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FR2843123A1 - Cellules souches issues de tissu adipeux humain - Google Patents

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FR2843123A1
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Yves Saint Laurent Parfums SA
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Yves Saint Laurent Parfums SA
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Abstract

L'invention concerne des cellules souches humaines multipotentes et adultes, caractérisées en ce qu'elles présentent :i) une activité télomérase significative,ii) un phénotype HLA Classe I négatif,iii) un caryotype normal,iv) une capacité à rentrer en quiescence,v) une capacité d'autorenouvellement conservée pendant au moins 130 doublements de population.

Description

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Cellules souches issues de tissu adipeux humain La présente invention concerne des cellules souches multipotentes humaines, susceptibles d'être isolées à partir de tissus adipeux humains, ainsi que l'utilisation de ces cellules en thérapie et en cosmétologie. L'invention concerne également une méthode permettant d'isoler ces cellules souches à partir de tissu adipeux adulte humain, ainsi qu'une méthode pour les différencier en cellules d'origine endodermique ou ectodermique ou mésodermique. Enfin l'invention concerne des méthodes de criblage permettant d'identifier des agents susceptibles d'exercer un effet, soit sur la différenciation des cellules, soit sur le fonctionnement des cellules différenciées.
La présence de cellules "souches" multipotentes adultes a été mise en évidence dans un grand nombre de tissus, par exemple la moelle osseuse, le sang, le foie, le muscle, le système nerveux, le tissu adipeux. Les cellules "souches" adultes, en théorie capables d'autorenouvellement à l'infini, possèdent une grande plasticité cellulaire, c'est à dire l'aptitude à se différencier en d'autres tissus que ceux auxquels on les croyait destinées. Les propriétés de ces cellules, similaires à celles des .cellules "souches" embryonnaires (ES), ouvrent des perspectives thérapeutiques considérables, d'autant plus que leur utilisation ne pose pas les problèmes de compatibilité et d'éthique, rencontrés avec les cellules ES.
Malheureusement, à l'heure actuelle, leur application médicale (transplantation) reste fortement limitée, essentiellement pour deux raisons : - premièrement, il est très difficile d'isoler ces cellules. En effet, les cellules "souches" sont très rares dans l'organisme et à ce jour on dispose de peu de connaissances sur celles-ci, notamment en termes moléculaires, ce qui rend leur purification impossible directement. Il existe par exemple une méthode d'enrichissement en cellules multipotentes (population appelée SP pour Side Population ) basée sur la capacité à exclure un colorant vital (Goodell MA et a/.(1996), J Exp Med, vol 83,1797-1806; Zhou S et al. (2001) Nature
Medecine, vol 7,1028-1034). D'autres méthodes impliquent une séléction positive ou négative, basée sur la présence ou l'absence de marqueurs cellulaires. Par exemple, la demande de brevet internationale WO 01/11011 décrit la déplétion de cellules de moelle osseuse en cellules CD45+ glycophorin A+, suivie par la mise en culture es cellules CD45- /
GlyA- en présence de facteurs de croissance. Une méthode similaire est décrite par Reyes et al (Blood, Novembre 2001, vol. 98, n 9, 2615-2625).
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- deuxièmement, l'amplification préalable de ces cellules à l'état indifférencié in vitro présente un problème majeur.
Si de nombreux investigateurs ont pu mettre en évidence avec succès la présence de cellules humaines multipotentes dans un grand nombre de tissus, aucun d'entre eux n'a pu maintenir ces cellules, in vitro, à l'état indifférencié, au-delà de 50 à 80 doublements de population. Or, la capacité d'autorenouvellement est un indice doublement important : d'une part, en raison du nombre très limité de cellules souches présentes naturellement dans les tissus adultes, une quantité de cellules souches suffisante pour une utilisation thérapeutique ne peut être obtenue que si l'on peut les multiplier in vitro tout en conservant leur caractéristiques d'origine. D'autre part, la capacité d'autorenouvellement est en relation étroite avec la définition même de la cellule souche véritable (qui est immortelle) et donc peut être indirectement corrélée à une plasticité cellulaire étendue. Il est donc très souhaitable d'isoler des cellules multipotentes ayant une capacité d'autorenouvellement conservée au delà de 100 doublements de population.
La demande de brevet internationale WO 01/11011 (au nom de Furcht, Verfaillie et Reyes) décrit des cellules humaines multipotentes isolées à partir de la moelle osseuse. Ces cellules ont un caryotype normal, un phénotype HLA Classe # négatif, et peuvent être maintenues en culture in vitro jusqu'à 40 doublements de population. Néanmoins, quelques rares cellules peuvent atteindre 70 doublements de population. Les auteurs indiquent que ces cellules peuvent se différencier en cellules du linéage mésodermique, par exemple en ostéoblastes, en chondroblastes, en adipocytes et en myocytes, et également en cellules du linéage ectodermique et du linéage endodermique. Ces cellules étant cependant capables d'un nombre de divisions limité, les auteurs suggèrent, pour permettre la production de quantité importante de cellules, d'y introduire un gène hétérologue codant pour la télomérase. Ce gène hétérologue doit être excisé avant toute utilisation en transplantation. Cette technique d'immortalisation réversible demeure néanmoins fortement contestée. En effet, il subsiste un risque de transformation maligne des cellules au cas où l'on introduit une activité télomérase exogène à un niveau d'expression non-physiologique et non-contrôlé par la cellule (Wong Jing et al., Nature, 405, juin 2000,755-756). Des travaux similaires sont également décrits par Reyes et al (Blood, Novembre 2001, vol. 98, n 9, 2615-2625).
Jiang et al (Nature, Advance Online Publication 20 June 2002, doi:10.1098/nature00870) décrivent la production de cellules multipotentes de souris et de rat qui peuvent être maintenues en culture in vitro, au-delà de 100 doublements de population. Les auteurs font également référence à une population multipotente humaine qui aurait pu être maintenue in vitro au-delà de 80 doublements de population. Ceci étant, aucune information complémentaire n'est donnée au sujet de ces cellules humaines.
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Qu-Petersen et al (J. Cell Biol. 157,5, 2002,851-864) rapportent l'obtention de cellules multipotentes murines à partir de tissu musculaire. Ces cellules, appelées MDSC ( Muscle Derived Stem Cells ), ont un caryotype normal et présentent une capacité d'autorenouvellement tout en conservant leur multipotentialité pendant environ 30 doublements de population. Elles peuvent se différencier en cellules appartenant à différents linéages. Ceci étant, le caractère multipotent disparaît au-delà de 40 doublements de population, stade auquel les cellules deviennent sénescentes et meurent. Ces travaux suggèrent fortement que ces cellules multipotentes ont un comportement immunologique privilégié. En effet, l'injection de ces cellules dans des muscles de souris dystrophiques, immunologiquement différentes de celles dont sont issues les cellules MDSC, conduit à une régénération importante du muscle, et ce en l'absence de substances immunosuppressives type cyclosporine. De façon surprenante, les auteurs constatent que la transplantation ne provoque pas d'infiltration du tissu par des lymphocytes CD4+ et CD8+ de la souris greffée. Cette tolérance est expliquée, du moins en partie, par le phénotype MHC Classe # négative des cellules MDSC. Ce travail montre donc que les cellules MDSC ne sont pas reconnues par les lymphocytes T du receveur, qui est pourtant incompatible immunologiquement, et suggèrent ainsi une utilisation adaptée de ces cellules en allo-transplantation. Cette étude n'a pas été étendue à des cellules humaines.
Deux hypothèses peuvent être proposées pour expliquer la capacité limitée d'autorenouvellement présentée par les différentes cellules multipotentes isolées jusqu'à ce jour : - d'une part on peut supposer que ces diverses études n'ont pas été menées sur des cellules "souches " véritables mais plutôt sur des précurseurs intermédiaires. Cette hypothèse est d'autant plus fondée que les cellules "souches" peuvent être facilement confondues avec les précurseurs en terme de plasticité. De plus, la contamination de la culture par les précurseurs est facilitée par l'abondance de ceux-ci, comparée aux cellules "souches", mais leur durée de vie est par contre limitée ; - d'autre part, on peut également envisager que les cellules "souches" n'ont pu être maintenues in vitro à l'état indifférencié car les conditions de cultures étaient inadaptées.
Il est également à noter que, à ce jour, un grand nombre des méthodes mises en #uvre pour obtenir des cellules multipotentes, emploie comme source cellulaire, la moelle osseuse. Or, le prélèvement de cellules de moelle osseuse est une opération délicate, impliquant des risques pour le patient, et représentant une source de cellules souches peu abondante. Il s'agit donc d'une technique peu appropriée pour une production de cellules souches à grande échelle.
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Plusieurs équipes d'investigateurs ont donc tenté de mettre au point des méthodes permettant d'isoler des cellules multipotentes à partir d'autres tissus plus abondants, et étant dépourvus de risques majeurs pour les patients. De ce point de vue, le tissu adipeux constitue a priori une source prometteuse. Ceci étant, jusqu'à ce jour, bien que la présence de cellules multipotentes ait été mise en évidence dans le tissu adipeux humain, les résultats sont relativement décevants. En effet, les populations cellulaires ainsi obtenues sont souvent hétérogènes et ne peuvent être maintenues en culture in vitro au-delà de deux ou trois doublements de population.
En outre, à ce jour, aucun investigateur n'a rapporté la production, à partir de tissu adipeux humain, de cellules multipotentes ayant un phénotype HLA Classe # négatif. Cette caractéristique, non-requise pour une utilisation en autogreffe, devient absolument indispensable si ces cellules sont destinées à une utilisation thérapeutique plus étendue, en particulier en allo-transplantation.
Par exemple, les demandes de brevet WO 01/62901 (au nom de Artecel Sciences Inc) et EP 1 077 254 (au nom de Zen Bio (ne) décrivent l'obtention, à partir de tissu adipeux, de populations de cellules stromales, à caractère multipotent. Ces populations sont hétérogènes et contiennent entre autres des pericytes, des cellules endothéliales et des cellules de muscle lisse (voir Erickson et al., Biochem. and Biophys. Res. Com. 290,763-769, (2002)). Leur capacité d'autorenouvellement est extrêmement limitée, et une analyse de l'expression des marqueurs de surface confirme qu'elles sont HLA Classe 1 positif. Les caractéristiques de ces populations cellulaires sont donc difficilement compatibles avec une utilisation en thérapie.
La demande de brevet américain US 2002/0076400 (Katz et al.) et la demande de brevet internationale WO 00/53795 (au nom de l'University of Pittsburgh et des Regents of the University of Califonia) décrivent également l'obtention de populations cellulaires multipotentes à partir de tissu adipeux humain. Ces populations de cellules peuvent être différenciées en adipocytes, en osteoblastes, en chondrocytes et en myocytes. Selon les auteurs, elles peuvent être maintenues en culture in vitro pendant au moins 15 transferts cellulaires sans perdre leur caractère multipotent. Aucune donnée sur le doublement de population correspondant n'est donnée. Avant de soumettre les cellules à des transferts successifs, une activité télomérase est détectée dans cette population, pourtant hétérogène. Cette activité n'a pas été mesurée après transferts successifs. Aucune analyse de marqueurs de surface n'a été effectuée. L'expression d'antigènes HLA Classe I n'a donc pas été déterminée.
La présente invention permet de remédier aux inconvénients des techniques précédemment décrites.
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En effet, les présents inventeurs ont mis au point une méthode permettant d'isoler de façon reproductible, des cellules "souches" multipotentes à partir de tissu adipeux de jeunes enfants et de les multiplier, à l'état indifférencié, en grande quantité in vitro pendant plus de 200 doublements de population. Leur utilisation thérapeutique devient alors possible. L'invention a pour objet principal, le procédé de production de cellules souches à partir de tissu adipeux, ainsi que l'utilisation des cellules souches obtenues.
