FR2803206A1 - Composition comprenant des acides nucleiques, preparation et utilisation - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à des compositions comprenant au moins un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables, leur procédé de préparation et leurs applications pour la transfection in vivo, in vitro et/ ou ex vivo d'acides nucléiques. Préférentiellement, lesdites particules minérales sont de formule générale : MII 1-x MIII x (OH)2 x+ Xm- x/m .nH2 Ox-
Description
<U>COMPOSITIONS COMPRENANT DES ACIDES NUCLÉIQUES.</U> PRÉPARATION <U>ET UTILISATION</U> La présente invention se rapporte à des compositions comprenant au moins un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure feuillets échangeables, leur procédé de préparation et leurs applications pour la transfection <I>in vivo, in vitro</I> et/ou<I>ex vivo</I> d'acides nucléiques.
Avec le développement des biotechnologies, la possibilité de transférer efficacement des acides nucléiques dans les cellules (c'est-à-dire de les introduire dans les cellules de façon à ce que le gène d'intérêt qu'ils portent y soit exprimé) est devenue une technique de base avec de nombreuses applications biotechnologiques. Il peut s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules<I>in vitro</I> , par exemple pour la production de protéines recombinantes, ou au laboratoire pour l'étude de la régulation de l'expression des gènes, le clonage de gènes ou tout autre manipulation impliquant l'ADN. II peut également s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules<I>in vivo,</I> par exemple pour la réalisation de vaccins, des études de marquage ou également des approches thérapeutiques. Il peut encore s'agir du transfert de gènes ex <I>vivo</I> dans des cellules prélevées d'un organisme, en vue de leur réadministration ultérieure par exemple pour la création d'animaux transgéniques.
Il existe à ce jour de nombreuses méthodes de transfert d'acides nucléiques dans des cellules : La précipitation au phosphate de calcium, l'électroporation, la microinjection, l'infection virale, l'injection d'ADN nu, ou encore l'utilisation de vecteurs -viraux, comme par exemple les polymères cationiques, les vecteurs biochimiques (constitués d'une protéine cationique associée à un récepteur cellulaire), ou encore les lipofectants, et plus particulièrement les lipides cationiques.
Toutefois, ces techniques développées à ce jour présentent de nombreux inconvénients qui limitent l'efficacité de la transfection et ne permettent pas de résoudre de manière satisfaisante les difficultés liées au transfert de gènes dans les cellules et/ou l'organisme. Ainsi, la précipitation au phosphate de calcium est une méthode qui est assez inefficace, notamment par rapport à l'injection d'ADN nu, et elle a donc été abandonnée depuis longtemps. S'il a été montré que l'injection d'acides nucléiques nus , c'est-à-dire non-formulés, permet d'obtenir des niveaux de transfection acceptables dans certains types cellulaires<I>in vivo</I> (voir notamment la demande de brevet W090/11092), les acides nucléique nus ne jouissent cependant que d'une demi-vie plasmatique courte, en raison de leur dégradation par les enzymes et de leur élimination par les voies urinaires. L'utilisation de polymères ou de lipides cationiques constitue ainsi un remède possible vis-à-vis des dégradations enzymatiques que subit l'ADN à transfecter, mais il a été souvent constaté que leur utilisation inhibe plus ou moins fortement l'efficacité de transfection et qu'ils induisent en outre une toxicité à l'égard des cellules. les virus recombinants permettent d'obtenir une bonne efficacité de transfert des acides nucléiques, leur emploi présente cependant certains risques liés à leur nature virale tels que la pathogénicité, la transmission, la réplication, la recombinaison, la transformation, fimrnunogénicité, etc... Il est donc préférable d'éviter les techniques de transfection virale. Enfin, des techniques telles que la microinjection ou l'électroporation constituent une alternative intéressante mais limitée à une administration locale. Elles provoquent bien souvent des dégats irréversibles sur les membranes cellulaires. II apparait donc qu'il serait souhaitable de disposer d'un vecteur de transfert qui permette à la fois de protéger les acides nucléiques des dégradations enzymatiques et d'obtenir une efficacité de transfert satisfaisante dans les cellules, sans pour autant les endommager ni induire de toxicité.
