FR2941240A1 - Procede pour determiner la sensibilite d'un patient a contracter une infection nosocomiale. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé pour déterminer la susceptibilité d'un patient à contracter une infection nosocomiale selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins un réactif spécifique du produit d'expression du gène cible S100A9 c. on détermine l'expression du gène cible S100A9

Description

La présente invention concerne un procédé et un kit pour déterminer la susceptibilité d'un patient à contracter une infection nosocomiale.

Les infections nosocomiales constituent un réel problème de santé publique, générant des conséquences en un coût économique et humain dramatique. En France, on estime entre 500 000 et 800 000 le nombre de patients qui contractent chaque année une infection nosocomiale. L'apparition d'infections nosocomiales est liée à différents facteurs, tels que les techniques médicales utilisées, mais également la susceptibilité du patient à contracter de telles infections.

Ainsi, l'utilisation de cathéters, de mesure de la pression veineuse centrale, l'implantation de prothèses, les perfusions etc. sont des techniques favorisant l'apparition d'infections nosocomiales. Ainsi, l'utilisation de cathéters veineux est responsable d'environ 30 à 35 % des d'infections nosocomiales, l'infection se propageant de l'extrémité du cathéter, en contact avec la peau du patient, jusqu'à l'intérieur de la circulation veineuse. De plus, les patients hospitalisés peuvent avoir un système immunitaire déficient, du fait de leur pathologie (diabète, insuffisance respiratoire, pathologies immunitaires, grands brûlés...) ou en raison de leur état général. Les personnes dénutries, les nouveau-nés ou les personnes âgées sont plus réceptives aux infections nosocomiales. Toutes les infections nosocomiales ne présentent pas le même caractère de gravité. Un traitement n'est pas toujours efficace et efficient, en fonction de la localisation de l'infection et de l'antibiogramme de l'agent infectieux en cause qui peut être résistant à un grand nombre d'antibiotiques.

De ce fait, les principales mesures pour combattre les infections nosocomiales restent préventives, incluant une bonne hygiène des mains des soignants, des patients et de leur entourage, un isolement septique des malades susceptibles de propager l'infection, la surveillance de l'usage des antibiotiques dans l'hôpital... Il est également possible d'isoler à titre préventif des sujets anormalement susceptibles aux infections. Malheureusement, il n'est pas toujours possible de déterminer lors de l'admission d'un patient, quelle peut être sa susceptibilité à contracter une infection nosocomiale.

La présente invention se propose de résoudre les inconvénients de l'état de la technique en présentant un nouvel outil fiable pour déterminer la sensibilité d'un patient à contracter une infection nosocomiale. D'une manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence qu'une telle susceptibilité peut être déterminée par l'analyse de l'expression du gène S100A9. L'invention présente donc une avancée importante dans le domaine de la lutte contre les infections nosocomiales.

Avant d'aller plus avant, les définitions suivantes sont données afin de mieux comprendre l'invention. On entend par infection nosocomiale, toute infection contractée dans un établissement de santé 48 heures après l'admission et qui n'était pas présente à l'admission du patient dans cet établissement. On entend par gène cible / gène cible S100A9, le gène de référence Genbank NM 002965.3. On entend par produit d'expression du gène S100A9, l'ARN messager ou un fragment d'ARNm, l'ADNc ou un fragment d'ADNc, une protéine ou un fragment de protéine. On entend par échantillon biologique, tout matériel issu du patient, susceptible de contenir un matériel biologique permettant de détecter l'expression d'un gène ou la protéine correspondante, et peut être notamment un échantillon de sang, de sérum, de salive ou de tissu ou de cellules circulantes du patient. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier, tel que notamment une prise de sang. On entend par matériel biologique tout matériel permettant de détecter l'expression d'un gène, comme notamment un acide nucléique ou une protéine, ou sa séquence codante. L'acide nucléique peut être notamment un ARN (acide ribonucléique) tel qu'un ARNm (ARN messager). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique est un acide nucléique, et encore plus préférentiellement un ARNm (ARN messager). L'extraction du matériel biologique de l'échantillon biologique peut être réalisée par tous les protocoles d'extraction d'acides nucléiques ou de protéines bien connus de l'homme du métier. A titre indicatif, l'extraction d'acides nucléique peut notamment être réalisée par : • une étape de lyse des cellules présentes dans l'échantillon biologique, afin de libérer les acides nucléiques contenus dans les enveloppes protéiques et/ou lipidiques des microorganismes (comme des débris cellulaires qui perturbent les réactions ultérieures). A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrite dans les demandes de brevet de la Demanderesse : o WO-A-00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, o WO-A-99/53304 sur la lyse électrique, et o WO-A-99/15321 sur la lyse mécanique. L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US-A-5,234,809). • une étape de purification, permettant la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US-A-4,672,040 et US-A-5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet déposées par la Demanderesse sous les références suivantes : WO-A-97/45202 et WO-A-99/35500. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne, soit sous forme de particules inertes (Boom R. et al., J. Clin. Microbiol., 1990, n°28(3), p. 495-503) ou magnétiques (Merck: MagPrep Silica, Promega: MagneSil'M Paramagnetic particles). D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne ou en format particulaire paramagnétique (Whatman: DEAE-Magarose) (Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344). Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique (société Xtrana: matrice Xtra-BindTM). Une telle étape d'extraction peut être faite en automates. L'automate easyMAG est particulièrement adapté. On entend par réactif spécifique un réactif qui réagit avec le matériel biologique afin de mettre en évidence, d'une manière directe ou indirecte l'expression d'un gène cible, qui peut être déterminé par l'analyse des ARNm issus de ce gène, ou par l'analyse de la protéine codée par ce gène.

