FR2922551A1

FR2922551A1 - Prodrogues phosphoesters de la gemcitabine comme agents anticancereux

Info

Publication number: FR2922551A1
Application number: FR0758386A
Authority: FR
Inventors: Suzanne Peyrottes; Christian Perigaud; Charles Dumontet
Original assignee: Hospices Civils de Lyon HCL; Universite de Montpellier; Universite Claude Bernard Lyon 1
Current assignee: Hospices Civils de Lyon HCL; Universite de Montpellier; Universite Claude Bernard Lyon 1
Priority date: 2007-10-17
Filing date: 2007-10-17
Publication date: 2009-04-24
Anticipated expiration: 2027-10-17
Also published as: FR2922551B1; WO2009053654A3; WO2009053654A2

Abstract

La présente invention concerne des prodrogues phosphoesters de la gemcitabine, à activité anti-tumorale, de formule (I): dans laquelle n, Y, Z et R1 sont tels que définis à la revendications 1, ainsi que les compositions pharmaceutiques comprenant un tel composé, en combinaison avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable et l'utilisation d'un tel composé pour la préparation d'un médicament anti-tumoral ou anti-cancéreux.

Description

La présente invention concerne de nouvelles prodrogues de la gemcitabine utiles en tant qu'agents anti-cancéreux. La gemcitabine, nucléoside anti-cancéreux, de formule : NH2 I~ N HOùi NO OH F est administrée sous une forme non phosphorylée, mais est phosphorylée in vivo sous la forme de métabolites monophosphate, diphosphate ou triphosphate actifs. La gemcitabine a récemment enrichi la pharmacopée anticancéreuse et est actuellement largement utilisée dans le traitement de cancers du poumon, du 10 pancréas ou de la vessie. Le mode d'action de cet agent thérapeutique requiert, après sa pénétration membranaire, une métabolisation intracellulaire en ses formes phosphorylées (nucléotides), qui interfèrent alors avec divers systèmes enzymatiques impliqués dans la biosynthèse des acides nucléiques. La gemcitabine peut être administrée 15 par voie intraveineuse, associée à d'autres agents anticancéreux ayant des mécanismes d'action différents. Les cures de chimiothérapie sont administrées à des intervalles variables selon les indications : une à trois cures de forte intensité en cas de leucémie aiguë, 6 à 12 cures administrées toutes les quatre semaines dans la majorité des autres indications. Les patients recevant de la 20 gemcitabine pour le traitement d'une tumeur solide bénéficieront dans un certain nombre de cas de ces traitements, mais il ne s'agit jamais d'un traitement curatif et tous les patients décèderont de leur maladie. Par ailleurs, l'utilisation clinique de la gemcitabine se heurte à l'apparition de phénomènes de résistance. Les mécanismes impliqués dans la résistance à la 25 gemcitabine ne peuvent être ramenés à l'expression d'un seul système enzymatique. Ces mécanismes, bien que mal connus encore aujourd'hui, sont d'origine multifactorielle. La dernière décennie a vu le clonage de plusieurs gènes clés impliqués dans l'action cytotoxique de ce composé : les transporteurs s équilibratifs (hENT) et concentratifs (hCNT) de nucléosides, les enzymes inactivatrices telles que les 5'-nucléotidases et d'autres protéines. Pendant la même période des études réalisées sur des lignées rendues résistantes in vitro aux analogues de nucléosides cytotoxiques et sur des échantillons de patients atteints d'hémopathies malignes ou de tumeurs solides ont permis d'identifier les paramètres ayant une importance clinique. Les étapes précoces conduisant à l'accumulation intracellulaire de dérivés triphosphates actifs peuvent ainsi être modifiées chez les patients atteints de néoplasies et être à l'origine de phénomènes de chimiorésistance aux analogues de nucléosides. Un déficit en hENT1, principal transporteur de la gemcitabine, est ainsi associé à une absence d'activité anticancéreuse de ces médicaments chez les patients atteints de cancer du pancréas. Un défaut de désoxycytidine kinase (dCK, enzyme impliquée dans la monophosphorylation d'analogues de la gemcitabine) a été observé par de nombreux investigateurs dans des modèles de résistance, tant dans des lignées rendues résistantes in vitro que chez des patients atteints de leucémie aiguë myéloïde (LAM) ou de leucémie lymphatique chronique (LLC) et ne répondant pas favorablement aux traitements. Un catabolisme extra- ou intracellulaire (désamination), un défaut de pénétration membranaire, ou encore un anabolisme (phosphorylation) inefficace constituent autant de limitations à l'activité de la gemcitabine. En l'absence d'une concentration intracellulaire adéquate en ses formes phosphorylées, il n'est en effet pas possible d'obtenir une activité antimitotique satisfaisante. Les inventeurs ont démontré, dans le cadre de publications antérieures "Sensitization of ara-C-resistant lymphoma tells by a pronucleotide analogue".

C.M. Galmarini, M.L. Clarke, C.L. Santos, L. Jordheim, C. Périgaud, G. Gosselin, E. Cros, J.R. Mackey et C. Dumontet. International Journal of Cancer, 2003, 107 (1), 149-154 ; "Characterization of a gemcitabine-resistant marine leukemic tell line: reversion of in vitro resistance by a mononucleotide prodrug". L.P. Jordheim, E. Cros, M.-H. Gouy, C.M. Galmarini, S. Peyrottes, J.R. Mackey, C. Périgaud et C.

Dumontet. Clin/cal Cancer Research, 2004, 10 (16), 5614-5621), que l'utilisation in vitro de prodrogues nucléotidiques (pronucléotides) incorporant deux groupements enzymolabiles protecteurs de la fonction phosphate de même nature et de type .5acyl-2-thioéthyle (SATE), tel que le composé de formule (A) suivant : SATE O O RxS~~OùPùONu Nu: nucleoside analogue OSATE mononucleoside bis(SATE)phosphotriester (A) conduisait à la libération intracellulaire sélective du premier métabolite phosphorylé (mononucléotide) d'un analogue de nucléoside.