La présente invention apporte une solution avantageuse à ces problèmes. La demanderesse a en effet montre que les compositions comprenant un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables permettent le transfert<I>in vitro, ex vivo</I> ou<I>in vivo</I> dudit acide nucléique dans une cellule et/ou un organe avec une efficacité supérieure à celles obtenues à ce jour avec les techniques classiques de transfert non-viral. Les compositions de l'invention permettent en outre d'éviter les inconvénients liés l'emploi de vecteurs viraux ou de techniques physiques de transfection.
Ainsi, un premier objet de la présente invention concerne les compositions comprenant au moins un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables.
Au sens de l'invention, on entend par particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables des particules minérales dont la structure est basée sur un empilement de feuillets de composition M(OH)2 analogues à ceux bien connus de la brucite (Mg(OH)2), M représentant un métal divalent, mais dans lesquels une partie des métaux divalents est remplacée par des métaux trivalents de façon à rendre les feuillets globalement cationiques. espaces inter-feuillets comprennent des entités anioniques solvatées par des molécules d'eau. Une telle structure est représentée à la figure 1 et est également appelée hydroxyde double lamellaire . Ces particules ont pour formule générale
dans laquelle Ma représente un cation métallique divalent, Mm représente un cation métallique trivalent, Xm représente un anion interfohaire et m est un entier supérieur ou égal à 1, x est compris entre 0 et 1 strictement, et n est strictement supérieur à 0.
dans laquelle Ma représente un cation métallique divalent, Mm représente un cation métallique trivalent, Xm représente un anion interfohaire et m est un entier supérieur ou égal à 1, x est compris entre 0 et 1 strictement, et n est strictement supérieur à 0.
De telles particules minérales ont déjà été décrites pour des applications dans de nombreux domaines tels que la catalyse ou l'environnement. En effet, elles forment des matériaux nanostruturés où des espèces moléculaires ou colloïdales sont intercalées dans une structure hôte lamellaire. Les propriétés de ces structures peuvent ainsi être mises à profit en catalyse hétérogène ou homogène sur support, dans des techniques d'échanges et de séparation notamment des isomères optiques, pour la conception de membranes éventuellement sélectives pour filtration et perméation, pour le piégeage et la restitution contrôlée de molécules, ou encore pour la conception de matériaux et dépôts électro-actifs, d'électrodes et de dispositifs électroniques. Cependant, de telles particules minérales n'avaient jamais été utilisées pour le transfert d'acides nucléiques et rien ne laissait prévoir qu'il serait possible d'obtenir une très nette amélioration de l'efficacité de transfert, en particulier par rapport aux résultats de transfection obtenus par injection d'ADN ou formulé avec les vecteurs synthétiques classiques tels que les lipides cationiques.
Les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables utilisables dans le cadre de la présente invention sont souvent nommées d'après la nature des cations métalliques majeurs feuillets : par exemple l'hydrotalcite (Mg- Al), la pyroaurite (Mg-Fe), la stichtite (Mg-Cr) ou encore la takovite (Ni-AI). La formule générale indiquée ci-avant sous-tend la grande variété des particules minérales qu'il est possible de préparer en faisant varier la nature des deux cations métalliques Ma et Mu, leurs proportions respectives avec extension possible à plus de deux types de cations (par exemple Mg, Zn et AI), la nature des anions interfoliaires, ou encore l'état d'hydratation. En outre, la richesse de la formule générale indiquée ci-avant est encore accrue par une diversité structurale résultant de l'existence de polytypes differant par la séquence d'empilement des feuillets ainsi que de l'apparition surstructures dues par exemple à un classement cationique dans le feuillet hydroxylé.
Les cations métalliques divalents Ma peuvent être choisis par exemple parmi le magnésium (Mg), le chrome (Cr), le manganèse (Mn), le fer (Fe), le nickel (Ni), le cobalt (Co), le cuivre (Cu) ou encore le zinc (Zn). De préférence, le cation métallique divalent est le magnésium. Les cations métalliques trivalents Mu peuvent être choisis par exemple parmi l'aluminium (Al), le chrome (Cr), le manganèse (Mn), le fer (Fe), le nickel (Ni), le cobalt (Co) ou encore le gallium (Ga). De préférence, le cation métallique trivalent est l'aluminium. En outre, les deux membres du couple Ma et peuvent également correspondre au même élément (par exemple Fe /FJ ou Mnn/Mnp).
Les anions interfoliaires Xm- peuvent être par exemple choisis parmi les halogénures, les oxoanions, les iso- et hétéroanions, les anions complexes, ou encore les anions organiques. Citons à titre d'exemple les fluorures, les chlorures, les bromures, les carbonates, les nitrates, les sulfates ou encore les oxoanions tétraédriques tels que CrOa2. De préférence, l'anion est choisi parmi les carbonates C03 .
