FR2817969A1

FR2817969A1 - Dispositif et procede d'analyse immunologique

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Publication number: FR2817969A1
Application number: FR0016024A
Authority: FR
Inventors: Frederic Buffiere; Christine Betremieux; Jean Alain Chevaleyre; Laetitia Gaillard; Sandie Menard; Gerard Ovlaque; Christophe Vinzia
Original assignee: Diagast SAS
Current assignee: Diagast SAS
Priority date: 2000-12-08
Filing date: 2000-12-08
Publication date: 2002-06-14
Anticipated expiration: 2020-12-08
Also published as: FR2817969B1; EP1342090A1; US20040063218A1; AU2002217217A1; WO2002046773A1

Abstract

Dispositif d'analyse biologique du type utilisant une réaction entre un analyte présent dans un fluide et un réactif susceptible de former un complexe avec ledit analyte, dans laquelle l'analyte et/ ou le réactif se présente sous la forme d'éléments figurés, ledit dispositif comprenant au moins un récipient de réaction (1) pourvu d'une zone de réaction (2) dans laquelle sont introduits le fluide et le réactif, et d'une zone d'immobilisation (3) sur laquelle est fixée une substance (4) apte à se lier spécifiquement avec les complexes éventuellement formés, la zone de réaction (2) et la zone d'immobilisation (3) étant séparées l'une de l'autre par une couche (8) d'un matériau, ledit matériau étant apte à passer d'un premier état dans lequel la couche (8) est sensiblement imperméable à un deuxième état dans lequel la couche (8) est susceptible de laisser passer les éléments figurés complexés ou non.

Description

L'invention est relative à un dispositif d'analyse biologique ainsi qu'à son procédé de mise en oeuvre.

Elle concerne particulièrement les analyses immunologiques basées sur la réaction entre un analyte présent dans un fluide, notamment biologique, et un réactif susceptible de former un complexe avec ledit analyte, dans laquelle l'analyte et/ou le réactif se présente sous la forme d'éléments figurés.

Elle s'applique typiquement à la recherche, dans du sang ou dans un composant sanguin, d'antigènes présents à la surface des globules rouges à l'aide d'anticorps anti-érythrocytaires connus (typage érythrocytaire) ou à la recherche d'anticorps anti-érythrocytaires à l'aide de globules rouges sur lesquels sont présents et/ou fixés des antigènes spécifiques.

On connaît déjà de telles méthodes parmi lesquelles on peut citer des méthodes en milieu liquide dans des tubes à hémolyse qui présentent notamment l'inconvénient d'être peu sensibles et des méthodes en microplaque qui nécessitent de nombreux lavages.

On connaît également, par exemple du document WO-98/02752, des méthodes dites en phase solide qui mettent en oeuvre la réaction entre l'analyte et le réactif dans un récipient pourvu d'une zone de réaction et d'une zone d'immobilisation dans lesquelles : - une substance apte à se lier spécifiquement avec les complexes éventuellement formés est fixée dans la zone d'immobilisation ; - la zone de réaction et la zone d'immobilisation sont séparées l'une de l'autre par un milieu spécifique.

Le milieu a alors pour fonction d'une part d'isoler la Zone d'immobilisation du Milieu réactionnel et d'autre part de permettre, sous l'effet de forces externes, le Passage sélectif des éléments figurés complexés ou non depuis la zone de faction vers la zone d'immobilisation.

Ce type de méthodes est largement répandu car elles présentent l'avantage d'éviter les lavages et donc de pouvoir être réalisées en une seule étape, d'être très sensibles et d'être faciles d'utilisation en nécessitant un nombre de manipulation réduit.

Mais elles présentent des inconvénients parmi lesquels on peut citer ceux présentés ci-dessous.

La mise en place, de façon précise et avec un état de surface plan, du milieu au-dessus de la zone d'immobilisation est difficile à réaliser, notamment de façon automatique, du fait de la viscosité du milieu.

En particulier, le milieu doit recouvrir totalement la substance apte à se lier spécifiquement avec les complexes éventuellement formés afin que celle-ci ne soit pas inactivée par un contact direct avec le milieu réactionnel.

En outre, les milieux proposés dans l'art antérieur ne sont pas parfaitement imperméable au milieu réactionnel, notamment lors du versement de celui-ci dans la zone de réaction.

C'est pourquoi, le document WO-98/02752 propose de disposer une barrière physique, par exemple formée d'une membrane poreuse pourvue de trous, audessus du milieu de sorte à améliorer l'étanchéité entre la zone de réaction et la zone de d'immobilisation.

Mais cette solution présente l'inconvénient de compliquer la fabrication du dispositif d'analyse immunologique en ajoutant un élément dans le récipient.

En outre, cette réalisation nécessite de prévoir une forme de membrane Particulière en fonction de la forme et/ou de la taille du récipient.

