FR2801219A1 - Procede de preparation de proteine recombinante renaturee en presence de detergent - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de préparation d'une protéine, notamment de type OmpA, ou un de ses fragments par voie recombinante, caractérisé en ce que ladite protéine ou un de ses fragments est, après extraction, renaturée en présence d'une solution comprenant un détergent choisi parmi le Zwittergent 3-14, le Zwittergent 3-12 et l'octylglucopyrannoside.

Description

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La présente invention concerne l'obtention de préparations immunisantes qui soient efficaces lors d'une administration par voie nasale. Elle se rapporte donc à l'utilisation de protéines porteuses susceptibles d'améliorer la réponse immunitaire à un haptène, lorsque le conjugué haptène-protéine porteuse est administré par voie nasale.

L'utilisation de vaccin par voie orale ou par voie nasale aurait une grande influence sur l'éradication de germes pathogènes. En effet, toute modification d'un vaccin lui permettant d'être utilisé avec une plus grande flexibilité (thermostabilité, distribution sans seringue, ...) aurait pour conséquence une vaccination plus efficace et plus étendue. D'autre part, l'immunisation par les voies muqueuses permet d'induire une immunité locale constituant la première barrière à l'invasion par un microorganisme.

Actuellement, les vaccins oraux sur le marché ne concernent que des vecteurs vivants atténués ou recombinés : - vaccin oral tétravalent contre la polio, - vaccin oral contre la fièvre typhoïde.

Des approches de vaccination par voie nasale ou orale sont déjà décrites dans la littérature.

Des essais ont ainsi été effectués sur des administrations mucosales de la PspA qui correspond à la protéine de surface A de Pneumocoque (Briles D.E., brevet EP 682 950), sur les filaments d'hémaglutinine (Capron A., brevet FR 2 718 750 ; Kimura A., brevet EP 471 177 ; Shahin R. D., brevet US 7532327), sur un fragment de la toxine tétanique (Dougan G., brevet WO 93/21950), sur la choléra toxin B (CTB).

Une protéine de la membrane externe de Neisseria meningitidis est utilisée mélangée à l'haptène en tant qu'adjuvant pour une immunisation par voie nasale (Van de Verg L. L., Infection and immunity, 1996, 64 : 5263-5268).

De manière inattendue, la Demanderesse a maintenant trouvé qu'une protéine de membrane provenant d'une autre bactérie permet, lorsqu'elle est administrée conjointement avec un antigène par la voie nasale, d'induire une réponse immunitaire d'intensité et de qualité satisfaisante pour l'obtention d'un vaccin.

C'est pourquoi la présente invention a pour objet l'utilisation d'au moins un fragment d'une protéine de membrane OmpA d'entérobactérie pour la préparation d'une

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composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie nasale, pour améliorer l'immunité d'un mammifère vis-à-vis d'un antigène ou d'un haptène.

Dans la présente description, on entend désigner par OmpA les protéines de la membrane externe de type A (OmpA pour "Outer membrane protein A").

L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un fragment d'une protéine de membrane de Klebsiella pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie nasale, pour améliorer l'immunité d'un mammifère vis-à-vis d'un antigène ou d'un haptène.

De préférence, la protéine de membrane est une protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae.

Avantageusement, ledit fragment de la protéine de membrane OmpA d'entérobactérie ou de la protéine de membrane Klebsiella selon l'invention est obtenu par voie recombinante.

De manière très avantageuse, ladite protéine de membrane ou son fragment obtenu par voie recombinante est, après extraction, renaturée en présence de détergent choisi parmi le Zwittergent 3-14, le Zwittergent 3-12 et l'octylglycopyrannoside, de préférence en présence de Zwittergent 3-14 à une concentration comprise entre 0,05 % et 2 % (p/v), de manière très préférée à une concentration voisine de 0,1%.

La demande WO 96/14415 a montré que la protéine membranaire majeure de Klebsiella pneumoniae, OmpA baptisée P40, couplée à des antigènes sous unitaires peptidiques est très immunogénique par voie systémique. La protéine P40 recombinante, exprimée chez E. Coli sous forme de corps d'inclusion, est baptisée rP40.

