FR2824842A1 - Phytocystatine - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à une nouvelle cystatine issue de Vigna unguiculata (Cystavine), ainsi qu'à ses applications dans la pharmacie, la cosmétique et l'agronomie, notamment pour la transgenèse végétale, pour la production de plantes résistantes à certains stress dont la sécheresse.

Description

ladite composition.

La présente invention se rapporte à une nouvelle cystatine issue de Vigna unguculata (Cystavine), ainsi qu'à ses applications dans la pharmacie, la cosmétique et l'agronomie, notamment pour la transgenèse végétale, pour la

production de plantes résistantes à certains stress dont la sécheresse.

Le terme générique " Cystatine " est utilisé pour désigner les inhibiteurs des cystéines protéinases. Les cystatines sont des inhibiteurs très puissants et réversibles des protéinases de la classe des cystéines protéinases (" papane-like >). Ces

endoprotéases sont caractérisées par la présence d'un résidu cystéine au site actif.

Les cystéines protéinases regroupent la papaine, les cathepsines B. H. L, la protéinase A virale de l'hépatite, les cystéines protéinases (certaines caspases) impliquées dans la mort cellulaire programmoe: apoptose, et les cystéines

protéinases des plantes dont certaines sont également impliquées dans l'apoptose.

Leurs inhibiteurs, les cystatines, constituent une super-famille qui comprend plusieurs familles: les stefines, les cystatines, les kininogènes, les cathelines (cat L)

et les phytocystatines (Turk et Bode, 1991).

Les Stefines sont constituées d'une châîne simple dont la masse moléculaire est d'environ llkDa, elles ne présentent pas de ponts disulfures et ne sont pas glycosylées. On peut nommer les stefine A et B humaine, cystatines a et, de rat,

orycystatine I et II de riz.

Les cystatines proprement dites sont caractérisées par la présence de deux ponts disultures en C terminal, une taille d'environ 1 10 - 1 15 acides aminés et une masse moléculaire d'environ 13 kDa. On cite par exemple la Cystatine C humaine

et la cystatine de blanc d'_uf.

les Kininogènes ont une masse moléculaire comprise entre 68 et 120 kDa en une seule chaîne protéique. Elles inhibent fortement la papame et la Cat L et faiblement les Cat B et H. leur propriété inhibitrice de la papane en font des inhibiteurs multi-fonctionnels. ils contiennent plusieurs domaines (souvent trois) " cystatin-like " dont les substrats diffèrent. Leur séquence possède des régions sensibles aux protéases et en particulier à l'aspartic protéinase (cathepsine D). Les

kininogènes proviendraient des cystatines par triplication du gène.

Du fait de leur potentiel inhibiteur de protéases, les cystatines sont potentiellement très intéressantes pour des applications variées impliquant les protéases, et notamment pour des applications thérapeutiques dans le domaine des maladies liées aux phénomènes inflamrnatoires. Certaines applications cosmétiques

sont également envisageables pour ces protéines.

La présente invention a pour objet une nouvelle cystatine, issue de l'espèce Vigna inguiculata, ainsi que la protéine recombinante correspondante. Cette

nouvelle cystatine semble étre une stefine double.

L'isolement de cette protéine a été effectué à partir d'un modèle de résistance au stress hydrique chez cette espèce végétale. L'obtention d'une nouvelle cystatine s'avère donc intéressante pour des applications pharmaceutiques et cosmétiques. De plus, le mode d'isolement de la protéine permet de prévoir des applications de cette protéine dans la transgenèse végétale, afin d'améliorer la résistance de plantes à la sècheresse. Enfin, les cystatines peuvent aussi être utiles

dans la lutte contre les virus et insectes par les plantes transgéniques les contenant.

Ainsi, la présente invention a pour objet un acide nuclélque purifé ou isolé, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléique choisie dans le groupe de séquences suivantes: a) SEQ IDN 1; b) la séquence d'un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs de SEQ ID N 1; c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, après alignement optimal avec une séquence définie en a) ou b); d) une séquence nucléique s'hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence nuclélque définie en a) ou b); e) la séquence complémentaire ou la séquence de 1'ARN

correspondant à une séquence telle que définie en a), b), c) ou d).

La séquence d' acides nucléiques selon l 'invention définie en c) présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ou b) ci-dessus, de prétérence 90 %, de façon plus

préférée 95 %, de façon la plus préférée 98 /0, ou 99 %.

Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente

description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou

non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucl éotid es non naturels, et pouvant correspondre aussi bi en à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADNs. Ainsi, les séquences nucléiques selon l'invention englobent

également les PNA (Peptid Nucleic Acid), ou analogues.

Il doit être compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel. I1 s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié. On entend ainsi également

désigner les acides nucléiques obtenus par synthèse chimique.

De préférence, les séquences selon l'invention codent pour une protéine ou un polypeptide ayant une activité d'inhibition de la papame, et/ou des caspases, notamment la caspase 3, et/ou de la calpaine, et/ou de toute autre cystéine

protéinase végétale.

Le fragment selon l'invention contient au moins 15, 25, 50, 75, 100, 150,

, 300, 500 nucléotides consécutifs de SEQ ID N 1.

Par " pourcentage d'identité " entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nocléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. On entend désigner par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci- après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisce par segment ou par " fenêtre de comparaison " pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P. BLAST N. FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de prétérence le programme BLAST, avec la

1 0 matrice BLOSUM 62. On peut également utiliser les matrices PAM ou PAM250.

Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignces de manière optimale, la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à comparer pouvant comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide arniné est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le

pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, de façon plus préférée 98 %, après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, etlou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nocléique présente au moins 80 %, de prétérence 90 %, de façon plus préférée 98 %, d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de rétérence. I1 s'agit de préférence de séquences dont les séquences complémentaires sont susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec les séquences SEQ ID N 1 de l'invention. De préférence, les conditions d'hyDridation spécifiques ou de forte stringence seront telles qu'elles assurent au moins 80 %, de préférence 90 %, de façon plus préférée 98 % d'identité après alignement optimal entre l'une des deux

séquences et la séquence complémentaire de l'autre.

Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. A titre d'illustration, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus,

sont avantageusement les suivantes.

L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes: (l) préhyDridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (l x SSC correspond à une solution O,lS M NaCl + 0,015 M citrate de sodium), 50 /0 de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), lO x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et l % d'ADN de sperme de saumon; (2) hybridation proprement dite pendant une nuit à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e.: 42 C, pour une sonde de taille > lOO nocléotides) suivie éventuellement de lavages non stringents et de 2 lavages stringents de 15 minutes à 42 C en O. l x SSC + O. l % SDS. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci- dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent étre adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite,

selon l'enseignement de Sambrook et al., l989.

Pammi les séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, de façon plus préférce 98 %, ou 99 % après alignement optimal avec la séquence selon l'invention, on préfère également les séquences nucléiques variantes de SEQ ID N l, ou de ses fragments, c'est-à-dire

l'ensemble des séquences nucléiques correspondant à des variants alléliques, c'est-

à-dire des variations individuelles de la séquence SEQ ID N 1. Ces séquences motées naturelles correspondent à des polymorphismes présents chez les mammifères, en particulier chez l'être humain et, notamment, à des polymorphismes pouvant conduire à la survenue d'une pathologie, comme par exemple une dégénérescence cellulaire. De préférence, la présente invention conceme les séquences nucléiques variantes dans lesquelles les mutations conduisent à une modiÈcation de la séquence d'acides aminés du polypoptide, ou de

ses fragments, codés par la séquence normale de SEQ ID N 1.