L'invention vise donc à remédier à l'ensemble de ces inconvénients en proposant un dispositif d'analyse immunologique de type en phase solide qui soit simple de fabrication tout en étant fiable et dans lequel le milieu de séparation entre la zone de réaction et la zone d'immobilisation est imperméable au milieu réactionnel de sorte notamment à permettre une introduction automatisée du milieu réactionnel dans la zone de réaction.

Par ailleurs, et une fois la réaction réalisée, le milieu de séparation peut être rendu, de façon simple et fiable, susceptible de laisser passer les éléments figurés complexés ou non depuis la zone de réaction vers la zone d'immobilisation.

A cet effet, et selon un premier aspect, l'invention propose un dispositif d'analyse biologique du type utilisant une réaction entre un analyte présent dans un fluide et un réactif susceptible de former un complexe avec ledit analyte, dans laquelle l'analyte et/ou le réactif se présente sous la forme d'éléments figurés, ledit dispositif comprenant au moins un récipient de réaction pourvu d'une zone de réaction dans laquelle sont introduits le fluide et le réactif, et d'une zone d'immobilisation sur laquelle est fixée une substance apte à se lier spécifiquement avec les complexes éventuellement formés, dans lequel la zone de réaction et la zone d'immobilisation sont séparées l'une de l'autre par une couche d'un matériau, ledit matériau étant apte à passer d'un premier état dans lequel la couche est sensiblement imperméable à un deuxième état dans lequel la couche est susceptible de laisser passer les éléments figurés complexés ou non.

Selon un deuxième aspect, l'invention propose un procédé d'analyse immunologique mettant en oeuvre un tel dispositif, prévoyant les étapes de : - introduire le fluide contenant l'analyte dans la zone de réaction ; - introduire le réactif dans la zone de réaction de sorte que la réaction entre l'analyte et le réactif puisse se produire ; - appliquer les conditions nécessaires pour faire passer le matériau depuis son premier état vers son deuxième état ;

- appliquer une force extérieure apte à permettre le passage des éléments figurés complexés ou non depuis la zone de réaction vers la zone d'immobilisation au travers de la couche de matériau dans son deuxième état, de sorte à mettre en contact les complexes éventuellement formés avec la substance apte à se lier avec eux ; visualiser la fixation éventuelle des complexes sur la zone d'immobilisation et/ou la présence éventuelle des éléments figurés non complexés dans la zone de recueil de sorte à en déduire le caractère positif ou négatif de l'analyse.

D'autres objets et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description qui suit en référence à la figure 1 annexée qui représente, en coupe et de façon schématique, un récipient d'un dispositif d'analyse immunologique suivant l'invention.

Un dispositif d'analyse immunologique comprend au moins un récipient de réaction 1, par exemple en matériau plastique rigide, tel que celui représenté sur la figure 1.

Suivant un mode de réalisation, le dispositif comprend une pluralité de récipients de réaction 1 de sorte à permettre la réalisation de plusieurs analyses identiques ou différentes avec un même dispositif.

Le dispositif comprend par exemple huit micro-puits 1 d'une plaque de microtitration type 96 puits d'une contenance unitaire comprise entre 300 et 350 Ill, de diamètre d'environ 6 mm et de hauteur d'environ 8 mm.

En outre, et préalablement à son utilisation, le récipient 1 peut être obturé hermétiquement par une feuille pelable, par exemple en aluminium spécial, de sorte à éviter la possible pollution de son contenu.

Chaque récipient 1 est destiné à permettre une éventuelle réaction entre un analyte présent dans un fluide, notamment biologique et un réactif susceptible de former un complexe avec ledit analyte.

Dans la description les termes élément figuré et complexe font respectivement références aux éléments cellulaires du fluide biologique ou du réactif et aux complexes formés par liaisons spécifiques avec ces éléments.

Le récipient 1 reçoit le milieu réactionnel formé du fluide biologique et du réactif dans une première zone 2 dite de réaction.

Dans un exemple particulier, le fluide biologique est du sang ou un composant du sang tel qu'un plasma ou un sérum.

Chaque récipient 1 a également pour fonction de permettre la révélation in situ du caractère positif ou négatif du test, c'est à dire de permettre la visualisation de la présence ou de l'absence de complexes.

A cet effet, le récipient 1 est pourvu d'une zone 3 dite d'immobilisation sur laquelle est fixée une substance 4 apte à se lier spécifiquement avec les complexes éventuellement formés.

Dans le mode de réalisation représenté sur la figure 1, le récipient 1 présente une forme en U, la partie d'ouverture formant zone de réaction 2 et la partie de base formant zone d'immobilisation 3.

Dans cette réalisation, la substance 4 apte à se lier spécifiquement avec les complexes éventuellement formés est fixée sur sensiblement toute la paroi interne incurvée 5 de la partie de base.

En outre, la zone d'immobilisation 3 peut comprendre une zone de recueil 6 pour les éléments non complexés qui, dans le mode de réalisation représenté sur la figure 1, est formée par la zone centrale la plus basse du U.

Dans d'autres modes de réalisation non représentés, on peut envisager d'autres formes de récipient 1, par exemple en V, ou encore des récipients 1 dont la zone d'immobilisation 3 est de forme convexe.