A titre d'exemple de ce type de composés, on peut citer le pronucléotide de 5 l'araC incorporant comme protections enzymolabiles de la fonction phosphate le groupement 5pivaloyl-2-thioéthyle (LBuSATE) de structure (B). (LN o N~O oH (B) L'évaluation comparative de ce pronucleotide (B) dans deux lignées cellulaires résistantes à l'araC et à la gemcitabine, a démontré sa capacité à 10 contourner, au moins en partie, les processus de résistance cellulaire. Ce résultat est associé à la libération sélective du 5'-mononucléotide (araCMP) au sein des cellules tumorales conduisant à une restauration des taux intracellulaires en formes phosphorylées. Néanmoins, des études pharmacologiques réalisées chez l'animal avec un 15 certain nombre de pronucléotides bis(SATE), ont montré la relative instabilité enzymatique de ce type de structures lors de leur administration par voie orale. Cette dégradation pré-systémique peut être associée à la présence d'une activité estérasique importante dans l'ensemble de l'appareil digestif et le foie. Ces études ont également mis en évidence la formation transitoire d'un 2- 20 mercaptoéthylphosphodiester, comme illustré sur le SCHEMA 1 ci-après, qui montre le processus de décomposition de pronucléotides bis(SATE) et les métabolites observés lors d'études pharmacologiques dans différents modèles animaux. NH2 25 SCHEMA 1 lereétape (rapide) : perte du premier groupement enzymolabile SATE 9 0Nu R S OSATE 1 décomposition chimique activité estérasique spontanée 9 TùONu 0- bis(SATE) phosphotri ester SATE phosphodiester 2'4 étape (limitante) perte du second groupement enzymolabile _9 décomposition chimique i activité estérasiaue 0~Ç'ùONu ùK O HS / 0- 5'-mononucléotide 2-mercaptoethyl phosphodi ester conjugués protéiques (clairance) Ce 2-mercaptoéthylphosphodiester est issu de la décomposition du second groupement SATE, et peut conduire à des conjugués protéiques via la création vraisemblable de ponts disulfures. L'identification de ce phosphodiester comme l'un des métabolites principaux lors de l'administration de pronucléotides bis(SATE) traduit une diminution de la vitesse de la SN; conduisant au 5'-mononucléotide, associée à la présence de la charge négative de la fonction phosphate.

L'invention se propose de fournir de nouvelles prodrogues de la gemcitabine qui permettent d'éviter un certain nombre des limitations associées à l'émergence de résistances lors de l'utilisation de cet analogue nucléosidique cytotoxique, en étant - résistants aux dégradations chimiques et enzymatiques 15 (catabolisme) ; - susceptibles de traverser les membranes cellulaires par un processus non dépendant de transporteurs (simple diffusion) ; - capables de libérer intracellulairement le premier métabolite phosphorylé (mononucléotide) de manière indépendante à l'expression de 20 kinases cellulaires (métabolisme) . Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont développé de nouvelles prodrogues de la gemcitabine à activité anti-tumorale, dites mixtes , qui se caractérisent par la présence de deux groupements enzymolabiles protecteurs de la fonction phosphate de nature différente. En particulier, l'invention a pour objet les composés phosphoesters mixtes, à activité anti-tumorale, de formule (I): Rl YùCùSù(CH2)nùOùPùO- z 0 OH F (I) dans laquelle : - n est égal à 1, 2, 3 ou 4, - Z représente 0 ou S - Y représente un groupe choisi parmi les groupes alkyle ou aryle, lesdits 10 groupes alkyle ou aryle pouvant éventuellement être substitués, par exemple par un ou plusieurs substituants choisis parmi ùOH, -SH ou ùNH2, -RI représente un groupe -NRaRb dans lequel Ra et Rb, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un groupe alkyle ou aryle, lesdits groupes alkyle ou aryle pouvant éventuellement être substitués, ou bien 15 Ra et Rb sont liés entre eux pour former, avec l'atome d'azote auquel ils sont liés, une amine cyclique choisie, par exemple, parmi les groupes pyrrolidinyle, pipéridinyle, morpholynyle, pipérazinyle, pyridyle éventuellement substitués. A titre d'exemple selon l'invention, les composés de formule (I), peuvent présenter une ou plusieurs des caractéristiques ci-dessous, lorsqu'elles ne 20 s'excluent pas l'une l'autre : - Y représente un groupe méthyle ou tert-butyle, - n est égal à 2, - RI représente un groupe -NRaRb avec Ra et Rb tels que définis pour la formule (I). Notamment, Ra représente un atome d'hydrogène et Rb 25 représente un groupe benzyle ou benzyle substitué, isopropyle ou n-butyle, La présente invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques comprenant un composé de formule (I) tel que défini précédemment, en combinaison avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne l'utilisation d'un composé de formule (I) tel que défini précédemment pour la préparation d'un médicament anti-tumoral ou anti-cancéreux, notamment destiné au traitement ou à la prévention de lésions tumorales bénignes, ou de cancers, incluant les hémopathies malignes et les tumeurs solides, y compris les tumeurs d'origine glandulaire, mésenchymateuse, génitale, cutanée et neurologique. Dans le cadre de l'invention, certaines définitions des termes employés sont 10 données ci-après : Par alkyle, on entend un radical monovalent hydrocarboné, linéaire ou ramifié, saturé, comportant, à moins qu'il n'en soit spécifié autrement, de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, tert- 15 butyle, sec-butyle, n-pentyle, n-hexyle. Par groupe aryle, on entend un carbocycle mono-, bi- ou polycyclique comprenant au moins un groupe aromatique. Les groupes aryles comprenant de 6 à 12 atomes de carbones sont préférés. En tant qu'aryle, on peut citer les groupes phényle, 1-naphtyle, 2-naphtyle, indanyle, indényle, biphényle, bicyclo[4.2.0]octa- 20 1,3,5-triène, les groupes phényle étant préférés. Lorsqu'il est indiqué qu'un groupe est éventuellement substitué, sans plus de précision, cela signifie qu'il est porteur de un ou plusieurs substituants identiques ou différents, notamment choisis parmi les halogènes, nitrooxocarboxy, cyano, alkyle, trifluoroalkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalkyle, 25 amino, alkylamino, dialkylamino, hydroxy, O-alkyl, 0-aryl. Par atome d'halogène, on entend un atome de chlore, brome, iode ou fluor. Le terme alcényle correspond à un groupe alkyle tel que ci-dessus défini comprenant au moins une double liaison. Les exemples de groupe alcényle sont par exemple des groupes vinyle, allyle, isopropényle, 1-,2- ou 3-butényle, pentényle, hexényle. Le terme alcynyle 30 correspond à un groupe alkyle tel que ci-dessus défini comprenant au moins une triple liaison. Le terme cycloalkyle, désigne une chaîne hydrocarbonée saturée cyclique comprenant de 3 à 10 atomes de carbone, par exemple cyclopropyle, cyclobutyle, cyclopentyle, cyclohexyle, des groupes cycloalkyle pontés tels que les groupes adamantyle, bicyclo[3.2.1]octanyle. Le terme hétérocycloalkyle désigne un cycloalkyle tel que ci-dessus défini, incorporant un ou plusieurs hétéroatomes, sélectionnés parmi les atomes d'azote, oxygène et soufre. A titre d'exemple de groupe hétérocycloalkyle, on peut citer les groupes pipéridine, pyrrolidine, azétidine, morpholine, tétrahydropyranne, tétrahydrothiophène. Aussi, les groupes benzyle et benzyle substitué sont des exemples de groupe alkyle substitué. A titre d'exemple de composé selon l'invention, on peut citer les prodrogues de la gemcitabine incorporant un groupement 5pivaloyl-2-thioéthyle (BuSATE) et un résidu aminé dérivé de la n-butylamine de formule (I.1), de l'isopropylamine de formule (I.2), de la benzylamine de formule (I.3) : O O I I - - Sl~/OO- NH O sOHNH2 L(Â~ F (1.3) Dans le cas des composés selon l'invention tels que définis pour la formule (I), une décomposition en 5'-mononucléotide correspondant est observée, sous l'action successive d'estérases, puis probablement d'une activité phosphoramidase permettant d'éviter la formation de métabolites susceptibles de s'associer de manière covalente aux protéines sériques.