On entend également désigner par séquence nucléique variante tout ARN ou ADNc résultant d'une mutation et/ou variation d'un site d'épissage de la séquence

nucléique génomique dont l'ADNc a pour séquence SEQ ID N 1.

L'invention concerne de préférence un acide nocléique purifié ou isolé selon la présente invention, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué de la séquence SEQ ID N 1, de sa séquence complémentaire ou de la séquence de

l'ARN correspondant à SEQ ID N 1.

L'invention concerne également un acide nucléique purifié ou isolé caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide possédant un fragment continu d' au moins 50, 75, de façon plus préférée 100, 150, de façon la plus prétérée 175 acides aminés de la protéine SEQ ID N 2, et présentant une activité d'inhibition de la papane, et/ou des caspases, notamment la caspase 3, et/ou de la calpane et/ou de

toute autre cystéine protéinase végétale.

De préférence, on préLère les fragments de SEQ ID N 1 qui comprennent les sites actifs situés aux acides aminés 53 à 57 ou 148 à 152 de SEQ ID N 2. Un site putatif de coupure par une aspartic protéinase a également été identifié aux acides aminés 91 à 94 de SEQ ID N 2. Ainsi, certains polypeptides préférés dans la présente invention consistent dans les polypeptides 1-90, ou 95-195 de SEQ ID N 2. Ces deux fragments contiennent en effet un site actif d'inhibition des cystéine protéinases. L' existence de ces deux sites, et de deux fragments polypeptidiques

dans Cystavine permet donc de définir cette protéine comme une stefine double.

Les amorces ou sondes, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence d'un acide nucléique selon l'invention, font également partie de l'invention. Ainsi, la présente invention concerne également les amorces ou les sondes selon l'invention qui peuvent permettre en particulier de mettre en évidence ou de discriminer les séquences nucléiques variantes, ou d'identifier la séquence génomique des gènes dont l'ADNc est représenté par SEQ ID N 1, en utilisant notamment une méthode d'amplification telle que la méthode PCR, ou une méthode apparentée. L'invention concerne également l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention comme sonde ou amorce, pour la détection,

l'identification, le dosage ou l'amplification de séquence d'acide nucléique.

Selon l'invention, les polynucléotides pouvant être utilisés comme sonde ou comme amorce dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquence nucléique, présentent une taille minimale de 15 bases,

de préférence de 20 bases, ou mieux de 25 à 30 bases.

Les sondes et amorces selon l'invention peuvent être marquées directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif par des méthodes bien connues de l'homme du métier, afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable. Les séquences de polynucléotides selon l'invention non marquées peuvent

étre utilisées directement comme sonde ou amorce.

Les séquences sont généralement marquées pour obtenir des séquences utilisables pour de nombreuses applications. Le marquage des amorces ou des sondes selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des

mol écules non radio actives.

Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32p, le 33P, le 35S, le 3H ou le '25I. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, I'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, l es colorants, l es agents luminescents tel s que l es agents radioluminescents, chémoluminescents,

bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.

Les polynucléotides selon l'invention peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment la technique de PCR (amplification en chaîne par polymérase) (RolLs et al., 1991). Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N 4,683,202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions, puis séquencés. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée en utilisant comme amorces les séquences nucléotidiques de polynucléotides de 1'invention et comme matrices, des plasmides contenant ces séquences ou encore les produits d'amplification dérivés. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon blologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits

fragments nucléotidiques amplifiés.

L'invention vise également les acides nucléiques susceptibles d'étre obtenus

par amplification à l 'aide d' amorces selon l 'invention.

D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entend désigner toutes les méthodes mettant en _uvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues. En général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription reverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992), la technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite par Kwoh et al. (1989), la technique 3SR (Self-Sustained Sequence Replication) décrite par Guatelli et al. (1990), la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) décrite par Kievitis et al. (1991), la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren et al. (1988), la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev (1992), la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al. (1990), la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par Miele et al.

(1983). Certaines de ces techniques ont depuis été perfectionnées.

Dans le cas o le polynucléotide cible à détecter est un ARNm, on utilise avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en _uvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de l'ARNm contenu dans l'échantillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes

mises en oeuvre dans le procédé d 'amplification ou de détection selon l 'invention.

La technique d'hybridation de sondes peut étre réalisée de manières diverses (Matthews et al., 1988). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un support (tels que la nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence

ou de l'activité enzymatique liée à la sonde).

Selon un autre mode de mise en _uvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sondes de capture. Dans ce cas, une sonde, dite << sonde de capture ", est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite " sonde de détection ", marquée par un élément facilement

détectable.

Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants, il faut ainsi citer en particulier les oligonucléotides anti-sens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du produit

correspondant, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression.

De tels oligonucléotides peuvent être utilisés en tant que produits thérapeutiques et médicaments pour réguler les phénomènes d'inflammation et de répression tumorale. L'utilisation de ses séquences sens ou antisens peut également être mise en _uvre in vitro, pour définir de nouveaux moyens de modèle et d'étude

de la résistance au stress, notamment hydrique.

La présente invention concerne également un polypeptide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi: a) un polypeptide de séquence SEQ ID N 2; b) un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs d'un polypeptide défini en a); c) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide défini en a); d) un polypeptide comportant au moins 80 % d'identité avec le

polypoptide de a), b) ou c).

Par "polypeptide ", on entend, au sens de la présente invention, désigner

des protéines ou des peptides.

Un fragment selon l'invention présente de préférence au moins 5, 7, 8, 10,

, 20, 25, 50 acides aminés consécutifs de SEQ ID N 2.

Par " fragment biologiquement actif ", on entend un fragment possédant la même activité biologique que le fragment peptidique dont il est déduit, de prétérence dans le méme ordre de grandeur (à un facteur 10 près). I1 présente de préférence au moins 5, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 50 acides aminés consécutifs de SEQ ID N 2. 1 0 On note ainsi notamment les fragments contenant les sites actifs 53-57 et/ou 148-152 de SEQ ID N 2, ainsi que les fragments contenant les acides aminés 1-90

ou 95-195 de SEQ ID N 2.

De préférence une protéine ou un polypeptide selon l'invention présente une activité d'inhibition de la papane, et/ou des caspases, notamment la caspase 3, et/ou

1 5 de la calpame et/ou de toute autre cystéine protéinase végétale.

De préférence un polypeptide selon l'invention est un polypeptide constitué de la séquence SEQ ID N 2 (correspondant à la protéine codée par le gène Cystavine) ou d'une séquence possédant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N

2 après alignement optimal.

La séquence du polypeptide présente un pourcentage d'identité d'au moins % après alignement optimal avec les séquences SEQ ID N 2 ou les acides aminés 1-90 ou 95-195 de SEQ ID N 2, de prétérence 90 ou 95 %, de façon plus préLérée 98 %, ou 99 %, et a de préLérence une activité d'inhibition de la papame, et/ou de la caspase 3, et/ou de la calpane et/ou de toute autre cystéine protéinase végétale. Par polypeptide dont la séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, de façon plus préférée 98 %, après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les polypeptides présentant certaines modifications par rapport au polypoptide de rétérence, comme en particulier une ou plusieurs délétions, troncations, un

allongement, une fusion chimérique, et/ou une ou plusieurs substitutions.