Dans le type de réaction mise en oeuvre dans le dispositif, le fluide biologique et le réactif comprennent des éléments protéiques et/ou des éléments figurés.

Suivant une première utilisation, l'analyse a pour but de révéler la présence d'un élément figuré particulier dans le fluide biologique. Le réactif qui est apte à se lier spécifiquement avec l'élément figuré recherché est alors sous forme protéique.

Un exemple particulier d'une telle analyse est lorsque l'analyte est une hématie portant un antigène de groupe sanguin et le réactif comprend un anticorps connu qui est susceptible de se lier à cet antigène. Cette analyse permet notamment de déterminer le groupe ou le phénotype de l'hématie.

Suivant une deuxième utilisation, l'analyse a pour but de révéler la présence d'un élément protéique particulier dans le fluide biologique. Le réactif qui est apte à se lier spécifiquement avec l'élément protéique recherché est alors sous forme figuré.

Un exemple particulier d'une telle analyse est lorsque le réactif comprend des hématies portant un antigène de groupe sanguin connu et l'analyte est un anticorps d'un sérum qui est susceptible de se lier à cet antigène. Cette analyse permet notamment de déterminer la présence et la nature d'un anticorps de type immun préalablement à une transfusion.

Suivant une troisième utilisation, l'analyste et le réactif se présentent sous forme figurée, l'analyse ayant également pour but de révéler la présence de l'analyte dans le fluide biologique.

Un exemple particulier d'une telle analyse est lorsque le réactif comprend des lymphocytes exprimant une structure apte à reconnaître des molécules de surface d'une autre cellule et l'analyte est ladite autre cellule.

On décrit ci-dessous, dans le cadre de ces trois exemples particuliers, une réalisation de la substance 4 apte à ce lier spécifiquement avec les complexes éventuellement formés.

La nature chimique et physico-chimique du plastique du récipient 1 permet de recouvrir celui-ci d'une couche 7 de molécules actives d'une substance 4 apte à se lier spécifiquement avec les complexes éventuellement formés.

La substance 4 est par exemple formée d'anticorps d'origine monoclonale et/ou polyclonale, notamment anti-immunoglobulines humaines (AGH).

En outre, la substance 4 peut comprendre des anticorps dirigés contre des déterminants de protéines sériques de type complément.

Les espaces de la paroi interne 5 du fond du récipient 1 qui ne comprennent pas de substance 4 peuvent être saturés à l'aide des agents saturants classiquement utilisés dans des techniques de type en phase solide ou ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay).

Cette couche 7 qui a été déposée, par exemple sous la forme d'une monocouche, dans la zone d'immobilisation 3 est capable de reconnaître tout type d'anticorps humains sans spécificité isotypique particulière et, dans le cas des anticorps anti-complément, la fraction C3 de celui-ci et plus particulièrement les fractions C3d et C3g portées par la molécule C3.

La fixation de la substance 4 sur la paroi interne 5 du fond du récipient 1 peut être réalisée par des moyens non spécifiques tels que l'adsorption passive, notamment des anticorps, ou par des techniques mettant en oeuvre des liaisons

covalente et permettant la fixation de structures à des matériaux de type plastique ou autre.

Cette mono-couche 7, en interagissant avec les antigènes lui correspondant, permet la fixation des complexes éventuellement formés sur la surface réactive.

Dans le cas d'une réaction positive, on observera un tapis de complexes recouvrant la surface réactive et, dans le cas contraire, on observera un point de négativité disposé dans la zone de recueil 6.

Dans un exemple de réalisation de la substance 4, une solution d'AGH et d'anticorps anti-complément humain à une concentration comprise entre 1 et 10 J. g/mt est préparée en tampon carbonate 0, 2M pH 9,6.

Cette solution est répartie sous un volume de 75 jj. t dans chaque puits 1 d'une micro-plaque à fond rond de type Maxisorp U8 NUNC, puis les plaques sont incubées une nuit à 4 C.

Les micro-puits 1 sont ensuite lavés à l'aide d'une solution tampon phosphate (PBS 2,5 mM pH 7,4) afin d'éliminer toutes les protéines non adsorbées directement au plastique.

Les micro-puits 1 sont ensuite traités à l'aide d'une solution d'albumine à 30g/1 en tampon PBS à raison de 100 fit par micro-puits.

Après une incubation de 2 heures à température ambiante, les micros-puits 1 sont à nouveau lavés à l'aide de tampon phosphate.

Une des contraintes qui se pose dans les analyses mises en oeuvre dans le dispositif est que les éléments protéiques doivent rester dans la zone de réaction 2 pour ne pas venir inactiver la substance 4 apte à se lier spécifiquement avec les complexes éventuellement formés.

En effet, dans la mesure où la couche 7 d'AGH est susceptible de reconnaître tout type d'anticorps contenus dans le liquide biologique, tout contact direct entre le liquide biologique et la couche 7 d'AGH conduirait à une analyse faussement négative.