A titre indicatif, lorsque l'on souhaite déterminer l'expression d'un gène cible par l'analyse de la protéine codée par ce gène, on peut utiliser des techniques de détection de protéines avec ou sans ligand. Parmi les techniques de détection avec ligand, on peut utiliser par exemple un anticorps spécifique de la protéine codée par ce gène cible. A titre indicatif, lorsque l'on souhaite déterminer l'expression d'un gène cible par l'analyse des ARN messagers (ARNm) transcrits à partir de ce gène, ce réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification spécifique de l'ADN complémentaire de cet ARNm (on parle alors d'amorce d'amplification spécifique d'un gène cible). L'ADN complémentaire d'un ARNm peut être obtenu selon un protocole bien connu de l'homme du métier. A titre indicatif, on extrait les ARN totaux (comprenant les ARN ribosomaux, les ARN de transfert, les ARNm) de l'échantillon biologique. On réalise ensuite une réaction de transcription inverse à l'aide d'une enzyme transcriptase inverse qui permet d'obtenir, à partir d'un fragment d'ARN, un fragment complémentaire d'ADN (ADNc). La réalisation d'une telle étape est bien connue de l'homme du métier. Lorsque l'on souhaite plus particulièrement obtenir uniquement les ADN complémentaires des ARN messagers, on réalise cette étape enzymatique en présence de fragments nucléotidiques comprenant uniquement des bases thymine (polyT), qui s'hybrident par complémentarité sur la séquence polyA des différents ARNm afin de former un complexe polyT-polyA qui sert alors de point de départ à la réaction de transcription inverse réalisée par l'enzyme transcriptase inverse. On obtient alors différents ADN complémentaires des différents ARN messagers initialement présents dans l'échantillon biologique. Dans la suite de l'exposé, on désigne par ADNc, un ADN complementaire d'un ARN messager. Par amorce d'amplification, on entend un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléotidiques, préférentiellement de 15 à 25 motifs nucléotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une réaction d'amplification enzymatique.

Par réaction d'amplification enzymatique, on entend un processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique cible à l'aide d'amorces d'amplification spécifiques par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes PCR (Polymerase Chain Reaction), LCR (Ligase Chain Reaction), RCR (Repair Chain Reaction), 3SR (Self Sustained Sequence Replication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995, NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), et TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A- 5,399,491. On parle alors d'amplicons pour désigner les polynucléotides générés par une technique d'amplification enzymatique. Préférentiellement, lorsque l'amplification enzymatique est une PCR, le réactif spécifique comprend au moins 2 amorces d'amplification spécifiques afin d'amplifier une région particulière de l'ADN complémentaire de l'ARNm issu du gène cible. Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR réalisée après une réaction de transcription inverse, on parle de RT-PCR. Par sonde d'hybridation, on entend un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléotidiques, notamment de 6 à 35 motifs nucléotidiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un fragment nucléotidique cible. Dans la présente invention, le fragment nucléotidique cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager ou une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse dudit ARN messager.

Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, tels que par exemple une sonde d'hybridation et un fragment nucléotidique cible, ayant des séquences suffisamment complémentaires sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques. Un fragment nucléotidique "capable de s'hybrider" avec un polynucléotide est un fragment pouvant s'hybrider avec ledit polynucléotide dans des conditions d'hybridation, qui peuvent être déterminées dans chaque cas de façon connue. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence, c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépendra principalement des sondes d'hybridation utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des sondes d'hybridation utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. On réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453-458 ou Keller G.H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249]. Par marqueur, on entend un traceur capable d'engendrer un signal. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la bêtagalactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase ; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, 35S ou 1251 Ainsi, le polynucléotide peut être marqué pendant l'étape d'amplification enzymatique, par exemple en utilisant un nucléotide triphosphate marqué pour la réaction d'amplification. Le nucléotide marqué sera un désoxyribonucléotide dans les systèmes d'amplification générant un ADN, comme la PCR, ou un ribonucléotide dans les techniques d'amplification générant un ARN, comme les techniques TMA et NASBA. Le polynucléotide peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde marquée selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO-A-91/19812.

Au sens de la présente invention, la sonde d'hybridation peut être une sonde dite de capture. Dans ce cas, le fragment nucléotidique cible peut être préalablement marqué au moyen d'un marqueur. La sonde dite de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption. On réalise alors une réaction d'hybridation entre ladite sonde de détection et le fragment nucléotidique cible marqué.

La sonde d'hybridation peut également être une sonde dite de détection. Dans ce cas, la sonde d'hybridation peut être marquée au moyen d'un marqueur. On réalise alors une réaction d'hybridation entre ladite sonde de capture et le fragment nucléotidique cible.

Que l'on utilise une sonde dite de capture ou une sonde dite de détection, la réaction d'hybridation peut être réalisée sur un support solide qui inclut tous les matériaux sur lesquels peut être immobilisé un acide nucléique. Des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ou le dextrane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WOA-94/12670, d'une particule ou d'une biopuce. Dans la présente invention, la détermination de l'expression du gène S100A9 peut être analysée par l'expression des ARNm qui sont transcrits à un temps donné. Dans ce cas, le matériel biologique est un acide nucléique, et le réactif spécifique peut être indifféremment une amorce d'amplification ou une sonde d'hybridation telles que définies précédemment.

A titre indicatif, on peut déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante: 1) après avoir extrait les ARN totaux d'un échantillon biologique, on réalise une étape de transcription inverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir les différents ADN complémentaires des différents ARN messagers initialement présents dans l'échantillon biologique (ou ADNc) 2) on amplifie spécifiquement les ADNc. Dans ce cas, le réactif spécifique utilisé comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible, telle que définie précédemment. Cette étape peut être réalisée notamment par une réaction d'amplification de type PCR ou par toute autre technique d'amplification. 3) on détermine l'expression du gène cible en quantifiant les ADNc. Les ADNc peuvent être quantifiés notamment par l'utilisation d'une gamme de quantification obtenue par une réaction d'amplification conduite jusqu'à saturation. Afin de tenir compte de la variabilité d'efficacité enzymatique qui peut être observée lors des différentes étapes (transcription inverse, PCR...), on peut normaliser l'expression du gène cible des différents groupes de patients, par la détermination simultanée de l'expression d'un gène dit de ménage, dont l'expression est similaire chez les différents groupes de patients. En réalisant un rapport entre l'expression du gène cible et l'expression du gène de ménage, on corrige ainsi toute variabilité entre les différentes expérimentations. L'homme du métier pourra se référer notamment aux publications suivantes : Bustin SA Journal of molecular endocrinology, 2002, 29 : 23-39 ; Giulietti A Methods, 2001, 25 : 386-401.

On peut également déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante: 1) après avoir extrait les ARN totaux d'un échantillon biologique, on réalise une étape de transcription inverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir les différents ADN complémentaires des différents ARN messagers initialement présents dans l'échantillon biologique (ou ADNc) 2) on immobilise les ADNc sur une membrane 3) on détermine l'expression du gène cible en hybridant les ADNc à des sondes d'hybridation spécifiques du gène cible préalablement marquées. De telles techniques d'hybridation sont bien connues de l'homme du métier, et on peut citer notamment la technique du Northern blot. Cette réaction d'hybridation peut être réalisée après une étape d'amplification spécifique des ADN complémentaires des ARN messagers d'un gène cible lorsque notamment le gène est faiblement exprimé. L'expression d'un gène cible peut être également analysée par l'expression des protéines codées par le gène cible. Dans ce cas, le matériel biologique est une protéine et plusieurs techniques de détection avec ou sans ligand peuvent être utilisées. La spectrométrie de masse peut être utilisée comme technique de détection sans ligand. Le réactif spécifique peut être un anticorps spécifique de la protéine codée par le gène cible pour un système de détection avec ligand.

