FR2937544A1 - Procede de traitement cosmetique, pharmaceutique et dermo-cosmetique destine a reduire a la fois la synthese eudogene des sirtuine et de reduire les contactions musculaires et compositions pour sa mise en oeuvre - Google Patents

Abstract

Procédé de traitement cosmétique, pharmaceutique et dermo-cosmétique caractérisé en ce qu'il consiste en une composition comportant au moins un extrait de calices et d'épicalices d'Hibiscus permettant de diminuer à la fois la synthèse endogène de sirtuine dans les cellules épidermiques et à réduire les contractions musculaires tout en stimulant l'expression de NICE-1 ainsi que lesdites compositions.

Description

L'invention a pour objet l'utilisation d'au moins un extrait de calices et d'épicalices de Hibiscus sabdariff i pour la préparation d'un produit cosmétique. pharmaceutique et dermocosmétique caractérisé en ce qu'il est capable à la fois d'inhiber l'expression des sirtuines à de très faible dose de l'ordre de quelques millième de % ainsi que la contraction musculaire à des doses de quelques °ro tout en stimulant l'expression de NICE-I. L'invention se rapporte également à tout produit cosmétique comportant un tel extrait de calices et d'épicalices de Hibiscus récoltés de préférence pendant ou après la période de fructification, et plus particulièrement la variété Hibiscus sabdariffà à fibres non colorées capable à la fois d'inhiber les sirtuines et les contractions musculaires tout en stimulant l'expression de NICE-1. L'abréviation NICE-1 est utilisée pour dénommer une protéine épidermique appelée Newsly Identified Component of the EDC avec EDC pour complexe épidermique de différenciation. Il s'agit d'une protéine incorporée en final aux enveloppes cornée du stratun cornéum, responsables de la résistance. de la cohésion et la fermeté épidermique.

Il est connu d'après des études sur des organismes simples comme la levure de boulangerie (S. cers"'isiae ). les nématodes (C. elegans) ou les Drosophiles (D. melanogaster) que leur longévité peut être augmentée par une restriction calorique et par la stimulation de certains gènes de la famille des Sirtuines (SIR2 pour silent information regulator 2) (voir par exemple Howitz et al. Srnall molecules activators of sirtuins extend Saccharomyces cervisiae lifespan. Nature 423,191-196. 2003) Ces gènes sembleraient avoir été conservés lors de l'évolution et ils sont présents chez les mammifères y compris l'Honuue où au moins 8 gènes auraient été identifiés. Le gène Sirt 1 est l'équivalent du gène Sir2 de la levure. Ils sont exprimés en autres dans la peau par les kératinocytes et les fibroblastes. I1 semble donc logique de penser que la stimulation de ces gènes et par exemple Sin I puisse améliorer la longévité de la peau et son vieillissement (Sirtuin activators mimic calorie restriction and delay ageing in metazoans JG.Wood et al.,Vature 2789. 1-4. 2004) et (Composition for manipulating the lifespan and stress response of cells and organisme. patent 20050136537). Cependant les sirtuines agissent en désacétylant diverses molécules qui sont alors inactivées et particulièrement la protéine suppresseur de tumeur p 53 ainsi que les facteurs de transcription FOXO (voir par exemple pour p53 : Langley E., Human SIR2 deacet) lates p53 and antagonizes PML/p53-induced cellular senescence. The Ki MO Journal 21, 2383-2396. 2002 et pour FOXO : Brunet A. et al., Stress-Dependent Regulation of FOXO Transcription Factors b} the SIRTI Deacetylase Science 303: 2011-2015.2004). P53 (ou TP 53 pour tumor protein 53) souvent dénommé gardien du génome joue un rôle central dans les réponses cellulaires aux stress génotoxiques. Elle déclenche. en fonction du contexte, l'arrêt du cycle cellulaire ou l'apoptose. On nomme apoptose (ou mort cellulaire programmée. ou suicide cellulaire). le processus par lequel des cellules déclenchent leur auto destruction en réponse à un signal. C'est une mort cellulaire physiologique_ génétiquement programmée_ nécessaire à la survie des organismes pluricellulaires. Elle est en équilibre constant avec la prolifération cellulaire.

Le gène p 53 est muté dans au moins 50% des cancers et lorsqu'il n'y a pas de mutation c'est que les cancers ont réussi de contourner l'effet tumeur suppresseur de cette protéine ce qui montre bien que cette molécule est de tous les combats.

FOXO (pour Forkhead box sub-group O) est une famille de facteurs de transcription comprenant chez l'Homme 4 membres (FOXO1. FOXO3. FOX04 et FOX06). Les fonctions cellulaires des FOXO qui sont l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose sont en faveur d'une fonction de suppresseur de tumeur comme pour p53. Ils participent aussi à la résistance cellulaire face au stress oxydatif. activité qui n'est pas perdue en cas de désacétylation par les sirtuines.