Parmi les polypoptides dont la séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, de façon plus préférée 98 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID N 2 ou avec 1'un de ses fragments selon l'invention, on préfère les polypeptides variants codés par les séquences nucléiques variantes telles que précédemment définies, en particulier les polypeptides dont la séquence d'acides aminés présente au moins une mutation correspondant notamment à une troncation, délétion, substitution et/ou addition d'au moins un résidu d'acide aminé par rapport à la séquence SEQ ID N 2 ou avec l'un

de ses fragments. L' invention comprend aussi les polypeptides glycosylés.

La présente invention concerne également les vecteurs de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique ou codant pour un polypeptide selon l'invention. Un tel vecteur peut également contenir les éléments nocessaires à

l'expression et éventuellement à la sécretion du polypeptide dans une cellule hôte.

Une telle cellule hôte est également un objet de l'invention. Un tel vecteur peut être

réplicatif ou intogratif dans la cellule hôte.

Les vecteurs caractérisés en ce qu'ils comportent une séquence de promoteur et/ou de régulateur selon l'invention, font également partie de l'invention. Lesdits vecteurs comportent de préDérence un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions approprices de régulation de la transcription. Ils doivent pouvoir être maintenus de façon stable dans la cellule et peuvent éventuellement posséder des signaux particuliers

spécifiant la localisation et/ou la sécrétion de la protéine traduite.

Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de 1'hôte

choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.

Parmi les systèmes à réplication autonome, on utilise de prétérence en fonction de la cellule hôte, des systèmes de type plasmidique ou viral, les vecteurs viraux pouvant notamment être des adénovirus (Perricaudet et al., 1992), des rétrovirus, des lentivirus, des poxvirus ou des virus herpétiques (Epstein et al., 1992). L'homme du métier connaît les technologies utilisables pour chacun de ces systèmes. Lorsque l'on souhaite l'intégration de la séquence dans les chromosomes de la cellule hôte, on peut utiliser par exemple des systèmes de type plasmidique ou viral; de tels virus sont, par exemple, les rétrovirus (Temin, 1986), ou les AAV

(Carter, 1993).

Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que 1'ADN nu ou 1'ARN nu selon la technique développée par la société VICAL, les chromosomes artificiels de bactérie (BAC, bacterial artificial chromosome), les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificial chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, mouse artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules murines et de manière préférée les chromosomes artificiels d'homme (HAC, human artificial

chromo some) pour l 'expression dans l es cellules humaines.

De tels vecteurs sont préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent étre introduits dans un hôte 1 5 approprié par des méthodes standard, telles que par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, la transformation après perméabilisation

chimique de la membrane, la fusion cellulaire. L'invention comprend en outre les cellules hôtes, notamment les cellules

encaryotes et procaryotes, transformées par les vecteurs selon l'invention ainsi que les végétaux et animaux transgéniques, de préférence les mammifères, excepté l'Homme, comprenant une desdites cellules transformées selon l'invention. Ces animaux peuvent être utilisés en temps que modèles, pour l'étude de l'étiologie de

maladies inflammatoires et/ou immunes, ou pour l'étude de cancers.

Parmi les cellules utilisables aux sens de la présente invention, on peut citer les cellules bactériennes (Olins et Lee, 1993), mais aussi les cellules de levure (Buckholz, 1993), de méme que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards et Aruffo, 1993), et notamment les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO). On peut citer également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant par exemple en _uvre des baculovirus (Luckow, 1993). On cite aussi, et de manière préférée, les cellules végétales, notamment les cellules de végétaux monocotylédones ou dycotylédones (angiospermes) ou gymnospermes. On peut notamment citer les cellules de tabac, bananes, riz, luzerne, alfalfa, manioc, blé, coton, soja, haricot, chou, tomate, mais, pomme de terre, betterave... Il est toutefois plus intéressant de produire la protéine à partir de la plante complète transgénique régénérée à partir de ces cellules végétales. Une cellule végétale présentant un intérêt est aussi une cellule d'algue, notamment d'algue microscopique. Parmi les mammifères selon l'invention, on prétère des animaux tels que les rongeurs, en p articuli er l es souris, l es rats ou les lapins, exprim ant un polypeptide

selon l'invention.

Parmi les mammifères selon l'invention, on prétère également des animaux tels que les souris, les rats ou les lapins, caractérisés en ce que le gène codant pour la protéine de séquence SEQ ID N 2, ou dont la séquence est codée par le gène homologue chez ces animaux, n'est pas fonctionnel, est invalidé ou présente au

moins une mutation.

Ces animaux transgéniques sont obtenus par exemple par recombinaison homologue sur cellules souches embryonnaires, transfert de ces cellules souches à des embryons, sélection des chimères affectées au niveau des lignées

reproductrices, et croissance desdites chimères.

Les animaux transgéniques selon l'invention peuvent ainsi surexprimer le gène codant pour la protéine selon l'invention, ou exprimer ledit gène dans lequel est introduite une mutation. Ces animaux transgéniques peuvent aussi surexprimer, sous-exprimer le gène intrinsèque homologue correspondant à Cystavine. Il est même possible que ce gène homologue soit rendu silencieux par une mutation dans

le génome de ces animaux transgéniques.

Ces animaux transgéniques, en particulier des souris, sont obtenus par exemple par transfection de copie de ce gène sous contrôle d'un promoteur fort de

nature ubiquitaire, ou sélectif d 'un type de tissu, ou après transcription viral e.

Alternativement, les animaux transgéniques selon l'invention peuvent être rendus déficients pour le gène codant pour le polypeptide de la séquence SEQ ID N 2, ou son gène homologue, par inactivation à l'aide du système LOXP/CRE recombinase (Rohlmann et al., 1996) ou de tout autre système d'inactivation de

l'expression de ce gène.

L'invention concerne également une plante, caractérisée en ce qu'elle contient une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) recombinante(s) selon l'invention, intégrée(s) de façon stable dans son génome, ladite plante étant choisies notamment parmi le colza, le tabac, le mais, le pois, la tomate, la carotte, le blé, l'orge, la pomme de terre, le soja, le haricot, le tournesol, la laitue, le riz, la luzerne, la betterave, la vigne, le coton, le chou, ou tout autre gymnosperme ou angiosperme mono ou dicotyledone. L'invention se rapporte également à un extrait de plante ou une partie de plante, notamment feuilles et/ou fruits et/ou semences et/ou cellules de plantes, transformés génétiquement, dérivés de ladite plante selon l'invention. De préférence, ladite séquence nucléotidique selon 1'invention est intégrée de façon

stable dans le génome de ladite plante, à un locus qui n'est pas le locus naturel.

Avantageusement, les séquences nucléotidiques recombinantes selon l'invention contiennent une (ou plusieurs) séquence(s) codant pour un peptide responsable de l'adressage des polypeptides recombinants dans un compartiment déterminé de la cellule végétale, notamment dans le réticulum endoplasmique, I'appareil de Golgi, les mitochondries, les chloroplastes ou dans les vacuoles de stockage ou l es vacuol es l ysosomal es, ou bi en même à l 'extérieur de l a cellul e, d ans

la paroi pectocellulosique ou dans l'espace extracellulaire aussi appelé apoplasme.