Dans le cadre de la présente invention, une protéine particulièrement adaptée comporte la séquence SEQ ID n 1.

La Demanderesse a démontré qu'une réponse anticorps anti-P40 est retrouvée chez tous les adultes, l'entéro-bactérie Klebsiella pneumoniae étant un pathogène très répandu. Cette sensibilisation est favorable à une augmentation de la réponse anticorps dirigée contre un antigène ou un haptène qui est administré couplé à la protéine porteuse P40. L'administration s'effectue par voie nasale en absence d'adjuvant.

Ledit antigène ou haptène selon l'invention peut être choisi dans le groupe comprenant les protéines, les peptides, les polysaccharides, les oligosaccharides et les acides nucléiques. Avantageusement, il est d'origine bactérienne ou virale.

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La présente invention est ainsi appropriée pour la préparation de vaccin dirigé contre tout micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes tel que par exemple les micro-organismes choisis parmi le VRS, le para influenzae virus (PIV), l'influenza virus, l'hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques et les méningocoques.

L'antigène ou l'haptène selon l'invention comprendra au moins un fragment dudit micro-organisme, tel qu'un fragment protéique, que l'homme de l'art saura déterminer pour sa capacité à conférer l'immunité recherchée par des techniques standards telles que celles décrites dans les exemples ci-après.

En particulier, la présente invention est appropriée pour la préparation de vaccin dirigé contre le VRS (ou virus respiratoire syncytial), notamment humain ou bovin.

Dans ce cas, l'antigène ou l'haptène selon l'invention comprend au moins un fragment protéique du virus VRS, et notamment au moins un fragment de la protéine G du VRS.

Les séquences de tels fragments ont été notamment décrites dans la demande WO 95/27787.

De préférence, lesdits fragments protéiques du virus VRS sont choisis parmi les fragments ayant pour séquences d'acides aminés les séquences SEQ ID n 2 à SEQ ID n 73.

Des séquences convenant à la préparation d'un vaccin selon l'invention sont les séquences SEQ ID n 2 à SEQ ID n 73.

Les conjugués chimiques issus d'un couplage de peptides à au moins un fragment d'une protéine membranaire de Klebsiella, telle que la rP40, donnent de bons résultats, et une évaluation de la réponse immunitaire montre des réponses anticorps contre ces peptides très fortes après pré-sensibilisation à Klebsiella pneumoniae.

Avantageusement, le fragment protéique provenant de protéine de membrane OmpA d'entérobactéries ou de protéine de membrane de Klebsiella est couplé de façon covalente avec l'antigène ou l'haptène, tel qu'un fragment protéique du VRS.

L'invention comprend également l'utilisation d'au moins un fragment d'une protéine de membrane OmpA d'entérobactéries ou d'une protéine de membrane de Klebsiella selon l'invention, caractérisée en ce que ledit fragment est couplé de façon covalente avec ledit antigène ou haptène.

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Selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre le fragment de protéine de membrane et l'antigène ou l'haptène.

Le couplage covalent de l'antigène ou l'haptène selon l'invention peut être réalisé à l'extrémité N- ou C-terminale du fragment de la protéine de membrane selon l'invention. Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage seront déterminés en fonction de l'extrémité du fragment de la protéine de membrane choisie pour effectuer le couplage et de la nature de l'antigène ou l'haptène à coupler. Ces techniques de couplage sont bien connues de l'homme de l'art.

Les conjugués issus d'un couplage de peptides à au moins un fragment d'une protéine membranaire OmpA d'entérobactéries ou d'une protéine membranaire de Klebsiella, peuvent être préparés par recombinaison génétique. La protéine hybride (conjugué) peut ' en effet être produite par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour le fragment de protéine de membrane, d'une séquence codant pour le ou les peptides antigènes ou haptènes. Ces techniques de préparation de protéine hybride par recombinaison génétique sont bien connues de l'homme de l'art (cf. par exemple S.C. MAKRIDES, 1996, Microbiologicals Reviews, 60,3, 512-538) et ne seront pas développées dans la présente description.

Ainsi, l'invention comprend également l'utilisation, selon l'invention, caractérisée en ce que la protéine hybride, obtenue après couplage entre le fragment d'une protéine de membrane et l'antigène ou l'haptène, de type protéique, est préparée par recombinaison génétique.

