur dans lesquels le fluide soit est statique, soit n'effectue jamais une rotation complète de circuit (mouvement de va-et-vient de fluide dans une chambre, qui en particulier n'autorise pas de comparaison entre le fluide en entrée de chambre et celui sortant de la chambre, ou traversée unique de la chambre par un fluide qui n'est pas réutilisé).

Une pompe péristaltique est une pompe dans laquelle le fluide est entraîné par compression et déformation d'un tube, à la manière des contractions musculaires autour de l'oesophage par exemple. Ce système est particulièrement adapté pour l'application à la culture cellulaire pour de nombreuses raisons. Tout d'abord, il s'applique principalement aux petits débits, pour lesquels il est d'une grande précision et d'une grande souplesse. L'arrêt de la pompe coïncide exactement avec l'immobilisation du fluide dans le circuit. Ensuite, il n'y a pas d'éléments autres que le tube flexible en contact avec le fluide. Il n'y a donc pas de risque de contamination ou de fuite. Enfin une seule pompe peut gérer plusieurs circuits de fluide à la fois, notamment 24 pour une pompe Ismatec® IPC-N particulièrement préférée. Cela correspond à la totalité des chambres de deux boîtes multi-réacteurs précédemment décrites. En jouant sur le diamètre interne des tuyaux 310, il est également possible de travailler en même temps avec des débits différents selon les circuits, ce qui peut par exemple être utile pour comparer différentes cinétiques d'exposition à une substance.

Un exemple de circuit avec une pompe 320 douze canaux et une boîte 1 selon l'invention est représentée figure 9. Il y a un circuit 300 de fluide par chambre 15. On remarque à nouveau qu'aucun élément supplémentaire tel un réservoir ou un piège à bulle n'est requis. La longueur de chaque circuit 300 et donc les variations de concentrations des substances injectées, sont minimales. Dans cet exemple, toutes les cultures sont parallélisées. Grâce aux connectiques 201, il est toutefois possible de réaliser des architectures très variées, avec différents réacteurs en série ou en parallèle. Cet aspect modulaire possible grâce à l'aspect dynamique de la culture cellulaire du système selon l'invention permet de simuler des métabolismes complexes, par exemple un enchaînement de plusieurs organes bioartificiels et/ou de différents types de cellules caractéristiques d'un même organe. C'est ce que l'on appelle la co-culture. En effet la réponse métabolique à une substance pourrait être à plusieurs niveaux : ne pas affecter un premier organe mais affecter un second, entraîner la sécrétion d'une substance par un premier organe qui aurait des répercussions sur un second, etc. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, chaque chambre 15 de la boîte multi-réacteurs simule un organe différent (foie, rein, pancréas...), ces organes bioartificiels étant câblés selon de multiples circuits représentant l'architecture humaine au plus près (rein en aval du foie par exemple).

Inserts à membranes De façon encore plus avantageuse, la boîte selon l'invention permet de simuler certains « filtres » présents dans l'organisme. Ainsi, la barrière hémato-encéphalique est une barrière anatomique qui filtre et contrôle le passage des substances sanguines et les empêche de passer librement du sang au liquide extra-cellulaire du système nerveux central. Elle isole la substance grise du reste de l'organisme et lui permet d'avoir un milieu spécifique. Seules 2% des molécules la traversent librement. Des substances qui s'avèreraient ainsi neurotoxiques si injectées directement sans le cerveau pourrait s'avérer d'une totale innocuité si injectées normalement. Pour prendre en considération cela, il est possible de placer dans les puits des inserts à membranes. Ces supports vendus dans le commerce se présentent sous la forme d'un petit disque présentant les propriétés physico-chimiques de la membrane anatomique à simuler, et s'installent dans les puits 10 d'entrée et de sortie de l'organe à isoler. La culture dynamique offerte par le système selon l'invention est encore une fois nécessaire pour utiliser cette possibilité. On peut ainsi par exemple compléter la structure décrite précédemment en simulant le passage dans le sang d'une molécule ingérée grâce à une muqueuse intestinale de synthèse.

Méthode d'ensemencement cellulaire Selon un dernier aspect, l'invention concerne une méthode d'ensemencement cellulaire de la boîte multi-bioréacteurs. Comme il a été expliqué, les connectiques 16 peuvent recevoir la pointe d'une pipette 2. Avant de pouvoir réaliser l'ensemencement à proprement parler, il est nécessaire d'accéder aux connectiques 16 en ouvrant le capot 200, en général après avoir déverrouillé les moyens de serrage 20. Dès lors, le fond des puits 10, et donc les connectiques 16, sont accessibles. L'opérateur utilise alors une pipette 2 comme instrument d'ensemencement. La configuration d'ensemencement est visible sur la figure 2a. Une fois chaque chambre ensemencée, il n'y a plus qu'à refermer le capot, connecter le ou les circuits 300, et lancer la perfusion par le fluide nutritif, pour initier le développement des cellules.

De façon préférée, la pipette 2 est une micropipette jaugée.