Parmi les terminateurs de transcription susceptibles d'être utilisés pour la transformation de cellules de plantes dans le cadre de la présente invention, on peut citer le terminateur polyA 35S du virus de la mosaque du chou-fieur (CaMV), ou le terminateur polyA NOS, qui correspond à la région en 3' non codante du gène de la

nopaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumetaciens souche à nopaline.

Parmi les promoteurs de transcription susceptibles d'être utilisés pour la transformation de cellules de plantes dans le cadre de la présente invention, on peut citer - le promoteur 35S (P35S), ou avantageusement le promoteur constitutif double 35S (Pd35S) du CaMV, ces promoteurs permettant l'expression des pol ypeptides recombinants de l 'invention dans l 'ensemble de l a pl ante obtenue à partir de cellules transformoes selon l'invention, et sont décrits dans l'article de Kay et al., (1987, Science, 236, 1299-1302), le promoteur PCRU du gène de la cruciférine de radis perrnettant l'expression des polypeptides recombinants de l'invention uniquement dans les semences (ou graines) de la plante obtenue à partir de cellules transformées selon l'invention, et décrit dans l'article de Depigny-This et al., (1992, Plant. Mol. Biol., 20, 467- 479), les promoteurs PGEAI et PGEA6 correspondant à la région 5' non codante des gènes de la protéine de réserve de graines, GEAI et GEAI, respectivement, d'Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., 1993, Mol. Gen. Genet., 238, 409-418), et permettant une expression spécifique dans les graines, le promoteur chimérique super-promoteur PSP (Ni M et al., l 995), constitué de la fusion d'une triple répétition d'un élément activateur transcriptionnel du promoteur du gène de l'octopine synthase d'Agrobacterium tumefaciens, d'un élément activateur transcriptionnel du promoteur du gène de mannopine synthase et du promoteur mannopine synthase d'Agrobacterium tumefaciens, - le promoteur actine du riz suivi de 1'intron actine de riz (PAR-IAR) contenu dans le plasmide pActl-F4 décrit par McElroy et al. (1991, Mol Gen Genet, 231, 150-160), - le promoteur HMGW (High Molecular Weight Glutenine) d'orge (Anderson et al, 1989, T.A.G., 77, 689-700), le promoteur du gène de zéine de mais (Pyzéine) contenu dans le plasmide py63 décrit dans Reina et al. (1990, Nucleic Acid Rescarch, 18, 6426), et permettant 1'expression dans l'albumen des semences de mas. L'homme du métier connait aussi les promoteurs permettant l'expression

spécifque des gènes dans les feuilles ou les racines de la plante.

Les séquences codant pour un peptide d'adressage utilisoes dans le cadre de la présente invention, peuvent être d'origine végétale, humaine ou animale, et on peut citer: la séquence nucléotidique de 69 nucléotides codant pour le prépeptide (peptide signal) de 23 acides aminés de la sporamine A chez la patate douce, ce peptide signal permettant l'entrée des polypeptides recombinants de l'invention dans le système de sécrétion des cellules végétales transformées selon l'invention (à savoir principalement dans le réticulum endoplasmique), la séquence nucléotidique de 42 nucléotides cod ant pour le propeptid e N-terminal d'adress age vacuol aire de 14 acides aminés de la sporamine A chez la patate douce, permettant l'accumulation des polypeptides recombinants de l'invention dans les vacuoles des cellules végétales transformées selon l'invention, ou la séquence nucléotidique de 111 nucléotides codant pour le prépropeptide de 37 acides aminés de la sporamine A constitué de la partie N-terminale vers la partie C-terminale des 23 acides aminés du poptide signal susmentionné suivis par les 14 acides aminés du propeptide susmentionné, ce prépropeptide permettant l'entrée de polypeptides recombinants de l'invention dans le système de sécrétion et leur accumulation dans les vacuoles des cellules végétales transformées selon l'invention (Murakami et al., 1986, Plant Mol.

Biol., 7, 343-355 et Matsuoka et al, 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 834-838).

On peut aussi citer le propeptide carboxyterminal de la lectine d'orge décrit notamment dans les articles de Schroeder et al., 1993 (Plant Physiol., 101, 451 458), et de Bednarek et al, 1991 (Plant Cell, 3, 11951206), et le PRS (Pathogenesis Related Protein, Cornelissen et al. 1986) permettant la sécrétion, ou les séquences codant pour les peptides KDEL, SEKDEL et HDEL et permettant un adressage

dans le réticulum endoplasmique.

Les cellules, plantes et mammifères selon l'invention sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide selon l'invention, comme décrit ci

dessous, et peuvent également servir à titre de modèle d'analyse.

Les cellules, plantes ou mammifères transformés tels que décrits précédemment peuvent aussi être utilisés à titre de modèles afin d'étudier les 1 5 interactions entre les polypeptides selon 1'invention, et les composés chimiques ou protélques, impliqués directement ou indirectement dans les activités des polypeptides selon l'invention, ceci afin d'étudier les différents mécanismes et

interactions mis en jeu.

Ils peuvent en particulier étre utilisés pour la sélection de produits interagissant avec les polypeptides selon 1'invention, notamment la protéine de séquence SEQ ID N 2 ou ses variants selon l'invention, à titre de cofacteur, ou d'inhibiteur, notamment compétitif, ou encore ayant une activité agoniste ou

antagoniste de l'activité des polypeptides selon l'invention.

L'invention concerne également l'utilisation d'une cellule, d'une plante, d'un mammifère ou d'un polypoptide selon 1'invention pour le criblage de composés chimiques ou biochimiques pouvant interagir directement ou indirectement avec les polypeptides selon l'invention, et/ou capable de moduler

l'expression ou l'activité de ces polypeptides.

Ainsi, I'invention se rapporte à un procédé de criblage de composés capables de se fixer à un polypoptide de séquence SEQ ID N 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de mise en contact d'un polypeptide, d'une cellule, d'un mammifère, d'une plante selon l'invention, avec un composé candidat et de détection de la formation d'un complexe entre ledit composé candidat et ledit polypeptide. L'invention se rapporte également aux procédés de criblages permettant l'identification de composés diminnant ou inhibant la capacité d'un polypeptide selon l'invention à inhiber les activités cytéine protéinase, et notamment de la calpaine, des caspases (en particulier la caspase 3) ou de la papalne, dans lesquels on met en _uvre un protocole expérimental permettant la mise en évidence de l'activité inhibitrice ci-dessus énoncée, et l'on examine ladite activité en présence

ou en absence du composé testé.

De la même façon, l'invention concerne aussi un procédé de criblage de composés capables d'interagir in vitro ou in vivo avec un acide nucléique selon l'invention, en utilisant un acide nucléique, une cellule, une plante ou un mammifère selon l'invention, et en détectant la formation d'un complexe entre les

composés candidats et l'acide nocléique selon l'invention.

Les composés ainsi sélectionnés sont également objets de l'invention.

Un tel composé selon l'invention peut être un composé ayant une structure chimique (du type petite molécule organique), un lipide, un sucre, une protéine, un peptide, un composé hybride protéine-lipide, protéine-sucre, poptide-lipide, ou peptide-sucre, une protéine ou un peptide sur lequel on a ajouté des ramifications

chimiques.

Parmi les composés chimiques envisagés, ils peuvent contenir un ou plusieurs cycles, aromatique(s) ou non, ainsi que plusieurs résidus de toute sorte

(notamment alkyle inférieur, c'est-à-dire présentant entre I à 6 atomes de carbones).

