FR2897069A1 - Construction de nouveaux variants de l'enzyme dextrane-saccharase dsr-s par ingienerie moleculaire. - Google Patents
Construction de nouveaux variants de l'enzyme dextrane-saccharase dsr-s par ingienerie moleculaire. Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne un procédé recombinant pour la production de dextrane-saccharases tronquées et/ou mutées tout en conservant leur activité enzymatique. Plus précisément, la présente invention concerne des séquences d'acides nucléiques de dextrane-saccharases tronquées et/ou mutées, des vecteurs contenant de telles séquences d'acides nucléiques et des cellules hôtes transformées par les séquences encodant pour les dextrane-saccharases tronquées et/ou mutées. Selon un autre aspect de l'invention, celle-ci concerne un procédé pour produire de façon recombinante des dextrane-saccharases tronquées et/ou mutées qui conservent leur activité enzymatique ainsi que des procédés pour produire des dextranes de haute masse molaire aux propriétés rhéologiques modifiées par rapport à celles du dextrane synthétisé par l'enzyme native dans les mêmes conditions et des dextranes ou des isomaltooligosaccharides de masse molaire contrôlée. Les dextranes et IMO de l'invention peuvent être utilisés notamment en tant qu'agents texturants ou en tant que prébiotiques.
Description
La présente invention concerne un procédé recombinant pour la production
de dextrane-saccharases tronquées et/ou mutées tout en conservant leur activité enzymatique. Plus précisément, la présente invention concerne des séquences d'acides nucléiques de dextrane- saccharases tronquées ou mutées, des vecteurs contenant de telles séquences d'acides nucléiques et des cellules hôtes transformées par les séquences encodant pour les dextrane-saccharases tronquées ou mutées. Selon un autre aspect de l'invention, celle-ci concerne un procédé pour produire de façon recombinante des dextrane-saccharases tronquées et/ou _ mutées qui conservent leur activité enzymatique ainsi que des procédés pour produire des dextranes ou des isomaltooligosaccharides de masse molaire contrôlée et des dextranes aux propriétés rhéologiques modifiées, notamment par rapport aux propriétés des dextranes obtenus avec l'enzyme native.
Domaine technique Les dextranes sont des a-D-glucanes de structures variées comportant des unités glycosyle contiguës liées à plus de 50 % par des liaisons a-1,6 dans la chaîne principale et par des branchements en a-1,2, a-1,3 et/ou a-1,4 [1]. Les enzymes qui produisent de tels dextranes à partir du saccharose sont appelées des dextrane-saccharases et appartiennent à la famille 70 des Glycoside-Hydrolases [2]. Au cours de la réaction, le fructose issu du saccharose est relargué et peut être valorisé par ailleurs. Les dextrane-saccharases sont produites par des bactéries lactiques des genres Leuconostoc, Streptococcus et Lactobacillus [1].
La dextrane-saccharase (DSR-S) de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F comporte 1527 acides aminés [3]. Cette enzyme catalyse la synthèse d'homopolymères de glucose liés en a-1,6 à plus de 95 %. La production de dextrane peut être redirigée vers celle d'oligosaccharides ou de conjugués glucosylés par l'ajout d'un accepteur adéquat dans le mélange réactionnel [4].
Les dextranes et les dérivés de dextranes ont un nombre d'applications industrielles croissant, en particulier, les dextranes de taille spécifique. Les dextranes de taille comprise entre 70 000 et 100 000 Da sont par exemple utilisés comme substitut du plasma [5, 31]. Par ailleurs, le dextrane de 40 000 Da est utilisé pour améliorer le flux sanguin, vraisemblablement par réduction de la viscosité sanguine et l'inhibition de l'aggrégation érythrocytaire [6,8]. Après sulfatation, des dextranes de taille plus faible, d'environ 10 000 daltons par exemple, sont utilisés comme transporteurs de fer [7] ou anticoagulants [8]. Ces composés pourraient avoir des propriétés antivirales [9,10]. De plus, des dérivés du dextrane réticulés sont utilisés depuis longtemps dans le domaine de la séparation moléculaire, les supports de chromatographie sous la marque Sephadex étant commercialisés depuis 1961 [6].
Par ailleurs, l'Union Européenne a approuvé récemment l'utilisation du dextrane à titre d'ingrédients alimentaires dans des produits de boulangerie lorsque ceux-ci contiennent plus de 95 % de liaisons a-1,6 et ont une masse molaire supérieure à 2,106 Da[15]. La dextrane-saccharase peut également produire des isomaltooligosaccharides (IMO) par réaction d'accepteur. Les réactions d'accepteur réalisées par les glucane-saccharases consistent en un transfert de résidus glucosyle à partir de saccharose sur d'autres molécules ajoutées au milieu réactionnel. Un intérêt commercial s'est révélé spécialement au Japon où la demande en isomaltooligosaccharides représente environ quinze mille tonnes par an [11]. Ces IMO de petite taille (DP 2 à 6) sont utilisés en boulangerie, pour des boissons, dans le saké, les assaisonnements et la confiserie, à titre d'édulcorants anticariogènes. Il a également été montré que ces IMO présentent des propriétés prébiotiques utiles pour la flore intestinale et/ou vaginale [12,13]. Ces propriétés semblent varier selon la taille des IMO et être favorisées par des degrés de polymérisation élevés [14].
La seule source de dextranes commerciale et usuelle consiste à cultiver L.mesenteroides NRRL B-512F avec du saccharose, ceci menant à la formation de polymères de haute masse molaire, d'environ 108 Da. La synthèse directe de dextranes plus petits, allant de 10 000 à 100 000 Da est actuellement impossible. Les dextranes sont actuellement produits classiquement par hydrolyse acide des polymères de haute masse molaire natifs, suivie du fractionnement à l'aide de solvants organiques. Cette seconde étape est cependant connue pour ses faibles rendements [19]. D'un point de vue commercial, les IMO de DP 2 à 6 ne sont pas produits par réaction d'accepteur avec la dextrane-saccharase DSR-S et du glucose, à cause des faibles rendements de la réaction, mais à partir d'hydrolysats d'amidon, et d'un mélange d'a-amylases et glucosidases [11]. Monchois et al., [16] décrit des délétions carboxyterminales de la dextrane- saccharase de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F et conclut que le rôle du domaine C-terminal est de faciliter le transfert du dextrane et des oligosaccharides vers l'extérieur du site actif. Le brevet US 5,229,277 décrit un procédé de production de polymères de dextrane ayant une masse molaire basse et homogène en utilisant Leuconostoc mesenteroides et un microorganisme mutant de Lipomyces starkeyi ATCC 74054, qui est une levure pourvue d'une activité dextranase, enzyme spécifique de l'hydrolyse des liaisons a-1,6 du dextrane. Ce procédé nécessite des conditions de culture particulières et une durée et température précisément régulées, pour que l'activité dextranase réduise la masse molaire des dextranes. Les polymères de dextrane produits par cette méthode ont une masse molaire comprise entre 40 000 et 150 000 Da. Au vu de ce qui précède, il existe un besoin pour la production de dextranes ayant une masse molaire allant d'environ 10 000 à 100 000 Da, par une méthode plus rapide, de meilleur rendement et qui ne requière notamment ni hydrolyse acide ni fractionnement.
La présente invention concerne des dextrane-saccharases produites de façon recombinante, tronquées et/ou mutées tout en conservant leur activité enzymatique ou des variants tronqués de dextranesaccharase qui produisent des dextranes de masse molaire contrôlée. Plus précisément, elles conservent la spécificité de liaison de la DSR-S native et peuvent produire, à partir de saccharose, des dextranes de haute masse molaire aux propriétés texturantes intéressantes et/ou des dextranes et IMO de masse molaire contrôlée. Un autre objet de la présente invention consiste à fournir des _ séquences d'acides nucléiques de dextrane-saccharase tronquée et/ou mutée, des vecteurs et des cellules hôtes transformées par ces vecteurs, ainsi que des séquences d'acides aminés de dextrane-saccharases tronquées et/ou mutées. Notamment, comme cela apparaîtra dans les exemples, certaines dextrane-saccharases produisent des polymères aux propriétés texturantes intéressantes, c'est-à-dire nettement supérieures à celles du polymère produit par l'enzyme native, d'autres produisent des dextranes et des isomaltooligosaccharides de masse molaire contrôlée. De l'isomaltose est produit par au moins une dextrane-saccharase tronquée et mutée.
D'autres objets de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description et des exemples ou des modes de réalisation préférés suivants. Résumé de l'invention Selon un premier aspect, l'invention concerne une séquence nucléotidique consistant essentiellement en une séquence nucléotidique selon la figure 1 (SEQ ID NO:1), une séquence nucléotidique selon la figure 2 (SEQ ID NO:2), une séquence nucléotidique selon la figure 3 (SEQ ID NO:3), une séquence nucléotidique selon la figure 4 (SEQ ID NO:4), une séquence nucléotidique selon la figure 5 (SEQ ID NO:5), une séquence complémentaire de l'une des séquences ID NO:1, 2, 3, 4 ou 5 ou une séquence qui s'hybride en une séquence ID NO:1, 2, 3, 4 ou 5 dans des conditions d'hybridation stringente, à la condition qu'elle conserve l'activité enzymatique dextrane-saccharase. Selon un autre objet, l'invention concerne des séquences nucléotidiques de dextrane-saccharase consistant essentiellement en une séquence nucléotidique choisie parmi le fragment de la séquence SEQ ID NO:1 allant de la position 373 à la position 4269, le fragment de la séquence SEQ ID NO:2 allant de la position 373 à la position 4005, le fragment de la séquence SEQ ID NO:3 allant de la position 373 à la position 3408, le fragment de la séquence SEQ ID NO:4 allant de la position 373 à la position 3018 et le fragment de la séquence SEQ NO:5 allant de la position 373 à la position 4269. Elle concerne aussi des séquences nucléotidiques consistant essentiellement en une séquence nucléotidique choisie parmi une séquence nucléotidique complémentaire du fragment de SEQ ID NO:1 allant du nucléotide de la position 373 à celui de la position 4269, une séquence nucléotidique complémentaire du fragment de SEQ ID NO:2 allant du nucléotide de la position 373 à celui de la position 4005, une séquence nucléotidique complémentaire du fragment de SEQ ID NO:3 allant du nucléotide de la position 373 celui de la position 3408, une séquence nucléotidique complémentaire du fragment de SEQ ID NO:4 allant du nucléotide de la position 373 à celui de la position 3018 et une séquence nucléotidique complémentaire du fragment de SEQ ID NO:5 allant du nucléotide de la position 373 à celui de la position 4269. Elle concerne encore des séquences nucléotidiques qui s'hybrident en conditions stringentes en une séquence nucléotidique choisie parmi le fragment de la séquence SEQ ID NO:1 allant de la position 373 à la position 4269, le fragment de la séquence SEQ ID NO:2 allant de la position 373 à la position 4005, le fragment de la séquence SEQ ID NO:3 allant de la position 373 à la position 3408, le fragment de la séquence SEQ NO:4 allant de la position 373 à la position 3018 et le fragment de la séquence SEQ ID NO:5 allant de la position 373 à la position 4269, à la condition qu'elle conserve l'activité enzymatique dextrane-saccharase. Selon un autre objet de la présente invention, celle-ci concerne des vecteurs, par exemple des plasmides, et des cellules hôtes transformées par de tels vecteurs et contenant une telle séquence d'acides nucléiques de la dextranesaccharase tronquée et/ou mutée, et notamment des variants des exemples. Selon un autre aspect de la présente invention, celle-ci concerne une protéine encodée par une telle séquence nucléotidique tronquée et/ou _ mutée de la dextrane-saccharase parmi le fragment de SEQ ID NO:6 allant de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1423, le fragment de SEQ ID NO:7 allant de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1335, le fragment de SEQ ID NO:8 allant de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1136, le fragment de SEQ ID NO:9 allant de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1006 et le fragment de SEQ ID NO:10 allant de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1423. De plus, l'invention concerne une dextrane-saccharase tronquée et/ou mutée consistant essentiellement en l'une des séquences décrites ici, et choisie notamment parmi le fragment de SEQ ID NO:6 allant de l'acide aminé en position 125 à l'acide aminé en position 1423, le fragment de SEQ ID NO:7 allant de l'acide aminé en position 125 à l'acide aminé en position 1335, le fragment de SEQ ID NO:8 allant de l'acide aminé en position 125 à l'acide aminé en position 1136, le fragment de SEQ ID NO:9 allant de l'acide aminé en position 125 à l'acide aminé en position 1006 et le fragment de SEQ ID NO:10 allant de l'acide aminé en position 125 à l'acide aminé en position 1423. Selon un autre aspect, l'invention concerne la préparation d'une dextrane-saccharase mutée et/ou tronquée par la culture de cellules hôtes contenant une telle séquence tronquée et/ou mutée de dextrane- saccharase dans des conditions permettant l'expression d'une dextrane- saccharase, et l'isolement de ladite dextrane-saccharase du milieu de culture. Est également un objet de l'invention, un procédé pour produire des dextranes et/ou des isomaltooligosaccharides (IMO) de masse molaire contrôlée par réaction d'une dextrane-saccharase mutée et/ou tronquée selon l'invention avec du saccharose et éventuellement un accepteur, pour obtenir de tels dextranes ou IMO de masse molaire contrôlée, dont de l'isomaltose. Un procédé pour produire directement des IMO à partir du saccharose essentiellement est également un objet de l'invention. Par essentiellement, on entend ici qu'il n'y a pas nécessairement d'accepteur mis en oeuvre dans la réaction. Les dextranes de haute masse molaire selon l'invention ont des propriétés rhéologiques modifiées par rapport à celles du dextrane synthétisé par l'enzyme native, notamment un caractère non newtonien, filant et/ou gélifiant. Enfin, l'invention concerne des compositions comportant des dextranes obtenus par l'entremise de telles dextrane-saccharases ainsi que l'utilisation de telles dextrane-saccharases pour produire des dextranes et des isomaltooligosaccharides de masse molaire contrôlée comprise entre 342 et 109 Da. Plus précisément, sont produits selon l'invention (i) de l'isomaltose (342 Da), (ii) des isomaltooligosaccharides de 342 à 5 000 Da, (iii) des dextranes de taille contrôlée allant de 1 300 à 52 000 Da, plus précisément de 5 000 à 22 000 Da, et centrés autour de 10 000 Da, (iv) des dextranes de taille contrôlée allant de 7 000 à 1,7.105 Da, et plus précisément entre 22 000 et 70 000 Da, centrés sur 40 000 Da. Brève description des figures La figure 1 représente la séquence d'acides aminés et nucléotidique d'une dextrane-saccharase DSR-S vardel A4N tronquée avec un marqueur thiorédoxine à la position 5' terminale de la séquence et 6 marqueurs histidine à la position terminale 3' de la séquence ainsi que des bras espaceurs entre les étiquettes protéiques et la séquence codant pour la dextrane-saccharase. La figure 2 représente la séquence d'acides aminés et nucléotidique d'une dextrane-saccharase DSR-S vardel A3 tronquée avec un marqueur thiorédoxine à la position 5' terminale de la séquence et 6 marqueurs histidine à la position terminale 3' de la séquence et des bras espaceurs entre les étiquettes protéiques et la séquence codant pour la dextrane-saccharase. La figure 3 représente la séquence d'acides aminés et nucléotidique d'une dextrane-saccharase DSR-S vardel Core tronquée avec un marqueur thiorédoxine à la position 5' terminale de la séquence et 6 marqueurs histidine à la position terminale 3' de la séquence et des bras espaceurs entre les étiquettes protéiques et la séquence codant pour la dextrane-saccharase.