Dans le contexte de la présente invention, les termes suivants signifient : autorenouvellement : la capacité de se diviser sans altérer les caractéristiques initiales de la cellule. cellule souche : cellule multipotente ayant une capacité d'autorenouvellement élevée, ayant une activité télomérase, et étant capable de rentrer en quiescence. cellule souche adulte : cellule souche autre qu'une cellule souche embryonnaire, provenantpar exemple d'un nouveau né, d'un enfant ou d'un adulte. multipotent ou multipotentiel : capable de se différencier en au moins deux types cellulaires. quiescent : la capacité d'une cellule de rester dans un état de non- prolifération et de non-sénescence.
Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé d'obtention de cellules souches humaines multipotentes à partir de tissu adipeux adulte. Ce procédé comprend, comme première étape, la mise en culture de cellules provenant d'un prélèvement de tissu adipeux adulte. Après 12 heures de culture, les cellules sont séparées en deux sous-populations en fonction de leur vitesse d'adhésion, une première population cellulaire dite CA adhérant en moins de 12h, et une deuxième population cellulaire dite CS adhérant plus lentement et se trouvant après 12 heures de culture, en suspension dans le milieu de culture. La population CA est ensuite enrichie jusqu'à l'obtention d'une population de cellules capables de rentrer dans un état de quiescence. A partir de ce stade, une prolifération intensive des cellules souches de la population CA peut être alors induite.
Selon une variante préférée de l'invention, le procédé d'obtention de cellules souches humaines multipotentes, comprend les étapes suivantes :
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a) digestion enzymatique d'un prélèvement de tissu adipeux, b) récupération d'une fraction cellulaire dépourvue d'adipocytes, contenant tous les types cellulaires présents dans la préparation obtenue selon (a), à l'exception des adipocytes, c) culture in vitro pendant au moins 12 heures, de la fraction cellulaire obtenue selon l'étape (b), d) sélection de deux sous-populations cellulaires, dites population CA et population CS , la population CA présentant une vitesse d'adhésion inférieure à 12 heures, et la population CS présentant une vitesse d'adhésion supérieure à 12 heures, e) enrichissement de la population CA jusqu'à l'obtention d'une population de cellules capables de rentrer dans un état de quiescence, f) éventuellement, induction d'une prolifération accrue des cellules souches de la population CA , par exemple par addition d'un facteur de croissance.
La Figure 19 présente un schéma d'une variante préférée du procédé de l'invention.
Etape (a) : digestion enzymatique d'un prélèvement de tissu adipeux : L'étape de digestion enzymatique est de préférence effectuée par mise en contact du prélèvement de tissu adipeux avec une préparation enzymatique telle que la collagénase pendant une durée courte, c'est-à-dire maximum 10 minutes, et plus préférablement de 5 à 10 minutes, ou encore de 5 à 8 minutes. Ceci permet une dissociation complète du tissu tout en évitant d'endommager certains types cellulaires, et conduit donc à une meilleure viabilité de tous les types cellulaires.
En ce qui concerne la nature du tissu adipeux, il provient de préférence d'un jeune enfant sain, âgé par exemple de moins de 10 ans, par exemple d'un nouveau-né ou d'un enfant âgé de 2 ou 3 mois à 8 ans. Il peut s'agir d'enfants de sexe masculin ou féminin.
L'âge du donneur semble être un point important. En effet, un certain nombre de données obtenues à partir de cellules "souches" hématopoïetiques suggère fortement que les cellules "souches", non seulement diminuent en nombre avec l'âge de l'individu mais subissent également un processus de vieillissement se traduisant par une perte de fonctionnalité (Geiger H et Van Zant (2002), Nature, vol3, n 4, 329-333).
Si l'on extrapole ces données, le tissu adipeux de jeunes enfants, semble constituer une source de cellules "souches" plus abondantes et plus fonctionnelles que le tissu adipeux d'individus adultes.
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Le prélèvement de tissu adipeux peut provenir de n'importe quel site anatomique, mais est de préférence un prélèvement de tissu d'origine extramédullaire, provenant par exemple de la région ombilicale ou de la région pubienne ou de la région inguinale ou de la région périnéale ou de la région abdominale ou de la région sous-cutanée. Les régions pubienne, pré-pubienne, inguinale et ombilicale sont particulièrement préférées.
Etape (b) : récupération d'une fraction cellulaire dépourvue d'adipocytes : Le tissu adipeux ayant subi une digestion enzymatique est ensuite traité pour retirer les adipocytes. On récupère alors une fraction cellulaire dépourvue d'adipocytes, contenant tous les types cellulaires présents dans le tissu adipeux (par exemple préadipocytes, cellules souches, cellules endothéliales, péricytes, mastocytes...), à l'exception des adipocytes.
L'élimination des adipocytes peut être effectuée par tout moyen approprié. La centrifugation est particulièrement efficace, puisque toutes les cellules d'intérêt se trouvent dans le culot de centrifugation tandis que les adipocytes flottent dans le surnageant.
Il est important de noter que cette étape de la procédure est effectuée sans filtration, permettant ainsi de conserver en culture tous les types cellulaires, autres que les adipocytes. En effet, dans les techniques classiquement décrites de préparation cellulaire à partir de tissus adipeux, on procède généralement à des étapes de filtrations successives ou non, selon les auteurs, et ceci avant ou après la centrifugation, afin d'éliminer les déchets. Cette étape cependant risque d'entraîner la perte de certains types cellulaires.
Etape (c) : culture in vitro : La fraction cellulaire obtenue lors de l'étape (b) est ensuite mise en culture pendant au moins 12 heures, et de préférence pendant 12 à 80 heures, par exemple 12 à 72 heures.
Pour cette étape de la procédure, l'ensemencement des cellules est effectué à une densité comprise entre 1000 et 5000 cellules /cm2, par exemple 1000 à 3500 cellules /cm2. En effet, les cellules multipotentes sont peu représentées, en comparaison aux autres types cellulaires, et un ensemencement à haute densité permet donc de s'assurer que chaque boîte contient ce type de cellule.
Le milieu de culture utilisé pour cette étape du procédé est normalement un milieu de culture type DMEM, additionné de sérum foetal sans ajout d'autres facteurs de croissance. Par exemple, un milieu particulièrement approprié est le suivant : DMEM+ 10 % de sérum de veau foetal décomplémenté + antibiotiques (100 U/ml de pénicilline, 100 g / ml de streptomycine).
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Le rendement cellulaire à cette étape est variable selon les prélèvements : de 1000 à 5000 cellules par mg de tissu.
Etape (d) : sélection de deux sous-populations cellulaires : L'étape d'enrichissement en cellules souches multipotentes débute par la séparation, au début de la mise en culture selon l'étape (c), de deux sous-populations cellulaires en fonction de leur vitesse d'adhésion : - une population cellulaire dite CA adhérant en moins de 12h - une population cellulaire dite CS adhérant plus lentement (de 48 à 72h).
La population CS se trouve après 12 heures de culture, en suspension dans le milieu de culture, alors que la population CA adhère aux boîtes.
Les cellules "souches" se retrouvent uniquement dans la sous-population CA alors que la deuxième sous-population contient des précurseurs multipotents qui meurent après environ 60 doublements de population. Bien que la population CS ne puisse donc être utilisée pour la production de cellules souches, elle peut néanmoins être utilisée pour d'autres applications. En effet la population CS présente les caractéristiques suivantes : i) elle est multipotente, ii) elle a un phénotype HLA Classe # négatif, iii) elle a un caryotype normal, iv) elle présente une capacité d'autorenouvellement conservée pendant environ 40 à 60 doublements de population v) sa vitesse de prolifération n'est pas affectée par le Leukemia Inhibitory Factor (LIF).
Cette population cellulaire se prête donc à des utilisations thérapeutiques et cosmétiques comparables à celles habituellement connues pour des cellules multipotentes de l'art antérieur.
L'étape de sélection de la population adhérant rapidement (population CA) est importante puisqu'elle permet, dès la mise en culture, de moins diluer les cellules "souches" par rapport à la masse des différentes cellules précurseurs, en faisant une première sélection.
Etape (e) : enrichissement en cellules souches : Les populations CA et CS sont ensuite mises en culture dans des conditions identiques. Pour la population CA, cette mise en culture permet d'obtenir un enrichissement important en cellules souches. Cette étape d'enrichissement est basée sur le fait que les précurseurs ont une durée de vie limitée par rapport aux cellules souches (en théorie immortelles). Lors des premiers doublements de population, les précurseurs vont se multiplier beaucoup plus rapidement que
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les cellules souches, puis ceux-ci vont commencer à mourir, jusqu'au stade 50 à 80 doublements de population. A ce stade, la population est fortement enrichie en cellules souches.
Lors de cette étape, chaque transfert cellulaire est effectué lorsque les cellules arrivent à 80% de confluence et l'ensemencement est effectué à haute densité, c'est-à-dire à une densité comprise entre 1000 à 5000 cellules / cm2, de préférence entre 1000 à 3500 cellules / cm2, et plus particulièrement entre 2000 et 2500 cellules / cm 2.
A chaque transfert cellulaire, les cellules sont diluées par 2 ou par 3 au maximum, pendant environ 50-80 doublements de population (stade auquel la population CA est fortement enrichie en cellules "souches" et où la population CS meurt, ce qui correspond à la mort des précurseurs). Cette étape est indispensable si on émet l'hypothèse que la vraie cellule "souche", qui est une cellule quiescente à l'état normal, se divise plus lentement qu'un précurseur. Une dilution supérieure des cellules au cours des étapes de trypsinisation pourrait entrainer le risque de perdre ces cellules multipotentes dans certaines boites de culture.
Après environ 50 à 80 doublements de population (par exemple 60 doublements de population), la population CS présente les caractéristiques d'une population sénescente (perte du potentiel prolifératif et perte de la multipotentialité) et meurt. Par contre la population CA, à ce même stade, prolifère plus lentement comparé aux premiers doublements de population (temps de doublement de population d'environ 72 heures, comparé à un temps moyen de doublement d'environ 36 heures initialement), et est capable de rentrer en quiescence.
La population CA peut être considérée comme ayant atteint la quiescence lorsqu'elle présente les caractéristiques suivantes : # arrêt spontané de la prolifération à 70% de confluence environ ; # la confluence peut être atteinte à ce stade en présence de bFGF ou autres facteurs de croissance. Une diminution du temps de doublement de population de 72 heures environ à 36 heures environ peut être observée ; # l'effet du bFGF ou autres facteurs de croissance sur le temps de doublement est réversible En outre, la mesure de l'activité X-gal endogène déterminée à pH 6 dans la population CA est négative (inférieur à 0. 05 %), confirmant que cette population est à l'état quiescent et non sénescent.
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Le milieu de culture employé pour cette étape d'enrichissement est typiquement un milieu sans facteurs de croissance rajouté, par exemple le milieu de culture DMEM+ 10% de sérum de veau foetal décomplémenté + antibiotiques (100 U/ml de pénicilline, 100 g/ml de streptomycine).
Stade (f) :induction de prolifération des cellules souches à l'état indifférencié : Après avoir atteint la quiescence, la prolifération des cellules de la population CA est induite par trypsinisation et dilution des cellules dans de nouvelles boîtes. De préférence, les cellules sont soumises à un traitement à la trypsine à 80% de confluence et diluées de 2 à 10 fois, de préférence de 5 à 10 fois, dans de nouvelles boites de culture identiques.
L'ajout d'un facteur de croissance à ce stade, par exemple le facteur de croissance fibroblastique basique (bFGF), le PDGF , l'EGF, le NGF ou le SCF permet la prolifération intensive des cellules "souches" de la population CA. L'ajout de bFGF humain à ce stade est particulièrement préféré.