L'invention concerne également l'utilisation d'un composé interagissant avec un polypeptide ou un acide nucléique selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné notamment au traitement du cancer ou d'une maladie

inflammatoire, caractérisé en ce qu'il est identifié par un procédé selon l'invention.

L'invention concerne également l'utilisation d'un composé diminnant ou inhibant la capacité de la Cystavine à inhiber les activités cytéine protéinase, et notamment de la calpane, des caspases (en particulier la caspase 3) ou de la papame, pour la préparation d'un médicament destiné notamment au traitement du cancer ou d'une maladie inflammatoire, caractérisé en ce qu'il est identifié par un

procédé selon l'invention.

Les médicaments envisagés peuvent aussi servir pour le traitement d'autres

maladies, telles celles mentionnées ci-dessous.

On peut aussi utiliser les composés selon l'invention pour la préparation de

compositions à usage cosmétique.

L'invention concerne aussi l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique

selon l'invention pour la synthèse de polypeptides recombinants.

La méthode de production d'un polypeptide de l'invention sous forme recombinante, elle-même comprise dans la présente invention, se caractérise en ce que l'on cultive les cellules transformées, notamment les cellules ou plantes de la présente invention, dans des conditions permettant l'expression d'un polypoptide recombinant codé par une séquence d'acide nuclélque selon l 'invention, et que l 'on récupère ledit polypeptide recombinant. Une méthode tout à fait préférée consiste

en l'utilisation de E. col' pour la production de la protéine recombinante.

Les polypeptides recombinants, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par ladite méthode de production, font également partie de l'invention. Les polypeptides recombinants obtenus comme indiqué ci-dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent

présenter ou non la structure tertiaire naturelle.

Les séquences des polypeptides recombinants peuvent être également

modifiées afn d'améliorer leur solubilité, en particulier dans les solvants aqueux.

De telles modifications sont connues de l'homme du métier comme par exemple la délétion de domaines hydrophobes ou la substitution d'acides aminés

hydrophobes par des acides aminés hydrophiles.

Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences d'acide nocl éique d éfini es ci-dessus, selon l es techniques de production de pol ypeptides recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression

dans un hôte cellulaire.

Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite

de disposer d'un vecteur et d'une cellule hôte selon l'invention.

Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mi se en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplicati on

et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transtectée.

Les procédés utilisés pour la purification d'un polypeptide recombinant sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant peut être purifié à partir de Iysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques, His-Tag, etc Les polypeptides selon la présente invention peuvent aussi être obtenus par synthèse chimique en utilisant l'une des nombreuses synthèses peptidiques connues, par exemple les techniques mettant en _uvre des phases solides (voir notamment Stewart et al., 1984) ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par

condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique.

Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des

acides aminés non naturels correspondants sont également compris dans l'invention.

Les anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon l'invention, font partie de l'invention. Des anticorps polyclonaux spécifiques peuvent être obtenus à partir d'un sérum d'un animal immunisé contre les polypeptides selon l'invention, notamment produit par recombinaison génétique ou par synthèse peptidique, selon les modes

opératoires usuels.

On note notamment l'intérêt d'anticorps reconnaissant de façon spécifique

certains polypeptides, variants, ou leurs fragments immunogènes, selon l'invention.

Les anti corps mono- ou polyclonaux ou l eurs fragments, anti corps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement le polypeptide de séquence SEQ ID N 2 sont

particulièrement prétérés.

Les anticorps monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon la

méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kohler et Milstein (1975).

Les anticorps selon l'invention sont, par exemple, des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab')2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin

d'obtenir un signal détectable etlou quantifiable.

L'invention concerne également des méthodes pour la détection et/ou la purification d'un polypeptide selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en _uvre un anticorps selon l'invention. L'invention comprend en outre des polypeptides purifiés, caractérisés en ce

qu'ils sont obtenus par une méthode selon l'invention.

Par ailleurs, outre leur utilisation pour la purification des polypeptides, les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent également étre utilisés pour la détection de ces polypeptides dans un échantillon

biologique (notamment pour des tests ELISA ou assimilés).

Ils constituent ainsi un moyen d'analyse immunocytochimique ou immuno histochimique de l'expression des polypeptides selon l'invention, notamment le polypeptide de séquence SEQ ID N 2 ou l'un de ses variants, par exemple par

immunofluorescence, marquage à l'or, immuno-conjugués enzymatiques.

Ils peuvent permettre notamment de mettre en évidence une expression

anormale de ces polypeptides dans les tissus ou prélèvements biologiques.

Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en _uvre dans toute situation o l'expression d'un

polypeptide selon l'invention, normal ou muté, doit étre observoe.

Les anticorps peuvent étre obtenus directement à partir de sérum humain, ou à partir d'animaux immunisés avec des polypeptides selon l'invention, puis

" humanisés ".

Ainsi, un procédé de détection d'un polypeptide selon l'invention dans un échantillon biologique, comprenant les étapes de mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps selon l'invention et de mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé est également un objet de l'invention, ainsi qu'une trousse perrnettant de mettre en _uvre un tel procédé. Une telle troussecontient en particulier: a) un anticorps monoclonal ou polyclonal selon l'invention; b) éventuellement des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réaction immunologique; c) les réactifs permettant la détection du complexe antigène

anticorps produit lors de la réaction immunologique.

Les polypeptides ou les anticorps selon l'invention peuvent être utilisés dans le traitement des maladies inflammatoires, des cancers, ou pour lutter contre les effets du vieillissement chez un mammifère, en particulier chez l'homme. On note notamment la protéinurie glomérulaire, la résorption des os, le métabolisme des métastases, l'invasion tumorale, l'infarctus du myocarde (notamment les dommages tissulaires), la maladie de Duchenne, toute maladie inflammatoire ou mettant en jeu des phénomènes inflammatoires (par exemple la spondylarthrite ankylosante, le rhumatisme psoriasique, la polyarthrite rhumatoïde, une maladie inflammatoire granulomateuse, telle le Syndrome de Blau ou la maladie de Crohn), la dystrophie musculaire, la maladie d'Alzeimer, les scléroses

multiples, les maladies virales (y compris oculaires), les maladies dégénératives.

Les polypoptides ou les anticorps selon l'invention peuvent être utilisés tels quels ou dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies précitées. L'analyse peut être effectuée par séquence de tout ou partie du gène, ou par d'autres méthodes connues de l'homme du métier. On peut en particulier utiliser des méthodes basées sur la PCR, par exemple la PCR-SSCP qui permet de détecter

d es mutations ponctuell es.

L'invention se rapporte également à une puce à ADN contenant une séquence selon l'invention. On peut utiliser une telle puce pour effectuer l'analyse de la présence et/ou de l 'expression de l 'acide nocléique selon l 'invention par fixation d'une sonde selon l'invention correspondant à l'une des séquences SEQ ID

N l sur une puce à ADN et l'hybridation sur ces microplaques.

De même, une puce à protéines contenant une séquence d'acides aminés selon l'invention est aussi un objet de l'invention. Une telle puce à protéines permet l'étude des interactions entre les polypeptides selon l'invention et d'autres protéines ou des composés chimiques, et peut ainsi être utile pour le criblage de composés interagissant avec les polypeptides selon l'invention. On peut également utiliser les puces à protéines selon l'invention pour détecter la présence d'anticorps dirigés contre les polypetides selon l'invention dans le sérum de patients. On peut aussi

mettre en _uvre une puce à protéines contenant un anticorps selon l'invention.