La figure 4 représente la séquence d'acides aminés et nucléotidique d'une dextrane-saccharase DSR-S Core AA tronquée avec un marqueur thiorédoxine à la position 5' terminale de la séquence et 6 marqueurs histidine à la position terminale 3' de la séquence et des bras espaceurs entre les étiquettes protéiques et la séquence codant pour la dextrane-saccharase. La figure 5 représente la séquence d'acides aminés et nucléotidique d'une dextrane-saccharase DSR-S vardel A4N mutant SEV663YDA tronquée avec un marqueur thiorédoxine à la position 5' terminale de la séquence et 6 marqueurs histidine à la position terminale 3' de la séquence et des bras espaceurs entre les étiquettes protéiques et la séquence codant pour la dextrane-saccharase. La figure 6 est une représentation schématique des variants tronqués de DSR-S et leur activité relative. Les quatre domaines différents, (i) à (iv) de DSR-S correspondant à : (i) peptide signal, (ii) région variable, (iii) domaine catalytique et (iv) domaine C-terminal ainsi que les unités répétées A, C et N (dans les cases ombrées) localisées selon Monchois et al., 1998 [16]. La figure 7 (A, B) représente des Western-blots anti-thiorédoxine (A) et anti-6xhis (B) réalisés sur un extrait de DSR-S vardel A 4N produit 5 par E. coli TOP10 à 23 C. La figure 8 représente un gel d'électrophorèse avec coloration de l'ensemble des protéines au bleu colloïdal sur des extraits de DSR-S vardel A4N lors de la purification d'affinité sur résine de nickel (Probond, Invitrogen). La piste 1 correspond au surnageant de sonication d' E. col/ 10 TOP 10 en fin de culture; la piste 2 à l'effluent obtenu après fixation des protéines 6xhis taggées sur la résine, la piste 3 à la fraction d'élution et la piste 4 à la fraction d'élution après élimination des agrégats. La figure 9 représente les profils d'élution obtenus par HPSEC des dextranes produits par la préparation de (a) DSR-S native de L. 15 mesenteroides NRRL B-512F, (b) la DSR-S recombinante entière, (c) la DSR-S vardel A4N avant purification et (d) la DSR-S vardel A4N purifiée. Le pic 1 correspond au polymère de haute masse molaire (HMW), le pic 2 au fructose, glucose et oligosaccharides de DP inférieur à 7, non séparés par le système. Entre ces deux pics, les perturbations de la ligne de base 20 reflètent la présence de dextranes de taille intermédaire (entre 103 et 107Da), en très faible concentration. La figure 10 A-E représente les spectres obtenus par RMN du proton sur les dextranes synthétisés par A) la DSR-S native de L. mesenteroides NRRL B-512F, B) la DSR-S recombinante de taille entière, 25 C) la DSR-S vardel A4N non purifiée, D) la DSR-S vardel A4N après purification. Le spectre E) est un spectre du carbone 13 du dextrane synthétisé par la DSR-S vardel A4N purifiée. La figure 11 correspond au chromatogramme HPAEC-PAD des produits de digestion à l'endodextranase des quatre dextranes synthétisés 30 par les DSR-S native, DSR-S recombinante entière et DSR-S vardel A4N, avant et après purification.
La figure 12 représente le comportement rhéologique des quatre dextranes synthétisés par les DSR-S native (1) avant et (2) après cisaillement, DSR-S recombinante de taille entière (3) avant et (4) après application d'une deuxième série de contraintes de cisaillement, DSR-S vardel MN (6) avant et (7) après application d'une deuxième série de contraintes de cisaillement, DSR-S vardel MN purifiée (5) où A) représente la mesure de viscosité en écoulement, B) des mesures de viscosité en mode dynamique (oscillations entre 0 et 10 Pa), avant de déterminer les modules de conservation G' et de dissipation d'énergie G" pour les dextranes synthétisés par les préparations de DSR-S vardel A4N non purifiées (o and •; comportement de type solution G'<G"; à 5 % déformation) et purifiées (^ and ^; comportement de type gel G'>G"; 0.4 0/0 déformation). La figure 13 représente un chromatogramme HPAEC-PAD des produits synthétisés par le mutant DSR-S vardel A4N SEV663YDA à partir de 100 g/I de saccharose uniquement (A), ou par réaction d'accepteur avec 100 g/I de saccharose et 50 g/1 de glucose (B). Le symbole G signifie du glucose, F du fructose, 12 de l'isomaltose, 13 de l'isomaltotriose, N/M du nigerose ou du maltose (non séparés par le système HPAEC-PAD) et le symbole ? correspond à des produits de structure inconnue. La figure 14 représente le chromatogramme HPSEC des dextranes synthétisés par la DSR-S vardel A3 à 20 et 10 C. Les flèches correspondent aux temps de rétention de dextranes commerciaux de 2. 106 Da, 70 000 et 10 000 Da ayant servi d'étalons.
La figure 15 représente le chromatogramme HPSEC des dextranes synthétisés à 20 C à partir de 100 g/I de saccharose et avec 1 U/ml de (1) DSR-S vardel MN, (2) DSR-S vardel A3, (3) DSR-S vardel Core et (4) DSR-S Core AA et le profil d'élution (5) d'un dextrane commercial de 10 000 Da (Sigma).
La figure 16 représente le profil HPAEC-PAD des dextranes synthétisés à 20 C à partir de 100 g/I de saccharose et avec 1 U/ml de DSR-S vardel A4N (1), DSR-S vardel A3 (2) , DSR-S vardel Core (3) et DSR- S vardel Core LA(4). La figure 17 représente le profil HPAEC-PAD (A) et la distribution (B) des IMO produits par réaction d'accepteur à 20 C avec les variants DSR-S vardel A4N (1), DSR-S vardel A3 (2), DSR-S vardel Core (3) et DSR-S Core AA (4). G: Glucose, F: fructose, L: leucrose, T: trehalulose, 12 to 120: isomaltooligosaccharides de DP 2 à DP 20. L'encart de la figure B correspond à un agrandissement des IMO de DP 15 à 27. Description détaillée des modes de réalisation préférés Par enzyme possédant l'activité enzymatique de la dextranesaccharase , on entend ici une enzyme qui catalyse la conversion du saccharose en oligosides et polyosides comprenant plus de 50% des unités glucosyle liées par des liaisons a-1,6 et de taille comprise entre 342 et 109 Da et plus précisément des dextranes et des isomaltooligosaccharides comprenant à plus de 95 % des liaisons a-1,6. Cette conversion peut avoir lieu en présence ou en absence d'accepteurs externes tels que le maltose, le glucose, l'isomaltose ou le fructose ou les isomaltooligosaccharides. Le maltose, l'isomaltose et le glucose sont les accepteurs préférés selon l'invention. L'activité enzymatique des dextrane-saccharases de la présente invention peut être mesurée tel qu'il est décrit dans les exemples. Les termes nucléotides , polynucléotides , acides nucléiques et oligonucléotides utilisés ici sont interchangeables et incluent, sans y être limités, les séquences ARN, ADN, ADN/ARN comportant plus d'un nucléotide dans une chaîne unique ou sous forme double. Les séquences de polynucléotides de la présente invention peuvent être préparées par toute méthode connue incluant, sans y être limitée, toute méthode synthétique recombinante et toute méthode de génération ex vivo, ainsi que des combinaisons de ces méthodes. Le terme tronqué utilisé ici signifie que l'une au moins des extrémités N- ou C-terminales de la séquence d'acides aminés ou d'acides nucléiques a été raccourcie. Ce raccourcissement peut être réalisé en utilisant des enzymes de restriction, des enzymes protéolytiques, ou de façon synthétique, y compris par amplification spécifique des séquences nucléotidiques par PCR, notamment. Par dextrane-saccharase purifiée , on entend ici une dextrane- saccharase ne possédant qu'une seule forme active dextrane-saccharase dans les préparations, et qui présente un degré de pureté protéique d'au moins 70 % ou 85 % ou 95 %. Par propriété texturante originale intéressante, on entend ici des propriétés rhéologiques des dextranes selon l'invention qui, en _ comparaison avec les dextranes synthétisés par l'enzyme native dans les mêmes conditions, présentent par exemple un comportement non newtonien, notamment un comportement de type gel ou filant. Un polymère du type gel est ici caractérisé par des mesures de rhéologie en mode dynamique, avec détection des modules de conservation d'énergie (G') et de dissipation d'énergie (G"). Pour un gel, G' est supérieur à G" sur toute la gamme de fréquence étudiée, comme cela apparaîtra dans l'exemple 5. Le caractère filant s'identifie à l'oeil nu. Les dextranes filants selon l'invention passent d'un comportement de type solution à un comportement de type gel après l'application d'une seconde série de contraintes de cisaillement, comme cela apparaîtra également à l'exemple 5. Les abréviations suivantes utilisées ici ont les significations données ci-après : DSR-S pour dextrane-saccharase de L.mesenteroides NRRL B-512F , DP pour degré de polymérisation, HMW pour high molecular weight IMW pour intermediate molecular weight , les polymères IMW étant des polymères très polydisperses de tailles comprises entre 1 000 et 10' Da, et dont la séparation en HPSEC est difficile compte tenu de leur faible concentration. Les polyméres LMW (pour low molecular weight) sont selon l'invention une population beaucoup plus importante et bien détectée entre 750 et 70 000 Da et centrée autour de 10 000 Da ou bien comprise entre 2000 et 1,7.105 Da et centrée autour de 40 000 Da. Par dextrane 10 000 Da, on entend ici une population de dextrane de taille comprise entre 1 300 et 52 000 Da, et plus précisément entre 5 000 et 22 000 Da, et centrée autour de 10000 Da. Lors de la caractérisation, la base du pic d'élution obtenu par perméation de gel a été comprise entre 1 300 et 52 000 Da, la fourchette de masses molaires estimée à mi-hauteur du pic d'élution est comprise entre 5 000 et 22 000 Da et le pic est centré sur une masse de 10 000 Da. Quand la masse molaire est exprimée à mi-hauteur du pic, au moins 50% de la population de dextrane est comprise dans la fourchette indiquée. Par dextrane de 40 000 Dagon entend une population de dextrane de taille comprise entre 7 000 et 1,7.105 Da, et plus précisément entre 22 000 et 70 000 Da, centrée sur 40 000 Da. Lors de la caractérisation, la base du pic d'élution obtenu par perméation de gel a été comprise entre 7 000 et 1,7.105 Da, la fourchette de masses molaires estimée à mi-hauteur du pic d'élution est comprise entre 22 000 et 70 000 Da et le pic est centré sur 40 000 Da. Quand la masse molaire est exprimée à mi-hauteur du pic, au moins 50 % de la population de dextrane est de taille comprise dans la fourchette indiquée. IMO signifie isomaltooligosaccharides. Par consistant essentiellement en quand il est question d'acides nucléiques ou d'acides aminés, on entend ici que d'autres ingrédients mineurs ou molécules peuvent être présents avec les séquences d'acides aminés ou d'acides nucléiques. Plus spécifiquement, la présente invention concerne des acides nucléiques qui encodent une dextrane-saccharase tronquée ou une dextrane-saccharase mutée, une séquence complémentaire de toutes ou partie de ces séquences ou une séquence qui s'hybride en conditions stringentes avec une des séquences ci-dessus pourvu que l'activité enzymatique dextrane-saccharase soit maintenue.