De plus, la grande variabilité structurale qui peut être apportée par la nature des groupements û(CH2)n-S-C(=Z)Y comme des substituants R1 permet de moduler la stabilité enzymatique de la prodrogue en relation avec sa lipophilie et ainsi optimiser ses propriétés pharmacocinétiques. En particulier, le choix des groupements R1, et par exemple du groupe -NRaRb sélectionné, permet de moduler les propriétés physicochimiques du composé de formule (1), notamment sa solubilité dans l'eau et sa lipophilie, et sa stabilité en fonction des affinités des phosphoramidases. Les composés de formule (I) selon l'invention pourront être utilisés en tant qu'agents anti-cancéreux. En effet, les composés selon l'invention sont insensibles aux problèmes de diffusion ou d'activation intracellulaire, ce qui permet d'élargir leur spectre d'indications par rapport aux nucléosides cytotoxiques classiques et augmenter significativement leur efficacité. De façon générale, les composés selon l'invention pourront être utilisés pour préparer un médicament destiné au traitement, à titre curatif ou préventif, de tout type de cancer ou état précancéreux. En particulier, les composés de formule (I), pourront être utilisés pour la fabrication de médicaments anti-tumoraux ou anticancéreux, notamment destinés au traitement ou à la prévention de lésions tumorales bénignes, ou de cancers, incluant les hémopathies malignes et les tumeurs solides, y compris les tumeurs d'origine glandulaire, mésenchymateuse, génitale, cutanée et neurologique. On pourra citer comme cancers pouvant être traités par les composés de la présente invention, les carcinomes, les hémopathies malignes des lignées myéloïdes et lymphoïdes, les tumeurs d'origine mésenchymateuse, les sarcomes, les tumeurs du système nerveux central et périphérique, les mélanomes, les séminomes, tératocarcinomes, ostéosarcomes, le xéroderma pigmentosum, le chératoacantum, les néoplasies endocrines, et le sarcome de Kaposi. La présente invention a donc également pour objet les composés de formule (I), en tant que médicaments, ainsi que les compositions pharmaceutiques contenant une dose efficace d'un composé de formule (I), et des excipients convenables.