L'invention concerne aussi l'utilisation de plantes, extraits de plantes ou parties de plantes selon l'invention, et/ou de polypeptides selon l'invention, pour la préparation de compositions pharmaceutiques, médicales, odontologiques, cosmétiques ou biotechnologiques, ainsi qu'une composition pharmaceutique, médicale, odontologique, cosmétique ou biotechnologique, caractérisée en ce qu'elle comprend des plantes, extraits de plante, parties de plantes ou des polypeptides selon l'invention L'invention se rapporte également à un procédé de détection et/ou de dosage et/ou d'isolement d'un acide nucléique selon 1'invention dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes de mise en contact d'une sonde selon l'invention avec un échantillon biologique et de détection et/ou dosage et/ou isolement de l'hybride formé entre ledit polynucléotide et l'acide nucléique de

l'échantillon biologique.

L'agent capable de détecter spécifiquement un acide nucléique codant pour la protéine Cystavine est avantageusement une sonde d'oligonucléotides selon l'invention, qui peut être formée d'ADN, d'ARN, de PNA, modifiés ou non. Les modifications peuvent inclure un marquage radioactif ou fluorescent, ou être dues à des modifications dans les liaisons entre les bases (phosphorothioates, ou méthylphosphonates par exemple). L'homme du métier connait les protocoles

permettant d'isoler une séquence spécifique d'ADN.

L'homme du métier sait mettre en _uvre un tel procédé, et peut en particulier utiliser une trousse de réactifs comprenant: a) un polynucléotide selon l'invention, utilisé en tant que sonde; b) les réactifs nocessaires à la mise en _uvre d'une réaction d'hybridation entre ladite sonde et l'acide nucléique de l'échantillon biologique; c) les réactifs nécessaires à la détection et/ou le dosage de l'hybride formé entre ladite sonde et l'acide nucléique de l'échantillon biologique;

qui est également un objet de l'invention.

Une telle trousse peut également contenir des contrôles positifs ou négatifs

afin d'assurer la qualité des résultats obtenus.

Toutefois, afin de détecter et/ou doser et/ou isoler un acide nucléique selon l'invention, I'homme du métier peut également effectuer une étape d'amplification

à l'aide d'amorces choisies parmi les séquences selon l'invention.

L'invention se rapporte également à un composé caractérisé en ce qu'il est .. chos parm a) un acide nucléique selon l'invention; b) un polypeptide selon l'invention; c) un vecteur selon l'invention; d) une cellule selon 1'invention; e) un anticorps selon l'invention; f) un composé selon l'invention, à titre de médicament, ainsi qu'à un de ces composés pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie inflammatoire, d'un cancer, ou pour lutter contre

les effets du vieillissement chez un mammifère, en particulier chez l'homme.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un acide nucléique selon l'invention pour la production d'une plante transgénique possédant des propriétés améliorées de résistance aux stress ablotiques, notamment le stress hydrique, et aux stress biotiques tels ceux induits par les virus et insectes, par rapport à la plante non transgénique. On peut aussi utiliser l'acide nuclélque selon l'invention pour produire des plantes transgéniques plus résistantes au gel, ou à des conditions extrémes de salinité. Les acides nucléiques selon l'invention peuvent également étre

utilisés pour lutter contre la sénescence cellulaire.

On peut introduire l'acide nucléique selon l'invention dans la plante, soit par l'intermédiaire d'un vecteur réplicatif dans les cellules, soit par l'intermédiaire d'un vecteur intégratif dans le génome de l a cellule. Les pl antes transgéni ques sont tel l es que décrites précédemment. De préférence, la cystatine selon l'invention sera

exprimée dans les feuilles de la plante ainsi transformée.

En effet, les travaux de la présente invention indiquent pour la première fois que le gène selon l'invention est fortement impliqué dans la réponse adaptative des plantes à la sécheresse: les plantes résistantes stimulent l'expression du gène codant la cystatine Cystavine ce qui n'est pas le cas des plantes sensibles. Il existe en effet une corrélation entre la régulation du gène et la résistance membranaire et la

résistance aux champs des plantes.

* Cystavine est donc impliquée dans la protection cellulaire lors du stress via la modulation de l'activité des cystéines protéinases foliaires. En conséquence, une stratogie de transgenèse visant à induire ou surexprimer le transgène selon l'invention via un promoteur inductible par le stresset spécifique des feuilles peut aboutir à l'obtention de plantes plus résistantes au stress hydrique induit par la sécheresse, les fortes températures, le gel, la salinité, la sénescence cellulaire, la

résistance aux insectes et/ou virus.

Les études rapportées par la présente invention montrent que Cystavine inhibe l'activité de la caspase. Les membres de la famille des caspases sont des cystéine protéases qui présentent un clivage spécifiques de l'aspartate. Elles jouent un rôle significatif à la fois dans l'inflammation ( Leung et al., 2000, J. Medicinal Chem., 43: 305-341) et 1'apoptose. Les inhibiteurs de caspase sont des outils très importants car ils inhibent 1'induction de 1'apoptose dans des cellules tumorales diverses (Schlogel et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 1841) et dans les cellules

normales (Zaks et al., 1999, J Immunol. 162: 3273-9).

EXEMPLES

Exemple 1: Caractérisation et clonae de l'ADNc codant une nouvelle cstatine putative L'ADNc a été caractérisé après criblage d'une banque d'expression de

feuille de haricot Niébé (Vigna unguiculata Vu, Cowpea).

La sonde d'ADN nécessaire au criblage a été obtenue par amplification PCR (Polymerase Chain Reaction) au moyen d'amorces oligonucléotidiques dogénérées déduites de deux séquences consensus déterminces par alignement de trois séquences de cystatines végétales publiées (BLAST) via Infobiogen (SEQ ID N 3

et SEQ ID N 4).

L'ADNc a été préparé à partir de 2mg d'ARNm de feuilles de Vu (kit Amersham) puis purifié (phénol, chloroforme, Appligène Oncor). L'amplification de la sonde a été réalisée par PCR en utilisant l'ADNc purifié comme matrice, les amorces dégénérées, I'ADN polymerase " Goldstar Red " (Eurogenetec), le tampon de réaction correspondant (Eurogenetec), des dNTP (5mM, Master Mix, Eurogentec). L'amplification de l'ADN a été effectuée au moyen d'un thermocycler

(Mastercycler 5330, Eppendorf).

Les ADN amplifiés ont été séparés par électrophorèse (Mupid, Eurogentec)

sur gel d'agarose à 1% (Promega).

Une sonde de 160 pb a été amplifiée, excisée du gel puis purifiée (QuiaexII, Quiagen). L'ADN a été cloné dans le phagemid pBluscriptIISK (Stratagene). Des bactéries compétentes (Epicurian coli XL1 blue, Stratagene) ont été transformées par les plasmides recombinés. 12 clones ont été sélectionnés sur la base de la taille de l'insert puis en fonction de 1'efficacité de leur amplification par PCR. Le plasmide correspondant au clone sélectionné a été purifié (kit Qula Prep Spin

Miniprep, Quiagen) et l'insert a été séquencé.