L'addition de facteurs de croissance tel que le bFGF, incorporé par exemple à une concentration d'environ 3 à 20 ng/ml de milieu, particulièrement 5 à 10 ng/ml, permet non seulement de réduire de moitié le temps, de doublement de population (par exemple le temps de doublement de population sans bFGF est d'environ 72 heures, alors qu' avec le bFGF il est d'environ 36 heures, mais elle permet également à la population d'atteindre la confluence. En effet sans facteurs de croissance, la prolifération d'une population quiescente de cellules souches de l'invention peut être provoquée par trypsination et dilution, mais la prolifération s'arrêtera spontanément à 70 % de confluence environ. Dans la mesure où la confluence est un état indispensable pour initier la différenciation de nombreux types cellulaires, l'utilisation de facteurs de croissance tel que le bFGF doit être prévue pour la production in vitro de ce type de cellule différenciée.
Cette étape du procédé se distingue clairement des procédés de l'art antérieur. En effet, selon le procédé de l'invention, les facteurs de croissance tel que le bFGF ne sont utilisés qu'après avoir obtenu une population capable de rentrer en quiescence. Par contraste, le bFGF est généralement utilisé dès la mise en culture des cellules fraîchement isolées (Tsutsumi S et al., Biochemical and Biophsysical Research Communications 288,413-419 (2001)). Cette utilisation très précoce du bFGF a un effet pervers car il stimule, non seulement la prolifération des cellules "souches" véritables mais également de tous les précurseurs. Ceci a pour conséquence d'accroître davantage le rapport précurseurs/ cellules "souches", se traduisant par la perte par dilution de ce type cellulaire rare. Selon l'invention, le point novateur est d'utiliser le bFGF lorsque la masse des précurseurs a disparu et que la population, fortement enrichie en cellules "souches", devient quiescente.
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L'induction de la prolifération des cellules souches permet de produire des quantités importantes de ces cellules multipotentes. Les cellules ainsi produites peuvent être récupérées des milieux de culture en utilisant des méthodes classiques.
En résumé, le procédé de l'invention comporte plusieurs éléments novateurs permettant d'optimiser la production de cellules souches : - une digestion rapide par une préparation enzymatique telle que la collagénase (étape (a)) qui permet une dissociation complète du tissu tout en évitant d'endommager certains types cellulaires, - l'absence d'étapes de filtrations dans l'étape (b), pour éviter de perdre sur les filtres certains types de cellules, - l'ensemencement des cellules à haute densité lors des étapes de culture (d) et (e). En effet, les cellules multipotentes sont peu représentées, en comparaison aux autres types cellulaires, - l'isolement de 2 sous-populations CA et CS en fonction de leur vitesse d'adhésion, - l'utilisation tardive d'un facteur de croissance tel que le bFGF, après que les cellules soient devenues quiescentes (étape f).
En mettant en oeuvre le procédé de l'invention, les présents inventeurs ont établi plusieurs lignées multipotentes humaines à partir de tissu adipeux de jeunes enfants. La technique de l'invention a été validée sur plusieurs prélèvements de tissus adipeux, par exemple celles indiquées le Tableau # (voir Exemples ci-dessous).
Les cellules de l'invention présentent de nombreuses caractéristiques des cellules souches, par exemple : capacité à rentrer en quiescence ; sortie de la quiescence induite par le bFGF ou autres facteurs de croissance, se traduisant par une reprise intense de la prolifération (effet réversible de ces facteurs de croissance, sécrétés in vivo dans l'organisme lors de dommage corporels) ; maintien de la multipotentialité pendant un nombre élevé de doublements de population ; une activité télomérase significative ;un caryotype normal.
Plus particulièrement, les cellules de l'invention sont des cellules souches adultes humaines et multipotentes, caractérisée en ce qu'elles présentent : i) une capacité d'autorenouvellement conservée pendant au moins 80 doublements de population, et de préférence pendant au moins 100 doublements de population, ii) une activité télomérase significative, iii) un phénotype HLA Classe # négatif, iv) un caryotype normal,
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v) une capacité à rentrer en quiescence.
La capacité d'autorenouvellement des cellules de l'invention est conservée pendant au moins 80 doublements de population, de préférence au moins 100 ou 130 doublements de population, et plus particulièrement pendant au moins 200 doublements de population. Ceci signifie que les cellules de l'invention sont capables de subir au moins 80 ou 130 ou 200 doublements de population sans perdre leurs caractéristiques d'origine. En d'autres termes, la multipotentialité, l'activité télomérase, le phénotype HLA Classe 1 négatif, le caryotype normal et la capacité à entrer en quiescence sont conservés pendant tous ces doublements de population.
L'activité télomérase des cellules de l'invention, mesurable en mettant en oeuvre des techniques conventionnelles, est particulièrement importante. En effet, en conformité avec la définition de la cellule "souche" de Watt et Hogan (Science, vol 287, February 2000), l'activité télomérase signifie normalement que les cellules obtenues seraient capables d'autorenouvellement à l'infini. L'activité télomérase est uniquement présente dans les cellules embryonnaires et, chez l'adulte, dans les cellules tumorales et les cellules "souches". Cette activité confirme donc qu'il s'agit bien de cellules souches.
Le niveau d'activité télomérase endogène des cellules de l'invention correspond de préférence à au moins 20 %, par exemple 20 à 50 % de l'activité télomérase d'une lignée cellulaire de référence. La lignée de référence est typiquement une lignée transformée ayant une activité télomérase endogène, telle que la lignée humaine transformée HEK293T (Human Embryonic Kidney 293 immortalisé par l'Ag T). Cette activité peut être mesurée à n'importe quel stade. Elle est de préférence mesurée au-delà de 30 ou 40 doublements de populations, par exemple au stade de la quiescence après environ 60 doublements de populations.
En ce qui concerne les caractéristiques immunologiques des cellules de l'invention, elles sont différentes d'une cellule somatique classique. En effet, ces cellules n'expriment pas de molécules du système HLA de classe # en surface (confirmé par des analyses de cytométrie de flux). Ces dernières présentent les peptides antigéniques du soi et du non soi aux lymphocytes T cytotoxiques CD8+, d'où leur rôle critique dans les réactions de rejet de greffes. L'absence de surface des molécules HLA de classe 1 laisse supposer l'universalité des cellules souches de l'invention en transplantation. Ces cellules pourraient être utilisées en allotransplantation sans aucun risque de rejet de la part de l'hôte, indépendamment de son génotype.
Le phénotype HLA Classe 1 négatif peut être analysé par toute technique conventionnelle. Il est de préférence mesuré au-delà de 30 ou 40 doublements de populations, par exemple au stade de la quiescence vers 60 doublements de populations, ou à un stade tardif c'est-à-dire au-delà
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de la quiescence, par exemple à 100 ou 120 doublements de population. En effet, pendant les premiers doublements de population, l'expression de surface des molécules HLA de Classe # est faible mais significative, puis disparaît à des stades tardifs (par exemple au-delà de la quiescence entre 50 et 80 doublements de populations), correspondant au stade de la disparition des précurseurs précoces.
Dans le contexte de l'invention, l'expression HLA négatif signifie que les cellules souches de l'invention présentent un niveau d'expression de surface de molécules HLA de Classe # nondétectable par cytométrie de flux par simple marquage (utilisation d'un fluorochrome) En outre, grâce à un phénomène de comportement immunitaire privilégié, les cellules de l'invention, à l'état différencié, n'induisent vraisemblablement pas de réaction de rejet chez un hôte, indépendamment de son génotype.
Les cellules de l'invention présentent un caryotype normal, confirmant qu'elles ne sont pas transformées.
A l'état normal, les cellules de l'invention, sont quiescentes (Blau HM et al, Cell, 105,829-841, June 29, (2001)) et se remettent à proliférer en présence de bFGF. La quiescence est une caractéristique propre aux cellules souches. En effet, au-delà d'un certain nombre de doublements de populations, les cellules non-souches arrivent à la sénescence. L'état de quiescence peut, en théorie, être maintenu indéfiniment. Pour les cellules de l'invention, les inventeurs ont maintenu cet état pendant des périodes allant jusqu'à un an. La prolifération peut ensuite être induite par trypsination et dilution, éventuellement accompagné de l'ajout d'un facteur de croissance. A quiescence, les cellules de l'invention s'arrêtent de proliférer spontanément, avant d'atteindre la confluence, par exemple entre 50% et 90% de confluence, plus particulièrement entre 60 % et 70 % de confluence.
Une caractéristique importante des cellules de l'invention est leur multipotentialité. Elles sont en effet capables de se différencier en au moins deux types cellulaires. Plus particulièrement, elles sont capables de se différencier en cellules d'origine endodermique (par exemple le foie) ou ectodermique (cellules nerveuses : astrocytes, oligodendrocytes et neurones) ou encore mésodermique. Comme exemples de cellules du linéage mésodermique, l'on peut citer les adipocytes, les ostéoblastes, les myocytes et les chondrocytes.
Il a notamment été démontré que les cellules de l'invention, même à des stades tardifs, sont capables de se différencier en adipocytes fonctionnels (démontré par lipolyse, activité GPDH, marqueurs adipocytaires) et en ostéoblastes fonctionnels (démontré par présence de
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marqueurs ostéoblastiques et calcification de la matrice extracellulaire). Cette différenciation peut avoir lieu in vitro et in vivo.
Les inventeurs ont investigué la présence de marqueurs sur les cellules souches de l'invention.
Ils ont constaté qu'elles expriment le facteur de transcription Oct-4 et l'antigène de surface ABCG2 (transporteur ABC responsable du phénotype SP : Zhou S et al., Nature Medicine, 7, n 9, Sept 2001,1028-1034). Le facteur de transcription Oct-4 est exprimé spécifiquement dans les cellules souches embryonnaires de souris et est indispensable au maintien de leur pluripotentialité. Il a été montré également que Oct-4 est exprimé par les cellules souches embryonnaires humaines.
Il a également été observé que les cellules souches de l'invention ne réagissent pas au Leukemia Inhibitory Factor (LIF), à des concentrations d'environ 10ng/ml. Le LIF ne produit aucun changement de morphologie ou de prolifération des cellules. Conformément aux résultats obtenus par d'autres investigateurs avec des cellules souches humaines, notamment des cellules souches embryonnaires, il peut donc être conclu que les cellules de l'invention n'expriment vraisemblablement pas le récepteur pour le LIF ( LIF-R ), et sont donc LIF-R négatif.
Le temps de doublement des populations cellulaires de l'invention varie en fonction de la proportion de cellules souches présentes. Par exemple, avant d'atteindre la quiescence, le temps de doublement est d'environ 36 à 40 heures, reflétant la présence de précurseurs dans la population CA. Au fur et à mesure que la proportion de cellules souches augmente, le temps de doublement augmente également, pour atteindre environ 70 à 80 heures à quiescence. En effet les cellules souches se divisent beaucoup plus lentement que les précurseurs. Après quiescence, l'ajout de facteurs de croissance tel que le bFGF permet de réduire de façon significative le temps de doublement, par exemple jusqu'à 36 heures environ, permettant une production intensive et rapide de cellules souches.
Les cellules de l'invention peuvent être modifiées génétiquement pour introduire ou faire exprimer une caractéristique nouvelle, par exemple, pour exprimer un transgène tel qu'un gène rapporteur, ou un gène dont le produit d'expression présente des propriétés thérapeutiques etc.
L'introduction d'ADN ou d'ARN hétérologue peut être faite par toute technique conventionnelle, par exemple, par vecteur viral (y compris des vecteurs rétroviraux), par agent chimique tel que le phosphate de calcium, et par agent physique par exemple l'éléctroporation, la micro-injection etc.