La valeur de x est comprise strictement entre 0 et 1, c'est-à-dire que 0 et 1 sont des valeurs exclues. De préférence, x est compris entre 0,05 et 0,95, et de préférence entre 0,1 et 0,9. Encore plus préférentiellement, x est compris entre 0,2 et 0,85. A titre d'exemple, x peut être égal à 0,25. En ce qui concerne la valeur de n, celle-ci indique l'état d'hydratation de la particule en question et elle est strictement supérieure à 0. De préférence, n est supérieur ou égal à 0,1. Par exemple, n peut être égal à 0,5.m est un entier supérieur ou égal à 1 qui représente la charge de l'anion interfoliaire. Par exemple, m peut être égal à 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
Des particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables selon la présente invention peuvent être choisies par exemple parmi l'hydrotalcite de formule Mg6A1-C03(OH)16.4H20, la manasseite de formule Mg6Al2C03(OH)16.4H20, la pyroaurite de formule Mg6Fe2C03(OH)16.4Hz0, la stichtite de formule Mg6Cr2C03(OH)16AH,0, la takovite de formule Ni6A12C03(OH)MAH20, la reevesite de formule Ni6Fe2C03(OH)16AH20, ou encore la comblainite de formule Ni6Co2C03(OH)16.4H20. D'autres particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables peuvent également convenir. De préférence, les compositions selon la présente invention comprennent au moins un acide nucléique et de l'hydrotalcite de formule Mg6A12C03(OH)i6.4H20.
Les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables selon la présente invention sont soit commerciales, soit elles peuvent être préparées selon des méthodes qui s'apparentent aux méthodes connues dites chimie douce . Notamment, la préparation des particules minérales selon l'invention peut être basée sur la précipitation contrôlée de solutions ou de suspensions aqueuses contenant à la fois les cations métalliques destinés à prendre place dans la charpente hydroxylée et les anions destinés à occuper les domaines interlamellaires. Dans conditions, il y a simultanément construction des domaines interlamellaires constitués d'anions et de molécules d'eau, et du feuillet. La nature et la texture des phases obtenues sont fortement dépendantes des conditions opératoires (température, vitesse d'addition et concentration des réactifs, contrôle du pH), mais aussi de la géométrie du réacteur et de l'état d'association préalable des cations métalliques dans les réactifs (existence oligomères). Le procédé de préparation se ramène finalement toujours à mettre en présence, à concentration et réactivité adéquates, les espèces conduisant à la construction des particules minérales dans des conditions optimales. Ces conditions optimales sont déterminées au cas par cas selon la méthode classique des tatonnements.
On entend au sens de l'invention par "acide nucléique" aussi bien un acide désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. II peut s'agir de séquences naturelles ou artificielles, et notamment d'ADN génomique (ADNg), d'ADN complémentaire (ADNc), d'ARN messager (ARNm), d'ARN de transfert (ARNt), d'ARN ribosomique (ARNr), de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques, d'oligonucléotides modifiés ou non. Ces acides nucléiques peuvent être par exemple d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne ou virale. Ils peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Ils peuvent être modifiés chimiquement.
Concernant plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques, ils peuvent être simple ou double brin ou encore des oligonucléotides courts ou des séquences plus longues. En particulier, les acides nucléiques sont avantageusement constitués par exemple par des plasmides, des vecteurs, des épisomes ou des cassettes d'expression. Ces acides désoxyribonucléiques peuvent notamment porter une origine de réplication fonctionnelle ou non dans la cellule cible, un ou plusieurs gènes marqueurs, des séquences régulatrices la transcription ou de la réplication, des gènes d'intérêt thérapeutique, des séquences antisens modifiées ou non ou encore des régions de liaison à d'autres composants cellulaires.
De préférence, l'acide nucléique comprend un ou plusieurs gènes d'intérêt thérapeutique sous contrôle de séquences de régulation, par exemple un ou plusieurs promoteurs et un terminateur transcriptionnel actifs dans les cellules cibles.