Les anticorps recombinants, spécifiques de la protéine traduite du gène cible peuvent être obtenus selon des procédés classiques connus de l'homme du métier, à partir d'organismes procaryotes, tels que bactéries, ou à partir d'organismes eucaryotes, tels que levures, cellules de mammifères, de plantes, d'insectes ou d'animaux, ou par des systèmes de production extra-cellulaire. Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés selon les techniques classiques connues de l'homme du métier telles que la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après. Dans un premier temps, on immunise un animal, généralement une souris, (ou des cellules en culture dans le cadre d'immunisations in vitro) avec un antigène cible d'intérêt, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre ledit antigène. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" (murines dans l'exemple) pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on effectue alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis de l'antigène d'intérêt pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert en une ou deux dimensions, en immunofluorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite purifiés notamment selon la technique de chromatographie d'affinité. Des fragments d'anticorps peuvent par exemple être obtenus par protéolyse. Ainsi, ils peuvent être obtenus par digestion enzymatique, résultant en des fragments de type Fab (traitement à la papaïne ; Porter RR, 1959, Biochem. J., 73 : 119-126) ou de type F(ab)'2 (traitement à la pepsine ; Nisonoff A. et al., 1960, Science, 132 1770-1771). Ils peuvent également être préparés par voie recombinante (Skerra A., 1993, Curr. Opin. Immunol., 5 256-262). Un autre fragment d'anticorps qui convient aux fins de l'invention comprend un fragment Fv qui est un dimère constitué de l'association non covalente du domaine variable léger (VL) et du domaine variable lourd (VH) du fragment Fab, donc de l'association de deux chaînes polypeptidiques. Afin d'améliorer la stabilité du fragment Fv due à la dissociation des deux chaînes polypeptidiques, ce fragment Fv peut être modifié par génie génétique en insérant un lien peptidique adapté entre le domaine VL et le domaine VH (Huston P. et al., 1988, Proc. Natl.Acad. Sci.USA, 85 : 5879- 5883). On parle alors de fragment scFv ( single chain Fragment variable ) car il est constitué d'une seule chaîne polypeptidique. L'utilisation d'un lien peptidique composé préférentiellement de 15 à 25 acides aminés permet de relier l'extrémité C-terminale d'un domaine à l'extrémité N-terminale de l'autre domaine, constituant ainsi une molécule monomérique dotée de propriétés de liaison similaires à celles de l'anticorps sous sa forme complète. Les deux orientations des domaines VL et VH conviennent (VL-lien-VH et VH-lien-VL) car elles présentent des propriétés fonctionnelles identiques. Bien entendu, tout fragment connu de l'homme du métier et présentant les caractéristiques immunologiques définies ci-dessus convient aux fins de l'invention. Lorsque le matériel biologique est une protéine issue de l'expression d'un gène, on peut déterminer l'expression de ce dernier, en détectant et ou quantifiant la dite protéine par Western Blot ou ELISA, ou toute autre méthode connue de l'homme du métier, telle qu'une méthode de chimiluminescence à partir du matériel biologique. La technique ELISA ( Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ) est un dosage immunoenzymatique sur support solide. Ce test entre dans le cadre plus général des EIA ( Enzyme Immunoassays ) dans lequel le dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme. La technique utilise un ou deux anticorps. L'anticorps de détection de la formation de complexes immuns (antigène / anticorps) est couplé à l'enzyme et peut générer l'émission d'un signal par un substrat chromogène ou fluorogène. La technique Western Blot est un test pour détecter une protéine spécifique dans un échantillon à l'aide d'un anticorps spécifique de cette protéine comprenant les étapes suivantes telle que décrites ci après. La première étape est une électrophorèse sur gel, qui permet de séparer les protéines de l'échantillon selon leur taille.