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De telles cellules génétiquement modifiées peuvent être utilisées en thérapie génique pour permettre d'apporter un produit d'expression d'un gène hétérologue à un individu. Grâce au caractère multipotent et HLA Classe 1 négatif, les cellules souches de l'invention sont particulièrement appropriées pour ce type d'application.
Lorsque les cellules de l'invention sont transduites ou transfectées par un gène rapporteur, elles peuvent être utilisées pour effectuer de nombreuses études. Par exemple, la plasticité des cellules souches multipotentes du tissu adipeux peut être investiguée à l'aide de cellules souches, transfectées avec le gène lacZ codant pour la ss-Galactosidase (bleues après coloration Xgal). Ces cellules marquées peuvent être utilisées pour des expériences in vitro et in vivo.
Par exemple, in vitro, la plasticité de ces cellules peut être étudiée par des expériences de coculture. Notamment, l'on peut analyser la capacité de ces cellules (d'origine mésodermique) à se différencier en cellules d'origine endodermique (par exemple le foie) et en cellules d'origine ectodermique (cellules nerveuses : astrocytes, oligodendrocytes et neurones).
In vivo, ces cellules marquées peuvent être également transplantées chez la souris athymique (nude), ayant un système immunitaire déficient et ne pouvant donc pas rejeter ces cellules. L'on peut également vérifier que les cellules transplantées ne donnent pas de tumeur. Le pouvoir de régénération de ces cellules n'est visible que si on effectue, au préalable, des lésions adéquates chez la souris à transplanter.
Les cellules souches de l'invention n'expriment pas de molécules HLA de classe 1 en surface, contrairement à la plupart des cellules somatiques. L'absence de ces protéines dont la fonction, immunitaire est cruciale, laisse supposer que ces cellules souches peuvent être transplantées universellement sans réaction de rejet.
L'invention concerne également des populations enrichies en cellules multipotentes, caractérisée en ce qu'elles comportent des cellules souches de l'invention, et en ce qu'elles sont dépourvues d'adipocytes, de fibroblastes, de pré-adipocytes, de cellules endothéliales, de péricytes, de mastocytes et de cellules de muscle lisse.
Les populations de l'invention sont de préférence entièrement homogènes, c'est-à-dire elles ne comprennent que des cellules souches. Plus particulièrement, les populations sont clonales.
L'invention concerne également la production de cellules différenciées à partir des cellules souches de l'invention.
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Par exemple, l'invention concerne la production de cellules différenciées du linéage mésodermique, caractérisée en ce que l'on cultive des cellules souches de l'invention à partir de la confluence, en présence d'un milieu de différenciation approprié.
Comme milieu permettant la différenciation en adipocytes, l'on peut citer le milieu suivant : - milieu DMEM/ Ham's F12 (vol/vol, 1:1), supplémenté d'antibiotiques par exemple 10OU/mi de pénicilline, 100 g / ml de streptomycine,
5 g/ml insuline humaine (Sigma),
10 g/ml de transferrine humaine (Sigma),
Activateur PPAR, par exemple 1 M de BRL49653,
100 à 250 M isobutyl-methylxanthine (IBMX)
1 M de dexamethasone.
Quarante huit à soixante douze heures après, ce milieu est remplacé par le même milieu mais ne contenant plus d'IBMX et de dexamethasone.
Comme milieu permettant la différenciation en ostéoblastes, l'on peut citer le milieu suivant : - DMEM, supplémenté d'antibiotiques par exemple 100 U/ml de pénicilline, 100 g / ml de streptomycine,
10% de sérum de veau décomplémenté, 0.1 M de dexaméthasone (SIGMA),
10mM (3-glycérophosphate (SIGMA) 50M d'acide ascorbique (SIGMA).
Le milieu est remplacé tous les 2-3 jours et ce pendant une période comprise entre 15 et
20 jours.
Comme milieu permettant la différenciation en myocytes, l'on peut citer le milieu suivant : milieu DMEM
2% de sérum de veau décomplémenté antibiotiques (par exemple 100 U/ml de pénicilline, 100 g / ml de streptomycine)
Le milieu est remplacé tous les 2-3 jours et ce pendant 4 à 6 semaines.
Pour les différenciations en adipocytes, en ostéoblastes et en myocytes, les cellules souches sont normalement ensemencées à une densité d'environ 10 000 à 25 000 cellules / cm2.
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Les cellules souches de l'invention sont particulièrement aptes à une utilisation en thérapie et en cosmétologie.
Les utilisations thérapeutiques des cellules souches de l'invention comprennent, entre autres, des utilisations en transplantation et en thérapie génique.
Par exemple, pour une utilisation en transplantation, les cellules de l'invention sont multipliées à l'état indifférencié in vitro, suivi de l'implantation des cellules chez un individu. Les cellules se différencient alors in vivo en fonction du site anatomique de l'implantation. Par exemple, la transplantation intramusculaire de cellules souches de l'invention chez un individu présentant des lésions musculaires, donnera lieu à une différenciation et régénération du muscle. De même, la régénération de tissu adipeux peut être envisagée par différenciation in vivo des cellules en adipocytes.
La transplantation des cellules de l'invention peut donc être utilisée pour la régénération de tissu in vivo, par exemple un tissu osseux, un tissu adipeux, ou un tissu musculaire.
Le cas échéant, la transplantation peut être accompagnée de l'implantation d'une matrice susceptible d'améliorer la régénération du tissu, par exemple en fournissant un support physique pour la prolifération des cellules ou en fournissant des substances telles que des facteurs de croissance etc. La matrice peut être bio-dégradable.
Selon l'invention, la transplantation peut être autologue ou allogénique. Les cellules de l'invention sont particulièrement adaptées aux allo-transplantations en raison de leur caractère HLA Classe # négatif. Les cellules peuvent donc être utilisées chez tout individu indépendamment de son génotype, sans risque de rejet.
Selon une autre variante, les cellules souches de l'invention peuvent être utilisées à l'état différencié, par exemple en adipocytes, en chondrocytes, en ostéoblastes, en myocytes etc.
Selon cette variante de l'invention les cellules souches sont soumises à une différenciation in vitro, suivie par l'introduction des cellules différenciées chez un individu.
Pour les applications thérapeutiques de l'invention les cellules souches peuvent être génétiquement modifiées ou non. Lorsque les cellules sont génétiquement modifiées, elles peuvent être utilisées en thérapie génique pour apporter un produit d'expression chez un patient, par exemple une protéine hétérologue. Les cellules modifiées peuvent être cultivées in vitro à l'état indifférencié puis introduites chez le récipient. Alternativement, les cellules peuvent être multipliées in vitro à l'état différencié et ensuite introduites chez le récipient.
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L'invention concerne également la mise en #uvre de méthodes chirurgicales et thérapeutiques employant les cellules souches de l'invention. Elle concerne également les compositions pharmaceutiques comprenant les cellules souches de l'invention en association avec un excipient physiologiquement acceptable.
Les cellules souches de l'invention peuvent également être utilisées pour la production in vitro, de protéines, recombinantes ou non, particulièrement des protéines thérapeutiques. En effet, les cellules de l'invention peuvent être cultivées in vitro pendant au moins 100, par exemple au moins 200 doublements de population, et constituent donc une source quasiment inépuisable de produits d'expression. Les protéines en question peuvent être des produits d'expression de gènes endogènes aux cellules souches, ou alternativement, peuvent être des produits d'expression de gènes hétérologues.
Les cellules de l'invention peuvent également être utilsées dans des systèmes de criblage pour identifier des agents actifs.
Par exemple, l'invention comprend un procédé de criblage permettant d'identifier des agents susceptibles de moduler la différenciation de cellules en cellules du linéage mésodermale, caractérisé par : a) la mise en culture de cellules souches selon l'invention dans des conditions permettant leur différenciation en cellules du linéage mésodermale, (par exemple en adipocytes, en ostéoblastes ou en myocytes) en présence d'un agent candidat, b) comparaison de la différenciation des cellules en présence de l'agent candidat avec la différenciation en l'absence de l'agent candidat .
L'agent sous test peut être un agent susceptible d'augmenter la différenciation, ou un agent susceptible d'empêcher ou ralentir ou diminuer la différenciation (substance antidifférenciatrice), ou encore une substance susceptible de modifier la voie de différenciation.
L'invention comprend également un procédé de criblage permettant d'identifier des agents susceptibles de présenter une activité lipolytique, caractérisé par : a) la mise en culture de cellules souches selon l'invention dans des conditions permettant leur différenciation en adipocytes, b) mise en contact des adipocytes ainsi obtenus, avec un agent candidat, évaluation de l'activité lipolytique de l'agent candidat.
L'invention comprend également un procédé de criblage permettant d'identifier des agents susceptibles de présenter une activité anti-lipolytique, caractérisé par :
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a) la mise en culture de cellules souches selon l'invention dans des conditions permettant leur différenciation en adipocytes, b) mise en contact des adipocytes ainsi obtenus, avec un agent candidat, en présence d'un agent lipolytique, c) évaluation de l'activité anti-lipolytique de l'agent candidat.
L'invention comprend également un procédé de criblage permettant d'identifier des agents susceptibles de présenter une activité insulino-sensibilisante, caractérisé par : a) la mise en culture de cellules souches selon l'invention dans des conditions permettant leur différenciation en adipocytes, b) mise en contact des adipocytes ainsi obtenus, avec un agent candidat, c) évaluation de l'activité insulino-sensibilisante de l'agent candidat, comparé à des adipocytes non-traités.
L'invention porte également sur l'utilisation des cellules souches en cosmétologie.
Dans la mesure où les cellules souches de l'invention peuvent se différencier en adipocytes, elles peuvent être utilisées en chirurgie, esthétique ou réparatrice, par exemple pour réduire l'aspect ridé de la peau, pour atténuer les cicatrices ou marques cutanées diverses, pour effectuer un remplissage tissulaire. L'invention concerne donc la mise en oeuvre de ces méthodes chirurgicales employant les cellules de l'invention.
Les cellules peuvent aussi être incluses dans des compositions cosmétiques comprenant des excipients, véhicules, solvants, colorants, parfums, antibiotiques ou autres produits et additifs habituellement utilisés dans les produits cosmétiques. L'inclusion des cellules dans des crèmes, pommades, onguents, gels, fluides divers etc, permet leur application directement sur la peau ou autres tissus ou phanères. L'invention porte donc également sur les compositions cosmétiques contenant les cellules souches de l'invention à l'état non-différencié, ou contenant des cellules différenciées dérivées des cellules souches.
Légendes des Figures Différents aspects de l'invention sont illustrés dans les figures : Figure 1 : Activité ss-galactosidase endogène des cellules CA et CS détectée à pH 6.
Une coloration Xgal, révélant l'activité ss-galactosidase endogène (traduisant la sénescence des cellules), effectuée au stade de 60 doublements de population, correspondant au transfert
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cellulaire 20 ( T20 ), révèle que la population CS est sénescente (Taux de sénescence 0.415 0.025%), alors que la population CA est simplement quiescente (Taux de sénescence 0.045
0.01 %).
Figure 2 : Effet du bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) à la concentration de 5 ng/ml de milieu) sur les populations CA et CS, à des stades tardifs, c'est à dire après 50 doublements de population.
La Figure 2 montre la prolifération des CA bFGF et CS bFGF (Abscisse : jours après étalement à 12 000 cellules / boîte de 35 mm de diamètre ; Ordonnée : nombre de cellules (x 1000) / boîte). Seules les cellules de la population CA répondent de manière efficace au bFGF.
Après 50 doublements de population, le bFGF n'a pas d'effet significatif sur la population CS.
Ces observations confirment l'état de quiescence de la population CA et l'état de sénescence de la population CS.
Figure 3 : Morphologie des cellules CA à des stades tardifs (après 50 doublements de population) en l'absence de bFGF et en présence de bFGF.