Lorsque p53 et FOXO sont inactivés. la formation de tumeurs est accélérée (voir par exemple pour FOXO. Hu MC et al. IkappaB kinase promotes tumorigenesis through inhibition of forkhead FOX03a. Ce/1 117, 225-37, 2004 et voir par exemple pour p53. Larsen CJ. The ARF-p53 pathway: a fine of defence against oncogenic signais. Pathol Biot:48:308-17. 2000). Il est donc trivial que toute activation ou stimulation des sirtuines se traduit par une diminution d'activité de p53 et de FOXO et qu'inversement toute inhibition des sirtuines se traduit par une augmentation d'activité de ces gènes suppresseurs de tumeurs. Tout se passe comme s'il y avait un équilibre entre d'un côté apoptose. arrêt des divisions cellulaires. suppression des tumeurs et de l'autre réparation cellulaire et longévité. Un peu comme si on devait choisir. au moins au niveau cellulaire. entre moins vieillir avec un risque de cancer plus élevé ou moins de risque de cancer mais une longévité plus courte. Ainsi le brevet 20050136537 Composition for manipulating the lifespan and stress response of cells and organisms décrit deux stratégies opposées pour : - soit stimuler par des agents activateurs de sirtuin (STACs pour Sirtuin activating compounds) afin de réduire l'activité de p53, l'apoptose et augmenter la longévité des cellules et des organismes. - soit par des agents inhibiteurs de sirtuine d'augmenter l'activité de p53. et l'apoptose au niveau cellulaire ou des organismes. Le fait que les sirtuines perturbent certaines transcriptions et sensibilisent à certains facteurs provoquant la mort cellulaire comme le facteur tumoral nécrosant alpha (TNF-alpha) font que les inhibiteurs de sirtuines agissent dans certaine situation également comme des facteur de protection cellulaire (voir à ce sujet Yeung. F. et al. Modulation of NF-kappaB-dependent transcription and ceil survival by the SIRT1 deacetylase. EMRO J. 23. 2369-2380, 2004) Les STACs activateurs de sirtuin sont des molécules de petite taille dont les plus connues dérivent du stilbène. Les stilbènes sont une classe de molécules ayant un certain nombre de propriétés biologiques et qui 35 sont assez répandus dans les végétaux. Le plus connu et le plus étudié est le resvératrol, qui est le 3.4.5'trihydroxy-stilbène. et que l'on trouve dans un grand nombre de végétaux. Le resvératrol est revendiqué pour de nombreuses activités biologiques: -Vaso-relaxant "Endothelium-dependant vasodilatator effects of Resveratrol. a natural phenolic component of red wines. in rat aorta" Orallo et Al. Cardiovascular pharmacologv PA-56 pp.127. 40 -Anti-oxydant Action anti-oxydante du resvératrol sur la lipoperoxydation J.P. Blond et Al. Sciences des Aliments_ (1995). 347-358. i -Anti-inflammatoire. Molecular and cellular effects of Resveratrol in inflammation J.Schwager et Al. _\IIS 2002. Rennes. France. mai 2002. 11 est également revendiqué dans des brevets de produits de soin de la peau comme le brevet FR 2766176 qui revendique certains esters de resvératrol ou d'oligomères pour leur activité anti-radicalaire. anti-oxydante. vasoprotectrice. Le brevet FR 2777186 (L'Oréal) revendique de 0.001 à 10% d'hydroxystilbènes et dérivés hydroxyalkylés pour stimuler la synthèse de collagène, stimuler la prolifération des fibroblastes. et inhiber l'expression des protéases et des métalloprotéinases de la matrice extracellulaire du derme. L'Oréal revendique les mêmes composés dans les mêmes proportions dans le brevet FR 2777184 pour la réduction de l'adhésion des micro-organismes sur la peau et les muqueuses. et dans le brevet FR 2277183. l'augmentation de la desquamation de la peau et enfin dans le brevet FR 2796278 l'inhibition de la glycation des protéines. Le brevet US 6.085,821 revendique le resvératrol et le picéatannol comme inhibiteur de myéloperoxydase.

Le brevet FR 15098000 décrit le resvératrol et ses oligomères comme inhibiteurs de l'enzyme 5alpha-réductase. Le brevet FR 2867977 décrit le resvératrol et ses dérivés comme inhibiteur des contractions musculaires. L'epsilon-Viniférine est revendiquée dans des brevets (déjà cités) aux côtés du resvératrol.

L'epsilon-Viniférine est également revendiquée dans le brevet FR 2844714 comme hormone-like et dans le brevet FR 2844 714 pour prévenir et/ou lutter contre des affections diverses de la peau et de ses annexes. affections comme la diminution de l'épaisseur. de la souplesse. de l'élasticité, de la fermeté de la peau, ou bien comme des infections microbiennes. comme l'excès de kératine. ou pour lutter contre la pollution ou la glycation.