Contrairement aux pipettes graduées, ces pipettes sont conçues pour contenir un volume particulier, pour lequel elles sont extrêmement précises. Puisque le volume d'une chambre 15 est connu, ainsi que la quantité de cellules à y injecter, il est possible de déterminer le volume optimal correspondant à l'ensemencement d'une chambre, et choisir une micropipette jaugée parfaitement adaptée. Avec un tel instrument, l'opérateur n'a plus qu'à répéter pour chacune des chambres des étapes de : remplissage de la pipette 2, introduction de sa pointe dans une connectique 16 de la chambre, injection du contenu, et retrait de la pointe. Chaque ensemencement ne prend que quelques secondes, utilise une quantité rigoureusement connue et minimale de liquide cellulaire, et garantit des conditions de cultures optimales. On peut alternativement utiliser une pipette graduée remplie d'un grand volume de liquide et ensemencer à la suite les chambres 15 en visualisant le volume à injecter à chaque fois grâce aux graduations. De façon particulièrement préférée, on utilisera une pipette multicanaux adaptée aux dimensions de la plaque multi-puits 110. Il s'agit d'une pipette comportant un seul manche, mais de multiples pointes (en l'occurrence six dans le cas d'une boîte 24 puits comme représentée dans les figures). Cet instrument permet d'ensemencer simultanément une chambre de chaque rangée, et donc d'ensemencer toute la boîte en seulement deux manipulations.

Une pipette multicanaux peut même être équipée sur un système de distribution automatisée. Un tel système comprend un bras robotisé et une alimentation ou un réservoir de fluide. Il se déplace tout seul d'une position à une autre afin d'ensemencer automatiquement toutes les chambres d'une boîte multi-bioréacteurs, voire de plusieurs. Ce genre de dispositif ouvre la voie à une culture de masse d'organes bioartificiels.

Claims (21)

1. REVENDICATIONS1. Boîte (1) comprenant au moins un puits (10) et au moins une chambre microstructurée de culture cellulaire dynamique (15), caractérisée en ce que chaque chambre microstructurée (15) est connectée à un puits (10) en entrée, le fond du puits (10) étant à une altitude supérieure à tout point de la chambre (15).
2. 2. Boîte selon la revendication précédente, caractérisée en ce que chaque chambre microstructurée (15) est connectée directement à un puits (10) via un trou (11) au fond du puits (10).
3. 3. Boîte selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle comprend un microsystème (150), des connectiques (16) d'interface dudit microsystème (150) venant s'insérer dans le ou les trous (11).
4. 4. Boîte selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le microsystème (150) est constitué d'une plaque inférieure (152) comprenant l'empreinte de ladite au moins une chambre microstructurée (15), et d'une plaque supérieure (151).
5. 5. Boîte selon la revendication précédente, caractérisée en ce que la connectique (16) est un tube déformable faisant partie de ladite plaque supérieure (151), par lequel on peut insérer la pointe d'une pipette d'ensemencement (2) dans la chambre (15).
6. 6. Boîte selon la revendication 4, caractérisée en ce que la connectique (16) est un connecteur fixé au trou (11) perfusant la chambre (15) à travers des trous de la plaque supérieure (151).
7. 7. Boîte selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisée en ce que chaque chambre microstructurée (15) est connectée à un puits d'entrée (10a) et un puits de sortie (10b) perfusés chacun par une connectique (16) respectivement d'entrée et de sortie.
8. 8. Boîte selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un boitier inférieur (100) recouvert d'un capot étanche (200) maintenu par des moyens de serrage (20).
9. 9. Boîte selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le boitier inférieur (100) comprend le microsystème (150) et une plaque multi-puits (110), les puits (10) étant des puits de ladite plaque multipuits (110).
10. 10. Boîte selon l'une des revendications 8 à 9, caractérisée en ce le capot comprend des connectiques mâle (204) perfusant les puits (10) et des connectiques femelle (201) d'entrée.
11. 11. Boîte selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle comprend un connecteur male (204) et un connecteur femelle (201a) par puits d'entrée (10a) et un connecteur male (204) et deux connecteurs femelle (201 b-c) par puits de sortie (10b). 25
12. 12. Boîte selon l'une des revendications 3 à 11, caractérisée en ce que le microsystème (150) est constitué de polydimethylsiloxane.
13. 13. Boîte selon l'une des revendications 9 à 12, 30 caractérisée en ce que la plaque multi-puits (110) est une plaque jetable en polystyrène. 15 20
14. 14. Boîte selon l'une des revendications 9 à 12, caractérisée en ce que la plaque multi-puits (110) est une plaque autoclavable en polycarbonate.
15. 15. Boîte selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'un insert à membrane est disposé dans au moins l'un des puits (10).
16. 16. Système de culture cellulaire dynamique caractérisé en ce qu'il comprend - une boîte (1) selon l'une des revendications précédentes, et - au moins un circuit (300) de fluide comprenant une tuyauterie (310) de circulation munie d'un moyen (320) de circulation et connectée à au moins une chambre microstructurée (15).
17. 17. Système selon la revendication précédente caractérisé en ce que le moyen (320) de circulation est une pompe péristaltique multicanaux.
18. 18. Méthode d'ensemencement cellulaire d'une boîte (1) selon l'une des revendications 8 à 15, caractérisée en ce qu'elle comprend des étapes de : a) Ouverture du capot (200) ; b) Introduction de cellules à ensemencer dans une pipette (2) ; c) Insertion de la pointe de la pipette (2) dans une connectique (16) ; d) Injection de cellules directement dans la chambre microstructurée (15) depuis la pipette (2) ; e) Fermeture étanche du capot (200) et verrouillage par les 30 moyens de serrage (20). 25 5 10
19. 19. Méthode selon la revendication précédente, caractérisée en ce que la pipette (2) est une micropipette jaugée, calibrée pour contenir une quantité prédéterminée de cellules correspondant à l'ensemencement optimal d'une chambre microstructurée (15).
20. 20. Méthode selon l'une des revendications 18 à 19, caractérisée en ce que les étapes b), c) et d) sont répétées autant de fois qu'il y a de chambres (15) dans le microsystème (150).
21. 21. Méthode selon la revendication précédente, caractérisée en ce que la pipette (2) est une pipette multicanaux à écartement adapté à la plaque multi-puits (110).