W/O FGF = en l'absence de bFGF +FGF = en présence de bFGF (5. ng/ml) FCS = sérum de veau foetal ( Foetal Calf Sérum ) Le bFGF entraîne un changement de la morphologie des cellules. Quiescentes, celles-ci sont applaties et élargies. En présence de bFGF, et donc en phase proliférative, elles prennent une forme fibroblastique.
L'effet du bFGF est réversible.
Figure 4 :Caryotype des cellules de la Primo 2 CA.
Le caryotype des cellules de la primo 2 a été réalisé sur les 2 sous populations CA et CS, en présence ou non de bFGF et à différents passages. Pour les cellules de la Primo 2CA les caryotypes ont été réalisés aux stades suivants : T21 = 80 doublements de population ; T23 = 90 doublements de population ; T34 = 130 doublements de population. Dans tous les cas, les caryotypes sont normaux. La Figure 4 montre un exemple de caryotype des cellules de la primo 2CA Figure 5: Différenciation des cellules de la primo 2 CA et de la Primo 2 CS en adipocytes à des passages précoces :
CST1 : population CS au passage 1 (correspondant à 3 doublements de population) ;
CST7 : population CS au passage 7 (correspondant à 21 doublements de population) ;
CAT5 : population CA au passage 5 (correspondant à 15 doublements de population).
Coloration Oil Red O.
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Figure 6: Expression transcriptionnelle de marqueurs adipogéniques au cours de la différenciation de cellules Primo 2. Analyse en Northern Blot.
JO, J7, J12 = 0,7 et 12 jours, respectivement, après induction de la différenciation,
CA T14 : population Primo 2 CA au passage 14 (correspondant à 42 doublements de population).
CS T16 : population Primo 2 CS au passage 16 (correspondant à 48 doublements de population) ; Figure 7 : Différenciation en ostéoblastes de cellules CA et CS à des passages précoces.
CST1 : population CS au passage 1 (correspondant à 3 doublements de population) ;
CST7 : population CS au passage 7 (correspondant à 21 doublements de population) ; CAT5 : population CA au passage 5 (correspondant à 15 doublements de population).
Coloration Alizarin Red.
Figure 8 : Capacité de différenciation de cellules CA à des passages tardifs.
A : Différenciation adipocytaire de cellules de la Primo 2CA. L'induction de différenciation adipocytaire est effectuée lorsque les cellules sont au stade T30 (environ 130 doublements de population). Coloration Oil Red O.
B : Différenciation ostéoblastique de cellules de la Primo 2CA. L'induction de différenciation ostéoblastique est effectuée lorsque les cellules sont au stade T30 (environ 130 doublements de population. Coloration Alizarin Red.
Figure 9 : Fonctionnalité des adipocytes et des ostéoblastes : Expression transcriptionnelle de marqueurs spécifiques soit de la différenciation adipocytaire, soit de la différenciation ostéoblastique.
L'expression transcriptionnelle des marqueurs hPPARy, haPA2 et hOC est déterminée par RTPCR. Les cellules utilisées sont i) des adipocytes (côté gauche de la Figure), issues de Primo2CA, l'induction adipocytaire ayant eu lieu au stade T32 (environ 140 doublements de population), et ii) des ostéoblastes (côté droite de la Figure), issues de Primo2CA, l'induction ostéoblastique ayant eu lieu au stade T32 (environ 140 doublements de population). hPPARy : récepteur y humain activé par les proliférateurs de péroxisome ("human peroxisome proliferator activated receptor y") : marqueur adipocytaire. haPA2 : protéine de liaison des acides gras humain ("human fatty acid binding protein") : marqueur adipocytaire, hOC : ostéocalcine humaine (marqueur ostéoblastique)
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Figure 10 : Fonctionnalité des adipocytes : de lipolyse des cellules de la Primo 2CA.
Des lipolyses ont été réalisées sur des adipocytes obtenus à partir de cellules Primo2CA T32 (environ 140 doublements de population), avec des agonistes spécifiques de différents récepteurs !}-adrénergiques. La Figure 10 montre les vitesses de lipolyse obtenues, et confirment l'absence de récepteurs p3 adrénergiques.
Figure 11 : Fonctionnalité des ostéoblastes : Détection de calcium associé à la matrice extracellulaire.
La matrice extracellulaire présente dans les boîtes de culture après lyse du tapis cellulaire, est séchée puis incubée avec la solution du "SIGMA calcium detection kit". La quantité de calcium sécrété par les ostéoblastes est quantifiée par lecture de cette solution au spectrophotomètre (DO 575). La fonctionnalité des ostéoblastes se confirme.
La quantité de calcium sécrétée par les ostéoblastes varie en fonction du lot de sérum (211707,210407, 210811,210812, 3903, classique). Ceux-ci peuvent contenir des cytokines, hormones ou facteurs de croissance non caractérisés et présents dans des proportions variables Les adipocytes ne sécrètent pas de quantité significative de calcium.
Figure 12 : Morphologie des cellules de la Primo2CA en fonction du nombre de doublements de population
A : 40 doublements de population
B : 100 doublements de population : quiescentes
C : 150 doublements de population : quiescentes
D : 150 doublements de population + bFGF : en phase proliférative.
Le bFGF entraîne un changement de la morphologie des cellules. Quiescentes, celles-ci sont applaties et élargies. En présence de bFGF, et donc en phase proliférative, elles prennent une forme fibroblastique (voir aussi Figure 3).
Figure 13 : Capacité de différenciation adipocytaire des Primo 1CA, Primo 3CA et Primo 6CA : Adipocytes après 8 jours de différenciation.
A : Primo 1 : différenciation induite à 50 doublements de population
B : Primo 3 : différenciation induite à 40 doublements de population
C : Primo 6 : différenciation induite à 40 doublements de population Figure 14 : Capacité de différenciation adipocytaire des Primo 1CA, Primo 3CA et Primo 6CA : Coloration Oil red 0 A : Primo 1 : induite à 40 doublements de population
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B Primo 3 : différenciation induite à 25 doublements de population
C : Primo 6 : différenciation induite à 25 doublements de population Figure 15 : Marquage cellulaire et analyse en cytométrie de Flux.
Mise en évidence du caractère HLA Classe # négatif des cellules souches Primo 2CA.
Simple Marquage: FITC
1. HELA . Cellules humaines tumorales. HLA Classe # positif.
2. SVF Tissu adipeux adulte, pas de doublements de populations. HLA Classe # positif
3. Primo 2CA : 120 doublements de populations
4. Primo 2CS : 45 doublements de populations
Courbe noire : IgG de souris : contrôle anticorps négatif
Courbe grise : W6/32 Anticorps anti-HLA Classe # Figure 16 : Obtention de clones multipotents à partir de cellules CA.
Les clones CA1 et CA3 ont été mis dans le milieu de culture permettant la différenciation en adipocytes et en ostéoblastes. Les adipocytes sont révélés par le colorant à l'huile rouge et les ostéoblastes par le rouge Alizarin.
Figure 17 : Expression d'un transgène dans les cellules souches CA.
Les cellules souches CA sont transduites par un rétrovirus exprimant un gène de résistance à un antibiotique, la puromycine et le gène rapporteur LacZ. Elles sont ensuite sélectionnées en présence de puromycine. Les cellules sélectionnées expriment toutes le gène LacZ révélé in situ par l'activité p-galactosidase.
Figure 18 : Expression de Oct-4 et ABCG2 dans les cellules souches CA Expression de l'ARN Oct-4 et ABCG2 dans les cellules CA et le clone CA1 Les ARN sont extraits à partir des cellules CA et CA1 et l'expression de Oct-4 et ABCG2 est : - amplifiée par RT-PCR - puis détectée par hybridation.
Les conditions de PCR sont : - pour Oct-4 : 94 C, 1 mn; 57 C, 1 mn; 72 C, 1 mn pendant 45 cycles.
- pour ABCG2 : 94 C, 1 mn; 60 C, 1 mn; 72 C, 1 mn pendant 31 cycles.
Figure 19 : Représentation graphique d'une variante préférée du procédé pour la production de cellules souches adultes à partir de tissu adipeux humain.
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EXEMPLES 1- Méthode d'obtention et d'expansion in vitro des cellules souches multipotentes du tissu adipeux
1 1. Descriptif des prélèvements de tissus adipeux obtenus
Six prélèvements de tissus adipeux de jeunes enfants, âgés de 1 mois à 7 ans, de sexe et de localisation anatomique variables, ont été obtenus.
Le tableau # résume l'origine de chaque prélèvement, le poids de celui-ci ainsi que le nombre de cellules obtenues en utilisant la technique qui sera détaillée plus loin.
Figure img00240001
<tb>
<tb>
Appellation <SEP> du <SEP> Sexe <SEP> Age <SEP> Localisation <SEP> Poids <SEP> du <SEP> Nombre <SEP> de
<tb> prélèvement <SEP> anatomique <SEP> prélèvement <SEP> cellules <SEP> obtenues
<tb> Primo <SEP> 1 <SEP> F <SEP> 2 <SEP> ans <SEP> 7 <SEP> Région <SEP> 300 <SEP> mg <SEP> 400 <SEP> 000 <SEP>
<tb> mois <SEP> ombilicale
<tb> Primo <SEP> 2 <SEP> M <SEP> 5 <SEP> ans <SEP> ' <SEP> Région <SEP> 400mg <SEP> 500 <SEP> 000 <SEP>
<tb> pubienne
<tb> Primo <SEP> 3 <SEP> M <SEP> 4 <SEP> mois <SEP> Région <SEP> 210 <SEP> mg <SEP> 400 <SEP> 000 <SEP>
<tb> prépubienne <SEP> ~~~~~~~~~~~~~~~~~
<tb> Primo <SEP> 4 <SEP> F <SEP> 7 <SEP> ans <SEP> Région <SEP> inguinale <SEP> 2.1 <SEP> g <SEP> 2 <SEP> 000 <SEP> 000 <SEP>
<tb> Primo <SEP> 5 <SEP> M <SEP> 1 <SEP> mois <SEP> inconnu <SEP> 200 <SEP> mg <SEP> 1 <SEP> 000 <SEP> 000 <SEP>
<tb> Primo <SEP> 6 <SEP> M <SEP> 18 <SEP> mois <SEP> inconnu <SEP> 200 <SEP> mg <SEP> 350 <SEP> 000 <SEP>
<tb>
Tableau 1 : Prélèvements de tissus adipeux humains utilisés pour la production de cellules souches multipotentes Les Exemples ci-dessous décrivent l'obtention de cellules souches multipotentes à partir des prélèvements Primo 1 à 6. Ces cellules souches ont été obtenues par la mise en #uvre des étapes suivantes : # isolement de cellules multipotentes à partir du prélèvement # enrichissement in vitro de la culture en cellules multipotentes # obtention d'une population de cellules souches quiescentes # induction d'une prolifération intensive de cellules souches
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Les cellules souches ainsi obtenues ont été caractérisées par # Mesure de l'activité télomerase # Réalisation de caryotypes à différents passages # Etude de la plasticité cellulaire (différenciation en différents types cellulaires) # Détermination de la présence ou de l'absence de marqueurs cellulaires # Clonage des cellules souches La méthodologie et les résultats sont décrits en détail ci-dessous.
1. 2 Méthode d'isolement des cellules multipotentes à partir de tissu adipeux de jeunes enfants Après l'acte chirurgical, le prélèvement est conservé dans du milieu DMEM ( Dulbecco's Modified Eagle's Médium). + 10% de sérum de veau foetal , à température ambiante. Le tissu est rincé dans du PBS ( Phosphate Buffer Saline) à 37 C puis égoutté et pesé. Le prélèvement est ensuite émincé très finement pour optimiser l'étape de digestion enzymatique.