Pour avoir un dispositif fiable, il est donc nécessaire d'isoler la zone de réaction 2 de la zone d'immobilisation 3 car les anticorps contenus dans le fluide biologique analysé qui sont irrelevant pour l'analyse considérée sont susceptibles de rentrer en compétition avec les anticorps spécifiques vis-à-vis de la couche 7 d'AGH.

A cet effet, l'invention propose que la zone de réaction 2 et la zone d'immobilisation 3 soient séparées l'une de l'autre par une couche 8 d'un matériau, notamment biologique, qui soit, dans un premier état, sensiblement imperméable à tout fluide.

Mais, postérieurement à la réaction, les éléments figurés complexés ou non doivent pouvoir passer au travers de la couche 8 de sorte que les complexes éventuellement formés puissent se lier à la substance 4.

A cet effet, l'invention propose que le matériau formant la couche 8 puisse passer dans un deuxième état dans lequel il laisse passer les éléments figurés complexés ou non.

La couche 8 a alors pour fonction, dans son premier état, d'agir comme une barrière physique vis-à-vis du milieu réactionnel et, dans son deuxième état, de permettre le transfert, sous l'action de forces externes, des éléments figurés complexés ou non.

On décrit ci-dessous un exemple de réalisation du matériau biologique formant la couche de séparation 8 entre la zone de réaction 2 et la zone d'immobilisation 3.

Dans cet exemple, le matériau biologique se présente, dans son premier état, sous la forme d'un gel solide ou de texture dense et, dans son deuxième état, sous la forme d'un liquide.

Après sensibilisation et saturation d'un récipient 1 comme décrit ci-dessus on utilise un matériau biologique formé d'un mélange d'alginates de sodium, d'albumine bovine, de pyrophosphate de sodium et de chlorure de calcium.

Les interactions entre ces différents composés ne sont pas complètement connues, mais on peut toutefois avancer que les chaînes d'alginates interagissent par l'intermédiaire de leurs zones hydrophobes avec les molécules d'albumine et par l'intermédiaire de leurs zones d'acide guluronique avec les ions calcium. Le pyrophosphate de sodium permet quant à lui de maîtriser la réaction de polymérisation entre le calcium et l'alginate qui, sans lui, serait trop rapide pour fabriquer un gel avec une réticulation homogène.

Le matériau biologique est introduit dans le récipient 1 sous forme liquide puis la gélification est obtenue après un temps d'incubation supérieur à une heure.

Ce temps de gélification permet au fluide de bien se répartir au-dessus de la substance 4 avec un bon état de surface.

Le gel ainsi obtenu permet la distribution des réactants dans la zone de réaction 2 à des vitesses de l'ordre de 400 pj/sec sans provoquer de fuite de milieu réactionnel dans la zone d'immobilisation 3.

Dans l'exemple décrit en relation avec la figure 1, la zone d'immobilisation 3 est remplie de matériau biologique de sorte que celui-ci serve également à la protection de la substance 4 apte à se lier spécifiquement avec les complexes éventuellement formés.

En variante, on peut envisager que le matériau biologique ne recouvre pas directement la substance 4, par exemple en prévoyant qu'un autre gel soit

disposé dans la zone d'immobilisation 3 préalablement à l'introduction du matériau biologique.

Dans l'exemple décrit, le passage entre le premier état et le deuxième est réalisé par un changement de phase du matériau biologique qui est provoqué par l'addition d'une substance chimique spécifique dans la zone de réaction 2.

En variante, le matériau biologique comprend en outre la substance chimique spécifique apte à le faire passer depuis son premier vers son deuxième état.

Dans cette variante, un rayonnement peut initier, au moment souhaité, l'action de la substance chimique sur le matériau de sorte à le faire passer depuis son premier vers son deuxième état.

Suivant d'autres réalisations, on peut envisager que le passage soit provoqué uniquement par l'action d'un rayonnement électromagnétique, par exemple de type ultra son ou micro onde, et/ou par un changement de température du matériau biologique.

La substance chimique spécifique apte à dépolymériser le gel décrit ci-dessus est un agent complexant les ions divalents, par exemple l'EDT A ou le citrate de sodium, qui provoque sa liquéfaction.

En effet, les alginates de sodium utilisés ont la propriété de former, en présence d'ions divalents, un réseau dense (premier état du matériau biologique). Ce réseau est cependant réversible car en présence d'agents complexant les ions divalents, on constate un réarrangement et/ou une dissociation des chaînes d'alginates provoquant une liquéfaction du gel (deuxième état du matériau biologique).

La cinétique de cette liquéfaction est liée à la concentration en agent séquestrant, à la température et à une éventuelle agitation.

A partir du moment où la liquéfaction du gel est totale, plus rien ne s'oppose alors au transfert des éléments figurés complexés ou non depuis la zone de réaction 2 vers la zone d'immobilisation 3.

Ce transfert peut se dérouler sous l'action de trois forces, utilisées en combinaison ou séparément : - la gravité, par décantation naturelle des éléments figurés ; - les forces centrifuges adaptées ; - les forces magnétiques dans le cas ou les éléments figurés présentent des propriétés paramagnétiques.