La séquence obtenue s'est avéré être caractéristique d'un partie de cystatine végétale. Après excision de l'insert du plasmide, on dispose donc de la sonde permettant de cribler une banque d'ADNc de feuilles de Vu réalisée dans le

phagemid Zip Lox (Gibco BRL), au laboratoire.

Pour ce faire, la sonde a été marquée au 32p (Kit Megaprime, Amersham), purifiée par chromatographie (colonnes Nick, Pharmacia), incubée avec les empreintes lesquelles ont été autoradiographiées (film X OMAT, Kodak). Le cribl age de l a banque a perrni s de sélectionner un cl one à partir duquel (pl age de lyse) l'ADN phagique recombiné a été amplifié et introduit dans des bactéries E. coli DH 1 OB (Gibco BRL) capables à l'état recombiné de transformer

(circularisation) les phages en plasmides.

L'ADN plasmidien recombiné a été extrait des bactéries et purifié (kit

Wizard Plus Midiprep, Quiagen) puis séquencé (ESGS).

La séquence nucléotidique obtenue est celle d'une nouvelle cystatine (SEQ ID N 1). Dans ces conditions on a décidé de tenter d'obtenir la protéine in vitro par

expression dans un système hétérologue.

Séquence en acides aminés de Cystavine (S1ÉQ ID N 2).

MATATVTLGGITDVPGAANSVEIANLARFAVDDHNKK

QNGVLEFVRVISAKQQVVSGILYYITLEAKDGETKKV

YKTKVWVREWLNPKEVQEFNLVTDSAIGTKDGGVGD

VP SDTLHIENLARFAVDQYNKNENANLEFVRVIDAKE

QV VEGFIYYITLEAKDGESKNVYEAKVWERSWLNSIE

L L E F K P V D V A V

Exemple 2: Expression de la cystatine dans E. coli 2.1-Construction par PCR

E coli a été choisi en raison de l'efficacité de son système d'expression.

L'ADNc de cystatine a été préparé par PCR de façon à éliminer le codon de départ de l'ORF et à insérer de part et d'autre deux sites de restriction, BamHI et SalI, permettant de l'insérer dans le vecteur plasmidial. Celuici, pQE30 (QIA Expressionist, Quiagen) contient les mêmes sites de restriction, I'ATG d'initiation

de la traduction et le codage pour 6 Histidines de l'His-tag.

Le vecteur est préparé (coupure par SalI et BamHI, déphosphorylation par CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, Promega et purification) et la ligation est effectuée (T4 DNA ligase, USB). Le plasmide recombinant obtenu est subcloné afin de conserver la construction dans E. coli (X11Blue (Subcloning-Grade

competent Cells, Stratagene).

2.2- Expression de la cystatine Le vecteur recombinant pQE30 est utilisé (après extraction de la bactérie Xll Blue, purification et dosage) pour transformer les bactéries E. coli M15 (kit QIA expressionist, Quiagen). Les bactéries sont cultivées en milieu liquide (milieu LB, ampicilline) et l'induction de l'expression de la cystatine est initiée par ajout d'IPTG (lmM). Les bactérie sont ensuite collectées par centrifugation (JE- 21ME, Bekman), les protéines sont extraites et analysées par électrophorèse automatique sur gel d'acrylamide, en conditions dénaturantes (SDS-PAGE, Phast system, Pharmacia). Une bande kès majoritaire a été obtenue, dont la masse moléculaire

correspond à la masse déduite de la séquence de l'ADNc de la cystatine putative.

Exemple 3: Rôle du gène VuCystl et activité de la cystatine Cystavine 3.1Expression (transcrits) du éne YuCystl L'étude de l'expression du gène par Northern blotting ou RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) a été réalisée dans le cas de plantes dont la sensibilité à la sécheresse (expérimentale ou naturelle) diffère. 4 lots de plantes ont été étudiés: plantes témoins bien arrosées (T), plantes soumises à un déficit hydrique contr81é. Les résultats obtenus montent que le gène n'est pas exprimé chez l es pl antes témoins, par contre les trans crits s'accumul ent en fonction de l 'intensité du stress. Cette réaction est. de plus, corrélée au degré de sensibilité de la plante à la sécheresse en champ. Donc Le gène VuCystl (codant pour la Cystavine) s'exprime en réponse à la contrainte hydrique d'autant plus que celle-ci est sévère et d'autant plus que la plante est sensible I1 ressort donc que l'ADNc VuCystl est un transgène candidat pour l'amélioration des plantes par transgenèse par une stratégie pour la résistance à la sécheresse. Sachant que la plupart des autres stress ablotiques: gel, salinité, floading, hautes températures, induisent à 1'échelle cellulaire un stress hydrique, VuCystl est un transgène candidat pour l'amélioration des plantes pour la résistance

à ces stress également.

3.2- Activité de la cystatine Cvstavine L'activité de la protéine recombinante Cystavine a été testée sur trois

substrats: la papame, la caspase, la calpame.

Cysinvine, inl:'ibiteur de la papane: Le principe du test d'activité est le suivant: cette anti-cystéine protéinase doit bloquer la réaction d'hydrolyse qui se produit entre une cystéine protéinase

végétale, la papane (Sigma) et son substrat l'azocaséine.

Le milieu réactionnel est le suivant: tampon Tris X5 200 1ll (Tris 0,5M, Bmercaptoethanol 25mM, pH 6,0), azocaséine 1% (Sigma), papaïne 250ng par 1, (Sigma), VuCYST1 purifiée 1,17 1lg/lll, H2O qsp 5001. La réaction se développe à 37 C pendant 15 min puis les protéines sont précipitées par traitement à 1'acide trichloracétique à 10% pendant 30 min à 5 C. Le dosage des acides aminés libérés

est effectué par spectrophotométrie par la mesure de l'absorbance (A) à \340.

Les résultats obtenus sont les suivants: Essais ( 3 expériences indépendantes. SD < 5%)(A) \340nm Sans enzyme + azocaséine (substrat)0, 338 Cystavine + azocaséine0,336 Papame (cystéine protéinase) + azocaséine0,554 Papaine + Cystavine + azocaséine (1)0,343 Papaine + Cystavine + azocaséine (21l)0,325 Les résultats obtenus montrent clairement que la cystéine protéinase (papaine) hydrolyse 1'azocaséine (substrat), la libération des acides aminés abouti à l'isolement du groupe chromogène et donc à l'augmentation de l'absortance A pour \340nm. En revanche ce phénomène est totalement inhibé en présence de l'inhibiteur Cystavine. En conclusion, la cystatine de Yigna unguiculata Cystavine produite par

expression de 1'ADNc dans E. colz est bien fonctionnelle.

Cystavine inhibieur de la caspase 3 Le test a été réalisé au moyen du kit "Caspase-3 Assay Kit colorimetric

(Sigma). Le substrat utilisé est "Ac-DEVD-pNa" (acetyl-Asp-Glu-Val-Asp o-

pnitrosanilide). Cystavine est utilisée à 24 mg/ml.

Essais ( 3 expériences indépendantes SD < 5%) (A) n405 nm Caspase-3 + AcDEVD-pNa (substrat) 0,060 Caspase-3 + Cystavine 20 + Ac-DEVD-pNa (substrat) 0,052 Caspase-3 + Cystavine 40 + Ac-DEVD-pNa (substrat) 0,043 Caspase-3 + Cystavine 50 + Ac-DEVD-pNa (substrat) + 0,025 préincubation Caspase-3/ Cystavine 15 min

Ces résultats montrent que Cystavine est un inhibiteur de caspase.