Le milieu de digestion est composé de milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) contenant des antibiotiques (100 U/ml de Penicilline et 100#g /ml Streptomycine), 2 mg/ ml de collagénase (Boerhinger référence 103586) et 20mg/ml de sérum albumine bovine fraction 5 (Sigma A référence 2153). Le volume de digestion étant fonction du poids de tissu, on utilise généralement 1 ml de milieu de digestion pour 100 à 200 mg de tissu. La digestion s'effectue à 37 C sous agitation lente. Contrairement aux techniques classiquement décrites sur la préparation de préadipocytes humains, la durée de la digestion est très rapide, de 5 à 10 minutes, durée qui correspond à la dissociation complète du tissu par la collagénase. L'activité collagénase est ensuite inhibée par l'addition de sérum de veau foetal (200 ni/ ml de milieu de digestion).
On procède alors à la centrifugation de la préparation cellulaire 5 min à 10 000 rpm, étape qui va permettre de séparer les adipocytes (qui flottent) des autres types cellulaires contenus dans le tissu adipeux (préadipocytes, cellules souches, cellules endothéliales, péricytes, mastocytes...).. Il est important de noter que cette étape de la procédure est effectuée sans filtration, ce qui permet de conserver tous les types cellulaires contenus dans le tissu adipeux (exception faites des adipocytes).
Le culot cellulaire obtenu après centrifugation est resuspendu dans le milieu de culture: DMEM+ 10 % de sérum de veau foetal décomplémenté + antibiotiques (100 U/ml de pénicilline,
100 g / ml de streptomycine). Le nombre de cellules obtenues est compté. Le rendement
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cellulaire est variable selon les prélèvements : de 1000 à 5000 cellules par mg de tissu. Les cellules sont ensemencées à haute densité, de 1000 à 3000 cellules par cm2, sur des boites plastiques (polystyrène cristal, Greiner).
Au moment de la mise en culture, deux sous-populations cellulaires sont isolées à partir de leur vitesse d'adhésion. La première sous-population, désignée sous le terme CA , est constituée de cellules qui adhèrent très rapidement (moins de 12h). La deuxième souspopulation, appelée CS , est constituée de cellules qui adhèrent beaucoup plus lentement (de 48 à 72h).
Pratiquement, 12 h après la mise en culture, certaines cellules ont adhéré au plastique. Ces cellules constituent la population CA. Les cellules constituant la population CS, se trouvent au même moment, en suspension dans le milieu de culture. Ce milieu de culture est prélevé et déposé dans une nouvelle boite de culture. Après 72h, les cellules CS ont adhéré.
1.3 Enrichissement de la culture en cellules souches multipotentes : 1.3.1 Obtention d'une population de cellules souches quiescentes : Les deux sous-populations CA et CS sont maintenues en culture de la même façon. Ces cellules, à des stades précoces (correspondant environ à 50-60 doublements de population), présentent des caractéristiques similaires en terme de plasticité, prolifération et morphologie.
Les cellules sont entretenues dans le milieu de culture DMEM+ 10% de sérum de veau fcetal décomplémenté + antibiotiques (100 U/ml de pénicilline, 100 g/ml de streptomycine).
Lorsque les cellules arrivent à 80% de confluence, elles sont traitées par trypsine (TrypsineEDTA, Invitrogen) et remises en culture dans trois nouvelles boîtes de diamètre identique. La densité d'ensemencement correspondante est de 1000 à 3500 cellules/ cm2. Les cellules ne sont volontairement pas diluées davantage, afin de conserver dans toutes les boites, les cellules multipotentes qui théoriquement se divisent plus lentement que les précurseurs.
Les cellules sont entretenues dans ces conditions jusqu'à ce qu'elles cessent de proliférer. Pour Primo 2, les cellules CA et CS cessent de proliférer à partir du transfert cellulaire 20 (T20), correspondant à 60 doublements de population.
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Une coloration Xgal (révélant l'activité P-galactosidase endogène, détectée à pH 6 et traduisant la sénescence des cellules), révèle que la population CS est sénescente alors que la population CA est simplement quiescente (voir Figure 1).
Pour cette étape d'enrichissement, différents milieux de culture ont été testés. Il a notamment été observé que les cellules souches de l'invention ne réagissent pas au Leukemia Inhibitory Factor (LIF) (10ng/ml). Le LIF ne produit aucun changement de morphologie ou de prolifération des cellules. Ceci tend à confirmer que les cellules n'expriment pas de récepteur pour LIF (LIF-R-).
1.3.2. Induction d'une prolifération intensive des cellules souches Après établissement d'une population de cellules CA quiescentes, l'on rajoute alors au milieu de culture précédemment décrit du bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) humain à la concentration de 5 ng/ml de milieu.
Comme l'indique la Figure 2, seules les cellules de la population CA répondent de manière efficace au bFGF. En revanche, le bFGF n'a pratiquement pas d'effet sur la population CS à des stades tardifs (c'est à dire après 50 doublements de population).
Ces observations confirment une fois de plus l'état de quiescence de la population CA et l'état de sénescence de la population CS.
Les cellules CA, traitées au bFGF, sont soumises à un traitement à la trypsine à 80% de confluence et diluées cette fois-ci de 5 à 10 fois dans de nouvelles boites de culture identiques.
Deux points supplémentaires sont à préciser sur le bFGF : - Le bFGF entraîne un changement de la morphologie des cellules. Quiescentes, celles-ci sont applaties et élargies. En présence de bFGF, et donc en phase proliférative, elles prennent une forme fibroblastique (Figure 3, Figure 12) - De plus, l'effet du bFGF est réversible (Figure 3).
1.4. Congélation des cellules des deux sous-populations CA et CS Les cellules des deux sous-populations CA et CS sont régulièrement congelées, pour constituer un stock de chaque population cellulaire et pour permettre de suivre son évolution au
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cours des transferts cellulaires. La cryoconservation ne change pas les propriétés de ces cellules.
De façon pratique, les cellules sont trypsinées, centrifugées et re-suspendues dans le milieu de congélation constitué de sérum de veau foetal additionné de 10% de DMSO. Ces cellules sont ensuite placées à-20 C pendant 1 h, puis à -80 C pendant une nuit et enfin stockées dans l'azote liquide à -180 C.
2. Mesure de l'activité télomérase des cellules souches
2. 1 Méthodologie pour la détermination de l'activité télomérase :
L'activité télomérase est quantifiée par le kit TeloTAGGG Telomerase PCR Elisa PLUS (Roche).
La quantification de l'activité télomérase se fait en deux étapes : i) La première étape est une étape d'amplification/élongation (ou TRAP assay) où la télomérase ajoute des motifs télomériques (TTAGGG) à l'extrémité 3' d'un primer biotinylé. ii) La deuxième étape est la détection et la quantification par Elisa.
Les produits PCR obtenus dans l'étape 1 sont hybridés avec un primer spécifique des extrémités télomériques, marqué à la digoxigenine. De plus les microplaques Elisa sont traitées à la streptavidine, ce qui permet l'immobilisation des produits via la biotine. Les amplicons immobilisés sont détectés avec un anticorps anti-digoxigenine, conjugué à un anti-DIG-HRP et le substrat peroxidase TMB.
L'intensité de la réaction photométrique est estimée en utilisant un lecteur microplaque Elisa (Absorbance à 450 nm avec longueur d'onde de référence 690nm).
On calcule alors l'activité télomérase relative de l'échantillon par rapport à l'activité télomérase d'un contrôle positif (cellules de la lignée HEK293 pour Human Embryonic Kidney 293)
2. 2 Résultats de la détermination de l'activité télomérase :
En utilisant le kit "Te/oTAGGG telomerase PCR Elisa Plus" commercialisé par Roche, l'activité télomérase présente dans les 2 sous populations CA et CS de la primo2, a été quantifiée.
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Une activité télomérase significative est détectée dans les cellules souches de l'invention.
Pour Primo 2CA (T25 : transfert cellulaire 25, correspondant à environ 100 doublements de population), l'activité télomérase est d'environ 20% comparée à l'activité télomérase de la lignée humaine transformée HEK293T (Human Embryonic Kidney 293 immortalisé par l'Ag T).
La lignée HEK293T est utilisée dans ce kit comme référence.
A l'inverse, aucune activité télomérase significative n'est détectée dans les cellules CS, par exemple les cellules de la primo 2 CS (T20) présente une activité d'environ 5% comparée à celle des HEK293T.
3. Caryotype des cellules souches
Le caryotype permet l'observation et la classification des chromosomes présents au cours de la métaphase.
3.1 Méthodologie pour la détermination du caryotype :
Les métaphases sont obtenues en utilisant les techniques classiques de cytogénétique. Après accumulation des cellules en métaphase par blocage de l'appareil fusorial (incubation en présence de colchicine pendant 3h), on procède à la dispersion chromosomique dans le cytoplasme par l'action d'une solution hypotonique (75 mM KCI pendant 40 min à 37 C) puis à une fixation avec du méthanol/acide acétique (3/1). Les chromosomes sont ensuite identifiés par la technique des bandes R (RHG-banding techniques)
3. 2 Résultats de la détermination du caryotype:
Le caryotype des cellules a été réalisé. Ces caryotypes ont été effectués sur les 2 sous populations CA et CS, en présence ou non de bFGF et à différents passages (T21, T23 et T34 pour les primo2 CA).
Dans tous les cas, les caryotypes sont tout à fait normaux. Les cellules n'ont donc subi aucun remaniement chromosomique. La Figure 4 montre le caryotype des cellules de la Primo 2CA.
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4. Plasticité cellulaire des cellules souches La plasticité des cellules souches est évaluée selon les techniques suivantes : 4. 1 Méthodologie pour évaluer la plasticité cellulaire : 4.1.1. Conditions de différenciation en différents types cellulaires : Les cellules sont trypsinées puis ensemencées à 20 000 cellules / cm2. Les cellules atteignent la confluence 24 à 48h après. La confluence étant une étape critique pour la différenciation, les cellules sont maintenues à confluence 24h supplémentaires avant de procéder à la différenciation (adipocytes, ostéoblastes, myocytes). i) Conditions de différenciation en adipocytes
Les cellules confluentes sont incubées dans un milieu DMEMI Ham's F12 (vol/vol, 1 :1) supplémenté de 100U/ml de pénicilline, 100 g / ml de streptomycine, 5 g/ml d'Insuline humaine (Sigma), 10 g/ml de transferrine humaine (Sigma), 1 M d'activateur de PPAR (par exemple BRL49653), 100 à 250 M isobutyl-methylxanthine (IBMX) et 1 M de dexamethasone. Quarante huit à soixante douze heures après, ce milieu est remplacé par le milieu précédemment décrit mais ne contenant plus d'IBMX et de dexamethasone. Ce milieu de différenciation est remplacé tous les 2-3 jours, et ce pendant une période de 15 à
20 jours, correspondant à une différenciation adipocytaire optimale. ii) Conditions de différenciation en ostéoblastes
Les cellules confluentes depuis 24h sont incubées avec le milieu de différenciation ostéoblastique composé de DMEM, 100 U/ml de pénicilline, 100 g / ml de streptomycine,
10% de sérum de veau décomplémenté, 0.1 M de dexaméthasone (SIGMA), 10mM ss- glycérophosphate (SIGMA) et de 50 M d'acide ascorbique (SIGMA).
Le milieu est remplacé tous les 2-3 jours et ce pendant une période comprise entre 15 et
20 jours. iii) Conditions de différenciation en mvocvtes
Les cellules confluentes depuis 24h , sont incubées dans du milieu DMEM, en présence de
2% de sérum de veau décomplémenté et d'antibiotiques (100 U/ml de pénicilline, 100 g / ml de streptomycine). Le milieu est remplacé tous les 2-3 jours et ce pendant 4 à 6 semaines.