L'epsilon-Viniférine qui est un dimère (oligomère) du resvératrol. est citée dans la littérature scientifique comme ayant un certain nombre d'activités biologiques : -Protection des hépatocytes contre les agressions de CC 14 (Oshima Y. et al. Experinrentia: vol 51: n l: pp 63-66; 1995) -Activité anti-bactérienne (Sultanbawa et al.. Phytochenristry: 26;3:1987; 799-802) -Activité anti-tumorale et hépatoprotectrice (Masayaoshi Ohyama et al.. Bioorganic &.%Jedicinal Chernistrv Letters: 9:1999:3057-3060) -Anti-fongique (Baia A.E.A et al, Journal of Physiopathologv:.2000, vol 148. n pp 29-32). L'inconvénient de l'utilisation de substances ayant des effets intéressants mais provocant en plus une stimulation des sirtuines avec des composés comme les resvératrol . l'epsilon- viniférine ou autres (STACs) est une déacétylation_ par les sirtuines. de la protéine suppresseur de tumeur p53 et des facteurs de transcription FOXO se traduisant par une augmentation néfaste du maintien de cellules problématiques pouvant générer des tumeurs alors que normalement elles auraient dû être éliminées (apoptose) ou stoppées dans leur multiplication (arrêt du cycle cellulaire).40 Cc risque est d'autant plus important lorsque les cellules ou les organismes sont soumis à un stress important dépassant ou saturant les limites de réparation de la cellule ou de l'organisme comme cela se passe lorsque la peau est soumise aux irradiations solaires Ce danger à d'ailleurs été confirmé dans deux publication récentes : Wenhui Zhao et al.. Negative regulation of the deacety lace SIRT 1 b.v DBC 1. _Nature 451, 587-590, 2008 et Ja-Eun Kim et al.. DBC1 is a negative regulator of SIRT!. ..Vature -451, 583-586,2008 dans lesquelles il est expliqué que BBC1 (Deleted in Breast Cancer 1) inhibe l'activité de SIRT1 et que sa carence augmente l'activité de SIRT I et donc la déacétylation de p53 et une incidence de cancer accrue.

Il est donc également trivial que toutes ces substances aux propriétés intéressantes mais qui activent les sirtuines pourraient être avantageusement associées à un ou plusieurs inhibiteurs de sirtuine afin de corriger cet inconvénient tout en bénéficiant des effets bénéfiques de ces substances. De manière tout à fait stu-prenante l'inventeur a constaté qu'une boisson. le bissap. consommée usuellement en Afrique et plus particulièrement au Sénégal. à la fois pour le plaisir mais aussi pour favoriser la digestion et diminuer la tension artérielle. connue ainsi que pour ses effets antiseptique et diurétique et réalisée à partir d' Hibiscus sabdariffa pouvait également avoir à des concentrations relativement faibles des effets d'inhibition de la synthèse endogène des sirtuines et particulièrement de la SIRT 1 humaine présente dans la peau et les cellules épidermiques ainsi que des effets inhibiteurs des contraction musculaires tout en stimulant l'expression de NICE-1 protéine incorporée dans les enveloppes cornées assurant la fermeté et la cohésion de la partie superficielle de l'épiderme. Il a de plus constaté que des traitements topiques réalisés à partir de calices et d'épicalices d'Hibiscus sabdariffa récoltés de préférence pendant ou après la période de fructification amélioraient l'état général de la peau. Il a également remarqué qu'un tel traitement topique permettait également de développer le buste et de redonner du volume aux zones cutanées ainsi traitées et d'en effacer partiellement les marques du vieillissement en comblant les creux du relief cutané. Il a remarqué de plus que l'état général de la peau était amélioré par un tel traitement après des agressions comme celles provoquées par une exposition solaire. La présente invention se rapporte à l'utilisation d'au moins un extrait de calices et d'épicalices d'Hibiscus et de préférence d'Hibiscus sabdariffa et particulièrement la variété à fibres non colorées pour la préparation d'un produit cosmétique. pharmaceutique, ou dermocosmétique caractérisé en ce qu'il est capable à la fois d'inhiber l'expression des sirtuines à de très faible dose de l'ordre de quelques millième de pourcent ainsi que les contractions musculaires à des doses de quelques pourcents tout en stimulant l'expression de NICE-I protéine incorporée dans les enveloppes cornées assurant la fermeté et la cohésion de la partie superficielle de l'épiderme. L'invention se rapporte également à tout produit cosmétique comportant un tel extrait de calices et d'épicalices d'Hibiscus sabdariffa, récoltés de préférence pendant ou après la période de fructification. capable à la fois d'inhiber la synthèse endogène des sirtuines et les contractions musculaires tout en stimulant l'expression de NICE-l.