L'efficacité de l'inhibition dépend de la concentration en cystatine et d'une pré-

incutation entre la cystéine protéinase (Caspase) et l'inhibiteur avant l'addition du substrat de l'enzyme. Une mise au point est en cours afin de déterminer les paramètres de l'inhibition afin d'optimiser le test Cystavine irhilirleur de la calparne Des expériences de cinétique d'inhibition enzymatique préliminaires ont été réalisées en utilisant un test adapté aux cystatines animales. Une inhibition par Cystavine de 40% de l'activité calpame a été obtenue sans aucune optimisation des paramètres. Dans ces conditions il est vraisemblable que l'optimisation des paramètres permettra d'augmenter l'efficacité de l'inhibition de la calpame par Cystavine.

Claims (27)

Revendications

1. Acide nucléique purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléique choisie dans le groupe de séquences suivantes: a) SEQIDN l; b) la séquence d'un fragment d'au moins lS nucléotides consécutifs de SEQ ID N l; c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, après alignement optimal avec une séquence définie en a) ou b); d) une séquence nucléique sthybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence nucléique définie en a) ou b); e) la séquence complémentaire ou la séquence d'ARN

correspond ant à une séquence tell e que défini e en a), b), c) ou d).

2. Acide nucléique purifié ou isolé selon la revendication l, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué d'une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID N l, la séquence complémentaire de SEQ ID N l et la séquence

d'ARN correspondant à SEQ ID N l.

3. Acide nucléique purifié ou isolé caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide possédant un fragment continu d' au moins 50 acides aminés de la

protéine SEQ ID N 2.

4. Polypeptide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi: a) un polypeptide de séquence SEQ ID N 2; b) un fragrnent d'au moins 5 acides aminés consécutifs d'un polypeptide défini en a); c) un fragrnent biologiquement actif d'un polypeptide défini en a); d) un polypeptide comportant au moins 80 % d'identité avec le

polypeptide de a), b) ou c).

5. Vecteur de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nocléique

selon l'une des revendications 1 à 3 ou codant pour un polypeptide selon la

revendication 4.

56. Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle est transforrnée par un vecteur

selon la revendication 5.

7. Animal, excepté l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule

selon la revendication 6.

8. Plante, caractérisée en ce qu'elle comprend une cellule selon la

revendication 6.

9. Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'une des

revendications 1 à 3 en tant que sonde ou amorce, pour la détection et/ou

l'amplification de séquences d'acide nucléique.

10. Utilisation in vitro d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1

à 3 comme oligonucléotide sens ou antisens.

11. Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'une des

revendications 1 à 3 pour la production d'un polypeptide recombinant.

12. Procédé d'obtention d'un polypeptide recombinant caractérisé en ce que l'on cultive une cellule selon la revendication 6 dans des conditions permettant

l'expression dudit polypeptide et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.

13.Polypeptide recombinant caractérisé en ce qu'il est obtenu par un

procédé selon la revendication 12.

14. Anticorps monoclonal ou polyclonal caractérisé en ce qu'il lie

sélectivement un polypoptide selon l'une des revendications 4 ou 13.

15. Procédé de détection d'un polypeptide selon l'une des revendications 4,

ou 13, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) mise en contact d'un échantillon biologique avec un anticorps selon la revendication 14; b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé. 16. Trousse de réactifs pour la mise en _uvre d'un procédé selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle comprend: a) un anticorps monoclonal ou polyclonal selon la revendication 14; b) éventuellement des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réaction immunologique; c) les réactifs permettant la détection du complexe antigène

anticorps produit lors de la réaction immunologique.

17. Puce à ADN caractérisée en ce qu'elle contient une séquence nucléique

selon l'une des revendications 1 à 3.

18. Puce à protéines caractérisée en ce qu'elle contient un polypeptide selon

l'une des revendications 4 ou 13, ou un anticorps selon la revendication 14.

19. Procédé de détection et/ou de dosage d'un acide nucléique selon l'une

des revendications 1 à 3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il

comprend les étapes suivantes: a) mise en contact d'un polynucléotide selon 1'une des

revendications 1 à 3, marqué;

b) détection et/ou dosage de l'hybride formé entre ledit

polynucléotide et l'acide nucléique de l'échantillon biologique.

20. Procédé de détection et/ou de dosage d'un acide nucléique selon l'une

des revendications I à 3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il

comprend une étape d'amplifcation des acides nucléiques dudit échantillon biologique à l'aide d'amorces choisies parmi les acides nucléiques selon l'une des

revendications 1 à 2.

21. Procédé de criblage de composés capables de se fixer à un polypoptide

selon l'une des revendications 4 ou 13, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes

de mise en contact d'un polypeptide selon l'une des revendications 4 ou 13, d'une

cellule selon la revendication 6, d'un animal selon la revendication 7, d'une plante selon la revendication 8, avec un composé candidat et de détection de la formation

d'un complexe entre ledit composé candidat et ledit polypeptide.

22. Procédé de criblage de composés capables d'interagir in vitro ou in viro

avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il

comprend les étapes de mise en contact d'un acide nucléique selon l'une des

revendications 1 à 3, d'une cellule selon la revendication 6, d'un animal selon la

revendication 7, d'une plante selon la revendication 8, avec un composé candidat et de détection de la formation d'un complexe entre ledit composé candidat et ledit

acide nucléique.

23. Procédé de criblage de composés diminuant ou inhibant la capacité d'un

polypeptide selon l'une des revendications 4 ou 13 à inhiber les activités cytéine

protéinase, comprenant l'étape d'examen de ladite activité d'inhibition de l'activité

cystéine protéinase dudit polypeptide en présence ou en absence du composé testé.

24. Utilisation d'un composé interagissant avec un polypeptide selon l'une

des revendications 4 ou 13 pour la préparation d'un médicament destiné notamment

au traitement du cancer ou d' une maladie inflammatoire, caractérisé en ce qu' il est

identifié par un procédé selon la revendication 21.

25. Utilisation d'un composé interagissant in vitro ou in vivo avec un acide

nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 pour la préparation d'un médicament

destiné notamment au traitement du cancer ou d'une maladie inflammatoire,

caractérisé en ce qu'il est identifié par un procédé selon la revendication 22.

26. Utilisation d'un composé diminuant ou inhibant la eapacité d'un

polypeptide selon l'une des revendications 4 ou 13 à inhiber les activités cytéine

protéinase, pour la préparation d'un médicament destiné notamment au traitement du eaneer ou d'une maladie inflammatoire, earactérisé en ce qu'il est identifié par un procédé selon la revendication 23. 27. Composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi

a) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3;

b) un polypeptide selon l'une des revendications 4 ou 13,

c) un vecteur selon la revendieation 5; d) une cellule selon la revendication 6; e) un anticorps selon la revendication 14;

à titre de médieament.

28. Composé selon la revendication 27, pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie inflammatoire, d'un eancer, ou pour lutter eontre les effets

du vieillissement chez un mammifère, en particulier ehez l'homme.

29. Utilisation d'un aeide nueléique selon l'une des revendieations 1 à 3 pour la produetion d'une plante transgénique possédant des propriétés améliorées de résistanee aux stress abiotiques, notarnment le stress hydrique, et aux stress