Par conditions d'hybridation stringentes, on entend ici des conditions telles qu'elles sont décrites par Sambrook et al., A Molecular Cloning Manual, 3`d edition (2001) c'est-à-dire par exemple les conditions suivantes : tampons d'hybridation : 2 X SSC, 10 x Denhardts solution (Ficoll 400 & PEG & BSA, ratio 1 :1 :1), 0,1 % SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Na2HPO4 250 pg/ml ADN de sperme de hareng, 50 pg/ml de t-ARN ou 0,25 M de tampon phosphate de sodium à pH 7,2, 1 mM EDTA, 7 % SDS ; Température d'hybridation : 60 C ; Tampon de lavage : 2 X SSC, 0,1 % SDS ; Température de lavage : 60 C. Les molécules d'acides nucléiques qui s'hybrident en conditions stringentes avec les acides nucléiques de la présente invention peuvent en principe encoder des dextrane-saccharases à partir de tout microorganisme tels que des bactéries, des bactéries gram-positives, et selon un certain aspect de l'invention, des bactéries appartenant aux genres Leuconostoc, Streptococcus ou Lactobacillus. La présente invention concerne les acides nucléiques qui encodent des protéines dextrane-saccharases ayant au moins 70 %, ou 80 % ou 90 % de leurs séquences identiques à celles des séquences SEQ ID NO :1 à SEQ ID NO:5, pourvu que la protéine encodée par ces séquences possède l'activité enzymatique dextrane-saccharase. Selon un autre aspect de l'invention, les séquences complémentaires à des séquences de l'invention ou des séquences qui s'hybrident avec de telles séquences en conditions stringentes, pourvu que l'activité enzymatique dextrane-saccharase soit maintenue, sont également comprises dans la présente invention. Les dérivations des séquences nucléotidiques basiques SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:5, où les séquences choisies parmi le fragment de la séquence SEQ ID NO:1 allant de la position 373 à la position 4269, le fragment de la séquence SEQ ID NO:2 allant de la position 373 à la position 4005, le fragment de la séquence SEQ ID NO:3 allant de laposition 373 à la position 3408, le fragment de la séquence SEQ ID NO:4 allant de la position 373 à la position 3018 et le fragment de la séquence SEQ NO:5 d'un nucléotide à la position 373 à la position 4269, les séquences complémentaires à ces séquences ou des séquences qui s'hybrident avec ces séquences en conditions stringentes, pourvu que l'activité enzymatique dextranesaccharase soit maintenue, peuvent être produites par délétion, substitution, insertion et recombinaison, par exemple, les méthodes pour réaliser de telles étapes et transformations étant bien connues dans la technique et décrites par exemple par Sambrook et al., supra. Il est entendu ici que si de quelconques délétions, substitutions, insertions ou recombinaisons de l'une quelconque des séquences nucléiques citées ci-dessus sont entreprises, les protéines encodées par les séquences doivent voir leur activité enzymatique de dextrane- saccharase maintenue. Ainsi, 1 à 132, de préférence 2 à 60 nucléotides, de façon préférée 15 à 36 nucléotides et de façon encore préférée 12 à 27 nucléotides peuvent être modifiés par délétion, substitution, insertion ou recombinaison, par exemple. Selon l'invention 90%, de préférence 95% des nucléotides restent inchangés.
L'activité enzymatique dextrane-saccharase peut être mesurée ainsi qu'il apparaîtra dans la section des méthodes et dans les exemples de la présente demande. Les oligonucléotides qui peuvent être utilisés à titre de sonde ou amorce sont par exemple SEQ ID NO:1 à SEQ ID NO:5 ou les séquences nucléotidiques choisies parmi le fragment de la séquence SEQ ID NO:1 allant de la position 373 à la position 4269, le fragment de la séquence SEQ ID NO:2 allant de la position 373 à la position 4005, le fragment de la séquence SEQ ID NO:3 allant de la position 373 à la position 3408, le fragment de la séquence SEQ ID NO:4 allant de la position 373 à la position 3018 et le fragment de la séquence SEQ NO:5 d'un nucléotide à la position 373 à la position 4269.
La longueur des sondes et amorces peut varier selon leurs applications. De façon générale, ils doivent avoir au moins 25 nucléotides et peuvent comprendre la totalité des séquences de dextrane-saccharase décrites, telles que 3896 nucléotides. La longueur peut aussi varier pour être comprise entre 25 et 150 nucléotides, 25 et 800 nucléotides ou 25 et 3000 nucléotides, par exemple. Les amorces comportent généralement 18 à 25 nucléotides en longueur, mais peuvent aussi être plus importantes, dépendant de l'application envisagée. Des exemples d'amorces qui peuvent être utilisées _ dans la présente invention sont : GGC TTC TCT GGT GTG ATT (SEQ ID NO:11) GAT CTG TCA GAA ACT GGC (SEQ ID NO:12) ACA CAA CAA GTT AGC GGC (SEQ ID NO: 13) CCA GAT ACT AAC TTG AGT (SEQ ID NO: 14) TTC ATT GAT GCA GAC GGG (SEQ ID NO:15) CAC GAC TAC GAC GCG CAA (SEQ ID NO :16) Il est à noter que les amorces aux positions terminales 5' et 3' des nucléotides encodent pour la dextrane-saccharase (SEQ ID NO:11 à 15) et du côté 5' et 3' de la séquence mutante (SEQ ID NO :16). Toutefois une personne du métier peut utiliser chacune de ces séquences pour faire des amorces ou des sondes utilisant des nucléotides consécutifs. Ainsi, ces séquences nucléotidiques qui sont utilisées comme sonde peuvent être marquées par radioactivité, marquage enzymatique, marquage fluorescent, notamment.
Pour le génie génétique de cellule procaryote ou eucaryote, les acides nucléiques de la présente demande ou une partie des acides nucléiques de la présente demande peuvent être introduits dans des plasmides permettant la mutagénèse ou la modification de séquences par recombinaison de séquences nucléotidiques. Les méthodes standards utilisant ces techniques sont connues de l'homme du métier, et elles sont décrites notamment par Sambrook et al. supra. Les fragments d'ADN peuvent également être connectés les uns aux autres par des adaptateurs ou des lieurs et des enzymes de restriction adaptées peuvent être utilisées pour supprimer certaines séquences d'ADN. Les méthodes telle que la mutagénèse, la restriction après restauration des amorces ou ligatures peuvent être mises en oeuvre pour obtenir la séquence désirée avec les insertions appropriées, les délétions ou les substitutions nécessaires ou souhaitables. De plus des étiquettes bien définies et encodant pour des acides nucléiques peuvent être rattachées aux extrémités N- ou C-terminales des séquences d'acides nucléiques de la présente invention. Il peut s'agir de peptides tels que Poly-His, c-myc épitope et HA-tag ou de petites protéines telles que GST bactérienne, MBP (maltose binding protein), thioredoxine, p-galactosidase, VSV-Glycoprotéine et analogues. Des acides nucléiques encodant d'autres étiquettes protéiques sont notamment His-tag, T7-tag, S-tag, un peptide flag , trpE, l'avidine/streptavidine, la protéine A ou G staphylococcique, la dihydrofolate réductase, des domaines liants la cellulose, la polycystéine, la polyphénylalanine et analogues peuvent également être utilisés dans la présente invention.
Selon un aspect de la présente invention, un acide nucléique encodant une thiorédoxine est fusionné à la séquence d'acides nucléiques N-terminale. Un acide nucléique codant pour une étiquette 6xhis est fusionné à l'extrémité 3' des séquences d'acides nucléiques. Les acides nucléiques de la présente invention peuvent être liés à une unité de transcription comportant (1) des éléments régulateurs de l'expression du gène tels que des promoteurs et des amplificateurs et (2) une séquence codante ou structurelle qui est transcrite en un mARN et traduite dans la protéine correspondante et (3) des signaux appropriés d'initiation et de terminaison.
De nombreuses séquences de contrôle d'expression appropriées sont connues dans la technique. Des méthodes générales pour l'expression de protéine recombinante sont aussi connues et exemplifiées dans le document R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990) [17]. Les régions promotrices utilisables dans les vecteurs de la présente invention incluent lacL, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, tre et ara. La présente invention concerne de plus des vecteurs et en particulier des plasmides, cosmides, virus, bactériophages et autres vecteurs usuellement connus dans le domaine du génie génétique et qui comportent des séquences d'acides nucléiques de la présente demande selon l'un des aspects de la présente invention, ces vecteurs sont des plasmides et peuvent être choisis parmi DSR-S vardel A4N, DSR-S vardel A3, DSR-S vardel Core, DSR-S CoreLA et DSR-S vardel MN SEV663YDA. L'expression des acides nucléiques de la présente invention peut être réalisée dans des cellules procaryotes ou eucaryotes. A titre d'exemples de telles cellules, on peut citer sans y être limité cellules VERO, cellules HELA telle que ATCC No. CCL3, des lignées cellulaires CHO telles que ATCC CCL61, des cellules COS telles que COS-7 et des cellules ATCC No. CR : 1650, W138, BHK, HepG2, 3T3 telle que ATCC No.