L'invention permet également de protéger la peau de la face des effets disgracieux des contractions répétées des muscles du visage. appelés muscles peauciers, comme les rides et la fermeté.

La composition cosmétique, pharmaceutique ou dermo-cosmétique selon l'invention peut se présenter dans des contenants adéquats tels que flacons, bouteilles, pots, boites. gélules. capsules. ampoules. lingettes, crayons, porte-sticks. support non tissé imprégné d'une émulsion lyophilisée ou non. La composition cosmétique, pharmaceutique ou dermo-cosmétique contenant l'extrait d'Hibiscus de façon préférentielle peut être associée a un autre agent actif et de manière nullement limitative une ou plusieurs des molécules ou extraits stimulant les sirtuines du groupe constitué par des isoflavones, des flavones_ des flavanones . des cathéchines et tannins, des chalcones. des stilbènes. des oligostilbènes. des stibènoïdes et des anthocyanidines comme par exemple le resvératrol. l'epsilon viniférine. le picéatannol. la pinosylvine, l'isoliquirigénine. la butéine. la fisétine et la quercétine. Certains extraits de fenugrec, certaines protéines ou peptides de riz. et en général toutes substances entrant dans la famille des STACs (Sirtuin activating compounds) comme définie dans l'article (Howitz et al.. Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature 425. 191-196, 11 September 2003) ou en général tout autre composé dérivant des molécules précédentes (comme leurs acétates. glucosides ou oligomères) et ayant un effet de stimulation et/ou d'activation des sirtuines pourront également être préférés. Ceci afin de contrebalancer les effets secondaires d'une stimulation de sirtuine tout en pouvant bénéficier des autres propriétés de ces substances telles que décrites ci-dessus. L'effet de stimulation et d'activation des sirtuines pourra être mesuré de la manière connue de l'homme de l'art et comme par exemple par un dosage d'activité histone déacetylase (HDAC) comme décrit dans l'article déjà cité (Howitz et al.. Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature 425, 191-196. 11 September 20()3) et adapté aux fibroblastes et/ou aux kératinocytesou encore par mesure de l'expression des sirtuines en RT-PCR sur culture de kératinocytes . Les extraits végétaux contenant les flavonoïdes cités ci-dessus et activant les sirtuines seront également à préférer lors de la constitution des formules contenant au moins un extrait de calices d'Hibiscus destiné à contrebalancer les effets de stimulation des sirtuine afin de conserver uniquement les autres avantages de ces composés comme les effets anti-rides. fermeté. éclat du teint suivant la substance considérée. La composition cosmétique. pharmaceutique ou dermo-cosmétique contenant l'extrait d'Hibiscus de façon préférentielle peut être associée a un autre agent actif et de manière nullement limitative une ou plusieurs des molécules ou extraits inhibant les sirtuines du groupe constitué par nicotinamide. l'acide nicotinique. la niacine. le N-methyl nicotinamide. les différents nicotinates (ethyl. methyl. tocophéryl). les sphingolipides dont la sphingosine. la phytoshingosine et l'ascorbate de phytosphingosine. l'extrait de fruit de baobab. les dérivés de dihydrocoumarine, le sirtinol, la splitomicine. ou de manière générale tout autre composé ayant un effet d'inhibition des sirtuines et/ou dérivant des molécules précédentes.

La composition cosmétique. pharmaceutique et dermo-cosmétique selon l'invention peut être réalisée sous différentes formes. en particulier sous la forme d'une émulsion huile dans eau (H/E) ou eau dans huile (E/H). d'émulsion multiple (H/E/H. E/H/E). de microémulsion_ d'émulsion à phase gémellaires. d'émulsion PTT. de nano-émulsion. de pseudo-émulsion (dispersion stable de deux phases non miscibles au moyen de gélifiant), de gel aqueux, de gel gras, de gel hydroalcoolique. de phase grasse. de suspension. de savon liquide ou solide, de solution moussante ou non. de gel ou d'émulsion lyophilisée et/ou d'une des formes précédentes contenant des microcapsules. des nano-capsules. des liposomes. des éthosomes.

La composition cosmétique. pharmaceutique et dermo-cosmétique selon l'invention peut se présenter sous forme de crèmes. de liquides. de pàtes. de lotions, d'émulsions. de lotions. d'huiles, de gels. de solides. de poudres. de masques, de stick, de sprays. d'aérosol. La composition cosmétique et/ou pharmaceutique selon l'invention peut se présenter. afin d'améliorer l'état de la peau de manière plus globale. sous forme de formule utilisable par voie orale comme par exemple gélules. comprimés. sirops. A titre illustratif et non limitatif on décrira ci-après différents procédés d'obtention possible d'un extrait de calices et d'épicalices d'Hibiscus sabdariffa ou d'un extrait natif d'Hibiscus sabdariffa. pouvant être utilisés dans le cadre de la présente invention. Exemple 1 La plante Hibiscus sabdariffa est cultivée sans engrais ni pesticide dans des parcelles spécialement dédiées à cette culture depuis plusieurs années et ce jusqu'au stade de maturation des fruits pendant lequel la pallie correspondant au calice devient charnue et peut être récoltée puis séchée de préférence pendant ou après la période de fructification. Les fruits sont également récoltés et seront semés pour assurer la récolte suivante.