La Demanderesse a également montré qu'en absence de sensibilisation à Klebsiella pneumoniae, l'administration d'un haptène couplé à au moins un fragment d'une protéine membranaire, telle que la protéine rP40, par voie nasale en absence d'adjuvant induisait une réponse anticorps anti-haptène.

L'invention concerne l'utilisation, selon l'invention, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique contient un fragment d'une protéine de membrane couplé avec un antigène ou un haptène selon l'invention, ou une cellule hôte transformée capable d'exprimer une protéine recombinante hybride contenant un fragment de protéine de membrane couplé avec l'antigène ou l'haptène selon l'invention, notamment en absence d'adjuvant. Parmi les cellules hôtes transformées capables d'exprimer ladite

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protéine hybride, on préfère les bactéries à gram négatifs telles que Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli type K12 couramment utilisée dans la fermentation ou E. coli transformée par un plasmide vecteur d'expression renfermant un promoteur fort tel que l'opéron du promoteur tryptophane (trp). Sont également préférées, les bactéries à gram positifs telles que les staphylocoques non pathogènes, S. carnosus et S. xylosus, dans la mesure où ces bactéries ne produisent pas de LPS (lipopolysaccharides) à la surface membranaire. Ces staphylocoques peuvent être transfectés par des vecteurs d'expression renfermant des promoteurs tels que le trp, ou le signal de sécrétion de Lipase ou encore le signal de sécrétion de la protéine A ou encore le signal du promoteur de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae.

Enfin, l'invention concerne un procédé de préparation d'une protéine ou un de ses fragments par voie recombinante, caractérisé en ce que la protéine ou son fragment est, après extraction, renaturée en présence d'une solution contenant un détergent choisi parmi le Zwittergent 3-14, le Zwittergent 3-12 et l'octylglucopyrannoside, et en ce que ladite protéine recombinante n'est pas l'interféron ss.

De préférence, ladite protéine est une protéine de membrane d'entérobactérie, notamment de type OmpA. De manière très préférée, ladite protéine est une OmpA de Klebsiella pneumoniae.

Dans le procédé selon l'invention, le Zwittergent 3-14 sera de préférence à une concentration comprise entre 0,05 % et 2 % de manière plus préférée voisine de 0,1%.

Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.

Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes : Figure 1 : par électrophorèse SDS-PAGE de la protéine rP40 après purification.

A : révélation au bleu de Coomassie - piste 1 : lot 1,2 g - piste 2 : lot 1, 10 ug - piste 3 : lot 2,2 ug - piste 4 : lot 2,10 g - piste 5 : lot 3,2 g - piste 6 : lot 3,10 g

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B : immunoblot et révélation à l'aide d'un sérum polyclonal de lapin anti-P40 - std : de masse moléculaire - piste 1 : rP40 dénaturée, 100 ng - piste 2 : rP40 native, 100 ng.

Figure 2 : Répartition des patients selon la D. O. (Densité Optique) correspondant aux anticorps anti-P40, mesurés par ELISA.

Figure 3 : Réponse anticorps anti-Gl'.

Figure 4 : Réponse anticorps anti-rP40.

Figure 5 : Réponse anticorps anti-Gl' de type IgA.

Figure 6 : Isotypage des immunoglobulines anti-Gl' obtenues en réponse secondaire.

Figure 7 : Isotypage des immunoglobulines anti-Gl' obtenues en réponse tertiaire.

Figure 8 : Réponse anticorps sériques anti-Gl' de type IgG totales.

Figure 9 : Isotypage des immunoglobulines anti-Gl' sériques après trois immunisations.

Figure 10 : Isotypage des immunoglobulines anti-Gl' des lavages bronchoalvéolaires après trois immunisations.