CRL6361, A549, PC12, K562, des cellules 293, des cellules Sf9 telle que ATTCC No. CRL1711, des cellules Cv1 telle que ATCC No. CCL70 et des cellules JRKAT telle que ATTCC Tib152. D'autres cellules utilisables selon la présente demande incluent, sans y être limitées, des souches de cellule hôte prokaryote telles que Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium ou des souches du genre Pseudomonas, Streptomyces et Staphylococcus, des souches de cellules hôtes eucaryotes tels que des parasites Apicomplexan (Plasmodia, Toxoplasma, Cryptosporidia) Leishmania ou Trypanosoma. D'autres cellules appropriées peuvent être utilisées dans la présente invention et incluent notamment des cellules de levure telles que Saccharomyces comme Saccharomyces cerevisiae ou pombe, Pichia pastoris et des cellules eukaryotes (cellules de plantes, cellules CHO et analogues). Selon un autre aspect, les cellules utilisées pour l'expression des acides nucléiques de la présente invention sont Escherichia coli et les souches choisies par exemple parmi JM109, BL21(DE3)pLysS, Top10 ou Pir1. La souche INVsc de Saccharomyces cerevisiae peut également être utilisée. La présente invention concerne des cellules hôtes transformées avec les séquences d'acides nucléiques décrites ci-dessus ou avec un vecteur tel que décrit ci-dessus et les cellules issues des cellules transformées et contenant le vecteur ou les séquences d'acides nucléiques décrites ici. Comme exemple de telles cellules hôtes, on peut citer Escherichia coli dans laquelle la dextrane-saccharase tronquée et/ou mutée peut être 15 produite. La préparation de telles cellules hôtes est connue dans le domaine technique. Des protéines, ainsi que des fragments biologiquement actifs de telles protéines, ainsi que des protéines mutées qui sont encodées par les molécules d'acides nucléiques de la présente invention et leurs méthodes 20 de préparation sont également l'objet de la présente demande. Ainsi, la présente invention concerne un procédé de préparation de dextrane-saccharase mutée et/ou tronquée comportant les étapes de : (a) culture de cellules hôtes transformées avec les séquences d'acides nucléiques décrites ci-dessus ou avec un vecteur tel 25 que décrit ci-dessus dans des conditions permettant l'expression d'une dextrane-saccharase et (b) isolement de ladite dextrane-saccharase du milieu de culture. Plus spécifiquement, les séquences d'acides nucléiques peuvent être choisies parmi SEQ ID NO:1 allant de la position 373 à la position 30 4269, le fragment de la séquence SEQ ID NO:2 allant de la position 373 à la position 4005, le fragment de la séquence SEQ ID NO:3 allant de la position 373 à la position 3408, le fragment de la séquence SEQ NO:4 allant de la position 373 à la position 3018 et le fragment de la séquence SEQ ID NO:5 allant de la position 373 à la position 4269, des gènes complémentaires de ces séquences et des séquences qui s'hybrident , en condition stringente, avec ces séquences, pourvu que l'activité enzymatique dextrane-saccharase soit maintenue. Après avoir été isolées, les dextrane-saccharases de la présente invention peuvent également être purifiées. A cet égard, les méthodes de purification usuelle peuvent être utilisées telles que la précipitation, la chromatographie par échange d'ions, la chromatographie d'affinité, la chromatographie d'échange hydrophobe, la filtration sur gel, la chromatographie CLHP phase inverse, la démixtion de phase, et analogues. Selon l'un des aspects de la présente invention, les dextranesaccharases mutées ou tronquées de la présente invention peuvent être purifiées en utilisant une résine chargée avec du nickel, compte tenu de l'existence de l'étiquette thioredoxine et 6xhis. Selon un autre aspect de la présente invention, celle-ci concerne des protéines de dextrane-saccharase consistant essentiellement en une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO:6 à 10 ou une séquence d'acides aminés choisie parmi le fragment de SEQ ID NO:6 allant de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1423, le fragment de SEQ ID NO:7 allant de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1335, le fragment de SEQ ID NO:8 allant de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1136, le fragment de SEQ ID NO:9 allant de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1006 et le fragment de SEQ ID NO:10 allant de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1423. Les séquences d'acides aminés homologues, c'est-à-dire dont le degré de similarité avec les séquences définies ci-dessus est suffisant pour que l'activé enzymatique soit maintenue sont également comprises dans l'objet de la présente demande. Ainsi, les programmes Blast et Fasta peuvent être utilisés pour rechercher la similarité. Comme il a été démontré ici qu'il était possible de tronquer les extrémités N- et C-terminales des dextrane-saccharases en maintenant l'activité enzymatique, la similarité de séquences ne peut être comprise ici comme considérée sur la seule séquence complète, mais aussi sur les séquences tronquées. La présente invention concerne donc toute séquence ayant 80%, 90%, ou 98% de similarité de séquence avec la séquence complète, mais aussi celles qui auraient 80%, 90% ou 98% de similarité de séquence avec une des séquences tronquées, pourvu que l'activité enzymatique soit maintenue.
Plus spécifiquement, la présente invention concerne les séquences ayant un degré de similarité de l'ordre de 90, 95 ou 98 % de similarité avec les SEQ ID NO:6 à 10 ou les séquences d'acides aminés choisies parmi SEQ ID NO:6 de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1423, SEQ ID NO:7 de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1335, SEQ ID NO:8 de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1136, SEQ ID NO:9 de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1006 et SEQ ID NO:10 de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1423, à la condition que ces protéines possèdent l'activité enzymatique de ces dextrane- saccharases. Bien entendu les séquences d'acides aminés ayant l'identité spécifique ci-dessus définie ont une majorité de substitutions d'acides aminés conservatives. Les substitutions d'acides aminés conservatives incluent les substitutions des acides aminés de la même classe. Ces classes comportent par exemple des acides aminés ayant des chaînes latérales polaires non chargées telles que Asn, Gln, Ser, Thr et Tyr ; des acides aminés ayant des chaînes latérales basiques comme His, Lys et Arg ; des acides aminés ayant des chaînes latérales acides telles que Glu et Asp et des acides aminés ayant des chaînes latérales non polaires telles que Ala, Gly, Leu, Val, lle, Pro, Phe, Cys et Trp.
Par ailleurs en ce qui concerne l'activité enzymatique de la dextrane-saccharase avec des substitutions d'acides aminés, celle-ci peut être testée en ce qui concerne son activité selon les exemples mais on peut également évaluer cette activité par analyses CLHP ou en utilisant des prédictions usuelles concernant les changements d'acides aminés affectant les fonctions protéiques. Selon un autre aspect, les séquences d'acides aminés étant indiquées ici, la protéine peut être synthétisée en utilisant la méthode de Merrifield, R.B. 1963 [20]. De ce fait, les protéines dextrane-saccharases synthétisées de façon synthétique constituent un autre aspect de la présente invention. La présente invention concerne également des dextranesaccharases mutantes appelées mutant SEV663YDA de la DSR-S vardel A4N dans lesquelles la sérine, l'acide glutamique, et la valine aux positions 663, 664 et 665 sont modifiés en tyrosine, acide aspartique et alanine, respectivement. Ce mutant peut être utilisé pour la synthèse d'isomaltose à partir du saccharose comme seul substrat à un rendement qui est équivalent à celui que l'on obtient quand un accepteur tel que du glucose est additionné au milieu réactionnel. De ce fait, la présente invention concerne une méthode de production d'isomaltose directement à partir du saccharose, cette méthode comportant la réaction de la dextrane-saccharase mutante de SEQ ID NO:10 avec du saccharose, et produisant de l'isomaltose.
Les protéines de fusion ayant une étiquette protéique telle que décrite ci-dessus sont également objet de la présente invention. A cet égard, les protéines mutées et/ou tronquées de la présente invention peuvent être fusionnées à au moins une étiquette protéique. La préparation de dextranes de haute masse molaire (environ 106 û 30 109 Da) et aux propriétés rhéologiques modifiées par rapport au dextrane synthétisé par la DSR-S native de L. mesenteroides NRRL B-512F utilisant la dextrane-saccharase tronquée de la présente invention en est un autre aspect. Plus spécifiquement, des microorganismes secrétant de la dextrane-saccharase ou des extraits cellulaires de microorganismes produisant de la dextrane-saccharase de manière intracellulaire peuvent être cultivés ou utilisés dans un milieu comportant du saccharose, ceci menant à la synthèse d'isomaltose (342 Da), (ii) des isomaltooligosaccharides de 342 à 5 000 Da, (iii) des dextranes de taille contrôlée allant de 1 300 à 52 000 Da et centrés autour de 10 000 Da, (iv) des dextranes de taille contrôlée allant de 7 000 à 1,7.105 Da et centrés autour de 40 000 Da et (v) des dextranes de haute masse molaire allant de 2.106 Da à 109 Da. Ces composés peuvent être isolés du milieu de culture par des méthodes conventionnelles telles que l'ultrafiltration, la nanofiltration, la précipitation alcoolique, la chromatographie liquide, et analogues. Alternativement, les dextrane-saccharases tronquées et/ou mutées décrites de la présente demande peuvent être purifiées et utilisées dans une méthode produisant des dextranes de masse molaire contrôlée. Ainsi l'invention concerne un procédé de production de dextranes et/ou d'isomaltooligosaccharides de masse molaire contrôlée comportant la réaction d'une dextrane-saccharase mutée et/ou tronquée consistant essentiellement en une séquence choisie parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID NO:6 à SEQ ID NO:10 définies ci-dessus avec au moins du saccharose et éventuellement un accepteur.
L'invention concerne aussi un procédé de production d'isomaltose, le procédé comportant la réaction d'une dextrane-saccharase mutée et/ou tronquée de séquence SEQ ID NO:10 avec essentiellement du saccharose. L'invention concerne également un procédé de production de dextranes aux propriétés texturantes intéressantes, le procédé comportant la réaction d'une dextrane-saccharase mutée et/ou tronquée de séquence SEQ ID NO:6.
L'invention concerne également les dextranes et isomaltooligosaccharides présentant les caractéristiques définies selon la présente demande et suceptibles d'être obtenus par les procédés décrits ici. Parmi ces propriétés caractéristiques figurent le fait que les dextranes de haute masse molaire ont un comportement non newtonien, et présentent le caractère de gel ou le caractère filant, ainsi que la propriété de passer d'un comportement de type solution à celui de gel après application d'une deuxième série de contraintes de cisaillement. Comme cela apparaîtra dans les exemples, il est avantageux que _ les propriétés rhéologiques différentes puissent être obtenues, selon que l'enzyme est purifiée ou non purifiée. Les dextranes produits de- façon enzymatique selon l'invention peuvent être utilisés notamment comme support dans l'industrie pharmaceutique, comme succédané du plasma, additifs dans les textiles ou peintures, dans les cosmétiques et dans l'industrie agroalimentaire, ainsi que comme agent texturant, par exemple comme substitut de la gomme arabique ou agent gélifiant. L'invention concerne également les compositions comportant les dextranes et IMO de l'invention. Une des applications importantes des dextranes et des isomaltosaccharides de la présente demande est leur utilisation à titre de prébiotiques. Ces produits ne sont en effet pas totalement métabolisés et sélectivement fermentés dans le colon par des espèces bactériennes appropriées telles que Bifidobacteria et Lactobacilli. Des oligosaccharides ont été traditionnellement utilisés pour l'alimentation humaine ou animale, les industries pharmaceutiques et cosmétiques ou à titre d'édulcorant, de stabilisant ou de charge [21]. Ces quinze dernières années, un nouveau champ d'activité s'est développé pour les propriétés prébiotiques de certaines molécules non digestibles [23]. Les oligosaccharides en tant que prébiotiques retiennent l'attention pour leur capacité à résister aux attaques des enzymes digestives et à accentuer la croissance de bactéries dites bénéfiques pour la santé , de façon prépondérante Bifidobacteria et Lactobacilli, dans les intestins. Ce concept est largement stimulé par l'émergence des produits prébiotiques industriels qui a rapidement pris de l'importance. Sont ainsi promus des oligomères tels que fructo-oligosaccharides, lactulose, galacto- oligosaccharides, xylo-oligosaccharides, oligosaccharides extraits du soja ou isomaltooligosaccharides la plupart du temps obtenus par des procédés biologiques ou par extraction à partir de plantes. A ce jour les efforts de recherche dans ce domaine sont centrés sur la production de nouvelles structures oligosaccharidiques appelées seconde génération de prébiotiques, qui auraient des propriétés physico-chimiques nouvelles et des activités biologiques plus spécifiques [18]. Selon un autre aspect, la présente invention concerne une composition comportant un dextrane obtenu à partir d'une dextrane saccharase de l'invention, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable ou alimentaire. Le véhicule acceptable peut par exemple être sélectionné parmi les adjuvants, les sels et analogues et parmi les adjuvants, des muramyl peptides, de l'alum, la montanide et analogues. Les dextrane-saccharases mutées et/ou tronquées peuvent être la protéine purifiée, une protéine produite de façon recombinante ou une protéine produite de façon synthétique. En ce qui concerne le procédé de production de dextranes et/ou d'IMO, les accepteurs préférés, quand il en est utilisé, sont le glucose, l'isomaltose, le maltose et les isomaltooligosaccharides.