Il existe plusieurs variétés d-Hibiscus sabdariffa caractérisées par la couleur des fibres de la plante et du calice. La variété d'Hibiscus sabdariffa à fibres non colorées sera préférée afin d'éviter une coloration rendant les compositions plus difficile à formuler. Ces calices et épicalices secs sont ensuite soit broyés afin d'obtenir une fine poudre soit extrait directement par un solvant.

Le solvant. eau pure. différentes solutions aqueuses. alcool ou mélange de deux de ces solvants comme par exemple un mélange 60% alcool et 40% eau sans que cet exemple soit limitatif. peut ensuite être ajouté directement aux calices séchés ou à la poudre résultant de leur broyage. Après agitation le liquide est séparé. par centrifugation ou simple filtration. Ce liquide peut être utilisé tel quel ou bien lyophilisé ou atomisé ou encore déshydraté par tout moyen respectant sa composition comme la zéodratation utilisant la zéolite comme agent déshydratant. La poudre ainsi obtenu par chacun des procédés sera dénommée extrait natif de calices de Hibiscus et pourra être resolubilisée dans un solvant facilitant son incorporation dans une formulation à destination topique comme par exemple et sans que cela soit limitatif à de la glycérine. Dans ce cas l'extrait natif ainsi solubilisé s'appellera extrait de calices d'Hibiscus.40 Les calices d'Hibiscus sabdariffa utilisés proviendront préférentiellement du Sénégal mais on pourra utiliser indifféremment les calices d'autres espèces d'Hibiscus et de préférence ceux à fibres non colorées.

Exemple 2 Etude de la concentration efficace pour inhiber la synthèse endogène des sirtuines dans les cellules épidermiques (kéiatinocytes) Type cellulaire: Normal human epidermal kératinocytes (NHEK) au troisième passage Condition de Culture : 37°C. 5% CO2 Milieu de Culture : Kératinocy tes-SFM (Invitrogen 17005-034) supplémentés par Epidermal Growth Factor (EOF) 0.25 ng/ml - Pituitar} extract (PE) 25 ug/ml (Invitrogen 3700015) Gentamycine 25 ug/ml (Sigma G1397) Milieu d'étude: Kératinocytc-SFM (Invitrogen 17005-034) supplemented with Gentamycine 25 ug/ml (Sigma G1397) Extrait testé Aspect Solution Dilution Concentration testée Extrait Sec Natif Poudre 1% Milieu 0.0114% Calice d'Hibiscus d'étude Batch n°2070715h Culture et traitement: Les cellules sont ensemencées et cultivées dans le milieu de culture decnt ci-dessus jusqu'à confluence et sont ensuite placées dans le milieu d'étude. Les cellules sont ensuite traitées ou non (contrôle) avec l'extrait à tester et cultivées encore 24h. Chaque condition expérimentale est répétée trois fois (triplicate). A la fin du temps d'incubation. les cellules sont lavées avec une solution de PBS (Invitrogen 20 14190094). 300 ul de TriReagent sont ajoutés et les cellules sont immédiatement congelées à 80°C Quantitative RT-PCR : Réverse Transcription : Les ARN totaux sont extraits de chaque échantillon en utilisant le Trireagent suivant les recommandations du fournisseur. 25 Les traces de ADN potentiellement contaminantes sont éliminées par utilisation du système ADNfree (Ambion ref 1906) La réverse-transcription de l'ARNm est réalisée en présence d'oligo(dT) et de Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen). PCR analyse en temps réel : La PCR (Pol merase Chain Reactions) est réalisée en triplicate 30 utilisant le LightCyelerR s) stem (Roche Molecular Systems Inc.) en suivant les recommandations du constructeur et qui fonctionne en 2 étapes faisant intervenir un thermocycler et un fluorimètre (longueur d'onde détectée: 521 nm). Les primers suivants ont été utilisés pour amplifier les fragments correspondant aux marqueurs sélectionnés. 3 Nom du Gene Abréviation Gène Bank ADNc bp 23-kDa highly basic protein:RPLI3A RPLI3A NM 00242 3 483 Sirtuin 1 SIRTI NM 012238 202 Dans cette expérience le gène RPL13A (Ribosomal Protein L13A) a été utilisé comme marqueur de référence Résultat de la PCR quantitative : L'incorporation de la fluorescence dans l'ADN est mesurée en continu pendant les cycles PCR..

