FR2877674A1 - MODEL ANIMALS COMPRISING AT LEAST ONE TRANSGENE AND A SEQUENCE PERMITTING CONTROLLED EXPRESSION OF AN INTERFERING RNA WITH SAID TRANSGENE - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une combinaison de séquences d'ADN permettant de développer des animaux modèles comprenant d'une part une modification de son génome afin d'introduire un nouveau gène pour être exprimé dans les animaux modèles, en particulier un gène d'origine humaine et d'autre part une expression contrôlée d'un RNA interférant avec ledit nouveau gène.The present invention relates to a combination of DNA sequences making it possible to develop model animals comprising on the one hand a modification of its genome in order to introduce a new gene to be expressed in model animals, in particular a gene of human origin. and on the other hand a controlled expression of an RNA interfering with said new gene.
Description
Animaux modèles comprenant au moins un transgène et une séquenceModel animals comprising at least one transgene and one sequence
permettantallowing
l'expression contrôlée d'un RNA interférant avec ledit transgène La présente invention concerne une combinaison de séquences d'ADN permettant de développer des animaux modèles comprenant d'une part une modification de son génome afin d'introduire un nouveau gène pour être exprimé dans les animaux modèles, en particulier un gène d'origine humaine et d'autre part une expression contrôlée d'un RNA interférant avec ledit nouveau gène. The present invention relates to a combination of DNA sequences making it possible to develop model animals comprising, on the one hand, a modification of its genome in order to introduce a new gene to be expressed in a gene. model animals, in particular a gene of human origin and secondly a controlled expression of an RNA interfering with said new gene.
La combinaison de séquences ADN selon l'invention permet de réaliser sur le même modèle animal plusieurs opérations nécessitant autrefois le développement et l'usage de plusieurs modèles distincts. Il permet par exemple, d'étudier avec le même modèle le phénotype obtenu par l'expression d'un transgène donné, puis d'observer le phénotype obtenu en exprimant le RNA interférant de manière contrôlée spatialement et/ou temporellement, c'est-à-dire en inhibant localement la traduction du RNAm du transgène exprimé. The combination of DNA sequences according to the invention makes it possible to carry out on the same animal model several operations that formerly required the development and use of several distinct models. It allows, for example, to study with the same model the phenotype obtained by the expression of a given transgene, then to observe the phenotype obtained by expressing the interfering RNA in a spatially and / or temporally controlled manner, that is, that is, by locally inhibiting the translation of the RNAm of the expressed transgene.
La combinaison de séquences d'ADN selon l'invention comprend une première séquence (Si) et une deuxième séquence (S2) destinées à être insérés dans l'ADN génomique d'une cellule eucaryote d'un organisme hôte. The combination of DNA sequences according to the invention comprises a first sequence (Si) and a second sequence (S2) intended to be inserted into the genomic DNA of a eukaryotic cell of a host organism.
Par séquence d'ADN on entend selon l'invention une molécule d'ADN constituée 20 par une séquence d'acides désoxyribonucléiques liés de manière covalente. By DNA sequence is meant according to the invention a DNA molecule consisting of a sequence of deoxyribonucleic acids linked covalently.
Pour la combinaison selon l'invention, les première et deuxième séquences S1 et S2 sont supportées soit sur deux vecteurs, soit sur un même vecteur, soit encore dans le génome d'au moins une cellule eucaryote d'un organisme hôte. For the combination according to the invention, the first and second sequences S1 and S2 are supported either on two vectors, or on the same vector, or again in the genome of at least one eukaryotic cell of a host organism.
Par cellule eucaryote, on entend plus particulièrement selon l'invention toutes cellules d'origine animale, à l'exception de l'homme, en particulier les cellules de mammifères, préférentiellement de mammifères rongeurs, plus préférentiellement de rat ou de souris. By eukaryotic cell is meant more particularly according to the invention all cells of animal origin, with the exception of humans, in particular mammalian cells, preferably rodent mammals, more preferably rat or mouse.