Les protéines dans le gel sont alors transférées sur une membrane (nitrocellulose, PVDF...) par pression ou par application d'un courant électrique, les protéines se fixant à la membrane grâce à des interactions hydrophobes et ioniques. Après saturation des sites d'interaction non spécifique, un 10 premier anticorps, spécifique de la protéine à étudier (anticorps primaire) est incubé avec la membrane. La membrane est ensuite rincée afin d'enlever les anticorps primaires non liés, puis incubée avec des anticorps dits secondaires, qui vont se lier aux anticorps primaires. Cet 15 anticorps secondaire est habituellement lié à une enzyme qui permet l'identification visuelle de la protéine étudiée sur la membrane. L'ajout d'un substrat marqué de l'enzyme engendre une réaction colorée qui est visible sur la membrane.

20 L'analyse de l'expression du gène S100A9 permet alors de disposer d'un outil pour déterminer la susceptibilité d'un patient à contracter une infection nosocomiale. On peut par exemple analyser l'expression du gène cible chez un patient dont on ne connaît pas la susceptibilité, et en comparant avec des 25 valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients ayant une forte susceptibilité à contracter une infection nosocomiale et des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients ayant une faible susceptibilité à contracter une infection nosocomiale, déterminer la susceptibilité du 30 patient à contracter une infection nosocomiale, afin de lui proposer, par exemple, un isolement préventif si nécessaire.

Ainsi, l'invention concerne un procédé pour déterminer la susceptibilité d'un patient à contracter une infection nosocomiale selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins un réactif spécifique d'un produit d'expression du gène cible S100A9 c. on détermine l'expression du gène cible S100A9. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique est un échantillon sanguin.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique est un acide nucléique. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on extrait les ARN totaux de l'échantillon biologique. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de S100A9 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible S100A9 ou au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible S100A9.. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le réactif spécifique selon l'invention comprend au moins un anticorps spécifique du produit d'expression du gène cible S100A9. L'invention concerne préférentiellement la détermination de l'expression des gènes cibles par l'analyse de l'expression des ARNm.

L'invention concerne également un kit pour déterminer la susceptibilité d'un patient à contracter une infection nosocomiale comprenant au moins un réactif spécifique d'un produit d'expression du gène S100A9.

Préférentiellement, le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible S100A9 ou au moins une amorce spécifique du gène cible S100A9.

Préférentiellement, le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins un anticorps.

L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un réactif spécifique d'un produit d'expression du gène S100A9 pour déterminer la susceptibilité d'un patient à contracter une infection nosocomiale. Préférentiellement, le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible S100A9 ou au moins une amorce spécifique du gène cible S100A9.. Préférentiellement, le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins un anticorps.

