FR2799205A1 - Promoteurs synthetiques et chimeriques, cassettes d'expression, plasmides, vecteurs, plantes de semences transgeniques les contenant, et leur methode d'obtention - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
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Abstract
La présente invention concerne des promoteurs synthétiques et chimériques comprenant au moins une séquence d'acide nucléique dérivée d'un promoteur d'un gène codant pour une gluténine à haut poids moléculaire du blé (HMWG). L'invention concerne également des cassettes d'expression, des vecteurs, et plantes transgéniques contenant lesdits promoteurs, ainsi qu'un procédé pour l'obtention desdites plantes et semences transgéniques.
Description
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PROMOTEURS SYNTHÉTIQUES ET CHIMÉRIQUES, CASSETTES D'EXPRESSION, PLASMIDES, VECTEURS, PLANTES ET SEMENCES TRANSGÉNIQUES LES CONTENANT ET LEUR MÉTHODE D'OBTENTION.
[DESCRIPTION] La présente invention concerne des promoteurs chimériques d'expression, destinés notamment à une mise en oeuvre dans le domaine de la biotechnologie végétale.
De manière générale, les promoteurs d'expression sont connus dans le domaine de la biotechnologie et de la manipulation génétique. S'agissant plus particulièrement de la biotechnologie végétale, le taux d'expression d'un gène codant pour un polypeptide à produire dans une cellule hôte est souvenu dépendant du promoteur utilisé. Les différents promoteurs utilisés couramment sont souvent limités à des applications ou des tissus particuliers, en raison de leur spécificité tissulaire ou puissance d'expression. On peut, par exemple, citer le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur comme un promoteur relativement fort, comparé par exemple au promoteur provenant du gène nos, ces deux promoteurs étant plus particulièrement utilisés dans le domaine de la biotechnologie végétale. Il existe donc un besoin pour de nouveaux promoteurs permettant de pallier les inconvénients de la mise en oeuvre des promoteurs actuels.
Une tentative de combler ce besoin a été rapportée dans la
demande de brevet PCT, publiée sous le numéro : 1C 97; 200r, qui décrit l'augmentation du taux d'expression géiqes, en utilisant des "enhancers", (c'est-à-dire ayant un effet positif sur l'activité d'un promoteur), dans des promoteurs connus. Les séquences nucléotidiques des "enhancers" sont riches en bases et T, la quantité totale de ces bases constituant plus de 5C% de la séquence nucléotidique de "l'enhancer". En particulier, les déposants de cette demande préconisent l'utilisation d'une zone
"enhancer" provenant du promoteur de la plasrocyanine du pois. Les expressions utilisées dans la description et les
demande de brevet PCT, publiée sous le numéro : 1C 97; 200r, qui décrit l'augmentation du taux d'expression géiqes, en utilisant des "enhancers", (c'est-à-dire ayant un effet positif sur l'activité d'un promoteur), dans des promoteurs connus. Les séquences nucléotidiques des "enhancers" sont riches en bases et T, la quantité totale de ces bases constituant plus de 5C% de la séquence nucléotidique de "l'enhancer". En particulier, les déposants de cette demande préconisent l'utilisation d'une zone
"enhancer" provenant du promoteur de la plasrocyanine du pois. Les expressions utilisées dans la description et les
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revendications ont la signification suivante : - "acide nucléique" signifie ADN ou ARN ;
"séquence d'acide nucléique" signifie un oligomère ou polymère, simple ou double brin, de bases nuclèo'idiques lues à partir de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', et comprend des plasmides autoréplicants, des gènes, des polymères d'ADN, ou