La première séquence S1 de la combinaison selon l'invention comprend, dans le sens 5'-3', les éléments suivants Un premier site SR1 de reconnaissance d'une première recombinase R1 - Un acide nucléique hétérologue et - Un deuxième site SRI de reconnaissance d'une première recombinase R1 La deuxième séquence S2 de la combinaison selon l'invention comprend, dans le sens 5'-3', les éléments suivants Une séquence d'acide nucléique comprenant une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans la cellule eucaryote dans le génome de laquelle elle sera intégrée Un premier site SR2 de reconnaissance d'une recombinase R2, une séquence d'acide nucléique comprenant une séquence d'arrêt de la transcription 5 Un second site SR2 de reconnaissance de la recombinase R2, et Une séquence d'acide nucléique codant pour un RNA interférant avec le RNAm produit de l'expression de l'acide nucléique hétérologue de la séquence S1, lié de manière fonctionnelle avec une séquence d'arrêt de la transcription. The first sequence S1 of the combination according to the invention comprises, in the 5'-3 'direction, the following elements: a first recognition site SR1 of a first recombinase R1 - a heterologous nucleic acid and - a second recognition site SRI The second S2 sequence of the combination according to the invention comprises, in the 5'-3 'direction, the following elements: A nucleic acid sequence comprising a promoter regulatory sequence functional in the eukaryotic cell in the A first SR2 recognition site of a recombinase R2, a nucleic acid sequence comprising a transcription termination sequence A second SR2 recognition site of the recombinase R2, and a sequence of nucleic acid encoding RNA interfering with RNAm produces expression of the heterologous nucleic acid of sequence S1, operably linked to a sequence stopping the transcription.
De manière préférentielle, la séquence d'acide nucléique comprenant une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans la cellule eucaryote dans le génome de laquelle elle sera intégrée est choisie parmi les promoteurs forts, plus préférentiellement des promoteurs Pol III. Preferably, the nucleic acid sequence comprising a promoter regulatory sequence functional in the eukaryotic cell in the genome from which it will be integrated is selected from strong promoters, more preferably Pol III promoters.
De manière préférentielle, le RNA interférant selon l'invention est un RNA antisens, un miRNAi, un shRNAi ou un siRNAi. Preferably, the interfering RNA according to the invention is an antisense RNA, a miRNAi, a shRNAi or a siRNAi.
De manière préférentielle, l'acide nucléique hétérologue de la première séquence S1 comprend un acide nucléique codant pour un polypeptide d'intérêt, en particulier un ADNc, plus préférentiellement un ADNc codant pour un polypeptide d'origine humaine. L'acide nucléique hétérologue codant pour un polypeptide d'intérêt peut être intégré par des méthodes usuelles permettant de remplacer le gène correspondant de l'organisme hôte. Preferably, the heterologous nucleic acid of the first S1 sequence comprises a nucleic acid encoding a polypeptide of interest, in particular a cDNA, more preferably a cDNA encoding a polypeptide of human origin. The heterologous nucleic acid encoding a polypeptide of interest can be integrated by customary methods to replace the corresponding gene of the host organism.
Le gène d'intérêt peut également comprendre une mutation par rapport à un gène cible de l'organisme hôte, sont intégration ciblée permettant d'introduire la mutation dans ledit gène cible. The gene of interest may also comprise a mutation relative to a target gene of the host organism, are targeted integration for introducing the mutation into said target gene.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'acide nucléique hétérologue de la première séquence S1 comprend un acide nucléique codant pour un polypeptide d'intérêt fusionné à un acide nucléique codant pour un polypeptide marqueur de sélection ou une polypeptide rapporteur, les deux acides nucléiques étant avantageusement séparés par une séquence de reprise de la traduction (IRES). Cette variante permet d'exprimer de manière concomitante avec substantiellement un même niveau d'expression le polypeptide d'intérêt et le polypeptide marqueur. Ainsi, la quantification du niveau d'expression du polypeptide d'intérêt peut être effectuée dans le temps et dans l'espace, permettant d'évaluer rapidement les effets de l'expression contrôlée du RNA interférant sur ladite expression. According to a particular embodiment of the invention, the heterologous nucleic acid of the first sequence S1 comprises a nucleic acid coding for a polypeptide of interest fused to a nucleic acid coding for a selection marker polypeptide or a reporter polypeptide. two nucleic acids being advantageously separated by a sequence of recovery of the translation (IRES). This variant makes it possible to express concomitantly with substantially the same level of expression the polypeptide of interest and the marker polypeptide. Thus, the quantification of the level of expression of the polypeptide of interest can be carried out in time and in space, making it possible to rapidly evaluate the effects of the controlled expression of the interfering RNA on said expression.