Exemple 1 : clonage de rP40
Clonage du gène rP40 :
Le gène codant pour rP40 a été obtenu par amplification par PCR (Réaction en Chaîne à la Polymérase) à partir de l'ADN chromosomal de la souche Klebsiella pneumoniae IP 1145 (décrit dans le brevet WO 96/14415). Après identification par séquençage ADN, le fragment correspondant à rP40 est cloné dans divers vecteurs d'expression, en particulier celui sous le contrôle du promoteur de l'opéron trp, en amont de 9 acides aminés du peptide leader (MKAIFVLNA). La séquence peptidique de rP40 est représentée dans la liste des séquences par la séquence SEQ ID n 1. Dans différentes souches E.coli K12, la protéine rP40 est produite sous forme de corps d'inclusion avec un rendement important (> 10 %, g protéines / g de biomasse sèche).

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Fermentation de protéines de fusion rP40 :
Dans un erlenmeyer contenant 250 ml de milieu TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) avec de l'Ampicilline (100 ug/ml, Sigma) et de la Tétracycline (8 ug/ml, Sigma), on inocule avec E. coli K12 transformé avec le plasmide pvaLP40. On incube pendant 16 heures à T = 37 C sous agitation. 200 ml de cette culture sont inoculés dans un fermenteur (CHEMAP CF3000, ALFA LAVAL) contenant 2 litres de milieu de culture.

Le milieu contient (g/1) : glycérol, 5 ; sulfate d'ammonium, 2,6 ; dihydro-génophosphate de potassium, 3 ; hydrogénophosphate dipotassium, 2 ; citrate de sodium 0,5 ; extrait de levure, 1 ; Ampicilline, 0,1 ; Tétracycline 0,008 ; Thiamine, 0,07 ; de magnésium, 1 et 1 ml/1 de solution de traces éléments et 0,65 ml/1 de solution de vitamines. Les paramètres contrôlés durant la fermentation sont : le pH, l'agitation, la température, le taux d'oxygénation, l'alimentation de sources combinées (glycérol ou glucose). Le pH est régulé à 7,0. La température est fixée à 37 C. La croissance est contrôlée en alimentant en glycérol (87 %) à un débit constant (12 ml/h) pour maintenir le signal de tension de l'oxygène dissous à 30 %. Lorsque la turbidité de la culture (mesurée à 580 nm) atteint la valeur de 80 (après environ 24 heures de culture), la production des protéines est induite par addition de l'acide indole acrylique (IAA) à la concentration finale de 25 mg/1. Environ 4 heures après induction, les cellules sont récoltées par centrifugation. La quantité de biomasse obtenue est d'environ 200 g, exprimée en biomasse humide.

Exemple 2 : extraction et purification de rP40
Matériel et méthodes
Extraction de la rP40
Après centrifugation du bouillon de culture (4000 rpm, 10 min, 4 C), les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-HCl 25 mM pH 8,5. Un traitement par le lysozyme (0,5 g/1, 1 heure / température ambiante / agitation douce) permet la libération des corps d'inclusion.

Le culot de corps d'inclusion obtenu par centrifugation (25 min à 10 000 g à 4 C) est repris dans un tampon Tris-HCl 25 mM pH 8,5 contenant 5 mM MgC12, puis centrifugé (15 min à 10 000 g).

La dénaturation de la protéine est obtenue par incubation des corps d'inclusion à 37 C pendant 2 heures dans un tampon Tris-HCl 25 mM pH 8,5 contenant 7 M urée

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(agent dénaturant) et 10 mM dithiothréitol (réduction des ponts disulfure). Une centrifugation (15 min à 10 000 g) permet d'éliminer la partie insoluble des corps d'inclusion.

Après dilution par 13 volumes d'un tampon Tris-HCl 25 mM pH 8,5 contenant du NaCl (8,76 g/1) et du Zwittergent 3-14 (0,1 %, p/v), le mélange est laissé pendant une nuit à température ambiante sous agitation au contact de l'air (renaturation de la protéine par dilution et réoxydation des ponts disulfure).

Purification de la protéine rP40
Etape de chromatographie d'échange d'anions.

Après une nouvelle centrifugation, l'échantillon est dialysé contre un tampon Tris-HCl 25 mM pH 8,5 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14 (100 volumes de tampon) pendant une nuit à 4 C.

Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur d'anions forts (gel Biorad Macro Prep High Q) équilibrée dans le tampon décrit cidessus à un débit linéaire de 15 cmlh. Les protéines sont détectées à 280 nm. La protéine rP40 est éluée, avec un débit linéaire de 60 cm/h, pour une concentration de 0,6 M en NaCl dans le tampon Tris/HCl 25 mM pH 8,5 ; 0,1% Zwittergent 3-14.