La courbe de l'intensité de la fluorescence en fonction du cycle de PCR permet de déterminer une expression relative (RE) pour chaque marqueur. La valeur retenue pour le calcul de la RE est le rendement maximum de la réaction. Ainsi pour un marqueur donné plus le nombre de cycle est grand plus faible est la quantité d'ARNm. T=at^ent .me RPL`.n E1 t f~'L' RRTIRE SIRTI Cycle=_ Cades REiÿU: R L^.:r. 4 Cortr 2 - e.rf `.E`EE= 2 Extrait S ec datif r,.':5 _et ' E?ZE"w 441E-`tZ .E ?3 ioe hibiscus Effets de l'Extrait Sec Natif de calices d'Hibiscus sur l'expression des SIRTI après 24h de traitement. Résultats comparés au marqueur RPLI3A (gène de référence). Conclusion : L'extrait sec natif de calices d'Hibiscus à une concentration de 0.004%(quelques millièmes de pourcent) réduit l'expression de la sirtuine 1 (SIRT-i) des cellules épidermiques 15 (kératinocytes) de 52 %. Exemple 3 Etude de la concentration efficace pour complètement bloquer la contraction musculaire Objectif : Evaluer l'effet d'un extrait végétal sur les contractions musculaires (effet botox-like) Méthodologie : L'évaluation de l'effet botox like est faite sur une co-culture nerf-muscle capable de 20 contractions spontanées. Le principe de cette méthode est basé sur la capacité de l'extrait de bloquer ou de diminuer la fréquence de ces cellules musculaires humaines. Un comptage des contractions est fait à des temps définis avant et après l'application de l'extrait. L'effet du produit est validé s'il y a une modification significative des contractions musculaires dans au moins 2 des 3 puits de culture (triplicate) 25 Résultats : Temps d'incubation Produit testé 2h 6h 24h EXTRAIT SEC NATIF de bloque bloque bloque Calice d'Hibiscus à 2.5% Conclusion : Dans les conditions expérimentales, l'extrait sec natif de calices d'Hibiscus. testé à 2.5% (quelque pourcents). bloque les contractions musculaires dans chacun des 3 puits testés. 2 heures. 6 heures et 24 heures après incubation.