Parmi les séquences codant pour un polypeptide d'intérêt, on peut citer une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide est un ADNc, plus préférentiellement un ADNc codant pour un polypeptide d'origine humaine. On citera notamment ceux décrits dans Li, et al. ((1997). J Cell Biol 139, 129-44), Schneider-Maunoury et al. ((1993). Cell 75, 1199-214) et Tajbakhsh et al. ((1996) Nature 384, 266-70). Among the sequences encoding a polypeptide of interest, there may be mentioned a nucleic acid sequence encoding a polypeptide is a cDNA, more preferably a cDNA encoding a polypeptide of human origin. These include those described in Li, et al. ((1997) J. Cell Biol 139, 129-44), Schneider-Maunoury et al. ((1993) Cell 75, 1199-214) and Tajbakhsh et al. ((1996) Nature 384, 266-70).
Les gènes codant pour un marqueur de sélection fonctionnel dans les cellules animales sont également bien connus de l'homme du métier. On citera notamment Yagi et al., (1990, PNAS, 87, 9918-22). Les gènes de sélection positive sont bien connus de l'homme du métier et sont préférentiellement des gènes de résistance à un antibiotique, tel les gènes de résistance à la kanamycine, qui permet également la résistance à la néomycine dans les cellules mammifères, résistance à l'hygromycine, à la zéocine, à la blasticidine... Genes encoding a functional selection marker in animal cells are also well known to those skilled in the art. Yagi et al., (1990, PNAS, 87, 9918-22). Positive selection genes are well known to those skilled in the art and are preferably antibiotic resistance genes, such as kanamycin resistance genes, which also allows resistance to neomycin in mammalian cells, resistance to hygromycin, zeocin, blasticidine ...
De manière préférentielle, la séquence d'acide nucléique codant pour une séquence d'intérêt dans la séquence Si comprend, liés de manière fonctionnelle, des éléments fonctionnels nécessaires à l'initiation de la transcription et/ou des éléments fonctionnels nécessaires à l'arrêt de la transcription. Preferably, the nucleic acid sequence coding for a sequence of interest in the Si sequence comprises, functionally linked, the functional elements necessary for initiating the transcription and / or the functional elements necessary for stopping. transcription.
Parmi les éléments nécessaires à l'initiation de la transcription, on peut citer ceux décrits notamment dans Baker et al ((1972) J Mol Biol.; 69:89-102.) et dans Georgiev GP.((1972) Curr Top Dev Biol. 7, 1-60). Among the elements necessary for the initiation of transcription are those described in particular in Baker et al ((1972) J Mol Biol, 69: 89-102.) And in Georgiev GP ((1972) Curr Top Dev Biol., 7, 1-60).
Les séquences d'arrêt de la transcription dans les cellules eucaryotes sont bien connues de l'homme du métier. On citera notamment les séquences décrites notamment dans Proudfoot et al (Cell. (1991) 64,:671-4) et dans Beaudoing et al. (Genome Res. (2001) 11, 520-526). Transcription termination sequences in eukaryotic cells are well known to those skilled in the art. The sequences described in particular in Proudfoot et al (Cell (1991) 64, 671-4) and in Beaudoing et al. (Genome Res (2001) 11, 520-526).
Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, les séquences S 1 et S2 sont supportées par un même vecteur, la séquence S1 étant préférentiellement en amont de la séquence S2.. In a particular embodiment of the invention, the sequences S 1 and S 2 are supported by the same vector, the sequence S 1 being preferably upstream of the sequence S 2.
De manière avantageuse, les sites de reconnaissance de recombinases SR1 et SR2 sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, parmi les sites Lox P, Lox P modifiés et FRT. Advantageously, the SR1 and SR2 recombinase recognition sites are chosen, independently of one another, from the modified Lox P, Lox P and FRT sites.