Dans le cas où le transfert se fait sous l'action de la gravité et/ou d'une force centrifuge, la densité du matériau biologique dans le deuxième état peut être comprise entre la densité des éléments protéiques du milieu réactionnel et celle des éléments figurés pour que d'une part les éléments protéiques restent dans la zone de réaction 2 et d'autre part les éléments figurés complexés ou non passent dans la zone d'immobilisation 3.

En variante, la densité du matériau biologique dans son deuxième état peut présenter un gradient suivant une direction longitudinale.

La séparation peut être également obtenue par une différence d'affinité Physico-chimique, par exemple par une différence de miscibilité, entre le matériau biologique d'une part et les éléments figurés ou les éléments protéiques d'autre part.

Dans toutes ces réalisations, la couche 8 dans son deuxième état a pour fonction, de part sa densité et/ou sa composition, de perrnettre, sous l'effet de forces externes, le passage des éléments figurés complexés ou non tout en empêchant le passage des éléments protéiques.

Dans le cas d'un transfert à l'aide d'une force magnétique, cette fonction peut également être souhaitable, afin d'éviter que le transfert des éléments figurés complexés ou non n'entraîne, notamment par effet de drainage, les éléments protéiques dans la zone d'immobilisation 3.

On décrit ci-dessous la préparation de la barrière biologique 8 présentée cidessus.

Préparation des différentes solutions - Solution d'alginates et de pyrophosphate tétra-sodique Une solution à 1,2 % (poids/volume) d'alginates de sodium partiellement hydrolysés (rapport acide manuronique/acide guluronique compris entre 0,8 et 1) et de pyrophosphate tétra-sodique 15 mM est préparée par dissolution d'un extrait sec d'alginates commercial et de pyrophosphate de sodium dans un tampon de LISPS (Low lonic Strengh Solution). Afin d'assurer une parfaite dissolution du produit, une agitation vigoureuse est réalisée. Les éventuelles bulles formées sont éliminées à l'aide d'une agitation plus douce. Cette solution est conservée à 4 C. Avant utilisation, la solution sera ramenée à température ambiante.

- Solution d'albumine Une solution d'albumine à 150 g/1 est préparée par dilution au demi en tampon LISPS d'une préparation commerciale d'albumine à 300 g/1. Cette solution est conservée à 4 C. Avant utilisation, la solution sera ramenée à température ambiante.

- Solution de chlorure de calcium

Une solution en tampon LISPS de chlorure de calcium à une concentration de 10 mM est utilisée. Cette solution est conservée à 4 C. Avant utilisation, la solution sera ramenée à température ambiante.

- Solution d'EDTA tétra-sodique Une solution en tampon LISPS de sel d'éthylène diamine tétra-acétique tétrasodique est préparée à une concentration de 100 mM. Le pH de cette solution est ajusté à 7. Cette solution est conservée à 4 C. Avant utilisation, la solution sera ramenée à température ambiante.

Préparation du gel Le mélange extemporané avant utilisation est réalisé suivant un ordre précis.

Dans un premier temps, un mélange volume à volume de la solution d'alginates et de pyrophosphate et de la solution d'albumine est réalisée. Après une agitation douce pendant quelques minutes, à un volume de cette solution est ajouté un volume de la solution de chlorure de calcium. Ce mélange est homogénéisé rapidement puis réparti dans les micro-puits 1 à raison de 100 i) par puits avant le début de la gélification de sorte à recouvrir totalement la couche d'AGH 7 (le temps de préparation et de manutention d'un tel produit ne doit pas excéder trente minutes). Une incubation d'une heure minimum permet d'obtenir un gel translucide et résistant.

De plus, l'étape de gélification se déroule suffisamment lentement pour permettre une industrialisation facile du dispositif et l'absence de lavage permet sa mise en oeuvre de façon aisée et éventuellement entièrement automatisée.

Le micro-puits 1 est alors prêt à l'emploi et doit être conservé à 4 C.

Dépolymérisation du gel

La dépolymérisation du gel est obtenue en distribuant environ 50 gl par puits 1 d'une solution contenant 100 mM d'EDTA (d'autres produits complexant les ions calcium peuvent être également utilisés). La liquéfaction complète du gel est obtenue après une incubation d'environ 15 minutes à une température de 20oC.

La préparation et la répartition de la couche 8 de matériau biologique sont ainsi réalisées en une étape et, le fait de mélanger suivant un ordre précis et à des concentrations données les différents constituants de cette couche 8 permet d'obtenir un gel homogène dans toute sa masse et dont la dépolymérisation est parfaitement contrôlable et a lieu simplement dans l'axe des micro-puits 1.