De façon préférée, le procédé de production d'isomaltooligosaccharides de masse molaire contrôlée comporte la réaction d'une dextrane-saccharase mutée et/ou tronquée consistant en les séquences SEQ ID NO:7, 8, 9 ou 10 avec essentiellement du saccharose. Le degré de polymérisation varie alors de 2 à 60 unités glucosyle (DP2 à DP60).
La réaction de production a lieu à des températures comprises entre 4 C et 80 C, de préférence 4 C à 40 C. De façon préférée, quand la séquence est SEQ ID NO:7, SEQ ID NO :8 ou SEQ ID NO:9, la température est comprise entre 4 C et 15 C, de préférence 8 C et 12 C, et de façon encore préférée, la température est de l'ordre de 10 C pour la production de dextranes de taille contrôlée. Par ailleurs, pour ces séquences, de façon préférée, la température est comprise entre environ 8 C et 25 C, de façon encore préférée de l'ordre de 20 C pour la synthèse des IMO.
Par ailleurs, de façon préférée, quand la séquence est SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:10, la température est comprise entre 15 C et 45 C, de préférence 17 C et 30 C, et de façon encore préférée de l'ordre de 20 C à 25 C. De plus, la concentration en saccharose est comprise entre 10 et 600 g/I, de préférence 75 et 400 g/l, de façon préférée 90 à 280 g/l. Lorsque la séquence est SEQ ID NO:7, SEQ ID NO :8 ou SEQ ID NO:9, la concentration en saccharose du milieu est de préférence de l'ordre de 250 g/I. Par ailleurs, lorsque la séquence est SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO :10, la concentration en saccharose peut être de l'ordre de 100 g/l. De plus, le cas échéant, le rapport de concentrations massiques saccharose/accepteur peut être de l'ordre de 0,5 à 12, de préférence 1 à 4, de façon préférée environ 2. Dans le procédé de l'invention, la dextrane-saccharase est sous forme libre ou immobilisée sur support. Cette immobilisation peut être réalisée par adsorption, inclusion ou liaison covalente, par exemple. Enfin, pour la mise en oeuvre du procédé, le pH est compris entre 3,0 et 10,0, de préférence 4,0 et 7,0, de façon préférée 4,5 et 6,0 et de façon encore préférée environ 5,2.
D'autres aspects de l'invention pourront apparaître à la lecture des exemples ci-après.
Exemple 1 : Construction des variants Le vecteur pBad/TOPO Thiofusion (Invitrogen) a été utilisé pour le clonage et l'expression des gènes dsrS tronqués et/ou mutés, sous le contrôle du promoteur L-arabinose. II permet la fusion du gène à un marqueur 6xhis à l'extrémité C-terminale, et à un marqueur thiorédoxine en N-terminale. Pour être utilisé comme matrice, l'ADN génomique de L. mesenteroides NRRL B-512F a été extrait en utilisant le kit Blood and Cell culture DNA maxi (Qiagen). La souche provient de la collection NCAUR, Peoria, IL, USA. Les cellules One Shot TOP10 (Invitrogen) ont été utilisées pour l'expression des gènes dsrS tronqués et/ou mutés. Les enzymes de restriction ont été achetées auprès de New England Biolabs et utilisées selon les instructions du fabricant. La purification de l'ADN a été effectuée en utilisant les kits QlAquick (purification par PCR et extraction de gel) et QlAprep (purification de plasmides) de Qiagen. Les variants ont été construits par amplification par PCR du gène dsrS à partir d'ADN génomique de L. mesenteroides NRRL B-512F, en utilisant la polymérase Expand High Fidelity (Roche) et les amorces suivantes (données dans le sens 5'--->3') : 1. DSR-S vardel MN a été construite en utilisant les amorces Pbad DSR-S vardel : 454-acacaacaagttagcggcaagtacgttgaaaaagac-490 et Pbad MN : 4350-actcaagttagtatctggatccacaatgatagc-4317. Elle contient les acides aminés T152 à S1450 de DSR-S. 2. DSR-S vardel A3 a été construite en utilisant les amorces Pbad DSR-S vardel : 454-acacaacaagttagcggcaagtacgttgaaaaagac-490 et Pbad A3: 4086-cccgtctgcatcaatgaattcacc-4062. Elle contient les acides aminés T152 à G1362 de DSR-S. 3. DSR-S vardel Core a été construite en utilisant les amorces Pbad DSR-S vardel : 454-acacaacaagttagcggcaagtacgttgaaaaagac-490 et Pbad Core : 3489-gccagtttctgacagatcattagttaactg-3459. Elle contient les acides aminés T152 à G1162 de DSR-S. 4. DSR-S Core AA a été construite en utilisant les amorces Pbad DSR- S cat : 843-ggcttctctggtgtgattgatggtcaa-870 et Pbad Core : 3489-5 gccagtttctgacagatcattagttaactg-3459. Elle contient les acides aminés G282à G1162 de DSR-S. 5. Le mutant DSR-S vardel ~4N SEV663YDA a été construit par mutagénèse dirigée, en utilisant la technique de la méga-amorce [33, 21] et l'ADN polymérase Pfu (Stratagene). Une première _ 10 réaction de PCR a été réalisée en utilisant la matrice plasmidique DSR-S vardel A4N, et le couple d'amorces SEV663YDA : 1965-agctttgtacgagctcacgactacgacgcgcaaacggtt-2004 et rev: 3447-gtcaccatcctcagtgttcqaaacg-3422, comportant le site de restriction BstBl (souligné). Ce produit PCR a alors été utilisé comme méga- 15 amorce reverse dans une seconde PCR, avec l'amorce forw : 1329-caaccacagtggaatgaaactagtc-1354 comportant le site de restriction Spel. Ce deuxième produit PCR a alors été digéré par les deux enzymes de restriction Spel et BstBI selon les conditions du fournisseur (New England Biolabs) et cloné dans le vecteur pBad 20 DSR-S vardel MN préalablement digéré par ces mêmes enzymes. L'amorce SEV663YDA est conçue de manière à introduire un site de restriction unique pour sélectionner les clones positifs (ici, site Sacl). La structure primaire de chacun des variants DSR-S vardel MN, DSR-S vardel A3, DSR-S vardel Core et DSR-S Core AA est représentée 25 schématiquement figure 6.
Exemple 2 : Production des variants chez E. coli Les cultures sont réalisées en fiole d'Erlenmeyer baflée sur milieu 2X YT tamponné à pH 6,4 avec 100 mM de Tris-HCI, la DSR-S étant 30 connue pour être instable dans des conditions de pH alcalines [3]. Composition du milieu 2X YT : 29 Bactotryptone 16 g/I Extrait de levures 10 g/I NaCI 5 g/I Tris 12,1 g/I Les cellules d'E. col/ TOP 10 portant les plasmides pBad DSR-S vardel MN et pBad DSR-S vardel MN SEV663YDA se cultivent à 23 C. L'induction au L-arabinose est réalisée lorsque la croissance cellulaire atteint une D0600 nn, de 0,2, avec 0,002 % (m/v) d'inducteur. Les cultures sont arrêtées lorsque la croissance cellulaire atteint un pallier (DOsoo nm d'environ 3-3,5), avant d'entamer la phase de lyse cellulaire. Lescultures d'E. col/ TOP 10 portant les plasmides pBad DSR-S vardel A3, pBad DSR-S vardel Core et pBad DSR-S Core AA sont menées à 16 C. L'induction est réalisée lorsque la croissance cellulaire atteint une DO600 nm de 0,2, avec 0,005 % (m/v) de L-arabinose dans le cas de DSR-S vardel A3 et 0,02 % (m/v) dans les cas de DSR-S vardel Core et DSR-S Core M. Les cultures sont arrêtées lorsque la croissance cellulaire atteint un pallier (DO600 nm d'environ 2,5), avant d'entamer la phase de lyse cellulaire.
En fin de culture, les cellules sont récupérées par centrifugation (8 000 g, 10 min, 4 C), resuspendues et concentrées à une DO600 nm équivalente à 80 dans un tampon acétate de sodium 50 mM, pH 5,2, supplémenté de 0,05 g/I de CaCl2 et 1 mM de Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF). Le cassage des cellules est effectué par sonication. Les préparations sont ensuite centrifugées à nouveau (20 000 g, 30 min, 4 C) de manière à éliminer les débris cellulaires et ne récupérer que le surnageant de sonication. L'activité enzymatique des extraits est mesurée par la méthode à l'acide dinitrosalicylique (DNS) de Sumner et Howell, 1935 [22]. Une unité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse la formation d'une pmole de fructose par minute à une température donnée (variant de 4 à 40 C selon les cas, plus précisément 20 ou 30 C) et dans un tampon à l'acétate de sodium (50 mM) pH 5,2 comportant 0,05 g/I de CaCl2 et 100 g/l de saccharose.
Exemple 3 : Purification du variant DSR-S vardel 44N Différentes formes enzymatiques de DSR-S vardel MN sont produites lors des cultures d'E. col/ TOP10 : une forme entière largement majoritaire et différentes formes dégradées à l'extrémité C-terminale (figure 7). L'origine de ces dégradations reste incertaine. La production selon l'exemple 2 atteint environ 5 500 U/I de culture dans les surnageants de sonication (dosage d'activité réalisé à 30 C). Afin de déterminer le nombre de formes enzymatiques actives dans les extraits, des gels d'électrophorèses ont été réalisés en conditions natives ou dénaturantes. Après renaturation du gel, celui-ci est incubé sur la nuit à 25 C dans un tampon acétate de sodium 50 mM pH 5,2 supplémenté de 100 g/I de saccharose. Les formes enzymatiques actives synthétisent alors du polymère à l'endroit où elles ont migré dans le gel. L'emploi d'un réactif (le réactif de Schiff) permet alors de colorer spécifiquement les polymères synthétisés par les dextrane-saccharases actives, après oxydation des fonctions alcools primaires du polymère à l'acide periodique, et coloration avec le réactif. Ce type de gel est appelé zymogramme. Dans le cas de DSR-S vardel 44N, ou de son mutant SEV663YDA, seules les deux formes de plus hautes masses molaires ont été détectées comme actives (résultats non montrés). Cependant, seule la forme entière possède à la fois l'étiquette thioredoxine et l'étiquette 6xhis. La présence de l'étiquette 6xhis uniquement sur la forme entière de DSR-S vardel MN a été mise à profit pour purifier l'enzyme par affinité sur résine de nickel (Probond Ni-NTA, Invitrogen).
La purification est réalisée à 4 C. Tous les tampons ont des concentrations de 50 mM d'acétate de sodium, 400 mM de NaCl, différentes concentrations en imidazole et sont ajustées à pH 7,5. La résine est équilibrée avec 8 volumes de tampon ayant une concentration de 40 mM d'imidazole. La fixation est réalisée pendant 2 h avec 7 volumes d'extrait enzymatique supplémenté de 20 mM d'imidazole et ajusté à pH 7,5. La résine est ensuite lavée avec 40 volumes de tampon à 40 mM d'imidazole, 8 volumes à 60 mM et 4 volumes à 100 mM. Enfin, les protéines sont éluées avec 7 volumes de tampon ayant une concentration de 250 mM d'imidazole. Les fractions contenant les protéines de fusion éluées sont mélangées et dialysées sur la nuit à 4 C contre un tampon contenant une concentration de 50 mM d'acétate de sodium pH 5,2 et 0,05 g/l de CaCl2. La concentration en protéine est déterminée par la méthode de microbradford (Bio-rad Laboratories), avec de la BSA (Bovine Serum Albumin) comme standard.
La pureté de la préparation en fin de procédé est estimée à 90 la environ (figure 8). Les protéines de DSR-S vardel MN purifiées ont une très forte tendance à s'agréger entre elles, entraînant la formation de précipités blancs et limitant les rendements obtenus en fin de procédé (tableau 1). Cependant, l'activité spécifique de la préparation a été estimée à 584 U/mg de protéine, ce qui correspond à la meilleure activité spécifique de dextrane-saccharase recombinante décrite. Par comparaison, l'activité spécifique de la DSR-S native (exprimée par L. mesenteroides NRRL B-512F) a été estimée à environ 170 U/mg [24].