Lesdits excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité. Les excipients pharmaceutiques acceptables étant, par exemple, définis par la Pharmacopée européenne. Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale ou intraoculaire, les principes actifs de formule (I) ci-dessus, peuvent être administrés sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, aux animaux et aux êtres humains pour la prophylaxie ou le traitement des troubles ou des maladies ci-dessus. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intranasale, les formes d'administration sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse et les formes d'administration rectale. Pour l'application topique, on peut utiliser les composés selon l'invention dans des crèmes, pommades, lotions ou collyres. Afin d'obtenir l'effet prophylactique ou thérapeutique désiré, chaque dose unitaire peut contenir de 0,1 à 10000 mg, de composé selon l'invention en combinaison avec un support pharmaceutique. Cette dose unitaire peut être administrée 1 à 5 fois par jour de façon à administrer un dosage journalier permettant d'obtenir l'effet souhaité. Lorsqu'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange l'ingrédient actif principal avec un véhicule pharmaceutique, tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose, d'un dérivé cellulosique, ou d'autres matières appropriées ou encore on peut les traiter de telle sorte qu'ils aient une activité prolongée ou retardée et qu'ils libèrent d'une façon continue une quantité prédéterminée de principe actif. On obtient une préparation en gélules en mélangeant l'ingrédient actif avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures. Les compositions pharmaceutiques contenant un composé de l'invention peuvent aussi se présenter sous forme liquide, par exemple, des solutions, des émulsions, des suspensions ou des sirops. Les supports liquides appropriés peuvent être, par exemple, l'eau, les solvants organiques tels que le glycérol ou les glycols, de même que leurs mélanges, dans des proportions variées, dans l'eau. Une préparation sous forme de sirop ou d'élixir ou pour l'administration sous forme de gouttes peut contenir l'ingrédient actif conjointement avec un édulcorant, acalorique de préférence, du méthylparaben et du propylparaben comme antiseptique, ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié. Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir l'ingrédient actif en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, comme la polyvinylpyrrolidone, de même qu'avec des édulcorants ou des correcteurs de goût. Pour une administration rectale, on recourt à des suppositoires qui sont préparés avec des liants fondant à la température rectale, par exemple du beurre de cacao ou des polyéthylèneglycols. Pour une administration parentérale, on utilise des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion et/ou des mouillants pharmacologiquement compatibles, par exemple le propylèneglycol ou le butylèneglycol. Le principe actif peut être formulé également sous forme de microcapsules, éventuellement ave un ou plusieurs supports ou additifs, ou bien avec des matrices telles qu'un polymère ou une cyclodextrine (patch, formes à libération prolongée). Les compositions de la présente invention peuvent contenir, à côté des produits de formule (I) par exemple des principes actifs qui peuvent être utiles dans le traitement des troubles ou maladies indiquées ci-dessus. Ainsi, la présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques contenant plusieurs principes actifs en association dont l'un est un composé selon l'invention. L'invention a donc pour objet leur utilisation comme médicaments pouvant être utilisés seuls ou en combinaison avec des traitements tels que la chimiothérapie ou la radiothérapie mettant éventuellement en oeuvre d'autres substances actives. Par ailleurs, d'une façon générale, les mêmes préférences que celles indiquées précédemment pour les composés de formule générale (I) sont applicables mutatis mutandis aux médicaments, compositions pharmaceutiques et utilisation mettant en oeuvre les composés selon l'invention. Les exemples ci-après n'ont aucun caractère limitatif et permettent d'illustrer l'invention. Les composés selon l'invention sont préparés selon des techniques bien connues de l'homme de l'art. Une de ses méthodes est illustrée sur le SCHEMA 2 ci-après dans lequel n, Y et Z sont tels que définis pour les composés de formule (I), R' représente un groupe protecteur de la fonction hydroxy et R" un groupe protecteur de la fonction amine : SCHEMA 2 Z 'Z O Y II S-(CH2)n-OH Y I) 'S-(CH2)n-O-P O 1 H (III)

NHR" N Y 11 S- (CH2)n-O-O-O- \N~O 1 H NHR" (Ia) Les fonctions hydroxyles portées par le résidu osidique (sucre) et l'amine exocyclique portée par les hétérocycles de ces nucléosides sont transitoirement protégées dans les intermédiaires (II) et (Ia). La condensation du composé (III) avec ces nucléosides convenablement protégés conduit aux dérivés (II). 15 L'oxydation amidative de ces précurseurs avec des dérivés du type HNRaRb, génère donc des prodrogues totalement protégées, notées (Ia). Une dernière OR' F (I) N Y II S--(CH2)n-O-P-O-- \N~`O R1 OR' F étape d'hydrolyse des groupements protecteurs est alors nécessaire pour conduire aux prodrogues recherchées (I). Les composés de départ (IV) sont préparés selon des techniques bien connue de l'homme de l'art.

Ce procédé est illustré dans les exemples qui suivent. EXEMPLE 1 Préparation de la prodrogue de la gemcitabine de formule (I.1) : Intermédiaire (IV.1) : Le 5pivaloyl-2-thioéthanol est obtenu selon un protocole décrit dans une publication antérieure, I. Lefevbre, C. Périgaud et al., Journal ofMedicina/ Chemistry, 1995, 38, (20), 3941. 15 Intermédiaire (1II.1) : 5Pivaloyl-2-thioéthyl hydrogénophosphonate monoester, sel de sodium Le .çpivaloyl-2-thioéthanol (IV.1, 2,7 g, 16,76 mmol) est dissous dans un mélange de pyridine (16 mL) et de dioxane (50 mL) anhydres. A la solution résultante, est 20 additionnée au goutte à goutte une solution de 2-chloro-5,6-benzo-1,2,3-dioxaphosphorin-4-one (4, 0 g, 20,00 mmol) dans du dioxane anhydre (16 mL). Après 45 minutes d'agitation à température ambiante, une solution de bicarbonate de triéthylammonium (TEAB, 8 mL, 1 M, pH 7) est ajoutée au mélange réactionnel. Après 30 minutes d'agitation, le milieu réactionnel est concentré sous 25 pression réduite et deux co-évaporations au toluène sont effectuées. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (dichlorométhane / triéthylamine, 99/1, v/v) en utilisant comme éluant un gradient de méthanol de 0 à 10% dans du dichlorométhane contenant 1% de triéthylamine. Après passage sur une colonne de résine Dowex (50 WX2, forme O IOI -O NH NH2 (LN NÂO10 Na+) et lyophilisation, le sel de sodium du composé (I11.1) est obtenu sous la forme d'une poudre blanche (2,7 g, 64%). RMN 1H (DMSO-d6i 400 MHz) 8 6,53 (d, 1H, Jp_H = 573, PH), 3,62 (m, 2H, CH20), 2,96 (t, 2H, J = 6,6, SCH2), 1,16 (s, 9H, C(CH3)3) RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz) S 205,6 (1s, C=O), 60,9 (1d, CH20), 45,9 (1s, C(CH3)3), 29,3 (Id, SCH2), 27,0 (1s, C(CH3)3) RMN 31P (DMSO-d6, 81 MHz) S 2,3 SM FAB>0 (GT) m/z497 (2M+H)+, 271 (M+Na)+, 249 (M+H)+ FAB<0 (GT) m/z473 (2M-Na) 225 (M-Na)" Microanalyse Calculée pour C7H14O4PSNa : C : 33,87 ; H : 5,68 ; S : 12,92 Trouvée : C : 33,79 ; H : 5,69 ; S : 12,90 Lors de la synthèse du O-(5pivaloyl-2-thioéthyl) hydrogénophosphonate monoester, c'est le sel de triéthylammonium qui est obtenu après la colonne chromatographique sur gel de silice et qui peut-être directement utilisé dans les réactions de couplage. Ce sel de triéthylammonium est converti en sa forme sodée par passage sur résine échangeuse d'ions de type Dowex afin d'obtenir les caractérisations physico-chimiques.