On décrit ci-dessous les étapes du procédé de mise en oeuvre d'un dispositif prêt à l'emploi dans lequel, postérieurement à l'enlèvement de la feuille pelable, on prévoit les étapes de : - introduire le fluide dans la zone de réaction 2 ; - introduire le réactif dans la zone de réaction 2 de sorte que la réaction entre l'analyte et le réactif puisse se produire ; - appliquer les conditions nécessaires pour faire passer le matériau biologique depuis son premier état vers son deuxième état ; - appliquer une force extérieure apte à permettre le passage des éléments figurés complexés ou non depuis la zone de réaction 2 vers la zone d'immobilisation 3 au travers de la couche 8 de matériau biologique dans son deuxième état, de sorte à mettre en contact les complexes avec la substance 4 apte à se lier avec eux ; - visualiser la fixation éventuelle des complexes sur la zone d'immobilisation 3 et/ou la présence éventuelle des éléments figurés non complexés dans la zone de recueil 6 de sorte à en déduire le caractère positif ou négatif de l'analyse.

En variante, et dans le cas où le passage du matériau biologique depuis son premier état vers son deuxième état est réalisé par addition d'une substance

chimique spécifique, le réactif et la substance chimique spécifique peuvent être introduits simultanément de sorte que les réactions d'une part entre l'analyte et le réactif et d'autre part entre le matériau biologique et la substance chimique se déroulent simultanément.

Dans une autre variante, et préalablement à l'application de la force extérieure, le mélange réactionnel présent dans la zone de réaction 2 est soumis à des conditions favorisant la réaction entre l'analyte et le réactif, par exemple à une incubation de sorte à augmenter la vitesse des réactions devant se produire.

Dans un premier mode de réalisation, la force extérieure apte à permettre le passage des éléments figurés complexés ou non depuis la zone de réaction 2 vers la zone d'immobilisation 3 au travers de la couche 8 de matériau biologique dans son deuxième état comprend une force centrifuge.

A cet effet, l'intensité, la direction et la durée de la force centrifuge sont ajustées pour d'une part permettre le transfert des éléments figurés complexés ou non depuis la zone de réaction 2 vers la zone d'immobilisation 3, ainsi qu'éventuellement pour permettre le recueil des éléments figurés non complexés dans la zone de recueil 6 et, d'autre part, laisser les éléments protéiques dans la zone de réaction 2.

Dans un deuxième mode de réalisation, la force extérieure apte à permettre le passage des éléments figurés complexés ou non depuis la zone de réaction 2 vers la zone d'immobilisation 3 au travers de la couche 8 de matériau biologique dans son deuxième état comprend, éventuellement en plus d'une force centrifuge, une force magnétique.

La force magnétique est crée, par exemple par un aimant permanent ou par un électro-aimant, dans une direction sensiblement longitudinale par rapport au récipient 1.

A cet effet, les éléments figurés doivent être ou doivent être rendus suffisamment paramagnétiques pour migrer depuis la zone de réaction 2 vers la zone d'immobilisation 3 sous l'effet de la force magnétique.

Dans le cas où les éléments figurés sont des hématies, en tant que réactif ou en tant qu'analyte, on décrit ci-dessous une méthode pour augmenter leur susceptibilité magnétique préalablement à leur introduction dans la zone de réaction 2 sans endommager les antigènes qu'elles portent.

On utilise des particules paramagnétiques qui présentent comme caractéristiques essentielles d'avoir une très grande homogénéité de taille (environ 200 nm), une forte charge en matériau ferromagnétique (environ 75% en masse) et un état de surface plutôt hydrophobe.

Ces particules sont fixées à la surface de l'hématie par l'intermédiaire, par exemple, de sérum albumine bovine de sorte à créer de multiples liaisons de faibles intensités entre la surface de l'hématie et les particules.

A cet effet, la fixation se déroule en deux étapes, la première consiste en l'activation des particules à l'aide d'un produit collant et la deuxième est la mise en présence de ces particules activées avec une suspension d'hématies traitées ou non par des enzymes protéolytiques.

Les hématies ainsi obtenues sont attirées par un champ magnétique et peuvent ainsi être utilisées directement ou, dans une variante, traitées par des solutions d'enzymes généralement rencontrées dans les tests immune-hématologiques. première étape : activation des particules ferromagnétiques Des particules de type P201 de la société Ademtech sont mises en présence d'une solution d'albumine bovine à 0, 1% (poids/volume) en tampon PBS pH , 2. Après une incubation de trente minutes à température ambiante et sous Agitation (proscrire toute agitation magnétique), les particules en suspension

sont attirées par un aimant et le surnageant dépourvu de particules est éliminé. Le culot de particules encollées peut être utilisé directement au cours de la phase de sensibilisation des hématies.