Au sens de l'invention, on entend par gène d'intérêt thérapeutique notamment tout gène codant pour produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être notamment une protéine ou un peptide. Ce produit protéique peut être exogène homologue ou endogène vis-à-vis de la cellule cible, c'est- à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie. Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène d'intérêt thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire ayant par exemple une stabilité accrue ou une activité modifiée. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines (par exemple les interleukines, les interférons ou le TNF : voir FR 92/03120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques (par exemple BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, VEGF, NT3, NT5 ou HARP/pléiotrophine), les apolipoprotéines (par exemple ApoAl, ApoAIV ou ApoE : voir FR 93/05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91/11947), la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs (par exemple p53, Rb, Rap1A, DCC ou k-rev : voir FR 93/04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation (Facteurs VII, VIII, , les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les enzymes du métabolisme ou catabolisme.
L'acide nucléique d'intérêt therapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. gènes thérapeutiques comprennent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP <B>321</B>201).
Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des micro-organismes, des virus ou cancers. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, du "syncitia forming virus", d'autres virus ou encore de peptides antigéniques spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Comme indiqué précédemment, l'acide nucléique comprend de préférence également des séquences permettant l'expression du gène d'intérêt thérapeutique et/ou du gène codant pour le peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. II peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes EIA, MLP, CMV, RSV ou HSV. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par exemple par addition séquences d'activation ou de régulation. II peut aussi s'agir de promoteurs inductibles ou répressibles.
ailleurs, l'acide nucléique peut également comporter, en particulier en amont du gène d'intérêt thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. L'acide nucléique peut également comporter une séquence signal dirigeant produit thérapeutique synthétisé vers un compartiment particulier la cellule.
compositions selon la présente invention peuvent être préparées par mélange d' solution aqueuse contenant une particule minérale ayant une structure à feuillets echangeables et d'une solution contenant les acides nucléiques. Plus précisément, les compositions selon la présente invention peuvent être préparées en mettant particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables en solution aqueuse à un pH proche de la neutralité (par exemple entre 6 et 8, et plus préférentiellement entre 6,5 et 7,5), puis en ajoutant la solution aqueuse ainsi obtenue à une solution contenant les acides nucléiques ou bien en ajoutant ladite solution contenant acides nucléiques à la solution aqueuse de particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables. La solution contenant les acides nucléiques est de préférence une solution isotonique dans du chlorure de sodium ou dans du glucose. De préférence, les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables et les acides nucléiques sont introduits dans la composition en quantités telles le rapport massique entre les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables et les acides nucléiques est compris entre<B>0,01</B> et 1000, de préférence entre 0,01 et 500, plus préférentiellement entre<B>0,01</B> et 100, et encore plus préférentiellement entre 0,5 et<B>100.</B> En tout état de cause, les quantités respectives de chaque composant peuvent être ajustées et optimisées aisément par l'homme du métier la méthode habituelle des tâtonnements, en fonction de la particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables utilisée, de l'acide nucléique, et des applications recherchées (notamment du type cellulaire à transfecter).
L'invention a également pour objet les compositions telles que définies ci- avant pour utilisation comme médicament.
L'invention a également pour objet l'utilisation des compositions telles définies ' avant pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules<I>in</I> iîtro, <I>in vivo</I> ou<I>e</I>x vivo. Plus précisément, la présente invention a pour objet l'utilisation des compositions telles que définies ci-avant pour la préparation médicament destiné à traiter les maladies, en particulier les maladies qui résultent d'une déficience en un produit protéique ou nucléique. L'acide nucléique contenu dans ledit médicament code ledit produit protéique ou nucléique, ou constitue ledit produit nucléique, apte à corriger lesdites maladies<I>in vivo</I> ou<I>ex vivo.</I> Ledit médicament peut en outre être un vaccin et dans ce cas, l'acide nucléique transfecté induit une réponse immunitaire.
Pour des utilisations <I>in vivo,</I> par exemple en thérapie ou pour l'étude de la régulation de gènes ou la création de modèles animaux de pathologies, les compositions selon l'invention peuvent être formulées en d'administrations notamment par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, intratrachéale ou intrapéritonéale. De préférence, les compositions de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou sur muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. En outre, les compositions selon l'invention peuvent contenir un ou des adjuvants classiquement utilisés en pharmacie. Les doses d'acides nucléiques utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. En ce qui concerne plus particulièrement le mode d'administration, il peut s'agir soit d'une injection directe dans les tissus, par exemple au niveau des tumeurs, ou dans les voies circulatoires, soit d'un traitement de cellules en culture suivi de leur réimplantation in t,ii,o, par injection ou greffe. Les tissus concernés dans le cadre de la présente invention sont par exemple les muscles, la peau, le cerveau, les poumons, le foie, la rate, la moelle osseuse, le thymus, le coeur, la lymphe, le sang, les os, les cartilages, le pancréas, les reins, la vessie, l'estomac, les intestins, les testicules, les ovaires, le rectum, le système nerveux, les yeux, les glandes ou les tissus conjonctifs.
Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules comprenant les étapes suivantes (1) la formation d'une composition comprenant au moins un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure feuillets échangeables telle que définie précédemment, et (2) la mise en contact des cellules avec la composition formée en (1).
Plus particulièrement, la présente invention concerne une méthode de traitement thérapeutique du corps humain ou animal comprenant les étapes suivantes (1) la formation d'une composition comprenant au moins un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure feuillets échangeables telle que définie précédemment, et (2) la mise en contact des cellules du corps humain ou animal avec la composition formée en (1).
La mise en contact des cellules avec la composition selon la présente invention peut être réalisée par incubation des cellules avec ladite composition ou par injection de la composition dans l'organisme ou une partie de l'organisme. L'incubation est réalisée de préférence en présence de par exemple de 0,01 à 1000 #[g d'acide nucléique pour<B>106</B> cellules. Pour une administration <I>in vivo,</I> des doses d'acide nucléique allant de 0,01 à 10 mg peuvent par exemple être utilisées.
Les compositions de l'invention peuvent en outre contenir un ou plusieurs adjuvants pharmaceutiquement acceptables. Dans ce cas, le ou les adjuvants sont préalablement mélangés à la solution aqueuse contenant la particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables selon l'invention et/ou à la solution d'acide(s) nucléique(s).
La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement avantageuse pour le transfert d'acides nucléiques, notamment pour le traitement de maladies, comprenant l'administration <I>in vivo</I> ou ex<I>vivo</I> d'un acide nucléique codant pour une protéine ou pouvant être transcrit en un acide nucléique apte à corriger ladite maladie, ledit acide nucléique étant associé à une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables telle que définie précédemment dans les conditions définies ci- avant.
Les compositions selon la présente invention sont particulièrement utiles pour le transfert d'acides nucléiques dans des cellules primaires ou dans des lignées établies. Il peut s'agir par exemple de cellules fibroblastiques, musculaires, nerveuses (neurones, astrocytes, cellules gliales), hépatiques, hématopoiétiques (par exemple les lymphocytes, CD34, ou dendritiques) ou épitheliales, sous forme différenciées ou pluripotentes (précurseurs).
Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples et figures qui suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en limiter la portée.
FIGURES <U>Figure 1 :</U> structure idéalisée des particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables (hydroxydes doubles lamellaires) selon la présente invention.
<U>Figure 2 :</U> représentation schématique de l'hydrotalcite Mg6A12C03(OH)16.4H20. <U>Figure 3 :</U> mesure du potentiel zéta de particules d' hydrotalcite seules en solution. <U>Figure 4 :</U> mesure du potentiel zéta de compositions contenant des particules d'hydrotalcite et de l'ADN dans un rapport massique égal à 0,5.
<U>Figure 5 :</U> Mesure du pourcentage d'ADN restant dans le surnageant par rapport la quantité initiale d'ADN introduite, en fonction du rapport massique hydrotalcite/ADN. Les mesures ont été faites pour trois concentrations différentes d'ADN introduites 20 d' ADN/ml, 50 pg d' ADN/ml, et<B>100</B> #ig d' ADN/ml.
<U>Figure 6 :</U> Electrophorèse sur gel d'agarose de différentes formulations d'ADN. colonne a constitue le contrôle (ADN non-formulé et non-soumis aux nucléases), la colonne b représente l'ADN non-formulé soumis aux nucléases, et les colonnes c f représentent des compositions hydrotalcite/ADN à des rapports massiques de 0, ou 0,25 ou 0,5 ou 1 qui sont soumises aux nucléases.
<U>Figure 7 :</U> visualisation sous forme d'histogramme de l'efficacité de transfert de gène <I>in vivo</I> (par injection dans le muscle tibial cranial de souris) de compositions ADN/hydrotalcite dans différents rapports massiques, comparativement à l'injection d' nu.