Exemple - Etude de l'expression du gène S100A9 pour déterminer la susceptibilité à contracter une infection nosocomiale. Echantillons L'étude a été réalisée sur une cohorte de 93 patients ayant développé un choc septique, et admis dans un service de réanimation Chirurgicale ou Médicale du centre hospitalier Lyon-Sud. Ces patients ont été prélevés à J7, J8, J9 ou J10 après le choc septique (HO étant le début du traitement vasopresseur). Parmi ces patients ayant développé un choc septique 27 patients ont contracté secondairement au choc une infection nosocomiale et 66 n'ont pas contracté d'infection nosocomiale dans les 53 jours d'observation de cette cohorte. Extraction des ARN et synthèse des ADNc Pour chaque patient, l'échantillon biologique est un prélèvement sanguin, qui a été régulièrement obtenu pendant les 10 premiers jours suivant le début du syndrome septique (patients SEP). Un prélèvement a également été effectué selon un même protocole chez les sujets sains (S). Ces prélèvements ont été collecté directement dans des tubes PAXgeneTM Blood RNA (PreAnalytiX, Frankin Lakes, USA). Après l'étape de prélèvement sanguin et afin d'obtenir une lyse totale des cellules, les tubes ont été laissés à température ambiante pendant 4 heures puis conservés à -20°C jusqu'à l'extraction du matériel biologique. Plus précisément, dans ce protocole, les ARN totaux ont été extraits à l'aide des kits PAXgene Blood RNA (PreAnalytiX) en respectant les recommandations du fabriquant. Brièvement, les tubes ont été centrifugés (10 min. à 3000g) afin d'obtenir un culot d'acides nucléiques. Ce culot a été lavé et repris dans un tampon contenant de la protéinase K nécessaire à la digestion des protéines (10 min. à 55°C). Une nouvelle centrifugation (5 min. à 19000g) a été effectuée pour éliminer les débris cellulaires et de l' éthanol a été ajouté afin d'optimiser les conditions de fixation des acides nucléiques. Les ARN totaux ont été spécifiquement fixés sur les colonnes PAXgene RNA spin columnTM et, avant l'élution de ceux-ci, une digestion de l'ADN contaminant a été effectuée à l'aide du RNase free DNAse setTM (Qiagen Ltd, Crawley, UK). Pour chaque extraction, la qualité des ARN totaux a été vérifiée par électrophorèse capillaire en utilisant le kit RNA 6000 Nana ChipTM (Agilent technologies). L'instrument utilisé est le bioanalyser 2100TM. Une réaction de transcription inverse (RT) a été réalisée dans un volume final de 20 pl. L'ARN total (0,5 pg) a été mélangé avec 1 pl de polyT à 50 pM et 1 pl de d'oligo (dT) 50 pM et 1 pL d'annealing buffer puis incubé 5 min. à 65°C. Après refroidissement dans la glace, la solution a été mélangée avec 10 pl de 2x First Strand Reaction Mix et 2 pL de SuperScript III/RNase out enzyme Mix RT (15 U/pl), tous ces produits étant issus du SuperScript First Strand Synthesis Super MixTM RT-PCR system (Invitrogen). La transcription inverse a été effectuée pendant 50 min. à 50°C puis stoppée par une incubation de 5 min. à 85°C. Pour finir, chaque solution d'ADNc a été diluée au 1/10è1Te dans de l'eau DEPC. Préparation de gammes étalon de quantification A partir d'un pool d'ADNc provenant de sujets sains, l'amplification de la région 153-179 du gène cible S100A9 (GenBank n° NM8002965.3) a été réalisée par PCR (Polymerase Chain Reaction), conduite jusqu'à saturation, en utilisant le couple d'amorces suivant : Amorce sens : 5'-TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3' (SEQ ID NO : 1) Amorce anti-sens : 5'-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3' (SEQ ID NO : 2) Analyse de l'expression des ARNm par PCR en temps réel Les ARNm du gène cible S100A9 retranscrits en ADNc, comme décrit ci-dessus, ont été quantifiés par PCR quantitative en temps réel en utilisant le LightCyclerTM (Roche). Les réactions PCR ont été effectuées à l'aide du Fast-StartTM DNA Master SYBR Green I realtime PCR kit (Roche Molecular Biochemicals). Chaque PCR a été effectuée dans un volume final de 20 pl contenant 3,6 pl d'eau, 2,4 pl de MgC12, 2 pl de SYBR Green mix (Fast start DNA master SYBR green + Taq DNA polymerase) et 1pl de chaque amorce (10 pM) et 10 pl de solution d'ADNc. Les amorces utilisées sont celles décrites précédemment. Après une étape de dénaturation de 10 min. à 95°C, l'amplification est effectuée à l'aide de 40 cycles d'un protocole de "touch-down" PCR (10 s à 95°C, 10 s d'hybridation à 68-58°C, suivi d'une extension de 16 s à 72°C). A la fin de chaque cycle, la fluorescence émise par le SYBR Green a été mesurée. Pour confirmer la spécificité de l'amplification, les produits PCR ont systématiquement fait l'objet d'une analyse de courbe de fusion (LightCyclerTM - Roche). Pour cela, les produits PCR ont été traités par une température croissante de 58 à 98°C avec une augmentation de 0,1°C/s. Pour chaque produit PCR, un seul pic a été obtenu lors de l'analyse de la courbe, caractérisé par une température de fusion spécifique. La combinaison d'amorces nécessaires à la quantification du gène de ménage CPB a été fournie par Search-LC (Heidelberg, Allemagne; référence 488116).

La quantité d'ARNm cible relative à la quantité d'ARNm du gène de ménage cyclophilin B a été analysée par la technique de quantification relative avec le LightCycler Relative Quantification SoftwareTM (Roche Molecular Biochemicals). La "Second Derivative Maximum Method" du logiciel LightCyclerTM (Roche) a été utilisée pour déterminer automatiquement le Crossing Point (Cp) pour chaque échantillon. La valeur du Cp a été définie comme le nombre de cycles pour lequel la fluorescence était significativement différente du bruit de fond.