Intermédiaire (II.1) : O-(..pivaloyl-2-thioéthyl)-0-5'-(/V 4-O-3'-bis(tert-butoxy carbonyl) gemcitabine hydrogénophosphonate diester La N 4-O-3'-bis(tert-butoxycarbonyl)gemcitabine (obtenue selon Z. W. Guo, J. M. Gallo, J. Org. Chem., 1999, 64, 8319) (0,5 g, 1,08 mmol) et le 0-(S-pivaloyl-2- thioéthyl) hydrogénophosphonate monoester, sel de triéthylammonium (I1I.1) (0,7 g, 2,16 mmol) sont co-évaporés avec de la pyridine, puis dissous dans de la pyridine anhydre (14 ml), puis du chlorure de pivaloyl (0,33 ml, 2,69 mmol) est alors additionné goutte à goutte. Après 12h, la réaction est arrêtée par ajout d'acétate d'ammonium (1 ml, 0,5 M), le mélange réactionnel est dilué dans du dichlorométhane (10 ml) puis lavé avec de l'acétate d'ammonium (10 ml, 0,01 M). La phase organique est séchée sur Na2SO4i filtrée puis évaporée sous pression réduite pour donner une huile jaune qui est ensuite coévaporée 3 fois avec du toluène. Une purification par chromatographie sur colonne, utilisant comme éluant un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle, 8/2,V/V+0,2% d'acide acétique, permet d'obtenir le O-(.rpivaloyl-2-thioéthyl)-0-5'-(IIF4-O-3'-bis(tert- butoxycarbonyl) gemcitabine hydrogénophosphonate diester (11.1) (0,2 g, 36%) sous la forme d'une huile incolore. RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) S 7.77 (m, 1H, H-6), 7.23 (m, 1H, H-5), 6.40 (m, 1H, H-1'), 6.89 (d, 1H, 1 JpH = 720, PH), 5.08 (m, 1H, H-3'), 4.39 (m, 2H, H-5' et H-5"), 4.27 (m, 1H, H-4'), 4.11 (pq, 2H, 1= 6.6, CH2O), 3.08 (t, 2H, J = 6.6, CH2S), 1.44 (s, 18H, CH3 Boc), 1.17 (s, 9H, CH3 SATE) RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) b 204.5 (CO SATE), 162.3 (C-4), 153.4 (CO Boc), 150.4 (C-2), 150.0 (CO Boc), 143.4 (C-6), 122.7, 119.2, 115.7 (C-2'), 94.8 (C-5), 84.3 (C CH3)3), 83.4 (C-1'), 81.9 ( CH3)3), 77. 1 (C-4'}, 71.2 (C-3'), 63.6 (CH2O), 62.2 (C-51, 45.5 (C(CH3)3), 28.3 (CH2S), Intermédiaire (I.1a) : 11r<(n-butylamino)-O-(.çpivaloyl-2-thioéthyl)-0-5'-(N-4-O-3'-bis- (tert-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidate diester La O-(S-pivaloyl-2-thioéthyl)-0-5'-(/W4-O-3'-bis(tert-butoxycarbonyl) gemcitabine hydrogénophosphonate diester (II.1) (0,6 g, 0,894 mmol) est co-évaporée 2 fois avec de la pyridine anhydre, puis dissoute dans du tétrachlorure de carbone (22 ml). A cette solution, de la n-butylamine (0,27 mL, 2,68 mmol) est additionnée goutte à goutte. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante. Après 1h15, le mélange réactionnel est dilué avec du dichlorométhane (86 ml) et lavé avec une solution d'acide chlorhydrique (86 ml, 0.1 N, pH = 1) jusqu'à ce que le pH de la solution aqueuse soit acide (pHrsi1). La phase organique est neutralisée avec une solution aqueuse de NaHCO3 puis lavée avec de l'eau (86 ml) et séchée sur Na2SO4r puis filtrée et concentrée sous pression réduite. Une purification par chromatographie sur colonne, en éluant avec un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole (7/3, v/v) donne la A isopropylamino-O-(.çpivaloyl-2-thioéthyl)-0-5'-(N. 4-0-3'-bis-(tert-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidite (I.1a) (0, 550 g, 83%) sous la forme d'une huile incolore. 27.2 (CH3), 26.4 (CH3) RMN 31P (CDCI3, 121 MHz) 8 8.0, 8.9 SM FAB>0 (G-T) m/z672 (M+H)+, 408 (M-GemC)+ FAB<0 (G-T) m/z670 (M-H)", 526 (M- tBuSATE)- RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) 8 7.81 (dd, 2H, 1= 7.1, H-6 et NH), 7.24 (d, 1H, J = 7.1, H-5), 6.38 (m, 1H, H-1'), 5.12 (m, 1H, H-3'), 4.25 (m, 3H, H-4', H-5' et H-5"), 4.02 (m, 2H, CH2O), 3.08 (ni, 2H, CH2S), 2.87 (m, 3H, CH2N et NH), 1.41 (m, 20H, CH22CH2N et CH3 Boc), 1.27 (m, 2H, CH2CH3), 1.21 (s, 9H, CH3 SATE), 0.86 (m, 3H, CH3 n-Bu) RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) 8 205.7 (CO), 163.2 (C-4), 154.5 (C-2), 151.4 (CO Boc), 150.9 (CO Boc), 144.5 (C-6), 123.0, 120.4, 117.8 (C-2'), 95.6 (C-5), 84.7 (C(CH3)3), 84.6 (C-1'), 83.0 (C(CH3)3), 78.4 (C-4'), 72.6 (C-3'), 65.0 (CH2O), 63.7 (C-5'), 46.5 (C(CH3)3), 41.2 (CH2N), 31.7 (CH2CH2N), 28.7 (CH2S), 27.9, 27.5, 27.3 (CH3 Boc et tBu), 19.7 Prodrogue (I.1) : N (rrbutylamino)-O-(S-pivaloyl-2-thioéthyl)-0-5'-gemcitabine phosphoramidate diester A une solution agitée de N (n-butylamino)-O-(.çpivaloyl-2-thioéthyl)-0-5'-(N 4-0-3'-bis-(tert-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidite (I.Ia) (0.55 g, 0,74 mmol) dans du dichlorométhane anhydre (7 ml), une solution de TFA (7 ml, 50% dans le dichlorométhane v/v) est ajoutée au goutte à goutte à 0°C. La réaction est complète après 1h15 à température ambiante. Le mélange réactionnel est coévaporé 2 fois avec du CH2Cl2 et 4 fois avec de l'éthanol. La purification du résidu sur une colonne RP18 utilisant comme éluant un gradient de 20% à 50% en volume de CH3CN/H20 permet d'obtenir le dérivé (I.1) désiré (0,264 g, 66%) sous la forme d'un solide blanc. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz) 8 7.55 (d, 1H, J= 7.5, H-6), 7.50, 7.45 (2s, 2H, NH2), 6.44 (t, 1H, J= 6.1, OH), 6.18 (t, 1H, J= 8.0, H-1'), 5.80 (dd, 1H, J = 7.5, H-5), 5.11 (m, 1H, NH), 4.13 (m, 3H, H-3', H-5' et H-5"), 4.01 (m, 1H, H-4'), 3.93 (m, 2H, CH2O), 3.09 (t, 2H, J = 6.4, CH2S), 2.75 (m, 2H, CH2N), 1.37 (m, 2H, CHH2N), 1.27 (m, 2H, CH2CH3), 1.18 (s, 9H, CH3 tBu), 0.84 (t, 3H, 1 = 7.3, CH3 nBu) (CH2CH3), 13.7 (CH3CH2) RMN 31P (CDCI3, 121 MHz) 8 9.6, 9.4 SM FAB>0 (G-T) m/z743 (M+H)+, 643 (M-Boc)+ FAB<0 (G-T) m/z 741 (M-H)-, 597 (M-tBuSATE)", 523 (M-tBuSATE- nBuNH)-, 497 (M-tBuSATE-Boc)- RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz) b 205.2 (CO), 165.4 (C-4), 154.3 (C-2), 141.0 (C-6), 126.0, 122.6, 119.2 (C-2'), 94.7 (C-5), 83.8 (C-1'), 78.3 (C-4'), 69.4 (C-3'), 63.7 (C-5' et CH2O), 45.9 (C(CH3)3), 40.3 (CH2N), 33.3 (CH2CH2N), 28.4 (CH2S), 26.8 (CH3 tBu), 19.2 (CH2CH3), 13.6 (CH3 nBu) RMN 31P (DMSO-d6, 121 MHz) 8 10.7, 10.0 SM FAB>0 (G-T) m/z 534 (M+H)+, 399 (M-tBuSATE)+ FAB<0 (G-T) m/z541 (M-H)- EXEMPLE 2 Préparation de la prodrogue de la gemcitabine de formule (1.2) : F (I.2) Intermédiaire (I.2a) : N (isopropylamino)-0-(S pivaloyl-2-thioéthyl)-O-5'-(N 4- O-3'-bis-(tert-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidate diester La O-(S pivaloyl-2-thioéthyl)-0-5'-(N4-0-3'-bis(tert-butoxycarbonyl) gemcitabine hydrogénophosphonate diester (II.1) (0,6 g, 0,894 mmol) est co-évaporée 2 fois avec de la pyridine anhydre, puis dissoute dans du tétrachlorure de carbone (22 ml). A cette solution, de l'isopropylamine (0,23 mL, 2,68 mmol) est additionnée goutte à goutte. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante. Après 1h15, le mélange réactionnel est dilué avec du dichlorométhane (86 ml) et lavé avec une solution d'acide chlorhydrique (86 ml, 0,1 N, pH = 1) jusqu'à ce que le pH de la solution aqueuse soit acide (pHzl). La phase organique est neutralisée avec une solution aqueuse de NaHCO3 puis lavée avec de l'eau (86 ml) et séchée sur Na2SO4, puis filtrée et concentrée sous pression réduite. Une purification par chromatographie sur colonne, en éluant avec un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole (7/3, v/v) donne la N isopropylamino-O-(.çpivaloyl-2-thioéthyl)-O-5'-(N. 4-0-3'-bis-(tert-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidite (I.2a) (0, 323 g, 50%) sous la forme d'une huile incolore. O O ~N~O 0.F NH OH RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) 7.81 (dd, 2H, 1= 7.6, H-6 et NH), 7.21 (m, 1H, H-5), 6. 34 (ni, 1H, H-1'), 5.17 (m, 1H, H-3'), 4.24 (m, 3H, H-4', H-5' et H-5"), 4. 01 (m, 2H, CH2O), 3.32 (m, 1H, NCH), 3.08 (m, 2H, CH2S), 2.75 (m, 1H, NH), 1.44 (s, 18H, CH3 Boc), 1.16 (s, 9H, CH3 SATE), 1.10 (m, 6H, CH3 iPr) RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) b 205.7 (CO), 163.1 (C-4), 154.5 (C-2), 151.4 (CO Boc), 150.9 (CO Boc), 144.5 (C-6), 122.9, 120.4, 117.7 (C-2'), 95.6 (C-5), 84.7 (C(CH3)3), 84.0 (C-1'), 83.0 (C(CH3)3), 78.3 (C-4'), 72.6 (C-3'), 65.0 (CH2O), 63.7 (C-5'), 46.5 (C(CH3)3), 44.1 (CHN), 29.7 (CH2S), 28.7, 27.9, 27.5 (CH3 Boc et tBu), 25.3 (CH3 iPr) RMN 31P (CDCI3, 121 MHz) 8 8.6, 8.3 SM FAB>0 (G-T) m/z 1457 (2M+H)+, 729 (M+H)+, 629 (M-Boc)+ FAB<0 (G-T) m/z 1455 (2M-H)-, 727 (M-H)-, 583 (M-tBuSATE)-, 483 (M-tBuSATE-Boc)- 15 Prodrogue (1.2) : iV (isopropylamino)-O-(5pivaloyl-2-thioéthyl)-0-5'-gemcitabine phosphoramidate diester A une solution agitée de N-asopropylamino)-O-(5-pivaloyl-2-thioéthyl)-a5'-(N.4-O-3'-bis- (tert-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidite (I.2a) (0.270 g, 0,37 20 mmol) dans du dichlorométhane anhydre (4 ml), une solution de TFA (4 ml, 50% dans le dichlorométhane v/v) est ajoutée au goutte à goutte à 0°C. La réaction est complète après 1h15 à température ambiante. Le mélange réactionnel est coévaporé 2 fois avec du CH2Cl2 et 4 fois avec de l'éthanol. La purification du résidu sur une colonne RP18 utilisant comme éluant un gradient de 20% à 60% en 25 volume de CH3CN/H2O permet d'obtenir le dérivé (I.2) désiré (0,170 g, 87%) sous la forme d'un solide blanc. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz) 8 7.55 (d, 1H, J= 7.6, H-6), 7.41, 7.37 (2s, 2H, NH2), 6.40 (t, 1H, J= 6.1, OH), 6.18 (t, 1H, J= 8.0, H-1'), 5.78 (dd, 1H, J= 7.6, H-5), 5.03 (m, 1H, NH), 4.21-4.12 (m, 3H, H-3', H-5' et 30 H-5"), 4.05 (m, 1H, H-4'), 3.94 (m, 2H, CH2O), 3.24 (m, 1H, CHN) 3.11 (t, 2H, 1= 6.4, CH2S), 1.20 (s, 9H, CH3 tBu), 1.10, 1.08 (2s, 6H, CH3 iPr) 10 RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz) 3 205.2 (CO), 165.6 (C-4), 154.5 (C-2), 141.0 (C-6), 122.6, 119.2 (C-2'), 94.7 (C-5), 83.2 (C-1'), 78.3 (C-4'), 69.5 (C-3'), 63.7 (C-5' et CH2O), 46.0 (C(CH3)3), 43.1 (CHN), 28.4 (CH2S), 26.9 (CH3 tBu), 24.9, 24.8 (CH3 iPr) RMN 31P (DMSO-d6, 121 MHz) 6 10.1, 9.9 SM FAB>0 (G-T) m/z 1057 (2M+H)+, 529 (M+H)+ O IO*1'..s../\,,•-0ùFIL N H OH F (I.3)