<U>Figure 8:</U> Représentation schématique du plasmide pXL3031 utilisé dans les expériences de transfert d'ADN dans les cellules <U>EXEMPLES</U> <U>A] MATÉRIEL ET MÉTHODES</U> Souris <U>utilisées.</U>
Les souris utilisées dans les expériences de transfert<I>in vivo</I> de gènes sont des souris femelles C57B16 âgées de 8 semaines, et réparties en 9 groupes de 12 souris. <U>Particule minérale selon l'invention</U> utilisée la particule minerale ayant une structure à feuillets échangeables utilisées dans les différents essais est l'hydrotalcite en solution aqueuse à une concentration 20 g/1 et à pH 7. Cette hydrotalcite est commercialisée par la société Süd-Chemie AG (Allemagne).
<U>ADN</U> Le plasmide utilisé est le pXL3031 qui contient le gène luc codant pour luciférase sous contrôle du promoteur P/E CMV du cytomégalovirus, représenté à la figure 8. Sa taille est de 3671 bp. La solution de plasmide utilisée contient 320 Vg d'ADN/ml dans une solution de chlorure de sodium (NaCI) à 150 mM.
<U>Complexes</U> hydrotalcite/ADN Les complexes sont préparés par mélange équivolumétrique de deux solutions : l'une contenant l'hydrotalcite et l'autre l'ADN plasmidique.
<U>Exemple 1 :</U> Mesure des potentiels zéta de l'hydrotalcite seul et des complexes ADN/hydrotalcite Le but de cet exemple est de montrer que l'ADN est capable de s'associer avec une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables telle que l'hydrotalcite. La mesure du potentiel zéta renseigne sur la nature de la charge de surface d'une particule placée dans un liquide. Le potentiel zéta n'est pas une mesure directe de la charge de surface, mais est le potentiel qui existe autour de le particule lorsque celle ci se déplace dans une solution lorsqu'elle est soumise à un champs électrique. Par conséquent si les particules ont une charge de surface positive, le potentiel zéta, qui est la seule grandeur mesurable, sera lui aussi positif. Le potentiel zéta joue un rôle déterminant dans la stabilité colloïdale des particules en solution. En effet, lorsque le potentiel zéta est fortement positif ou négatif, les particules ne s'agrègent pas car des forces de répulsions électrostatiques les maintiennent isolées. Par contre, les particules qui possèdent un potentiel zéta proche de zéro ne sont pas stables car les forces de Van Der Waals attirent les particules entre elles, et les font précipiter. Le potentiel zéta de l'hydrotalcite et des complexes hydrotalcite/ADN a été mesuré par un zétamètre de marque Couper (Delsa 440 SX). La solution d'hydrotalcite contenait 0,15 mg d'hydrotalcite/ml dans une solution de chlorure de sodium (NaCI) à 20 mM, soit une conductivité de 2,3 mS/cm. Les complexes hydrotalcite/ADN ont été préparés à des concentrations de 250 #tg d'ADN/ml dans une solution de chlorure de sodium (NaCI) à 20 mM, au rapport massique de 0,5. La mesure a été effectuée en appliquant un champs électrique de 1,5 mA pendant 60 secondes.
La figure 3 représente le potentiel zéta de l'hydrotalcite seul avant d'être mélangé avec l'ADN. Ce potentiel zéta est de + 32 mV et indique donc une charge en surface globalement cationique, ce qui est cohérent avec la structure et la composition de l'hydrotalcite (voir figures 1 et 2). La figure 4 représente le potentiel zéta de complexes hydrotalcite/ADN au rapport massique de 0,5. Dans ce cas, le potentiel zéta est de - 41 mV. La charge de surface a donc été modifiée et est à présent globalement anionique, ce qui indique que les molécules d'ADN anioniques se sont associées sur la surface de l'hydrotalcite modifiant ainsi sa charge de surface.
<U>Exemple 2 :</U> Mise en évidence de l'association entre l'ADN et les particules minérales ayant une structure feuillets échangeables telle que l'hydrotalcite Le but de cet exemple est de montrer que les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables telle que l'hydrotalcite s'associent avec l'ADN.