Les sites SRI et SR2 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi les sites LoxP, LoxP modifiés et FRT. De préférence, les sites de reconnaissances SR1 et SR2. The SRI and SR2 sites are chosen independently of each other among the modified LoxP, LoxP and FRT sites. Preferably, the recognition sites SR1 and SR2.
Les combinaisons préférées sont représentées sur le tableau ci-dessous. 30 SR1 SR2 FRT LoxP LoxP FRT En fonction des sites de reconnaissance choisis, les recombinases R1 ou R2 sont choisies, indépendamment l'une de l'autre, parmi les recombinases suivantes: Cre ou FLP. The preferred combinations are shown in the table below. According to the chosen recognition sites, the R1 or R2 recombinases are chosen, independently of one another, from the following recombinases: Cre or FLP.
Les sites de reconnaissance Lox P, Loi: P modifié, FRT et les recombinases Cre et FLP correspondantes sont bien connus de l'homme du métier, notamment décrits dans Kilby, et al. ((1993). Trends Genet 9, 413- 21), Sauer, et Henderson ((1988). Proc Natl Acad Sci U S A 85, 5166-70), Gu et al. ((1994). Science 265, 103-6), Cohen-Tannoudjiet Babinet ((1998). Mol Hum Reprod 4, 929-38), Shibata, et al. ((1997). Science 278, 120-3), Schlake et Bode ((1994). Biochemistry 33, 12746-51). The Lox P, Loi: P modified recognition sites, FRT and the corresponding Cre and FLP recombinases are well known to those skilled in the art, in particular described in Kilby, et al. ((1993), Trends Genet 9, 413-21), Sauer, and Henderson ((1988) Proc Natl Acad Sci U S A 85, 5166-70), Gu et al. ((1994) Science 265, 103-6), Cohen-Tannoudjiet Babinet ((1998) Mol Hum Reprod 4, 929-38), Shibata, et al. ((1997) Science 278, 120-3), Schlake and Bode ((1994), Biochemistry 33, 12746-51).
Les recombinases peuvent être délivrées de façon ubiquitaires ou tissue spécifique. The recombinases can be delivered ubiquitously or in a specific tissue.
Parmi les moyens permettant une telle délivrance tissus spécifique, on citera en particulier la délivrance de vecteurs viraux, virus ou rétrovirus, permettant l'expression de la recombinase R2 de manière tissusspécifique, l'injection des recombinases de manière tissus spécifique ou encore le croisement des animaux selon l'invention avec des animaux modèles comprenant des éléments permettant l'expression de la recombinase R2 de manière tissus spécifique. Among the means allowing such specific tissue delivery, mention will be made in particular of the delivery of viral vectors, viruses or retroviruses, allowing the expression of recombinase R2 in a tissue-specific manner, the injection of recombinases in a specific tissue or the cross-linking of animals according to the invention with model animals comprising elements allowing the expression of recombinase R2 in a specific tissue manner.
L'expression de la recombinase R2 de manière tissus spécifique au moyen de vecteurs viraux peut être réalisée comme suit: Un virus d'expression de la recombinase d'intérêt est préparé et purifié selon les méthodes classiques de préparation virales, bien connues de l'homme du métier. Le virus est alors injecté par stéréotaxie dans la région d'intérêt, par exemple la région cérébrale d'intérêt. La dose de virus ainsi que le nombre d'injection sont des paramètres permettant d'obtenir un nombre de cellules hôtes excisées croissant ainsi qu'une diffusion géographique accrue. The expression of the recombinase R2 in tissue-specific manner by means of viral vectors can be carried out as follows: An expression virus of the recombinase of interest is prepared and purified according to the standard methods of viral preparation, which are well known to the patient. skilled person. The virus is then injected by stereotaxis into the region of interest, for example the brain region of interest. The dose of virus as well as the number of injection are parameters making it possible to obtain an increasing number of excised host cells as well as an increased geographical spread.
L'utilisation de systèmes d'inhalation pour les poumons, d'injection IV pour le foie et les épithéliums et d'injection anaux pour le colon sont d'autres exemples de mode 25 d'administration. The use of lung inhalation systems, IV injection for the liver and epithelium, and anal injection for the colon are other examples of the mode of administration.