Intermédiaire (I.3a) : N-(benzyiamino)-0-(.9pivaloyl-2-thioéthyl)-a5'-(N4-O-3'-bis-(tert-buto) ycarbonyl) gemcitabine phosphoramidate diester

La O-(.9pivaloyl-2-thioéthyl)-O.5'-(/ 4-0-3'-bis(tert-butoxycarbonyl) gemcita bine hydrogénophosphonate diester (II.1) (0,1 g, 0,156 mmol) est co-évaporée 2 fois

avec de la pyridine anhydre, puis dissoute dans du tétrachlorure de carbone (3.7 ml). A cette solution, de la benzylamine (0,05 mL, 0,47 mmol) est additionnée goutte à goutte. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante. Après 1h15, le mélange réactionnel est dilué avec du dichlorométhane (15 ml) et lavé avec une solution d'acide chlorhydrique (15 ml, 0,1 N, pH = 1) jusqu'à ce que le

pH de la solution aqueuse soit acide (pHee1). La phase organique est neutralisée avec une solution aqueuse de NaHCO3 puis lavée avec de l'eau (15 ml) et séchée sur Na2SO4, puis filtrée et concentrée sous pression réduite. Une purification par chromatographie sur colonne, en éluant avec un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle (7/3, v/v) donne la N-benzylamino-0-(5pivaloyl-

2-thioéthyl)-0-5'-(N4-O-3'-bis-(tert-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidite (I.3a) (0,084 g, 70%) sous la forme d'une huile incolore.

RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) S 7.77 (m, 1H, H-6), 7.26 (m, 5H, Ph), 7.20 (m, 1H, H-5), 6.38 (m, 1H, H-1'), 5.08 (m, 1H, H-31, 4.22 (d, 2H, J= 6.1, EXEMPLE 3 Préparation de la prodrogue de la gemcitabine de formule (I.3) : N .N.-L0 CH2O), 4.05 (m, 4H, H-5', H-5" et CH2N), 3.50 (m, 1H, H-4'), 3.