Exemple 4 Selon un premier mode de réalisation de l'invention la composition est composé de : - Acrylate C10-30 O.;0 g - Resvératrol 0.001g - Ethoxydigl. col 5.00 g - Extrait vin rouge 0.20 g - Alcool 2.00 g - Quercétine 0.01 g - Butylène glycol 0,24 g - Carbomère 0.126 g - EDTA 0.005 g - Conservateur 0.867 g - Huile de macadamia 0.5 g - Lécithine hydrogénée 0.09 g - Cvclométhicone 0,20 g - l'EA 99% 0.62 g - Extrait natif de calices d'Hibiscus 0.00 4g - Colorants 0,0002 g - Eau déminéralisée qsp 100 g Après 4 semaines d'utilisation plus de 75% des utilisateurs perçoivent une atténuation d'au moins une marque de vieillissement comme les rides, l'éclat du teint, l'hydratation de la peau et de la fermeté. Selon un second mode de réalisation, la composition cosmétique, pharmaceutique ou dermo-cosmétique peut être composée de : Carboxypolyméthylène ou polymère carboxilique 0.10 g Diéthanolamine cétyl phosphate 1.50 g Octyl dodécanol 5,50 g Alcool cétylique 1.00 g Huile minérale 2 00 g Acide stéarique 1.00 g Alcool stét)lique éthoxylé (20 E) 0.30 g Alcool céto-stéarylique 1.80 g Conservateur 0.15 g Huile de macadanua 0.50 g Triéthanolamine 0.60 g Cyclométhicone 12.00 g Diméthicone copolyol 3.00 g Phényl triméticone 2.00 g - Extrait glycolique de calices d'Hibiscus 3.50 g Sépigel 305 1.00 g Butylène glycol 6.00 g Mica et oxyde de titane i 00 g Eau déminéralisée gsp 100 g Après 4 semaines d'utilisation plus de 65% des utilisatrices perçoivent une amélioration d'au moins un paramètre comprenant, le volume de la poitrine. la fermeté des seins. ou leur tenue. Quatre autres exemples de réalisation sont également exposés ci-après : 1.) Emulsion H/E : - Paraffine liquide 6 g - Lanoline liquide 3 g I 0 - Arlacel 165 (commercialisé par Atlas) 6 g - Tween 60 (commercialisé par Atlas) 2 g - Alcool céty lique 1.2 g - Acide stéarique 2.5 g - Rétinyl palmitate 0.5 g 15 - Huile de silicone volatile 10 g - Triéthanolamine 0.1 g - Conservateur 0.3 g - Antioxydants 0.3 g -Extrait natif de fiait de baobab 2.5 g 20 - Extrait glycolique de calices d'Hibiscus 2.5 g - Eau déminéralisée qsp 100 g Après une semaine d'utilisation au niveau des pommettes plus de 70% des utilisateurs perçoivent un effet de comblement. leurs pommettes sont comme repulpées. 2.) Crème aux liposomes : 25 - Alcool cét} lique 4 g - B-sitostérol 4 g - Dicétyl phosphate 0.5 g - Conservateur 0.3 g - Carbopol 981 (commercialisé par Goodrich) 0.2 g 30 - Triéthanolamine 0.2 g - Phospholipide 0.05 g - Resvératrol 0.001 g - Extrait glycériné de calices d'Hibiscus 1.5 g - Extrait de sarment de vigne 1g 35 - Eau déminéralisée qsp 100 g Après 4 semaines d'utilisation la peau est plus radieuse et en meilleur état pour plus de 75% des utilisateurs 3.) Emulsion E/H : - Protégin (commercialisépar Goldschmidt) 19 g 40 - Glycérine 3 g - Huile de vaseline 8 g !1 -Sulfate dcM& [.5 g 'Extrait natif dccalices d'Hüüscns 3g 'Bdi01palmitate 00g 5 'Conscnm4cur 02g 'Eaodéminéralisée qsp 100g Après 15 jours d'utilisation la peau est plus ferme et plus lisse pour plus de 75% des utilisateurs 4.) Bondnioogel 8/G - Cuzhopo!98l(commercialisé puGmodrich) K6g 'Alcool éthylique l5 g 'Huile dcsilicone volatile 3 g 'Huile dopmcdÜu 7g 'Conservateur /8â ' Parfum /\fg -Nicodnute dck/m/phon] Klg Triéthanolamine 'i2& 'Estrait glyceriné dccalices d'DKiscon 1g 'Eaudéminéralisée qsp l00& Après 3 semaines d'utilisation suivant une exposition solaire. plus de 70% des utilisateurs trouvent leur peau moins agressée. 5.) Poudre de maquillage. De manière non limitative un exemple de poudre non compactée et ayant la composition pondérale suivante est donnée: ' 20ù94% de mica '5 ù45% de poudre de polymères. - 1,5 à 5% d'huile. '0ù4% de savons métalliques. '0/)5 à 1% d'extrait natif de calices d'Hibiscus -0.2ùi% d'ADN hautement polymérisé -0ù]0% d'agents nacrant. ' 0ù5% d'autres ingrédients usuels. - et des quantités suffisantes de parfum et de pigments. la somme des pourcentages des ingrédients cités étant égale à 100. Cette poudre de maquillage peut ètre associée à chacune des formules pour former un renfort d'efficacité à utiliser lorsque la peau est la plus agressée. Exemple 5 Evaluation de l'expression du gène codant pour NICE-1 par micro-puces à ADN (cDNA-array) sur cellules épidermiques humaines (kératinocytes). Type cellulaire: Normal homuocpidcrn/u! kératinocytes (NHEK) au troisième passage Condition de Culture : 37°C.5% CO-.

Milieu de Culture : Kératinoc)tes-SFM (Invitrogen 170054)34) supplémentés par Epidermal Growth Factor (EOF) 0.25 ng/ml - Pituital) extract (PE) 25 ug/ml (Invitrogen 3700015) Gentamycine 25 ug/ml (Sigma G1397) Milieu d'étude: Kératinocyte-SFM (Invitrogen 17005-034) supplemented with Gentamycine 25 ug/ml (Sigma G1397) Extrait testé Aspect Solution Dilution Concentration testée Extrait Sec Natif Poudre 1 % Milieu 0.004% de Calices d'étude d'Hibiscus Culture et traitement: Les cellules sont ensemencées et cultivées dans le milieu de culture décrit ci-dessus jusqu'à confluence et sont ensuite placées dans le milieu d'étude. Les cellules sont ensuite traitées ou non (contrôle) avec l'extrait à tester et cultivées encore 24h. Chaque condition expérimentale est répétée trois fois (triplicate). A la fin du temps d'incubation, les cellules sont lavées avec une solution de PBS (Invitrogen 14190094). 300 ul de TriReagent sont ajoutés et les cellules sont immédiatement congelées à - 80°C Analyse par micro-puce à ADN : L' ARN messager est extrait de chaque culture de kératinocytes (NHEK) 15 et mis en contact avec des sondes ADNc spécifiques fixées de manière covalente sur des micro-puces et des ADNc marqués. L'analyse est réalisée par quantification directe de la radioactivité sur chaque spot après 72 h. Résultats : Dans ces conditions expérimentales et donc au niveau des cellules épidermiques. l'expression du gène codant pour NICE-1 est stimulée de + 1074 % par l'extrait natif de calices d'hibiscus à 0.004%.