Lorsque l'on dispose d'un modèle animal exprimant la recombinase R2 de manière tissus spécifique, il est possible d'obtenir un animal exprimant séquence d'intérêt de manière tissus spécifique par son croisement avec l'animal modèle selon l'invention. When an animal model expressing the recombinase R2 is available in tissue-specific manner, it is possible to obtain an animal expressing a tissue-specific sequence of interest by its crossing with the model animal according to the invention.
De tels modèles animaux exprimant une recombinase de manière tissus spécifique sont bien connus de l'homme du métier, décrits notamment dans Xu et al. ((1999). Nat Genet 22, 37-43), Shibata, et al. ((1997). Science 278, 120-3), Kulkarni, et al. ((1999). Cell 96, 329-39), Tsien et al. ((1996). Cell 87, 1327-38) et Harada, et al. ((1999). Embo J 18, 5931-42). Such animal models expressing a recombinase in a specific tissue manner are well known to those skilled in the art, described in particular in Xu et al. ((1999) Nat Genet 22, 37-43), Shibata, et al. ((1997) Science 278, 120-3), Kulkarni, et al. ((1999) Cell 96, 329-39), Tsien et al. ((1996) Cell 87, 1327-38) and Harada, et al. ((1999) Embo J 18, 5931-42).
La présente invention concerne également un procédé de transformation de cellules eucaryotes pour intégrer dans son génome la combinaison de vecteurs selon l'invention. The present invention also relates to a method of transforming eukaryotic cells to integrate into its genome the combination of vectors according to the invention.
Les méthodes d'intégration de séquences dans le génome de cellules eucaryotes sont bien connues de l'homme du métier, notamment décrites dans Smithies et al. ((1985). The methods for integrating sequences into the genome of eukaryotic cells are well known to those skilled in the art, in particular described in Smithies et al. ((1985).
Nature 317, 230-4) et Wong et al. ((1986). Somat Cell Mol Genet 12, 63-72) . Nature 317, 230-4) and Wong et al. ((1986) Somat Cell Mol Genet 12, 63-72).
De manière préférentielle, les cellules sont des cellules animales transformées par les méthodes telles que décrites dans Vasquez et al ((2001) PNAS 98, 8403-8410) et Yanez et al ((1999), somatic cell and molecular genetics 25, 27-31). Preferably, the cells are animal cells transformed by the methods as described in Vasquez et al ((2001) PNAS 98, 8403-8410) and Yanez et al ((1999), somatic cell and molecular genetics 25, 27- 31).
La présente invention concerne aussi les cellules eucaryotes dans le génome desquelles est intégré la combinaison de séquences selon l'invention, plus:préférentiellement les cellules animales telles que définies précédemment, en particulier souris ou rat. The present invention also relates to the eukaryotic cells in the genome of which is integrated the combination of sequences according to the invention, more preferably: animal cells as defined above, in particular mouse or rat.
Ces cellules selon l'invention peuvent être des cellules obtenues par intégration de:la combinaison de séquences par le procédé selon l'invention. Elles peuvent également comprendre des cellules obtenues par prélèvement sur des animaux obtenus à partir desdites cellules obtenues par le procédé selon l'invention. These cells according to the invention may be cells obtained by integration of the combination of sequences by the method according to the invention. They may also comprise cells obtained by taking from animals obtained from said cells obtained by the process according to the invention.
L'invention concerne également des embryons d'animaux obtenus à partir des cellules selon l'invention, ainsi que les animaux obtenus à partir de ces embryons et la descendance desdits animaux ayant conservé le vecteur selon l'invention. Les animaux selon l'invention sont définis précédemment à l'exception de l'homme, préférentiellement des mammifères, plus préférentiellement des mammifères rongeurs, encore plus préférentiellement des rats ou des souris. The invention also relates to animal embryos obtained from the cells according to the invention, as well as the animals obtained from these embryos and the offspring of said animals having retained the vector according to the invention. The animals according to the invention are defined above with the exception of humans, preferably mammals, more preferably rodent mammals, even more preferably rats or mice.