Etape de chromatographie d'échange de cations.

Les fractions contenant la protéine rP40 sont rassemblées et concentrées par ultrafiltration à l'aide d'un système de cellule à agitation Amicon utilisé avec une membrane Diaflo de type YM10 (seuil de coupure 10 kDa) pour des volumes de l'ordre de 100 ml, ou à l'aide d'un système de filtration à flux tangentiel Minitan Millipore utilisé avec des plaques de membranes possédant un seuil de coupure 10 kDa pour des volumes supérieurs. La fraction ainsi concentrée est dialysée pendant une nuit à 4 C contre un tampon citrate 20 mM pH 3,0, à 0,1% de Zwittergent 3-14.

Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur de cations forts (gel Biorad Macro Prep High S) équilibrée dans le tampon citrate 20 mM pH 3,0, à 0,1% de Zwittergent 3-14. La protéine rP40 est éluée (vitesse 61 cm/h) pour une concentration 0,7 M en NaCl. Les fractions contenant la rP40 sont rassemblées et concentrées comme décrit précédemment.

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Résultats
A partir d'une culture de 1 litre, un cycle de dénaturation-renaturation permet d'obtenir 300 mg de protéine (estimation par dosage selon la méthode de Lowry). 75 mg de rP40 sont purifiés après les deux étapes chromatographiques.

Comme précédemment, la protéine rP40 est concentrée après purification afin d'atteindre une concentration finale comprise entre 5 et 10 mg/ml. Les profils électrophorétiques montrent un degré de pureté de l'ordre de 95 % (figure lA). Après immunoblot la protéine est spécifiquement reconnue par un anticorps monoclonal antiP40 naturelle obtenu chez la souris (figure 1B).

L'état de la protéine est suivi par SDS-PAGE. Selon sa forme, dénaturée ou native, la protéine P40 extraite de la membrane de Klebsiella pneumoniae possède un comportement électrophorétique (migration) caractéristique. La forme native (structure en feuillets P) présente en effet une masse moléculaire plus faible que la forme dénaturée (structure en hélices a) sous l'action d'un agent dénaturant, tel que l'urée ou le chlorhydrate de guanidine, ou par chauffage à 100 C en présence de SDS (figure 1B).

La protéine rP40 n'est pas correctement renaturée en fin de renaturation, que celle-ci soit réalisée en absence ou en présence de 0,1% (p/v) Zwittergent 3-14. Par contre une renaturation totale est obtenue après dialyse contre un tampon Tris/HCI 25 mM pH 8,5 contenant 0,1 % (p/v) Zwittergent 3-14. Toutefois, il faut noter que cette renaturation n'est obtenue que lorsque l'étape de dilution et le traitement à température ambiante sont réalisés eux-mêmes en présence de Zwittergent 3-14 (résultats négatifs en absence de détergent).

Exemple 3 : couplage du peptide Gl' sur rP40
Matériel et méthodes
Le peptide Gl' est un peptide synthétique de 15 acides aminés, dont la séquence est la suivante :
N1SIDSNNPTOWAISKC15C
Sans le résidu Cys (Cystéine) ajouté en position C-terminale, ce peptide (partie 1-14) correspond à la partie 174-187 de la protéine G du virus respiratoire syncytial et présente, par rapport au peptide natif, deux modifications majeures qui sont : - le remplacement en position 13 du résidu Cys par un résidu Ser (Sérine),

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- le remplacement en positions 3 et 9 des résidus Cys, formant un pont disulfure, par respectivement des résidus Asp (acide aspartique) et Orn (Ornithine) formant un pont de type lactame.

Ces modifications sont introduites dans le but d'éliminer les résidus Cys du peptide natif afin de pouvoir réaliser un couplage univoque de ce dernier sur la protéine grâce au résidu Cys introduit en position C-terminale, tout en maintenant la structure du peptide à l'aide de l'introduction d'un pont lactame.