Tableau 1. Purification de la DSR-S vardel A4N par chromatographie d'affinité sur résine de nickel. Etape de Volume Activité Protéines Activité Facteur de Rende- conc. spécifique purificatio purification (ml) (U/ml) (mg/1) (U/mg) n 0 ment (%) Surnageants de 150 149.2 9.46 15.7 1 100 sonication 150 67.6 0.25 270.5 17 45.3 Fraction d'élution après dialyse 150 38.2 0.09 424.4 27 25.4 Fraction soluble après élimination des agrégats Exemple 4 : Séquences nucléotidiques et séquences d'acides aminés Les constructions ont été séquencées et les séquences correspondantes apparaissent aux figures 1 à 5.
Exemple 5: Synthèse de dextrane par la DSR-S vardel &4N, comparaison avec la DSR-S de L. mesenteroides NRRL B-512F Des synthèses de dextrane ont été réalisées à partir de DSR-S native de L. mesenteroides NRRL B-512F, de DSR-S recombinante entière (surnageant de sonication) et de DSR-S vardel MN (surnageant de sonication et enzyme purifiée). Conditions de synthèse et analyse des produits formés La DSR-S recombinante entière a été construite sur le même principe que les variants décrits dans l'exemple 1, avec des amorces adéquates pour l'amplification du gène entier. Les cellules d'E. col/ TOP10 portant le plasmide pBad DSR-S ont été cultivées suivant le protocole décrit pour la DSR-S vardel MN (exemple 2). Le surnageant contient trois formes enzymatiques, dont les deux de plus haute masse molaire actives.
La forme de plus haute taille contient la DSR-S dans son intégralité, les deux autres formes sont dégradées en position N- terminale (données non montrées). L'activité de chaque préparation enzymatique a été déterminée à 30 C. Les synthèses de dextranes ont été réalisées à 25 C à partir d'une solution à 100 g/I de saccharose, dans un tampon à 50 mM d'acétate de sodium contenant 0,05 g/I de CaCl2 et avec 1 Unité par ml d'enzyme. L'épuisement progressif en saccharose a été suivi par analyses HPAEC- PAD (voir ci-dessous), et la réaction stoppée après sa consommation totale, par chauffage pendant 5 min à 95 C (dénaturation complète des dextrane-saccharases citées). Les produits formés sont analysés par HPAEC-PAD (High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection) en ce qui concerne les mono-, di- et oligosaccharides, et par HPSEC (High Performance Size Exclusion Chromatography) en ce qui concerne les polysaccharides. Le système HPAEC-PAD comprend une colonne Dionex Carbo-Pack PA100 de 4x250 mm. Un gradient d'acétate de sodium de 6 à 300 mM en 28 min dans une solution de soude à 150 mM est appliqué à un débit de 1 ml/min. La détection est effectuée par ampérométrie en utilisant un module Dionex ED40 avec une électrode en or et une référence de pH Ag/AgCI. Le système HPSEC est constitué de deux colonnes Shodex OH- Pack SB-805 et SB-802.5 en séries, en utilisant 0,45 M de nitrate de sodium + 1% (v/v) d'éthylèneglycol comme solvant, à raison de 0,3 ml/min. Colonnes et précolonnes sont maintenues à 70 C et les échantillons sont filtrés sur filtres 0,45 pm (Sartorius) avant injection. La détection est de type réfractométrique, couplée à un détecteur de diffusion de la lumière (Wyatt) pour la détermination de la masse des dextranes.
34 Les concentrations massiques en glucose, fructose et leucrose (isomère du saccharose) sont déterminées par analyses HPAEC-PAD. Les pourcentages de résidus glucosyle provenant du saccharose incorporé dans le glucose et le leucrose libres sont calculés par la formule : %Gdextrane ù Aire x162/342 saccharoseû10 où Surfacedextrane ff correspond à la surface du pic de dextrane estimée sur le chromatogramme d'HPSEC à la fin de la réaction, et Surfacesaccharose to à celle du pic de substrat initial. En effet, pour une concentration donnée, la 15 surface obtenue par réfractométrie est identique, quel que soit le sucre. La proportion d'unités glucosyle incorporées dans les polymères IMW ou les oligosaccharides pour lesquels la concentration ne peut pas être directement quantifiée par analyses HPAEC-PAD ou HPSEC est déterminée par la formule : 20 % IMW = 100ù /'glucosetf u/Gleucrore-tf %Gdextrane-ttf Les profils d'élution des quatre dextranes obtenus par HPSEC sont présentés figure 9. Différentes populations se distinguent : un premier pic élué à 38 min correspondant au polymère de haute masse molaire (HMW) et un second pic à 75 min correspondant au fructose, glucose, leucrose (5- 25 O-a-D Glucosyl Fructose) et autres oligosaccharides de degré de polymérisation (DP) inférieur à 7, non séparés par le système ou en très faible concentration. Entre ces deux pics principaux, comme indiqué par les perturbations de la ligne de base, des produits de taille intermédiaire (IMW dextranes) sont également présents. Ces composés, allant de tailles très %Gglucose [Saccharose ,,,]x180 /342 se [Saccharose,o] où [Glucosetf] et [Leucrosetf] correspondent aux concentrations finales de glucose et leucrose à la fin de la réaction et [Saccharoseto] à celle du substrat initial (g/I). Le pourcentage de résidus glucosyle incorporés dans le polymère 10 HMW a été déterminé par analyses HPSEC d'après la formule A iredextrane - j [Glucose e] et %G/.' [Leucrosef1 variables, entre 1 000 et 10' Da sont très polydisperses et très peu concentrés, ce qui explique leur faible intensité sur le chromatogramme. Des analyses HPAEC-PAD ont toutefois confirmé leur présence (résultats non montrés).
La quantité relative d'unités glucosyle issues du saccharose et incorporée dans les différents produits est listée tableau 2. Le rendement de synthèse en dextrane HMW représente environ 60 % des unités glucosyle pour chacune des préparations. Le transfert d'unités glucosyle sur l'eau (glucose) ou sur le fructose (leucrose) représente moins de 8 %, alors que la synthèse de dextranes de taille intermédiaire (IMW) compte pour 25 à 32 % des unités glucosyle transférées. Toutes les formes recombinantes de DSR-S ont tendance à synthétiser plus de dextranes de taille intermédiaire. Les analyses HPSEC montrent également que l'enzyme native semble synthétiser deux populations différentes de dextrane, contre une seule pour les enzymes recombinantes. La masse molaire des HMW dextranes a été déterminée par mesure de diffusion de la lumière, et estimée supérieure à 10' g/mol pour tous les échantillons (limite d'exclusion des colonnes utilisées).
Tableau 2. Pourcentage d'unités glucosyle incorporées dans les différents produits issus de synthèses de dextrane à 25 C et 100 g/1 de saccharose, pour les quatre préparations de DSR-S citées. - Glucose Leucrose dextranes dextranes HMW IMW Rel. % HMW (g/mol) 1.5x108 Native DSR-S 4.12 5.80 25.60 64.47 8.88x 10' DSR-S entière 2.32 5.39 29.32 62.96 1.86x 108 DSR-S vardel A4N 2.43 5.90 31.03 60.64 4.87x 10' DSR-S vardel MN 2.33 5.80 32.24 59.62 2.47x 10' purifiée Structure des dextranes formés La structure du dextrane produit par la DSR-S vardel A 4N (purifiée ou non) a été comparée à celles des dextranes synthétisés à partir de DSR-S recombinante entière et de DSR-S native. Ces structures ont été déterminées par Résonance Magnétique Nucléaire (1H NMR) sur Brücker AC 300 à 85 C et pour une fréquence d'acquisition de 300.13 MHz. Les temps d'acquisition ont été de 3 s, avec de 32 à 64 passages. Les dextranes ont d'abord été séparés du fructose co-produit par 3 précipitations avec 1 volume d'éthanol absolu, récupérés par centrifugation, lavés à l'eau distillée et lyophilisés. Les échantillons ont été dissous dans du D2O à la concentration de 6 mg/ml. Les spectres RMN sont présentés figure 10. Seule la présence de liaisons a-1,6 est détectée. Une analyse par RMN du carbone 13 a également été effectuée sur le dextrane synthétisé par la DSR-S vardel A4N purifiée. Le spectre obtenu est identique à ceux publiés pour le dextrane de L. mesenteroides NRRL B-512F et DSR-S entière [3]. Des digestions de ces polymères à l'endodextranase de Chaetomium gracile ont également été réalisées pendant 16 h à 37 C avec 3 unités d'enzyme par ml de milieu de synthèse. Les produits de digestion ont été analysés par HPAEC-PAD (figure 11). Les profils de digestion obtenus sont identiques pour les quatre dextranes analysés, confirmant qu'ils possèdent tous au moins 95 % de liaisons a-1,6. Les délétions effectuées en positions N et C-terminales de la DSRS pour la construction du variant vardel A4N n'ont donc aucune influence significative sur l'activité initiale de DSR-S ou sur la part d'unités glucosyle issues du saccharose incorporées dans la synthèse de dextrane HMW, la taille ou la structure du polysaccharide. Comportement rhéologique des dextranes formés Le comportement rhéologique des quatre dextranes a été analysé à l'aide d'un système cône-plan (AR 1000, TA Instrument) équipé d'un cône de 4 cm de diamètre et d'un angle de 3.59 , et couvrant des gradients de vitesses de 0.01 à 100 s"'. Les mesures ont été effectuées à 25 C. Des expériences dynamiques ont été réalisées dans le domaine linéaire entre 0 et 10 Pa, avec une déformation de 8 % pour le dextrane synthétisé par la DSR-S native de L. mesenteroides NRRL B-512F (contrôle), 3 % pour celui synthétisé par la DSR-S recombinante de taille entière, 5 % pour celui synthétisé par un extrait non purifié de DSR-S vardel A4N et 0,4 % pour celui synthétisé par la DSR-S vardel A4N purifiée. Le module de rigidité complexe est défini par la relation G*(w) = G'(w) + iG"(w). Le module de conservation d'énergie G'(w) est d'autant plus important que l'échantillon est à prédominance élastique ou fortement structurée. Le module de perte G"(w) représente l'énergie dissipée durant la déformation. Les échantillons à prédominance visqueuse ont un G"(w) élevé. Ces analyses rhéologiques montrent des résultats tout à fait originaux (figure 12). Comme décrit dans la littérature, la DSR-S native synthétise un dextrane au comportement Newtonien [25]. Les extraits de DSR-S recombinante entière et de DSR-S vardel A4N non purifiés produisent des solutions visqueuses au comportement identique (viscosité environ 10 fois plus importante que celle du dextrane produit par l'enzyme native). Observées à l'oeil nu, celles-ci présentent également un caractère filant assez prononcé. De plus, après application de nouvelles contraintes de cisaillement, le comportement de ces polymères passe d'un type solution à un type gel, nouvelle propriété identifiée pour ce type de biopolymère. Le dextrane produit par l'enzyme native n'est au contraire pas filant, et son comportement est tout à fait réversible après application d'une deuxième série de contraintes (figure 12A). L'enzyme purifiée, quant à elle, synthétise directement un polymère ayant les propriétés d'un gel fortement structuré (figure 12B, module G' très supérieur à G"), gardant ses caractéristiques pour une gamme de températures allant de 10 C à 70 C (résultats non montrés). Ce comportement est tout à fait différent de celui de l'enzyme native. Seule la préparation de DSR-S vardel A4N purifiée ne contient qu'une dextrane-saccharase active dans l'extrait. La DSR-S native est connue pour être sujette à des problèmes de dégradations protéolytiques [26] et les techniques de purification développées n'ont pas permis de résoudre ce problème [27, 28, 29]. La DSR-S recombinante entière utilisée dans l'essai contient au moins deux formes enzymatiques actives, tout comme la préparation de DSR-S vardel MN avant purification. Entre DSR- S native, DSR-S recombinante entière et DSR-S vardel A4N, les formes dégradées sont toutefois différentes. On suppose aujourd'hui qu'une coopération entre ces différentes formes enzymatiques actives présentes dans le milieu pourrait être à l'origine de modifications sur les chaînes de dextranes, entraînant ces différences de comportement.