Les méthodes de préparation d'animaux modèles sont bien connues de l'homme du métier, et notamment décrites pour le mouton (Wilmut et al. Nature 385, 810-813, 1997; WO 97 07669), la souris (Wakayama et al. Nature 394, 369-374, 1998; WO 99 37143), Ees bovins (Wells et al. Biol. Reprod. 60, 996-1005, 1999), la chèvre (Baguisi et al. Nature Biotechnol. 17, 456-461, 1999; WO 00 25578), le porc (Polejaeva et al. Nature 407, 86- 90, 2000), le lapin (Chesne et al. Nature Biotechnol. 20, 366-369, 2002) et le rat (Zhou & al., Science, 25 septembre 2003; PCT/FR04/001275). Les méthodes de transfert nucléaire sont notamment décrites par Campbell & al. (Nuclear transfer in practice, School of Biosciences, University of Nottingham, Leicestershire, United Kingdom). The methods for preparing model animals are well known to those skilled in the art, and in particular described for sheep (Wilmut et al Nature 385, 810-813, 1997, WO 97 07669), the mouse (Wakayama et al. Nature 394, 369-374, 1998, WO 99 37143), cattle (Wells et al., Biol Reprod 60, 996-1005, 1999), goat (Baguisi et al., Nature Biotechnol 17, 456-461). 1999; WO 00 25578), pig (Polejaeva et al., Nature 407, 86-90, 2000), rabbit (Chesne et al., Nature Biotechnol 20, 366-369, 2002) and rat (Zhou et al. , Science, 25 September 2003, PCT / FR04 / 001275). Nuclear transfer methods are described in particular by Campbell et al. (Nuclear transfer in practice, School of Biosciences, University of Nottingham, Leicestershire, United Kingdom).
Les animaux modèles ainsi obtenus peuvent être employés de la manière décrite ci-dessous. The model animals thus obtained may be employed as described below.
La stratégie décrite permet de développer un animal porteur d'un gène intérêt par exemple un gène Humain introduit en remplacement de son homologue de souris. The described strategy makes it possible to develop an animal carrying an interest gene, for example a human gene introduced in replacement of its mouse homologue.
Ce modèle Humanisé peut faire l'objet d'étude: criblage de composés pharmaceutiques, études physiologiques... This Humanized model can be studied: screening of pharmaceutical compounds, physiological studies ...
L'animal est également porteur d'un shRNA produisant un siRNA dirigé contre la forme Humaine. L'expression d'une recobinase cre ubiquitaire permet d'exprimer ce siRNA dans tous les tissus et donc d'étudier l'effet de l'inactivation de cette protéine Humaine dans le modèle murin et / ou de mesurer l'efficacité in vivo du siRNA. The animal also carries a shRNA producing a siRNA directed against the human form. The expression of a ubiquitous recobinase makes it possible to express this siRNA in all tissues and thus to study the effect of the inactivation of this human protein in the murine model and / or to measure the in vivo efficacy of the mouse. siRNA.
Une expression tissu specificque en employant une souri exprimant la recombinase Cre (recombinase R2) dans les neurones permet ainsi d'exprimer le siRNA uniquement dans les neurones exprimant la recombinase et donc d'étudier l'inactivation de la forme Humaine dans ces seules cellules. Cette approche permet de disséquer des mécanimes impliquant plusieurs organes ou types cellulaires. Specific tissue expression by using a mouse expressing Cre recombinase (R2 recombinase) in neurons thus makes it possible to express siRNA only in neurons expressing recombinase and thus to study the inactivation of the human form in these cells alone. This approach allows to dissect mechanics involving several organs or cell types.
Dans un second temps cet animal peut être croisé avec une souris Flp ubiquitaire 15;recombinase R1) de façon à supprimer la cible Humaine. Ce modèle est très intéressant car il permet d'étudier in vivo les effets non spécifiques du siRNA. In a second step, this animal can be crossed with a ubiquitous Flp mouse 15, recombinase R1) so as to eliminate the human target. This model is very interesting because it allows to study in vivo the nonspecific effects of siRNA.
A partir d'un seul modèle animal il est donc possible d'étudier la spécificité d'un siRNA, et son efficacité puis d'utiliser ce modèle pour analyser des phénomènes biologiques. From a single animal model it is therefore possible to study the specificity of a siRNA, and its effectiveness then to use this model to analyze biological phenomena.
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