Le couplage du peptide sur la protéine est réalisé à l'aide du réactif BHA ou bromo-N-hydroxysuccinimide acétate (Svenson et al, 1990, Proc. Natl. Acad Sci. USA 87,1347, Bematowicz and Matsueda, 1986, Anal. Biochem. 155,95). Ce réactif hétérobifonctionnel permet une activation des résidus Lys (Lysine) de la protéine par bromoacétylation, puis un couplage du peptide par le groupement thiol libre porté par le résidu Cys.

Dans un premier temps, la protéine rP40 est activée par le BHA. La rP40 est dialysée contre un tampon phosphate 0,1 M pH 7 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14 pendant 24 heures à + 4 C. Après dialyse, la concentration est ajustée à 5 mg/ml à l'aide du même tampon avant addition du BHA à raison de 1,2 mg (50 l) / mg de rP40.

L'ensemble est placé à l'obscurité pendant une heure sous agitation et à température ambiante.

La rP40 activée est ensuite dessalée par chroma-tographie de gel-filtration (élution par le tampon précédemment cité). Les fractions contenant la protéine bromoacétylée sont rassemblées.

Pour le couplage, le peptide (10 mg/ml en tampon phosphate 0,1 M pH 7 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14) est additionné à la protéine activée à raison de 0,4 mg / mg de protéine. Après saturation sous courant d'azote, le tube est placé à nouveau à l'obscurité pendant 2 heures sous agitation et à température ambiante.

Le peptide non fixé peut être éliminé à l'aide d'une étape de dialyse ou de chromatographie de tamisage moléculaire.

Résultats
Le conjugué obtenu est caractérisé par dosage de protéine (méthode BCA ou LOWRY) et par électrophorèse SDS-PAGE. Le taux de couplage du peptide sur la protéine est estimé par dosage du résidu carboxyméthylcystéine : dosage des acides

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aminés libérés par hydrolyse (HCl 6N) est réalisé par HPLC après dérivatisation à l'aide du PITC (méthode Pico-Tag, Waters).

Le taux de couplage déterminé par cette méthode est d'environ 10 peptides G1'/mole de rP40.

Exemple 4 : Immunité naturelle chez l'adulte
Des sérums humains issus d'une étude clinique sont analysés par dosage ELISA pour déterminer la présence d'anticorps anti-P40.

Les résultats sont représentés sur la figure 2.

Parmi 113 sérums testés après dilution au 1/400,110 sérums donnent un signal colorimétrique révélant les IgG anti-P40. Il existe chez tous les patients des anticorps anti-P40 circulant avec des taux plus ou moins élevés selon le patient considéré.

Exemple 5 : Réponse anticorps anti-Gl' après des sensibilisations et des immunisations rapprochées
Des souris BALB/c ont été ou non sensibilisées 2 fois avec une souche de Klebsiellapneumoniae I145 afin de reproduire la séropositivité retrouvée chez l'homme.

Les souris sont par la suite immunisées par voie nasale en l'absence d'adjuvant 7 jours après la sensibilisation. Cette immunisation est effectuée avec un faible taux d'antigène, les souris recevant 10 g d'équivalent G1' couplé à rP40. Les souris reçoivent un rappel 10 et 20 jours après la première immunisation. Une ponction est pratiquée au sinus rétro-orbital des souris 9 jours après la première immunisation et 10 jours après chaque rappel (réponses secondaire et tertiaire). Les anticorps anti-Gl' (Figure 3) et antiporteur (Figure 4) sériques sont dosés par méthode ELISA.

5. 1 Dosage des IgG sériques anti-Gl'
Les résultats sont représentés sur la figure 3.

En réponse primaire, les souris présensibilisées avec Klebsiella pneumoniae et immunisées avec rP40-G1' sont les seules à produire des anticorps anti-Gl'.

Le taux d'anticorps anti-Gl' retrouvé chez les souris présensibilisées avec Klebsiella pneumoniae et immunisées avec rP40-Gl' est augmenté après une seconde immunisation. En absence de présensibilisation, une seconde immunisation en présence des conjugués rP40-Gl' induit une réponse anticorps anti-Gl'.

Après trois immunisations, la réponse anticorps anti-Gl' est augmentée chez les souris présensibilisées ou non.