Exemple 6 : Synthèse d'isomaltose à partir de saccharose La capacité du mutant DSR-S vardel MN SEV663YDA à ne synthétiser que de l'isomaltose (IMO de DP 2) à partir de saccharose et au détriment des dextranes de haute masse molaire, a été étudiée. Le mutant a été purifié par chromatographe d'affinité suivant la procédure décrite pour la DSR-S vardel MN donnée à l'exemple 3. Le dosage d'activité a été effectué à 30 C. Avec une activité spécifique de 9 U/mg seulement, les mutations SEV663YDA induisent de sévères effets sur l'activité de DSR-S (perte de 98 % de la vitesse initiale de consommation en saccharose). Cette activité spécifique est cependant équivalente à celle de l'amylosaccharase recombinante de N. polysaccharea [32], largement étudiée pour son potentiel applicatif.
Les caractérisations réalisées démontrent la faisabilité de production d'isomaltose par ce mutant de DSR-S, alors que l'enzyme sauvage ne produit que des dextranes de haute masse molaire. Des synthèses ont été réalisées à 25 C dans un tampon contenant une concentration de 50 mM en acétate de sodium pH 5,2 et 0,05 g/I de CaCl2, 1 U/ml d'enzyme purifiée et en utilisant 100 g/I de saccharose comme seul substrat, ou par réaction d'accepteur à partir de 100 g/l de saccharose et 50 g/I de glucose. L'épuisement du saccharose a été suivi par analyses HPAEC-PAD (cf. exemple 4 pour conditions d'analyses) et les réactions interrompues après sa consommation complète. La production d'isomaltose a ainsi atteint un rendement de 47 % à partir de saccharose comme seul substrat (tableau 3 et figure 13), rendement équivalent à celui obtenu par réaction d'accepteur. L'addition d'un accepteur exogène n'est donc pas nécessaire. Des traces d'isomaltotriose, de maltose ou de nigerose (non séparés par le système) sont également identifiées (figure 13), ainsi que la présence d'autres oligosaccharides de DP inférieur à 7 et de structure inconnue.
Tableau 3. Synthèse d'isomaltose par le mutant DSR-S vardel A4N SEV663YDA à partir de 100 g/l de saccharose seul, ou par réaction d'accepteur avec 50 g/I de glucose. Concentration des différents produits présents en fin de réaction. 100 g/1 saccharose 100 g/1 saccharose + 50 g/1 glucose Glucose 16.73 33.14 Fructose 45.95 42.31 Isomaltose 23.99 47.17 Autres 13.33 27.38 oligosaccharides % de résidus glucoses 47.98% 47.17%2 transférés sur 1' isomaltose calculé à partir des résidus glucosyle issus du saccharose et du glucose exogène rajouté au milieu La production d'isomaltose atteint donc dans cet exemple un rendement de 47 %. A ce jour, il s'agit du premier procédé impliquant une seule enzyme pour synthétiser de l'isomaltose à partir de saccharose, les travaux antérieurs étant tous liés à la dégradation de l'amidon par un cocktail d'a-amylases et glycosidases [11], ou à une action conjuguée de dextrane-saccharase et dextranase [30]. De plus, le saccharose est un substrat bon marché et disponible, dont le fructose relargué au cours des synthèses constitue un co-produit dont la valeur peut être exploitée séparément.
Exemple 7 : Synthèse de dextrane par la DSR-S vardel A3 Différentes formes enzymatiques de DSR-S vardel A3 sont produites lors des cultures d'E. coli TOP10 . Toutefois, la forme entière est très largement majoritaire et les zymogrammes réalisés (cf. exemple 3) montrent que seule la forme entière est active. La température optimale d'activité de ce variant est de 20 C. Les dosages d'activité ont donc été réalisés à cette température. La production de DSR-S vardel A3 suivant l'exemple 2 atteint environ 320 U/l de culture. Des synthèses de dextrane ont été réalisées à 20 C, dans du tampon contenant 50 mM d'acétate de sodium pH 5,2 et 0,05 g/I de CaCl2, 100 g/I de saccharose et 1 U/ml d'extrait de DSR-S vardel A3 non purifié. L'extrait de DSR-S vardel A3 peut être purifié par chromatographie d'affinité sur résine de nickel suivant le protocole décrit pour DSR-S vardel A4N dans l'exemple 3. Cependant, le surnageant de sonication ne contenant qu'une seule forme enzymatique de dextrane-saccharase, et E. coli ne produisant pas d'autre enzyme susceptible de consommer du saccharose, la purification du variant ne constitue pas un pré-requis à une caractérisation rigoureuse de ses propriétés. Pour comparaison, des synthèses de dextrane ont été réalisées dans les mêmes conditions avec DSR-S vardel MN (non purifiée). La disparition du saccharose a été suivie par analyses HPAEC-PAD et les réactions stoppées (5 min, 95 C) après son épuisement total. Les produits synthétisés ont été analysés et quantifiés par HPAEC- PAD et HPSEC suivant les conditions décrites dans l'exemple 4. Pour les analyses HPSEC, la taille des dextranes est estimée à l'aide de dextranes commerciaux de taille 2.106, 503.103, 70 000, 10 000 Da, de maltoheptaose et de glucose (Sigma). Comme attesté figure 13, le variant DSR-S vardel L3 synthétise à 20 C deux populations de polymères. Une population majoritaire de HMW dextrane de taille supérieure à 2. 106 Da, représentant environ 39 % des résidus glucosyle issus du saccharose (tableau 4) et une seconde population allant de 1 300 à 52 000 Da, centrée sur 10 000 Da (environ 25 % des résidus glucosyle). C'est la première fois qu'une deuxième population de dextrane clairement visible sur chromatogramme HPSEC a été mise en évidence pour un variant de DSR-S. Effet de la température sur le profil des produits Des synthèses de dextranes ont également été réalisées à une température de 10 C, toujours avec un tampon contenant 50 mM d' acétate de sodium pH 5,2 et 0,05 g/I de CaCl2 et 1 U/ml d'enzyme (selon activité dosée à 20 C). L'épuisement en saccharose a été suivi par analyses HPAEC-PAD et les réactions stoppées (5 min, 95 C) après sa consommation totale. Comme attesté figure 14 le variant DSR-S vardel A3 synthétise à 10 C une population de dextrane très différente de celle produite à 20 C. Le polymère majoritairement formé (environ 44 %) à cette température a une masse molaire comprise entre 7 000 et 1,7.105 Da centrée autour de 40 000 Da. Tableau 4. Pourcentage d'unités glucosyle incorporées dans les différents produits synthétisés par DSR-S vardel 44N et DSR-S vardel A3 à 10 et 20 C à partir de 100 g/1 de saccharose.
DSR-S vardel DSR-S vardel A3 MN 20 C 10 C 20 C 10 C HMW dextrane 55.2 37.1 39.2 8.8 >2.106Da Dextrane nd' nd nd 43.9 40,000 Da Dextrane 18.2 14.7 24.8 nd 10,000 Da Oligosaccharides 16.2 39.1 27.3 36.7 de DP <82 9.2 7.6 5.3 9.3 Leucrose Glucose 1.2 1.5 3.4 1.3 : nd = non détecté 2: degré de polymérisation calculé à partir du temps de rétention estimé à la limite inférieure du pic de dextrane 10 000 Da.
Effet de la concentration en saccharose Quatre concentrations croissantes en saccharose ont été testées (100, 150, 200 et 250 g/I), pour des synthèses de dextranes réalisées à 20 C et 10 C avec DSR-S vardel A3 (1 U/ml). La consommation totale du saccharose a été suivie par analyses HPAEC-PAD et les synthèses arrêtées après sa consommation totale (moins de 48 h). Pour les deux températures, l'augmentation initiale de la concentration en substrat favorise la synthèse des dextranes de faible masse molaire. A 20 C, la synthèse de dextrane de 10 000 Da passe ainsi d'un rendement de 25 à 48 % en passant de 100 à 250 g/I de saccharose initial. A 10 C et à partir de 250 g/l, la synthèse de dextranes HMW est complètement abolie, et celle de dextrane dont la population majoritaire est de masse molaire centrée sur 40 000 Da atteint un rendement avantageux de 69 %. Pour tous les dextranes synthétisés par DSR-S vardel A3, à 10 et 20 20 C, et à partir de 100 jusqu'à 250 g/1 de saccharose, les profils de digestion à l'endodextranase (cf. exemple 5) réalisés ont confirmé que la spécificité de liaison de DSR-S était inchangée (mêmes profils d'oligosaccharides détectés par HPAEC-PAD qu'avec DSR-S vardel A4N, donc au moins 95 % de liaison a-1,6).
Exemple 8 : Synthèse de dextrane par les DSR-S vardel Core et DSR-S Core AA Les variants DSR-S vardel Core et DSR-S Core AA sont également légèrement dégradés lors de l'expression par E. col/ TOP suivant les conditions décrites dans l'exemple 2. Cependant, comme pour le variant DSR-S vardel A3, seule la forme entière, très largement majoritaire, est active d'après zymogramme (résultats non montrés). La température optimale d'activité de ces variants est également de 15 20 C. Les productions atteignent alors 38 et 180 U/l de culture pour DSR-S vardel Core et DSR-S Core AA respectivement. Des synthèses de dextranes ont été réalisées à 20 et 10 C, pour de 100 à 250 g/I de saccharose, dans du tampon contenant 50 mM d'acétate de sodium pH 5,2 et 0,05 g/I CaCl2 et 1 U/ml d'extrait 20 enzymatique (non purifié). La consommation du saccharose a été suivie par analyses HPAEC-PAD et les synthèses arrêtées (5 min, 95 C) après son épuisement complet (moins de 48 h). Les produits formés ont été analysés par HPAEC-PAD et HPSEC, et leur concentration quantifiée suivant l'exemple 5. 25 La figure 15 montre le profil de produits synthétisés à 20 C par les deux variants (chromatogramme HPSEC). On y voit clairement qu'avec ces variants, et contrairement aux DSR-S vardel MN et DSR-S vardel A3, la population majoritaire de dextrane formé est de masse molaire avoisinant 10 000 Da, dont la base du pic est entre 1 300 et 52 000 Da (à mihauteur entre 5 000 et 22 000). Avec le variant DSR-S Core AA, la synthèse de dextrane HMW est d'ailleurs complètement abolie (tableau 5). Une diminution de la température à 10 C permet d'augmenter les rendements de synthèse en dextrane de -10 000 Da, sans différence significative de taille comme dans le cas de DSR-S vardel A3 (tableau 5).
La synthèse de dextrane avec le variant DSR-S vardel Core AA atteint ainsi un rendement de 75 %. Un rendement équivalent est obtenu avec le variant DSR-S vardel Core lorsque la concentration initiale en saccharose est de 250 g/I (résultats non montrés).
Tableau 5. Pourcentage d'unités glucosyle incorporées dans les différents produits synthétisés par DSR-S vardel Core et DSR-S Core AA à 10 et 20 C à partir de 100 g/1 de saccharose. DSR-S vardel MN DSR-S vardel Core DSR-S Core AA 20 C 10 C 20 C 10 C 20 C 10 C HMW dextrane 55.2 37.1 9.9 2.4 nd nd >2.106Da Dextrane 18.2 14.7 57.5 62.5 64.4 74.5 10,000 Da Oligosaccharides 16.2 39.1 19.6 14.8 19.8 10.0 of DP <82 9.2 7.6 6.5 10.2 12.7 12.8 Leucrose Glucose 1.2 1.5 6.5 10.1 3.1 2.7 : nd = non détecté 2: degré de polymérisation calculé à partir du temps de rétention estimé à 15 la limite inférieure du pic de dextrane 10 000 Da. L'analyse HPAEC-PAD du dextrane synthétisé à partir de 100 g/I de saccharose à 20 C par les différents variants montre la très grande polydispersité du produit (figure 16), contenant des 20 isomaltooligosaccharides de DP 2 à environ DP 60 pour le DSR-S Core AA notamment. Pour tous les dextranes synthétisés par DSR-S vardel Core et DSR-S CoreAA, à 10 et 20 C, et de 100 et jusqu'à 250 g/I de saccharose, les profils de digestion à l'endodextranase (cf. exemple 5) réalisés ont confirmé que la spécificitéde liaison de DSR-S est inchangée (mêmes profils d'oligosaccharides détectés par HPAEC-PAD qu'avec DSR-S vardel A4N, donc au moins 95 % de liaison a-1,6).