20 NICE-1 est incorporées dans les enveloppes cornées (elles sont également appelées lace envelope proteins) pendant le développement et la différenciation épidermique. NICE permet ainsi de renforcer la solidité de la couche cornée et la fermeté épidermique. La peau résiste mieux aux tensions générées par les contractions des muscles du visage à l'origine des rides et à la perte de fermeté. 25

Claims (10)

1. REVENDICATIONS1.) Extrait de calices et d'épicalices d'Hibiscus. dans ou pour la préparation d'une composition cosmétique. pharmaceutique et demmo-cosmétique caractérisé en ce qu'il est capable à la fois d'inhiber l'expression des sirtuines dans les cellules épidermiques à de très faibles doses de l'ordre de quelques millièmes de pourcent et à la fois d'inhiber la contraction des fibres musculaires à des doses de quelques pourcents tout en stimulant l'expression de NICE-l.
2. 2.) Extrait selon la revendication 1. caractérisé en ce que les calices et épicalices de l'Hibiscus sont récoltés pendant ou après la période de fructification.
3. 3.) Extrait selon l'une des revendications 1 à 2 caractérisé en ce que l'extrait est un extrait d'Hibiscus sabdariffa et de préférence la variété à fibres non colorées.
4. 4.) Composition cosmétique. pharmaceutique et dermo-cosmétique selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle comprenne en outre un autre agent actif comme par exemple une ou plusieurs substances du groupe constitué par le nicotinamide, l'acide nicotinique, la niacine, le N-mettey l nicotinamide. les différents nicotinates (ethyl. meth) 1. tocophéryl), les sphingolipides dont la sphingosine. la phytoshingosine et l'ascorbate de phytosphingosine. l'extrait de fruit de baobab. les dérivés de dihy drocoumarine. le sirtinol, la splitomicine. ou de manière générale tout autre composé a) ant un effet d'inhibition des sirtuines et/ou dérivant des molécules précédentes .
5. 5.) Composition cosmétique, pharmaceutique et dermo-cosmétique selon les revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle comprenne en outre un autre agent actif comme par exemple une ou plusieurs substances du groupe constitué par constitué par des isoflavones. des flavones, des flavanones. des cathéchines et tannins. des chalcones. des stilbènes. des oligostilbènes, des stilbènoïdes et des anthocyanidines ayant un effet de stimulation et/ou d'activation des sirtuines .
6. 6.) Composition cosmétique. pharmaceutique et dermo-cosmétique selon les revendications 1 à 5 caractérisés en ce que la compositions est sous la forme d'une émulsion huile dans eau (H/E) ou eau dans huile (E/H), d'émulsion multiple (HIE/H. E/H/E). de microémutsion_ d'émulsion à phase gémellaires, d'émulsion PIT, de nanoémulsion, de pseudo-émulsion (dispersion stable de deux phases non miscibles au moyen de gélifiant), de gel aqueux. de gel gras. de gel hydroalcoolique, de phase grasse. de suspension, de savon liquide ou solide, de solution moussante ou non, de gel ou d'émulsion b ophilisée et/ou d'une des formes précédentes contenant des micro-capsules des nano-capsules. des liposomes. des éthosomes et pouvant se présenter sans que cela soit limitatif en crèmes. liquides. pâtes. lotions, émulsions, huiles. gels. sirops. solides. poudres. masques. stick. comprimés. sprays, aérosol. gélules. comprimés. sirop.
7. 7.) Utilisation d'une quantité efficace d'un extrait selon l'une des revendications 1 à 4. pour la préparation d'une composition cosmétique, pharmaceutique et denno-cosmétique. la composition étant destinée à augmenter le volume des zones traitées et à combler les creux du relief cutané.
8. 8.) Utilisation d'une quantité efficace d'un extrait selon l'uî des revendications 1 à 4. pour la préparation d'une composition cosmétique et pharmaceutique_ la composition étant destinée à protéger la peau de l'accumulation de cellules problématiques générées par tous types d'agressions dont l'exposition solaire.
9. 9.) Utilisation d'une quantité efficace d'un extrait selon l'une des revendications 1 à 4, pour la préparation d'une composition cosmétique et pharmaceutique. la composition étant destinée à protéger la peau de la face des effets disgracieux des contractions répétées des muscles du visage comme les rides et la fermeté.
10. 10.) Procédé de traitement cosmétique de la peau destiné à diminuer à la fois la synthèse endogène de sirtuine dans les cellules épidermiques et à réduire les contractions musculaires. caractérisé par le lait que l'on applique sur la peau une composition contenant comme principe actif. au moins un extrait tel que défini selon l'une des revendications 1 à 3.