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4. 1.2 Colorations i) Coloration Oil Red 0 (adipocytes: coloration des lipides intracellulaires)
Après fixation dans une solution PBS/0.25% glutaraldéhyde, les cellules sont incubées pendant 5 minutes à température ambiante dans une solution de Oil Red O 2% (poids/volume). Les cellules sont ensuite lavées puis conservées dans du glycérol 70%. ii) Coloration Alizarin Red (ostéoblastes: Calcification de la matrice extracellulaire)
Après fixation dans une solution PBS/025% glutaraldéhyde, les cellules sont incubées 5 minutes à température ambiante avec la solution Alizarin Red 1% (poids/volume). Les cellules sont ensuites lavées à l'eau puis conservées à sec.
4. 1.3. Analyse transcriptionnelle i) Extraction d'ARN
Les ARNs cellulaires sont extraits en utilisant le Tri Reagent (Euromedex, Ref TR-118) ii) Northern Blot
20 g d'ARN / puit sont déposés sur un gel d'agarose(1.2%)/MOPS (1X)/ formaldéhyde (1.1 M). Après électrophorèse dans du tampon de migration MOPS (1X), les ARN sont transférés sur une membrane de nylon Hybond N+ (Amersham Pharmacia).
La membrane est ensuite hybridée en présence d'une sonde spécifique , marquée au 32P [dCTP] à l'aide du kit Rediprime TM II Random Prime Labelling system (Amersham
Pharmacia). iii) RT-PCR
La réaction de Reverse transcription PCR a été réalisée en utilisant le kit OneStep RT-PCR de Qiagen.
4. 2 Résultats de l'analyse de la plasticité cellulaire 4.2.1. Plasticité des deux sous populations cellulaires CA et CS à des passades précoces A des stades précoces (par exemple T1, T5, T7 correspondant à 3,15 et 21 doublements de population, respectivement), les populations CA et CS présentent les mêmes caractéristiques en terme de plasticité, morphologie et prolifération .
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i) Différenciation en adipocytes
Les résultats pour les expériences impliquant une Coloration Oil Red 0 sont illustrés dans la Figures 5 (pour Primo 2CA et Primo 2CS) et la Figure 14 pour Primo 1CA (40 doublements de populations), Primo 3CA (25 doublements de population) et Primo 6CA (25 doublements de population). En outre, des adipocytes issus de la Primo 1 CA, Primo
3CA et Primo 6CA après 50,40 et 40 doublements de population, respectivement, sont illustrés dans la Figure 13. Une comparaison des Figures 13 et 14 démontre clairement que, plus le nombre de doublements de population est élevé, plus la différenciation est homogène.
Une analyse par Northern Blot (Figure 6) démontre l'expression transcriptionnelle de marqueurs adipogéniques (aP2 et PPARy2) au cours de la différenciation : CA T14 (42 doublements de population) et CS T16 (48 doublements de population). ii) Différenciation en ostéoblastes
La Figure 7 illustre la différenciation des cellules CS et CA en osteoblastes. Coloration
Alizarin Red.
4. 2.2. Evolution de la plasticité cellulaire à des passages tardifs Les cellules de la primo 2 CS, à partir du transfert 20 (correspondant à environ 60 doublements de population) entrent en sénescence. Elles perdent simultanément leur potentiel prolifératif et leur capacité de différenciation.
Par contre, les cellules de la population CA, au même stade, deviennent quiescentes. Elles prolifèrent en présence de bFGF et conservent leur plasticité. Cette plasticité reste inchangée à un transfert 40 (correspondant à environ 200 doublements de population). La Figure 8 illustre la différenciation adipocytaire et ostéoblastique pour la Primo2 CA T30 (environ 130 doublements de population).
On conserve également dans la population CA, à des passages tardifs, l'expression transcriptionnelle des différents marqueurs spécifiques soit de la différenciation adipocytaire, soit de la différenciation ostéoblastique. (Figure 9) Primo2 CA T32 (140 doublements de population) .
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5. Caractérisation de la fonctionnalité adipocytaire par dosage enzymatique
5. 1 Méthodologie pour caractériser la fonctionnalité adipocytaire
5.1.1 Mesure de l'activité Glycérophosphate Déshydrogénase (GPDH)
On procède dans un premier temps à la lyse des cellules dont on veut mesurer l'activité GPDH.
Le principe du dosage est résumé sur ce schéma:
GPDH
Dihydroxyacétone phosphate + NADH# Glycérophosphate + NAD
On détermine la vitesse initiale de disparition du NADH à 340nm (en présence de NADH,
DHAP et du lysat cellulaire), ce qui permet de calculer la quantité de substrat dégradé, d'où l'activité enzymatique spécifique (après dosage des protéines).
La lecture se fait sur un spectrophotomètre permettant de faire des cinétiques (KONTRON
Uvicon 860 thermostaté à 37 C).
5.1.2. Test de lipolyse
Ce test consiste à mesurer le glycérol radiomarqué libéré par les adipocytes en présence d'agonistes de récepteurs []adrénergiques. La méthode utilisée est celle décrite par
Bradley DC et Kaslow HR (Anal Biochem, 1989,180,11-16). Le glycérol libéré est phosphorylé en présence de glycérokinase, et d'ATP et d'ATP marqué au P32 sur la position y. L'ATP résiduel est ensuite hydrolysé en milieu acide à 90 C et précipité avec du molybdate d'ammonium et de la triethylamine. La radioactivité incorporée sous forme de glycérophosphate marqué au P32 est estimée par comptage au compteur (3 et les valeurs ont exprimées en pmol grâce une courbe étalon.
5.2 Résultats de la caractérisation de la fonctionnalité adipocytaire
5.2 .1. Activité Glycérophosphate Déshydrogénase (GPDH)
Cellules primo2 CA (T24 en présence de bFGF humain) : Après 11 jours de différenciation (2 expériences)
Contrôle : 77 nmol/min/mg de protéine
En présence d'un agoniste de PPARy (BRL49653) : 290nmol/min/mg de protéine
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Après 16 jours de différenciation (3 expériences)
Contrôle : 20 nmol/min/mg de protéine
En présence d'un agoniste de PPARy (BRL49653) : 390 nmol/min/mg de protéine
Cellules primo2 CS (T22 en présence de bFGF humain) :
Après 13 jours de différenciation (3 expériences)
Contrôle : 22 nmol/min/mg de protéine
En présence d'un agoniste de PPARy (BRL49653) : 30 nmol/min/mg de protéine
5. 2.2. Capacité de lipolyse des cellules de la primo 2 CA
Les lipolyses ont été réalisées, sur des cellules primo2 CA T32 avec des agonistes spécifiques des différents récepteurs ss adrénergiques, à savoir:
Isoprotérénol: ss1, ss2 adrénergique
Dobutamine: /31 adrénergique
Terbutaline: ss2 adrénergique CL316243 p3 adrénergique :
Les vitesses de lipolyse obtenues sont les suivantes (d'après la courbe de glycérol étalon) :
Contrôle : 5. 76 nmol/ h /mg de protéine
Dobutamine: 60.1 nmol/h/mg de protéine
Terbutaline:93.78 nmol/h/mg: 60.1 nmol/h/mg de protéine
CL316243: 17.1 nmol/h/mg de protéine
Les résultats sont illustrés dans la Figure 10.
Les expériences de lipolyse montrent la présence de récepteurs ss1 et ss2 adrénergiques, et l'absence de récepteurs ss3 adrénergiques, résultats en accord avec les observations in vivo (Galitzky et al; (1997) British J. Pharmacol 122: 1244-1250).
6. Caractérisation de la fonctionnalité des ostéoblastes pardétection du calcium associé à la matrice extracellulaire
6. 1 Méthodologie pour la caractérisation de la fonctionnalité des ostéoblastes :
Pour détecter le calcium sécrété par les ostéoblastes, les cellules sont cultivées dans le milieu de différenciation ostéoblastique précédemment décrit.
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Après différenciation optimale, le tapis cellulaire est lysé avec une solution 0.1 N NaOH pendant
45 min. On procède ensuite à une étape de neutralisation, en rajoutant du HCL 1 N ( 0.2 vol/ vol NaOH). Les boites, où restent toujours la matrice extracellulaire, sont séchées puis incubées avec la solution du "SIGMA calcium detection kit". La quantité de calcium sécrété par les ostéoblastes est quantifiée par lecture de cette solution au spectrophotomètre (D0575)
6. 2. Résultats : Fonctionnalité des ostéoblastes
La fonctionnalité des ostéoblastes a été mise en évidence par la technique de détection du calcium associé à la matrice extracellulaire (Figure 11) .
Nous pouvons également souligner l'importance du lot de sérum de veau dans la différenciation ostéoblastique. Ceci reflète le rôle crucial dans la différenciation ostéoblastique de certaines cytokines, hormones ou facteurs de croissance non caractérisés et présents dans des proportions variables selon les lots de sérum.
7. Marquage cellulaire et analyse en cytométrie de Flux
Le caractère HLA Classe 1 négatif des cellules souches de l'invention a été mis en évidence par analyse en cytométrie de flux, utilisant un système de simple marquage classique :
7.1 Simple marquage
Les cellules sont décollées puis lavées dans du PBS. Après centrifugation, les cellules sont re- suspendues et incubées avec l'anticorps primaire à la concentration de 10 g/ml pendant 30 min à 4 C. Les anticorps utilisés sont soit un anticorps monoclonal de souris, dirigé contre les molécules HLA de classe 1 (W6/32, Novocastra), soit un anticorps IgG de souris (Santa Cruz) utilisé comme contrôle négatif. Le nombre de cellules utilisées par condition est de 5 x 105 à
106. Les cellules employées pour cette analyse sont les suivantes :
HeLa : Cellules humaines tumorales (HLA Classe 1 positif : contrôle positif).
SVF : Tissu adipeux adulte, pas de doublement de population (HLA Classe # positif )
Primo 2CA : 120 doublements de population
Primo 2CS : 45 doublements de population
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Les cellules sont ensuite lavées puis incubées pendant 20 min à 4 C avec un anticorps (dit secondaire) qui est un anti IgG de souris couplé au FITC (0.2 g/ 106 cellules) (Caltag).
Les cellules sont ensuite lavées et leur fluorescence analysée par cytométrie en flux (Scan FACS Becton Dickinson).
Les résultats sont illustrés dans la Figure 15, et montrent que les cellules souches de l'invention (par exemple Primo 2CA) présentent un niveau d'expression de molécules HLA de Classe 1 non-détectable par cytométrie de flux en simple marquage.. Les cellules souches de l'invention sont donc HLA négatif .
Cette expérience de cytométrie de flux a également été mise en oeuvre avec les cellules souches de la Primo1 CA, de la Primo3CA et de la Primo6CA, ainsi qu'avec les cellules de la Primo 2CS (Figure 15). Dans tous les cas, le niveau d'expression de surface de HLA Classe # est négatif.
8. Obtention de clones multipotents à partir des cellules CA Les cellules de la Primo 2 CA ont été ensemencées en condition de dilution limite, à savoir 1/3 de cellules par puits de plaques de 24 puits, puis maintenues en présence de 10% FCS contenant 5ng/ml bFGF.
Dix jours après, des clones ont été isolés et amplifiés. Ces clones conservent leur phénotype non-différencié jusqu'à la mise en condition de différenciation. Leur capacité de différenciation en adipocytes et ostéoblastes est alors mise en évidence.
La Figure 16 montre deux clones, CA1 et CA3, qui ont été mis dans le milieu de culture permettant la différenciation en adipocytes et en ostéoblastes. Les adipocytes sont révélés par le colorant à l'huile rouge et les ostéoblastes par le rouge Alizarin.