Exemple 9 : Réaction d'accepteur avec du glucose Des réactions d'accepteur ont été réalisées à 20 C avec un rapport Saccharose/Glucose = 2 (100 g/I de saccharose, 50 g/I de glucose), 1 U/ml d'extrait de DSR-S vardel 44N, DSR-S vardel 43, DSR-S vardel Core et DSR-S Core AA dans un tampon contenant 50 mM d'acétate de sodium pH 5,2 et 0,05 g/I de CaCl2. La consommation totale du saccharose a été suivie par HPAEC-PAD et les réactions arrêtées après son épuisement total. Tous les variants synthétisent alors des isomaltooligosaccharides (IMO) de DP allant de 2 à environ 30 au détriment de la synthèse de polymère de plus haut DP. Cependant, les rendements obtenus sont plus élevés pour les variants tronqués d'unités A. Ainsi, la production d'IMO atteint 52 % dans le cas de DSR-S vardel 43 et 58 % pour DSR-S vardel Core et DSR-S Core M, contre 47 % dans le cas de DSR-S vardel MN. La distribution des oligosaccharides est également modifiée (figure 17). Pour DSR-S vardel 43, la proportion d'IMO de DP 2 à DP 15 est inférieure à celle des produits synthétisés par DSR-S vardel MN. Cette situation est inversée pour les IMO de DP supérieur à 15.
De même, les mutants DSR-S vardel Core et DSR-S Core AA s'avèrent bien plus performants pour la synthèse d'IMO de DP élevé que DSR-S vardel MN ou la DSR-S native (DP 2 à 15 essentiellement) : la production d'IMO de DP 12 à DP 27 est de deux à 5 fois plus importante avec ces deux variants (d'après les rapports d'aires obtenus par HPAEC- PAD).
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Claims (39)
1. Séquence nucléotidique consistant essentiellement en une séquence nucléotidique selon la figure 1 (SEQ ID NO:1), une séquence nucléotidique selon la figure 2 (SEQ ID NO:2), une séquence nucléotidique selon la figure 3 (SEQ ID NO:3), une séquence nucléotidique selon la figure 4 (SEQ ID NO:4), une séquence nucléotidique selon la figure 5 (SEQ ID NO:5), une séquence complémentaire de l'une des séquences ID NO:2, 3, 4 ou 5 ou une séquence qui s'hybride en une séquence ID NO:2, 3, 4 ou 5 dans des conditions d'hybridation stringentes à la condition qu'elle conserve l'activité enzymatique dextrane-saccharase.
2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, consistant essentiellement en une séquence nucléotidique choisie parmi le fragment de la séquence SEQ ID NO:1 allant de la position 373 à la position 4269, le fragment de la séquence SEQ ID NO:2 allant de la position 373 à la position 4005, le fragment de la séquence SEQ ID NO:3 allant de la position 373 à la position 3408, le fragment de la séquence SEQ ID NO:4 allant de la position 373 à la position 3018 et le fragment de la séquence SEQ NO:5 d'un nucléotide à la position 373 à la position 4269.
3. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou 2 consistant essentiellement en une séquence nucléotidique choisie parmi une séquence nucléotidique complémentaire du fragment de SEQ ID NO:1 allant du nucléotide de la position 373 à celui de la position 4269, une séquence nucléotidique complémentaire du fragment de SEQ ID NO:2 allant du nucléotide de la position 373 à celui de la position 4005, une séquence nucléotidique complémentaire du fragment de SEQ ID NO:3 allant du nucléotide de la position 373 celui de la position 3408, une séquence nucléotidique complémentaire du fragment de SEQ ID NO:4 allant du nucléotide de la position 373 à celui de la position 3018 et une séquence nucléotidique complémentaire du fragment de SEQ ID NO:5 allant du nucléotide de la position 373 à celui de la position 4269. 51
4. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la séquence nucléotidique s'hybride en conditions stringentes en une séquence nucléotidique choisie parmi le fragment de la séquence SEQ ID NO:1 allant de la position 373 à la position 4269, le fragment de la séquence SEQ ID NO:2 allant de la position 373 à la position 4005, le fragment de la séquence SEQ ID NO:3 allant de la position 373 à la position 3408, le fragment de la séquence SEQ NO:4 allant de la position 373 à la position 3018 et le fragment de la séquence SEQ ID NO:5 allant de la position 373 à la position 4269, à la condition qu'elle conserve l'activité enzymatique dextrane-saccharase.
5. Séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle est identique au moins pour 70 % à un fragment tel que défini dans l'une des revendications 2 ou 3.
6. Séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle est 15 identique au moins pour 80 %, de préférence 90 %, à un fragment tel que défini dans l'une des revendications 2 ou 3.
7. Vecteur contenant une séquence d'acides nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 6.
8. Vecteur selon la revendication 7, qui est un plasmide. 20
9. Vecteur selon la revendication 7 ou 8, comportant une séquence d'acides nucléiques codant pour une enzyme variant de l'enzyme dextrane-saccharase choisie parmi DSR-S vardel A4N, DSR-S vardel A3, DSR- S vardel Core, DSR-S Core AA et DSR-S vardel MN mutant SEV663YDA. 25
10. Cellules hôtes transformées par un vecteur selon l'une des revendications 7 à 9.
11. Protéine encodée par l'une des séquences nucléotidiques SEQ ID NO:1 à SEQ ID NO:5 ou les fragments desdites séquences, selon l'une des revendications 1 à 6.
12. Dextrane-saccharase tronquée et/ou mutée consistant essentiellement en l'une des séquences choisie parmi SEQ ID NO:6 à SEQ ID NO:10 à la condition qu'elle conserve son activité enzymatique.
13. Dextrane-saccharase selon la revendication 12 consistant essentiellement en une séquence d'acides aminés choisie parmi le fragment de SEQ ID NO:6 allant de l'acide aminé en position 125 à l'acide aminé en position 1423, le fragment de SEQ ID NO:7 allant de l'acide aminé en position 125 à l'acide aminé en position 1335, le fragment de SEQ ID NO:8 allant de l'acide aminé en position 125 à l'acide aminé en position 1136, le fragment de SEQ ID NO:9 allant de l'acide aminé en position 125 à l'acide aminé en position 1006 et le fragment de SEQ ID NO:10 allant de l'acide aminé en position 125 à l'acide aminé en position 1423.
14. Protéine de fusion comportant, à la position N-terminale et/ou à la position C-terminale, des marqueurs protéiques des séquences d'acides aminés choisies parmi le fragment de SEQ ID NO:6 allant de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1423, le fragment de SEQ ID NO:7 allant de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1335, le fragment de SEQ ID NO:8 allant de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1136, le fragment de SEQ ID NO:9 allant de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1006 et le fragment de SEQ ID NO:10 allant de l'acide aminé à la position 125 à l'acide aminé à la position 1423.
15. Protéine de fusion selon la revendication 14, dans laquelle le marqueur protéique est une thiorédoxine située à l'extrémité N-terminale.
16. Protéine de fusion selon la revendication 14 ou 15, dans laquelle le marqueur protéique est une étiquette 6xhis située à l'extrémité C-terminale.
17. Procédé de préparation de dextrane-saccharase mutée et/ou 30 tronquée comportant les étapes de :(a) culture de cellules hôtes selon la revendication 10 dans des conditions permettant l'expression d'une dextrane-saccharase et (b) isolement de ladite dextrane-saccharase du milieu de culture.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape de purification de la dextrane-saccharase isolée.
19. Procédé de production de dextranes et/ou d'isomaltooligosaccharides de masse molaire contrôlée comportant la réaction d'une dextrane-saccharase tronquée et/ou mutée consistant essentiellement en une séquence choisie parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID NO:6 à NO:10 de la revendication 12 ou 13 avec au moins du saccharose et éventuellemnt au moins un accepteur.
20. Procédé selon la revendication 19, dans lequel la réaction a lieu en présence d'au moins un accepteur choisi parmi le glucose, le maltose, l'isomaltose, le fructose, les isomaltooligosaccharides et leurs mélanges, de préférence le maltose, l'isomaltose et/ou le glucose.
21. Procédé selon la revendication 19, pour la production d'isomaltose, le procédé comportant la réaction d'une dextrane-saccharase consistant essentiellement en la séquence SEQ ID NO:10 avec essentiellement du saccharose.
22. Procédé selon l'une des revendications 19, 20 ou 21, caractérisé en ce que la réaction a lieu à des températures comprises entre 4 C et 80 C, de préférence 4 C et 40 C.
23. Procédé selon la revendication 19 ou 20, caractérisé en ce que ladite séquence est SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:9 et la température est comprise entre 4 C et 15 C, de préférence 8 C et 12 C.
24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que la température est de l'ordre de 10 C.
25. Procédé selon l'une des revendications 19 à 24, caractérisé en ce que ladite séquence est SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NO:10 et la température est comprise entre 15 C et 45 C, de préférence 17 C et 30 C.
26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que la température ést de l'ordre de 20 C à 25 C.
27. Procédé selon l'une des revendications 20 à 26, caractérisé en ce que la concentration en saccharose est comprise entre 10 et 600 g/I, de préférence 75 et 400 g/l, de façon préférée 90 à 280 g/I.
28. Procédé selon l'une des revendications 19, 20 et 22 à 27, caractérisé en ce que ladite séquence est SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:9 et la concentration du saccharose est de l'ordre de 250 g/I.
29. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que ladite séquence est SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO :10 et la concentration du saccharose de l'ordre de 100 g/I.
30. Procédé selon l'une des revendications 19 à 29, caractérisé en ce que la dextrane-saccharase est sous forme libre ou immobilisée sur support , par adsorption, inclusion ou liaison covalente.
31. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 30, caractérisé en ce que le pH est compris entre 3,0 et 10,0, de préférence 4,5 et 6,0, de façon préférée environ 5,2.
32. Dextrane susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 19 à 31, au comportement non newtonien.
33. lsomaltooligosaccharides susceptibles d'être obtenus par le procédé selon l'une des revendications 19 à 31.
34. Composition comportant un dextrane ou IMO obtenu par l'entremise d'une dextrane-saccharase selon la revendication 12 ou 13 ou obtenue par un procédé de la revendication 17 ou 18 ou obtenu par un procédé selon l'une des revendications 19 à 31 ou un dextrane selon la revendication 32 ou un isomaltooligosaccharide selon la revendication 33.
35. Composition pharmaceutique ou alimentaire comportant un dextrane ou 1MO obtenu par l'entremise d'une dextrane-saccharase selonla revendication 12 ou 13 ou obtenue par un procédé de la revendication 17 ou 18 ou obtenu par un procédé selon l'une des revendications 19 à 31 ou un dextrane selon la revendication 32 ou un isomaltooligosaccharide selon la revendication 33 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable ou alimentaire.
36. Composition texturante caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un dextrane obtenu par l'entremise d'une dextrane-saccharase selon la revendication 12 ou 13 ou obtenue par un procédé de la revendication 17 ou 18 ou obtenu' par un procédé selon l'une des revendications 19 à 31.
37. Utilisation d'une dextrane-saccharase de la revendication 12 ou 13 ou obtenue par un procédé de la revendication 17 ou 18, dans un procédé de fabrication (i) d'isomaltose (342 Da), (ii) d' isomaltooligosaccharides de 342 à 5 000 Da, (iii) des dextranes de taille contrôlée allant de 1 300 à 52 000 Da et centrés autour de 10 000 Da, (iv) des dextranes de taille contrôlée allant de 7 000 à 1,7.105 Da et centrés autour de 40 000 Da et (v) des dextranes de haute masse molaire allant de 2.106 Da à 109 Da ou un dextrane ou IMO obtenu par un procédé selon l'une des revendications 19 à 31.
38. Utilisation d'un dextrane selon la revendication 32 en tant qu'agent texturant.
39. Utilisation d'un dextrane ou IMO selon la revendication 32 ou 33 en tant que prébiotique, notamment un dextrane de taille contrôlée allant de 1 300 à 52 000 Da et centré autour de 10 000 Da.25
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