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5. 2 Dosage des IgG sériques anti-rP40
Les résultats sont représentés sur la figure 4.

La réponse anticorps anti-P40 montre que les souris ont été sensibilisées à Klebsiella pneumoniae de façon identique quel que soit le lot considéré.

L'immunisation en présence de conjugués rP40-Gl' augmente faiblement la réponse anticorps anti-rP40.

5. 3 Dosage des IgA sériques anti-Gl'
Dans un second temps nous avons dosé la réponse anticorps anti-Gl' de type IgA sérique : immunoglobuline caractéristique d'immunisations effectuées par les voies muqueuses (nasales ou orales).

Les résultats sont représentés sur la figure 5.

Après une seule immunisation les IgA ne sont pas détectées. Après deux immunisations, des IgA anti-Gl' sont détectées essentiellement chez des souris présensibilisées à Klebsiella pneumoniae et immunisées avec rP40-G1'. Cette réponse est augmentée par la troisième immunisation. En absence de sensibilisation des IgA anti-Gl' sont détectées chez des souris après deux immunisations avec des conjugués rP40-Gl'. Ce taux d'IgA est augmenté par la troisième immunisation.

5. 4 Isotypage des immunoglobulines sériques anti-Gl'
Deux types de réponses peuvent être observées, Thl et Th2. Ces réponses diffèrent par le profil de cytokines produites et par leurs fonctions dans la réponse immunitaire. Les IgGl sont caractéristiques d'une réponse de type Th2 et les IgG2a d'une réponse Thl.

Un profil mixte de réponse Thl et Th2 est retrouvé uniquement chez les souris immunisées avec les conjugués rP40-Gl' qu'elles soient ou non présensibilisées avec Klebsiella pneumoniae (Figure 6).

Après trois immunisations (Figure 7), le profil reste mixte chez les souris immunisées avec les conjugués rP40-Gl'.

Exemple 6 : Réponse anticorps anti-Gt' après des sensibilisations et des immunisations éloignées.

Par rapport au protocole précédent, la première immunisation est séparée de la dernière sensibilisation par une période de 3 semaines au lieu d'une semaine. Les

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anticorps anti-Gl' sont dosés dans les sérums et en réponse tertiaire dans les lavages broncho-alvéolaires par méthode ELISA.

6. 1 Dosage des IgG sériques anti-Gl'
Comme on le voit sur la figure 8,7 jours après la première immunisation des anticorps sériques anti-Gl' de type IgG totales sont détectés chez les souris présensibilisées à Klebsiella pneumoniae et immunisées en présence des conjugués rP40-Gl'. Cette réponse anticorps est augmentée par les deux autres immunisations.

6. 2 Isotypage des immunoglobulines sériques
Les résultats sont représentés sur la figure 9.

Dans ce cas nous observons également une réponse mixte, nous obtenons en effet le même titre en IgG1 qu'en IgG2a (Figure 9). De plus, un taux élevé d'IgA est retrouvé chez les souris présensibilisées à Klebsiella pneumoniae et immunisées trois semaines après en présence des conjugués rP40-Gl'.

6.

3 Isotypage des immunoglobulines des lavages broncho-alvéolaires
Dans les lavages broncho-alvéolaires, on retrouve les 4 types d'immunoglobulines uniquement chez les souris sensibilisées à Klebsiella pneumoniae et immunisées 3 fois en présence des conjugués rP40-Gl' (Figure 10).

Claims (8)

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation d'une protéine ou un de ses fragments par voie recombinante, caractérisé en ce que ladite protéine ou un de ses fragments est, après extraction, renaturée en présence d'une solution comprenant un détergent choisi parmi le Zwittergent 3-14, le Zwittergent 3-12 et l'octylglucopyrannoside, et en ce que ladite protéine recombinante n'est pas l'interféron ss.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit détergent est à une concentration comprise entre 0,05 % et 2 % en poids par volume.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit détergent est le Zwittergent 3-14.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape de renaturation est réalisée à température ambiante sous agitation au contact de l'air.

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite protéine est une protéine de membrane d'entérobactérie.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite protéine est une protéine de type OmpA.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite protéine est une protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae est la protéine de séquence SEQ ID N 1.