Des isothermes d'adsorption sont réalisées en mélangeant des quantités croissantes d'hydrotalcite avec une quantité constante d'ADN. Les mélanges hydrotalcite/ADN sont préparés par mélange équivolumétrique d'une solution contenant l'ADN et d'une solution contenant l'hydrotalcite. L'ensemble de ces mélanges est ensuite ultracentrifugé à 50000 tour/minute pendant 10 minutes (Ultracentrifugeuse Beckman TL100). Le graphique la figure 5 indique que la quantité d'ADN présente dans le surnageant diminue progressivement avec l'augmentation du rapport massique hydrotalcite/ADN. A un rapport hydrotalcite/ADN de 50 poids/poids, il n'y a plus d'ADN présent dans le surnageant. Ceci indique que toutes les molécules d'ADN sont associées avec l'hydrotalcite et trouvent dans le culot après ultracentrifugation. Le même phénomène a été observé trois concentrations d'ADN différentes : 20, 50 et 100 pg d'ADN/ml. Par conséquent, on peut en déduire qu'il y a bien association entre l'hydrotalcite et l'ADN. <U>Exemple 3 :</U> Protection de l'ADN vis- vis des dégradations causées par les nucléases Le but de cet exemple est de montrer que l'ADN est protégé vis-à-vis des dégradations enzymatiques lorsqu'il est associé à une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables telle que 'hydrotalcite.
Des échantillons d'ADN nu et d'ADN formulé avec l'hydrotalcite ont été soumis au test de résistance aux dégradations causées par les nucléases. Pour cela, les échantillons ont été incubés avec un prélèvement de liquide musculaire. La figure 6 indique que lorsque l'ADN est associé avec l'hydrotalcite à différents rapports massiques (colonnes c , d , e et f ), il n'est pas dégradé par les nucléases puisqu'il est tout à fait possible d'observer une bande d'ADN sur le gel. Par contre, la colonne b qui représente l'ADN nu -associé avec l'hydrotalcite est totalement dégradé par les nucléases car au lieu d'avoir une bande d'ADN bien identifiée sur le gel, on observe une multitude de petits fragments qui migrent dans le gel.
Ainsi, lorsque l'ADN est associé avec les particules minérales d'hydrotalcite, il est protégé de l'action de dégradation des nucléases, par opposition à l'ADN nu qui est rapidement dégradé. Cette propriété conférée par les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables telle que l'hydrotalcite est très intéressante car une plus grande quantité d'ADN peut ainsi atteindre le noyau des cellules pour y être transcrit, avec les conséquences bénéfiques que cela implique en terme d'efficacité de transfection.
<U>Exemple 4 :</U> Transfection in<I>vivo</I> de complexes hydrotalcite / ADN <U>a) Injections</U> Les injections ont été réalisées en bilateral dans le muscle tibial cranial des souris à raison de 25 1.d /muscle, soit 4 N.g d'ADN/muscle.
Les animaux sont anesthésiés avec 250 lil de Ketamine/Xylazine par voie intrapéritonéale (3,9 ml d'imalgène 1000, 0,6 ml Rompun à 2%, et 40,5 ml d'une solution de chlorure de sodium NaCI à 150 mM). Ensuite, les animaux sont rasés et injectés au niveau des deux muscles tibial cranial.
<U>b) Prélèvement des muscles</U> Les muscles tibial cranial sont repris 6 jours post-injection dans 1 ml de tampon de lyse/muscle (Lysis Buffer de Promega supplementé par des inhibiteurs de protéase (coktail tables - Boehringer). Les muscles sont prélevés dans les tubes spéciaux de chez BIO101 et conservés à -20 C, avant broyage et lecture. <U>c) Extraction de la</U> luciférase exprimée <U>par les cellules</U> musculaires L'extraction de la luciférase est réalisée avec un appareil Fastprep machine dans des conditions d'extraction utilisant 1 ml de tampon de lyse par à une vitesse de 6,5 m/s, pendant 30 secondes. Les tubes sont ensuite mis dans la glace et centrifugés à 2000 g pendant 10 minutes à 4 C.
<U>d) Détermination de l'activité</U> luciférase L'activité luciférase est mesurée en utilisant un kit de test de luciferase (Promega) et lunninomètre Dynex MLX. La lecture de cette activité est mesurée en RLU Relative Light Unit : Unité de Lumière Relative).
<U>e)</U> transfection <I><U>in vivo</U></I><U> dans le muscle</U> Les résultats du transfert de gène<I>in vivo</I> dans le muscle sont représentés à la figure 7.
Ces résultats indiquent qu'au rapport massique hydrotalcite/ADN de 0,5 une augmentation de l'activité luciférase d'un facteur 14 est obtenu par rapport à l'ADN nu. Plus généralement, les compositions ADN/hydrotalcite présentent une efficacité de transfection améliorée par rapport à celle obtenue par injection d'ADN nu.