Deuxième étape : sensibilisation des hématies Est ajouté, au culot de particules ferromagnétiques encollées, la suspension globulaire mise en tampon LISPS à la concentration adéquate (possibilité de travailler avec des suspensions cellulaires comprises entre 0,6 à 10% et préalablement lavées trois fois ou non avec de l'eau physiologique par exemple). Après avoir parfaitement homogénéisé la suspension (vérifier qu'il n'existe plus d'agrégats de particules), celle-ci est incubée trente minutes à température ambiante sous agitation douce mais homogène (l'ensemble du volume réactionnel doit être mis en mouvement). Les hématies sont ensuite lavées avec un tampon PBS pH 7,4 (deux lavages par centrifugation, trois minutes à 500g). Le culot d'hématies sensibilisées peut être ensuite repris à la concentration de mise en oeuvre de l'analyse à l'aide d'un tampon de LISS Dans un exemple particulier, le rapport entre la quantité de particules mise ne oeuvre et la quantité d'hématies est compris entre 600 et 1000 de sorte à obtenir une magnétisation suffisante sans risquer de dégrader les antigènes présents à la surface de l'hématie.

L'utilisation de cette méthode permet ainsi d'augmenter la susceptibilité magnétique des hématies sans altérer les antigènes qu'elles portent.

Ces hématies sensibilisées par les particules paramagnétiques présentent alors la double propriété d'être attirée par un champ magnétique et également de posséder à leur surface les antigènes sanguins (groupe et phénotype). Elles pourront alors être utilisées comme support de réaction et vecteur de transport du couple antigène-anticorps et traverser ainsi le matériau biologique dans son deuxième état.

Les hématies ainsi obtenues peuvent soit être utilisées directement en tant que réactif ou en tant qu'analyte, soit subir un traitement par des enzymes protéolytiques telle que la papaïne pour effectuer une analyse dite enzymatique.

En variante, les anticorps sont, préalablement à leur introduction dans la zone de réaction 2, traités de sorte à être rendus paramagnétiques, par exemple au moyens d'une méthode analogue à celle présentée ci-dessus.

On décrit ci-dessous, un premier et un deuxième exemple d'analyse réalisée avec ce procédé.

Dans le premier exemple, on souhaite, à l'aide d'hématies dont le groupe et le phénotype sont connus, détecter et déterminer la nature d'un anticorps de type immun, c'est-à-dire développé à la suite d'une immunisation au cours d'une transfusion sanguine ou d'une grossesse. La présence de tels anticorps peut compromettre gravement toute nouvelle transfusion de sang non compatible dans le système considéré et dans le cas d'une grossesse avoir des conséquences graves pour la survie du foetus. Cette analyse régulièrement pratiquée est appelée Recherche d'Agglutinines Irrégulières (RAI).

Pour la mise en oeuvre de ce type d'analyse, le réactif comprend des hématies portant un antigène de groupe sanguin connu et l'analyte est un anticorps susceptible de se lier à cet antigène.

L'opérateur dépose alors dans la zone de réaction 2 un volume de sérum ou de milieu biologique à étudier (environ 25 gel) et deux volumes de solution d'hématies indicatrices, par exemple préalablement traitées avec des particules

paramagnétiques. En variante, cette solution peut comprendre l'agent dépolymérisant le gel.

L'opérateur dépose alors la micro-plaque ou la barrette sur une forme adaptée permettant si besoin une incubation à 37 C puis l'ensemble est soumis à un champ magnétique et/ou à une force centrifuge.

Arrivés au contact avec la couche 7 d'AGH, les anticorps liés spécifiquement aux antigènes de surface des hématies vont interagir avec les anticorps adsorbés sur la paroi interne 5 du récipient 1.

Ainsi, dans le cas d'une réaction positive se formera une image de tapis d'hématies dont l'homogénéité et les dimensions seront fonctions de la quantité d'anticorps recherchés. Si la réaction est négative, un point central d'hématies apparaîtra dans la zone de recueil 6.

Dans le deuxième exemple, on souhaite déterminer le groupe et le phénotype de l'hématie, et dans ce cas on utilise des sondes spécifiques (anticorps monoclonaux ou polyclonaux, lectines végétales) de certains déterminants des groupes sanguins.

A cet effet, l'analyste est une hématie portant un antigène de groupe sanguin et le réactif peut comprendre un anticorps connu qui est susceptible de se lier à cet antigène.

La mise en oeuvre de l'analyse est alors identique à celle présentée précédemment à la différence que, dans le cas de l'utilisation d'une force magnétique, ce sont les hématies à analyser qui peuvent être traitées de sorte à augmenter leur susceptibilité magnétique.

En variante, ce sont les anticorps qui peuvent être traités de sorte à être rendus paramagnétiques et ainsi entraîner, sous l'effet d'une force magnétique, les hématies auxquels ils sont liés dans la zone d'immobilisation 3.