04 RMN 31P (m, 2H, CH2S), 1.43 (s, 18H, CH3 Boc), 1.15 (s, 9H, CH3 SATE) (CDCI3, 121 MHz) S 9.1, 8.8 SM FAB>0 (G-T) m/z 777 (M+H)+, 677 (M-Boc)+ Prodrogue FAB<0 (G-T) m/z775 (M-H)- (1.3) : N (benzylamino)-O-(9pivaloyl-2-thioéthyl)-O-5'-gemcitabine phosphoramidate diester A une solution agitée de /w(benzylamino)-0-(5pivaloyl-2-thioéthyl)-0-5'-(N-4-0- 10 3'-bis-(tert-butoxycarbonyl) gemcitabine phosphoramidite (L3a) (0.041 g, 0,052 mmoi) dans du dichlorométhane anhydre (0,5 ml), une solution de TFA (0,5 ml, 50% dans le dichlorométhane v/v) est ajoutée au goutte à goutte à 0°C. La réaction est complète après 1h15 à température ambiante. Le mélange réactionnel est co-évaporé 2 fois avec du CH2Cl2 et 4 fois avec de l'éthanol. La purification du 15 résidu sur une colonne chromatographie en utilisant comme éluant avec un mélange dichlorométhane/éthanol (9/1, v/v) permet d'obtenir le dérivé (I.3) désiré (0,026 g, 72%) sous la forme d'un solide blanc. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz) 5 7.71 (d, 1H, J= 6,9, H-6), 7.41, 7.04 (2s, 2H, NH2), 7.3 (m, 5H, Ph), 6.50 (s, 1H, OH), 6.16 (m, 1H, H-1'), 5.91 (d, 20 1H, J = 6.9, H-5), 5.78 (ni, 1H, NH), 4.15 (m, 3H, H-3', H-5' et H-5'1, 3.96 (m, 5H, H-4', CH2O et CH2N) 3.05 (t, 2H, J = 6.3, CH2S), 1.17 (s, 9H, CH3) RMN 31P (DMSO-d6, 121 MHz) 8 10.1, 9.9 SM FAB>0 (G-T) m/z 1053 (2M+H)+, 577 (M+H)+ 25 L'évaluation de l'activité antitumorale des composés (I.1) à (I.3) dans une lignée cellulaire résistante à la gemcitabine (Tableau 1), montre sa capacité à contourner, au moins en partie, les processus de résistance cellulaire. L'évaluation de l'activité cytotoxique des composés est réalisée par un test de cytotoxicité in vitro sur lignées tumorales. Ces lignées sont cultivées en conditions 30 stériles pendant 72 heures dans un milieu de culture avec 10% de sérum de veau foetal en présence de différentes concentrations du composé d'intérêt. Au bout de 72 heures, la prolifération cellulaire est évaluée par mesure de l'activité métabolique par réduction de MTT en cristaux de formazan. Ces cristaux sont5 solubilisés dans un mélange isopropanol/HCI iN (90:10, vol :vol) et des valeurs de densité optique sont obtenues par spectrophotométrie. Ces valeurs permettent la détermination des concentrations inhibitrices 50%, correspondant à la concentration de composé provoquant une inhibition de croissance de 50% par rapport au contrôle (lignée identique cultivée en absence de composé). Tableau 1. Chimio sensibilité d'une lignée cellulaire non résistante (Messa wt) et résistante (10K) exposées à différentes concentrations de gemcitabine ou d'une prodrogue (I) Composé IC50 IC50 RR Messa wt Messa 10K Messa Gemcitabine 5 > 10 n.m. composé (I.1) 0,15 1 6 Composé (I.2) 0,25 2 8 Composé (I.3) 0,20 5,7 28,5 Les IC50 sont obtenues en moyennant les résultats obtenus sur trois expériences et sont exprimées en pM. IC50 et les valeurs du ratio de résistance relative sont obtenues à partir des courbes d'effet de concentrations, générées par ordinateur. RR: ratio de résistance relative (IC50 Messa 10K/ Messa wt). n.m. : non mesurable.

Claims

REVENDICATIONS

1 - Prodrogues phosphoesters de la gemcitabine, à activité anti-tumorale, de formule (1): R YùCùSù(CH2)nùOùPùO z O OH F (I) dans laquelle : - n est égal à 1, 2, 3 ou 4, - Z représente O ou S - Y représente un groupe choisi parmi les groupes alkyle ou aryle, lesdits groupes alkyle ou aryle pouvant éventuellement être substitués, par exemple par un ou plusieurs substituants choisis parmi ùOH, -SH ou ùNH2 - RI représente un groupe -NRaRb dans lequel Ra et Rb, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un groupe alkyle ou aryle, lesdits groupes alkyle ou aryle pouvant être éventuellement substitués, ou bien Ra et Rb sont liés entre eux pour former, avec l'atome d'azote auquel ils sont liés, une amine cyclique choisie parmi les groupes pyrrolidinyle, pipéridinyle, morpholynyle, pipérazinyle, pyridyle éventuellement substitués.

2 - Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce que Y = méthyle ou tert-butyle.

3 - Composés selon la revendication 1 ou 2 caractérisés en ce que n = 2.

4 - Composés selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisés en ce que RI = -NRaRb avec Ra et Rb tels que définis à la revendication 1.

5 - Composés selon la revendication 4 caractérisés en ce que Ra = H et Rb = benzyle, isopropyle ou n-butyle.

6 - Composés selon la revendication 1 de formule (I.1), (I.2) ou (1.3) suivante :NH2 àN NH F N Q OH F

7 - Compositions pharmaceutiques comprenant un composé selon l'une des revendications 1 à 6, en combinaison avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

8 - Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 7 pour la préparation d'un médicament anti-tumoral ou anti-cancéreux.

9 - Utilisation selon la revendication 8 pour la préparation d'un médicament anti-tumoral ou anti-cancéreux destiné au traitement ou à la prévention de lésions tumorales bénignes, ou de cancers, incluant les hémopathies malignes et les tumeurs solides, y compris les tumeurs d'origine glandulaire, mésenchymateuse, 15 génitale, cutanée et neurologique.