Cinq dilutions en séries au 1/10ème ont été réalisées en quadruplicate avec chaque standard afin de générer une courbe d'étalonnage exprimant le Cp en fonction du logarithme du nombre de copies. Les dilutions de standard ont été optimisées afin que la courbe d'étalonnage couvre le niveau d'expression attendu pour le gène cible et le gène de ménage. Les courbes standards relatives décrivant l'efficacité de PCR pour le gène cible et le gène de ménage ont été générées et utilisées pour réaliser une quantification avec le LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals).

Résultats des analyses univariée et multivariée Afin de déterminer les variables influant sur la survenue d'une infection nosocomiale, une analyse univariée puis une analyse multivariée sont réalisées. L'analyse univariée est réalisée en effectuant une régression logistique du statut atteint ou non atteint d'une infection nosocomiale en fonction de différentes variables et sur le marqueur S100A9 en ARNm sur les jours J7 à J10 après le début du choc septique. Ensuite une régression logistique multivariée est réalisée sur les variables présentant un niveau de significativité (p) <0,15 avec l'analyse univariée.

La méthode de sélection backward (au départ toutes les variables sont prises en compte dans le modèle, puis elles sont retirées une à une) est utilisée avec un seuil de significativité à 0,05. Les résultats sont présentés dans le tableau 2 qui suit. L'odd ratio (O.R.) et son intervalle de confiance à 95% sont indiqués pour chaque résultat.

21 Tableau 2 Analyse univariée (N=93) Analyse multivariée (N=93) OR 95% CI p OR 95% CI p Sexe Masculin 1 - - Féminin 1.6 0.641-3.997 0.3143 Age (ans) > 65 1 - - - - - <- 65 2.04 0.814-5.115 0.1285 - - 0.1186 SAPS II à > 51 1 - - l'admission <_ 51 1.107 0.450-2.723 0.8246 SOFA à < 10 1 - - - - - l'admission >_ 10 3.036 1.132-8.144 0.0274 - - 0.1384 Co-morbiditées 0 1 - - >_ 1 1.021 0.414-2.514 0.9645 Type Nosocomiale 1 - - d'infection Communautaire 1.144 0.467-2.803 0.7682 Site Pulmonaire 1 - - d'infection Abdominale 1.735 0.644-4.672 0.3268 Autres 1.172 0.299-4.597 0.8540 S100A9 (mRNA) < 6.1 1 - - 1 - - 6.1 6.27 1.718-22.891 0.0055 6.242 1.662-23.447 0.0067 OR : Odd Ratio CI : intervalle de confiance P : seuil de significativité Comme cela ressort du tableau 2, l'analyse multivariée révèle qu'une expression du marqueur S100A9 ? 6.1 sur les jours 7 à 10 après le début du choc septique augmentent significativement la probabilité de survenue d'une infection nosocomiale (odd ratio à 6.2).

Claims (14)

1. REVENDICATIONS1. Procédé pour déterminer la susceptibilité d'un patient à contracter une infection nosocomiale selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins un réactif spécifique d'un produit d'expression du gène cible S100A9 c. on détermine l'expression du gène cible S100A9.
2. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'échantillon biologique est un échantillon sanguin.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel le matériel biologique est un acide nucléique.
4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible S100A9.
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible S100A9.
6. 6. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins un anticorps.
7. 7. Kit pour déterminer la susceptibilité d'un patient àcontracter une infection nosocomiale comprenant au moins un réactif spécifique d'un produit d'expression du gène S100A9.
8. 8. Kit selon la revendication 7 selon lequel le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible S100A9.
9. 9. Kit selon la revendication 7 selon lequel le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible S100A9.
10. 10. Kit selon la revendication 7, dans lequel le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins un anticorps.
11. 11. Utilisation d'au moins un réactif spécifique d'un produit d'expression du gène S100A9 pour déterminer, in vitro, la susceptibilité d'un patient à contracter une infection nosocomiale.
12. 12. Utilisation selon la revendication 11, selon laquelle le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible S100A9.
13. 13. Utilisation selon la revendication 11, selon laquelle le réactif spécifique de S100A9 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du produit d'expression du gène cible S100A9
14. 14. Utilisation selon la revendication 11, selon laquelle le réactif spécifique de S100A9 comprend au moins un anticorps.