Claims (2)
1. Composition comprenant au moins un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables.
2. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que ladite particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables a pour formule générale
dans laquelle Mu représente un cation métallique divalent, représente un cation métallique trivalent, Xm représente un anion interfoliaire et m un entier supérieur égal à 1, x est compris entre 0 et 1 strictement, et n est strictement supérieur à 0. Composition selon la revendication 2 caractérisée en ce que le cation métallique divalent ME peut être choisis parmi le magnésium (Mg), le chrome (Cr), le manganèse (Mn), le fer (Fe), le nickel (Ni), le cobalt (Co), le cuivre (Cu) le zinc (Zn). Composition selon la revendication 2 caractérisée en ce le cation métallique divalent M" est le magnésium. Composition selon la revendication 2 caractérisée en ce le cation métallique trivalent Mm peut être choisis parmi l'aluminium (Al), le chrome (Cr), le manganèse (Mn), le fer (Fe), le nickel (Ni), le cobalt (Co), ou le gallium (Ga). Composition selon la revendication 2 caractérisée en ce le cation métallique trivalent Mff est l'aluminium. 7. Composition selon la revendication 2 caractérisée en ce que l'anion interfoliaire Xm peut être choisis parmi les halogénures, les oxoanions, les iso- et hétéroanions, les anions complexes, ou les anions organiques. 8. Composition selon la revendication 2 ou 7 caractérisée en ce que l'anion interfoliaire Xm est le carbonate C03'`-. 9. Composition selon la revendication 2 caractérisée en ce que m est égal à 1, 2, 3, 4, 5 6. Composition selon la revendication 2 caractérisée en ce que x est compris entre 0,05 et 0,95. 11. Composition selon la revendication 2 caractérisée en ce que n est supérieur ou égal à 0,1. 12. Composition selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que ladite particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables est choisie parmi l'hydrotalcite de formule Mg6Al2CO (OH)16.4H20, la manasseite de formule Mg6Al2C03 (OH)16.4H20, la pyroaurite de formule Mg6Fe2CO(OH)16.4H20, la stichtite de formule Mg6Cr2C03(OH)16.4H20, la takovite de formule Ni6A12C03(OH)16AH20, la reevesite de formule Ni6Fe2C03(OH)16AH20 ou la comblainite de formule Ni6COC03(OH)16.4H20. 13. Composition selon la revendication 12 caractérisée en ce que ladite particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables l'hydrotalcite de formule Mg6AI2C03 (OH)16.4H20. 14. Composition selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide désoxyribonucléique ou bien un acide ribonucléique. 15. Composition selon la revendication 14 caractérisée en ce que ledit acide nucléique comprend une ou plusieurs gènes d'intérêt thérapeutique sous contrôle de séquences de régulation. 16. Composition selon la revendication 14 caractérisée en ce que ledit acide nucléique est un gène ou une séquence antisens. 17. Composition selon l'une des revendications 1 à 16 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un ou des adjuvants pharmaceutiquement acceptables. 18. Composition selon l'une des revendications 1 à 17 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable. 19. Composition selon l'une des revendications 1 à 17 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une application sur la peau et/ou les muqueuses. 20. Composition selon l'une des revendications 1 à 19 caractérisée en que le rapport massique particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables/acide(s) nucléique(s) est compris entre 0,01 et<B>1000.</B> 21. Composition selon l'une des revendications 1 à 20 pour utilisation comme médicament. 22. Utilisation d'une composition telle que définie dans l'une des revendications 1 à 20 pour la préparation d'un médicament destiné à la transfection de cellules. Procédé de préparation d'une composition telle que définie dans l'une des revendications 1 à 20 caractérisé en ce qu'on mélange une solution aqueuse contenant particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables et solution contenant le ou les acides nucléiques. 24. Procédé de préparation selon la revendication 23 caractérisé en ce que, dans le cas où les compositions telles que définies dans les revendications precédentes contiennent en outre un ou plusieurs adjuvants pharmaceutiquement acceptables, le ou les adjuvants sont préalablement mélangés à la solution aqueuse contenant une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables et/ou à la solution d'acide(s) nucléique(s). 25. Méthode de transfert d'acides nucléiques dans des cellules<I>in vitro ex vivo</I> comprenant les étapes suivantes la formation d'une composition comprenant au moins un acide nucléique une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables telle que définie dans l'une des revendications 1 à 20, et la mise en contact des cellules avec la composition formée en (1).
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