Claims

REVENDICATIONS 1. Dispositif d'analyse biologique du type utilisant une réaction entre un analyte présent dans un fluide et un réactif susceptible de former un complexe avec ledit analyte, dans laquelle l'analyte et/ou le réactif se présente sous la forme d'éléments figurés, ledit dispositif comprenant au moins un récipient de réaction (1) pourvu d'une zone de réaction (2) dans laquelle sont introduits le fluide et le réactif, et d'une zone d'immobilisation (3) sur laquelle est fixée une substance (4) apte à se lier spécifiquement avec les complexes éventuellement formés, caractérisé en ce que la zone de réaction (2) et la zone d'immobilisation (3) sont séparées l'une de l'autre par une couche (8) d'un matériau, ledit matériau étant apte à passer d'un premier état dans lequel la couche (8) est sensiblement imperméable à un deuxième état dans lequel la couche (8) est susceptible de laisser passer les éléments figurés complexés ou non.
2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la zone d'immobilisation (3) est remplie du matériau de sorte que celui-ci serve également à la protection de la substance (4) apte à se lier spécifiquement avec les complexes éventuellement formés.
3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le passage entre le premier état et le deuxième est réalisé par changement de phase du matériau sous l'action d'un rayonnement électromagnétique, d'un changement de température et/ou de l'addition d'une substance chimique spécifique dans la zone de réaction (2).
4. Dispositif selon la revendication 3, caractérisé en ce que le matériau se présente, dans son premier état, sous la forme d'un gel solide et, dans son deuxième état, sous la forme d'un liquide.
5. Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que le matériau est un matériau de nature biologique formé d'un mélange d'alginates de sodium,

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d'albumine bovine, de pyrophosphate de sodium et de chlorure de calcium de sorte à former un gel avec une réticulation homogène, la substance chimique spécifique étant un agent complexant les ions divalents, par exemple LEDTA, apte à liquéfier ledit gel.
6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la densité du matériau dans le deuxième état est comprise entre la densité des éléments protéiques du milieu réactionnel et celle des éléments figurés.
7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la substance (4) apte à se lier spécifiquement avec les complexes comprend des anticorps qui sont fixés, sous la forme d'une mono-couche (7), sur la paroi interne (5) du fond du récipient (1).
8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la zone d'immobilisation (3) comprend une zone de recueil (6) pour les éléments figurés non complexés.
9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend une pluralité de récipients de réaction (1).
10. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce que les récipients (1) sont des micro-puits d'une plaque de micro-titration comprenant de 8 à 96 puits, lesdits micro-puits ayant une forme en U ou en V.
11. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que, préalablement à son utilisation, le récipient (1) est obturé hermétiquement par une feuille d'aluminium spéciale.
12. Procédé d'analyse immunologique mettant en oeuvre un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, prévoyant les étapes de : - introduire le fluide contenant l'analyte dans la zone de réaction (2) ;

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introduire le réactif dans la zone de réaction (2) de sorte que la réaction entre l'analyte et le réactif puisse se produire ; appliquer les conditions nécessaires pour faire passer le matériau depuis son premier état vers son deuxième état ; - appliquer une force extérieure apte à permettre le passage des éléments figurés complexés ou non depuis la zone de réaction (2) vers la zone d'immobilisation (3) au travers de la couche (8) de matériau dans son deuxième état, de sorte à mettre en contact les complexes éventuellement formés avec la substance (4) apte à se lier avec eux ; visualiser la fixation éventuelle des complexes sur la zone d'immobilisation (3) et/ou la présence éventuelle des éléments figurés non complexés dans la zone de recueil (6) de sorte à en déduire le caractère positif ou négatif de l'analyse.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les conditions nécessaires pour faire passer le matériau depuis son premier état vers son deuxième état comprennent l'ajout dans la zone de réaction (2) d'une substance chimique spécifique.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le réactif et la substance chimique spécifique sont introduits simultanément.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que les conditions nécessaires pour faire passer le matériau depuis son premier état vers son deuxième état comprennent l'application d'une action physique externe, par exemple l'action d'un rayonnement électromagnétique et/ou d'un changement de température.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que, préalablement à l'application de la force extérieure, le mélange réactionnel présent dans la zone de réaction (2) est soumis à des conditions favorisant la réaction entre l'analyte et le réactif, par exemple à une incubation.

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17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisé en ce que le fluide est du sang ou un composant du sang tel qu'un plasma ou un sérum.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le réactif comprend des hématies portant un antigène de groupe sanguin connu et l'analyte est un anticorps susceptible de se lier à cet antigène, le procédé permettant notamment de déterminer la présence et la nature d'un anticorps de type immun préalablement à une transfusion.
19. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'analyte est une hématie portant un antigène de groupe sanguin et le réactif comprend un anticorps connu qui est susceptible de se lier à cet antigène, le procédé permettant notamment de déterminer le groupe ou le phénotype de l'hématie.
20. Procédé selon la revendication 18 ou 19, caractérisé en ce que, préalablement à leur introduction dans la zone de réaction (2), les hématies sont traitées de sorte que leur susceptibilité magnétique soit augmentée.
21. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que, préalablement à leur introduction dans la zone de réaction (2), les anticorps sont traités de sorte à être rendus paramagnétiques.
22. Procédé selon la revendication 20 ou 21, caractérisé en ce que des particules paramagnétiques sont fixées à la surface des hématies et/ou aux anticorps, par exemple par l'intermédiaire de molécules de sérum albumine bovine.
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 22, caractérisé en ce que la force extérieure comprend une force centrifuge.
24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 23, caractérisé en ce que la force extérieure comprend une force magnétique.