9. Expression d'un transgène dans les cellules souches Les cellules souches de l'invention, notamment les cellules du clone CA1 (obtenu selon l'Exemple 7) ont été transduites au stade 21 doublements de population, par un rétrovirus exprimant un gène de résistance à un antibiotique, la puromycine, et le gène rapporteur LacZ sous le contrôle d'un promoteur LTR.
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Les virions infectieux sont produits à partir de cellules 293 transfectées de façon stable avec un vecteur PVPack-GP (contenant les séquences gag et pol), que l'on co-transfecte avec le plasmide pFB-Neo-lacZ et le vecteur PVPack-VSVG expressing vector, contenant la protéine G du virus de la stomatite vesiculaire La figure 17 montre que les cellules transduites puis sélectionnées en présence de puromycine expriment toutes le gène LacZ révélé in situ par l'activité ss-galactosidase.
10. Expression de Oct-4 et de ABCG2 dans les cellules souches CA Oct-4 est un facteur de transcription exprimé spécifiquement dans les cellules souches embryonnaires de souris et est indispensable au maintien de leur pluripotentialité. Il a été montré également que Oct-4 est exprimé par les cellules souches embryonnaires humaines.
L'expression transcriptionnelle de Oct-4 a été mise en évidence dans les cellules souches de l'invention. Les ARN sont extraits à partir des cellules CA (populations homogènes et populations clonales) et l'expression de Oct-4 est amplifiée par RT-PCR, puis détectée par hybridation. Les conditions de PCR sont : 94 C, 1 mn ; 57 C, 1 mn ; 72 C, 1 mn pendant 45 cycles.-RT : contrôle négatif.
De même, l'expression transcriptionnelle d'ABCG2 a été mise en évidence dans des cellules CA (populations homogènes et populations clonales). Les ARN sont extraits à partir des cellules CA et CA1 et l'expression de ABCG2 est amplifiée par RT-PCR, puis détectée par hybridation. Les conditions de PCR pour ABCG2 sont : 94 C, 1 mn; 60 C, 1mn; 72 C, 1 mn pendant 31 cycles.
La Figure 18 montre les résultats obtenus avec les cellules Primo 2CA du transfert 16 (48 doublements de population) et les cellules du clone Primo 2CA1 du transfert 5 (15 doublement de population). Elles expriment Oct-4 et ABCG2.

Claims (47)

  1. REVENDICATIONS 1. Cellule souche humaine multipotente et adulte, caractérisée en ce qu'elle présente : i) une activité télomérase significative, ii) un phénotype HLA Classe 1 négatif, iii) un caryotype normal, iv) une capacité à rentrer en quiescence, v) une capacité d'autorenouvellement conservée pendant au moins 130 doublements de population, et en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par un procédé comprenant les étapes suivantes : - mise en culture de cellules provenant d'un prélèvement de tissu adipeux humain, - sélection de deux sous-populations cellulaires, dites population CA et population CS , la population CA présentant une vitesse d'adhésion inférieure à 12 heures, et la population CS présentant une vitesse d'adhésion supérieure à 12 heures, - enrichissement de la population CA jusqu'à l'obtention d'une population de cellules quiescentes, - induction d'une prolifération des cellules souches de la population CA .
  2. 2. Cellule souche selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a une capacité d'autorenouvellement conservée pendant au moins 200 doublements de population.
  3. 3. Cellule souche selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est capable de se différencier en cellule d'origine endodermique ou ectodermique ou mésodermique.
  4. 4 Cellule souche selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est capable de se différencier en adipocyte, en ostéoblaste, en myocyte ou en chondrocyte.
  5. 5. Cellule souche selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle présente une activité télomérase correspondant à au moins 20 % de l'activité télomérase d'une lignée cellulaire de référence.
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  6. 6. Cellule souche selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle exprime le facteur de transcription Oct-4.
  7. 7. Cellule souche selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle peut être modifiée génétiquement.
  8. 8. Cellule souche selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle peut exprimer au moins un transgène.
  9. 9. Population de cellules comportant une pluralité de cellules selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est dépourvue d'adipocytes, de fibroblastes, de préadipocytes, de cellules endothéliales, de péricytes, de mastocytes, de cellules de muscle lisse.
  10. 10. Population de cellules selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'elle est clonale.
  11. 11. Population de cellules selon l'une quelconque des revendications 9 à 10, caractérisée en ce qu'elle devient quiescente après environ 60 doublements de population.
  12. 12. Population de cellules selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est capable de proliférer en présence de facteurs de croissance tels que le facteur de croissance fibroblastique basique (bFGF), le PDGF, l'EGF, le NGF, le SCF.
  13. 13. Procédé d'obtention de cellules souches humaines multipotentes, comprenant les étapes suivantes : - mise en culture de cellules provenant d'un prélèvement de tissu adipeux, - sélection de deux sous-populations cellulaires, dites population CA et population CS , la population CA présentant une vitesse d'adhésion inférieure à 12 heures, et la population CS présentant une vitesse d'adhésion supérieure à 12 heures, - enrichissement de la population CA jusqu'à l'obtention d'une population de cellules quiescentes, - induction d'une prolifération des cellules souches de la population CA .
  14. 14. Procédé selon la revedication 13, comprenant les étapes suivantes : a) digestion enzymatique d'un prélèvement de tissu adipeux, b) récupération d'une fraction cellulaire dépourvue d'adipocytes, contenant tous les types cellulaires présents dans la préparation obtenue selon (a), à l'exception des adipocytes,
    <Desc/Clms Page number 40>
    c) culture in vitro pendant au moins 12 heures, de la fraction cellulaire obtenue selon l'étape (b), d) sélection des deux sous-populations cellulaires, CA et CS , e) enrichissement de la population CA jusqu'à l'obtention d'une population de cellules capables d'entrer dans un état de quiescence, f) éventuellement, induction d'une prolifération des cellules souches de la population CA .
  15. 15. Procédé selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que le prélèvement de tissu adipeux provient d'un enfant sain âgé de moins de 10 ans.
  16. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que le prélèvement de tissu adipeux est un prélèvement de tissu extramédullaire, provenant par exemple de la région ombilicale ou de la région pubienne ou de la région inguinale ou de la région périnéale ou de la région abdominale, ou de la région sous-cutanée.
  17. 17. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la prolifération induite selon l'étape (f) est une prolifération intensive induite par addition d'un facteur de croissance.
  18. 18. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la digestion enzymatique selon l'étape (a) s'effectue par mise en contact du prélèvement de tissu adipeux avec une préparation de collagénase pendant une durée maximum de 10 minutes.
  19. 19. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la fraction cellulaire dépourvue d'adipocytes est obtenue par la mise en #uvre d'une étape d'élimination des adipocytes, par exemple par centrifugation.
  20. 20. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la fraction cellulaire mise en culture selon l'étape (c) ne subit aucune étape de filtration avant d'être mise en culture.
  21. 21. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'étape de culture (c) s'effectue dans un milieu de culture additionné de sérum foetal sans ajout d'autres facteurs de croissance.
  22. 22. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que, lors de l'étape de culture (e), un transfert cellulaire est effectué lorsque les cellules arrivent à 80% de confluence, le transfert étant effectué à une densité d'ensemencement d'environ 1000 à 3500 cellules / cm2.
    <Desc/Clms Page number 41>
  23. 23. Procédé selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que la population CA devient quiescente après environ 60 doublements de population.
  24. 24. Procédé selon la revendication 17caractérisé en ce que le facteur de croissance employé lors de l'étape (f) est choisi parmi le bFGF, le PDGF, l'EGF, le NGF, le SCF.
  25. 25. Cellules souches selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour une utilisation en thérapie.
  26. 26. Cellules souches selon la revendication 25 caractérisées en ce que la thérapie comporte la transplantation de cellules chez un individu, suivie de la différenciation des cellules et la régénération de tissu in vivo.
  27. 27. Cellules souches selon la revendication 26 caractérisées en ce que la transplantation est allogénique.
  28. 28. Utilisation d'une cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ou d'une population de cellules selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, pour la fabrication d'un produit thérapeutique pour la régénération de tissu in vivo.
  29. 29. Utilisation selon la revendication,28 caractérisée en ce que le tissu est un tissu osseux.
  30. 30. Utilisation selon la revendication 28caractérisée en ce que le tissu est un tissu adipeux.
  31. 31. Utilisation selon la revendication 28, caractérisée en ce que le tissu est un muscle.
  32. 32. Procédé pour la production de cellules différenciées du linéage mésodermique, caractérisé en ce que l'on cultive des cellules souches selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 à partir de la confluence, en présence d'un milieu de différenciation.
  33. 33. Procédé selon la revendication 32, caractérisé en ce que les cellules souches sont ensemencées à une densité d'environ 10 000 à 25 000 cellules / cm2.
  34. 34. Procédé selon la revendication,32 ou 33 caractérisé en ce que le milieu de culture est un milieu permettant la différenciation en adipocytes.
    <Desc/Clms Page number 42>
  35. 35. Procédé selon la revendication 32 ou 33, caractérisé en ce que le milieu de culture est un milieu permettant la différenciation en ostéoblastes.
  36. 36. Procédé selon la revendication 32 ou33 caractérisé en ce que le milieu de culture est un milieu permettant la différenciation en myocytes.
  37. 37. Procédé de criblage permettant d'identifier des agents susceptibles de moduler la différenciation de cellules en cellules du linéage mésodermique, caractérisé par : a) la mise en culture de cellules souches selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 dans des conditions permettant leur différenciation en cellules du linéage mésodermale, en présence d'un agent candidat, b) comparaison de la différenciation des cellules en présence de l'agent candidat avec la différenciation en l'absence de l'agent candidat .
  38. 38. Procédé selon la revendication 37 caractérisé en ce que les conditions de culture permettent la différenciation en adipocytes.
  39. 39. Procédé selon la revendication 37 caractérisé en ce que les conditions de culture permettent la différenciation en ostéoblastes.
  40. 40. Procédé selon la revendication 37 caractérisé en ce que les conditions de culture permettent la différenciation en myocytes.
  41. 41. Procédé selon la revendication 37 caractérisé en ce que l'agent susceptible de moduler la différenciation est une substance anti-différenciatrice.
  42. 42. Procédé de criblage permettant d'identifier des agents susceptibles de présenter une activité lipolytique, caractérisé par : a) la mise en culture de cellules souches selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 dans des conditions permettant leur différenciation en adipocytes, b) mise en contact des adipocytes ainsi obtenus, avec un agent candidat, c) évaluation de l'activité lipolytique de l'agent candidat.
  43. 43. Procédé de criblage permettant d'identifier des agents susceptibles de présenter une activité anti-lipolytique, caractérisé par : a) la mise en culture de cellules souches selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 dans des conditions permettant leur différenciation en adipocytes,
    <Desc/Clms Page number 43>
    b) mise en contact des adipocytes ainsi obtenus, avec un agent candidat, en présence d'un agent lipolytique, c) évaluation de l'activité anti-lipolytique de l'agent candidat.
  44. 44. Procédé de criblage permettant d'identifier des agents susceptibles de présenter une activité insulino-sensibilisante, caractérisé par : a) la mise en culture de cellules souches selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 dans des conditions permettant leur différenciation en adipocytes, b) mise en contact des adipocytes ainsi obtenus, avec un agent candidat, c) évaluation de l'activité insulino-sensibilisante de l'agent candidat.
  45. 45. Utilisation des cellules souches selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 dans la cosmétique.
  46. 46. Composition cosmétique comprenant une pluralité de cellules selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, en association avec un excipient, véhicule, solvant, colorant, parfum, antibiotique ou autres additifs acceptables dans les produits cosmétiques.
  47. 47. Composition pharmaceutique comprenant une pluralité de cellules selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 en association avec un excipient acceptable du point de vue physiologique.
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