d'ARM, infectieux ou non, et de l'ADN, ou l'ARN, fonctionner ou non-fonctionnel. Dans la notation nuciéof Ldique utilisée dans la présente demande, sauf mention particulière, l'extrémité gauche d' une séquence nucléotidique simple brin est l'extrémité 5' ; - "séquence d'acide nucléique dérivée" signifie que la séquence dérive directement ou indirectement de la séquence à laquelle il est fait référence, par exemple par substitution, délétion, addition, mutation, fragmentation, et/ou synthèse d'un ou plusieurs nucléotides ; - "promoteur" ou "séquence d'acide nucléique promotrice" signifie une région d'acide nucléique en amont du codon de démarrage de la traduction et qui est impliquée dans la reconnaissance et la liaison de l'ARN polynérase et d'autres protéines pour la transcription ; - "promoteur végétal" est un promoteur capable d'initier la transcription dans des cellules végétales ; - "promoteur constitutif" est un promoteur capable d'exprimer des séquences d'acides nucléiques liées de manière opérationnelle audit promoteur, dans tous ou pratiquement tous les tissus de l'organisme hôte pendant tout le développement dudit organisme ; - "promoteur tissulaire spécifique" est an promoteur capable d'exprimer de manière sélective, des séquences d'acides nucléiques liées de manière opérationnelle audit promoteur, dans certains tissus spécifiques de l'organisme hôte ;
- "liées de manière opérationnelle" eu "1-ée de manière fonctionnelle" signifie la liaison d'une séquence d'acide nucléique, par exemple un promoteur eu une boîte régulatrice ou fonctionnelle, à une autre séquence d'acide nucléique, par exemple une autre boîte régulatrice ou fonctionnelle, ou un gène
"séquence d'acide nucléique" signifie un oligomère ou polymère, simple ou double brin, de bases nuclèo'idiques lues à partir de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', et comprend des plasmides autoréplicants, des gènes, des polymères d'ADN, ou
d'ARM, infectieux ou non, et de l'ADN, ou l'ARN, fonctionner ou non-fonctionnel. Dans la notation nuciéof Ldique utilisée dans la présente demande, sauf mention particulière, l'extrémité gauche d' une séquence nucléotidique simple brin est l'extrémité 5' ; - "séquence d'acide nucléique dérivée" signifie que la séquence dérive directement ou indirectement de la séquence à laquelle il est fait référence, par exemple par substitution, délétion, addition, mutation, fragmentation, et/ou synthèse d'un ou plusieurs nucléotides ; - "promoteur" ou "séquence d'acide nucléique promotrice" signifie une région d'acide nucléique en amont du codon de démarrage de la traduction et qui est impliquée dans la reconnaissance et la liaison de l'ARN polynérase et d'autres protéines pour la transcription ; - "promoteur végétal" est un promoteur capable d'initier la transcription dans des cellules végétales ; - "promoteur constitutif" est un promoteur capable d'exprimer des séquences d'acides nucléiques liées de manière opérationnelle audit promoteur, dans tous ou pratiquement tous les tissus de l'organisme hôte pendant tout le développement dudit organisme ; - "promoteur tissulaire spécifique" est an promoteur capable d'exprimer de manière sélective, des séquences d'acides nucléiques liées de manière opérationnelle audit promoteur, dans certains tissus spécifiques de l'organisme hôte ;
- "liées de manière opérationnelle" eu "1-ée de manière fonctionnelle" signifie la liaison d'une séquence d'acide nucléique, par exemple un promoteur eu une boîte régulatrice ou fonctionnelle, à une autre séquence d'acide nucléique, par exemple une autre boîte régulatrice ou fonctionnelle, ou un gène
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à exprimer qui code pour une protéine à produire, de telle sorte que les séquences exercent leur fonctions primaires dans une cellule, un génome, un vecteur ou une cassette l'expression dans
lesquels elles auraient été introduites, c'esr a dire qu'elles soient opérationnelles dans de tels environnements. Or. doit comprendre également que dans le cas d'un promoteur, la séquence du promoteur inclut également des séquences transcrites entre le site de démarrage de la transcription et le codon de démarrage de la traduction ;
- "cassette a ' expression" signifie des séquences :1ucéot idLpes capables de diriger l'expression d'une séquence d'acide nucléique, ou d'un gène, codant pour un polypeptide à produire dans un organisme hôte compatible avec de telles séquences. De telles cassettes incluent au moins un promoteur et un signal de
terminaison de la transcription, et optionnellement d'autres facteurs nécessaires ou utiles à l'expression ; - "vecteur" signifie des systèmes d'expression, par exemple des projectiles enrobés d'ADN, des véhicules de transit à base d'acides nucléiques, des molécules d'acioe nucléique adaptées
pour livrer de l'acide nucléique, et de 'AD1 circulaire autoréplicant autonome, par exemple plasmides, cosmides, phagemides, etc. Si un micro-organisme ou une culture cellulaire recombinant est décrit comme hôte d'un "vecteur a ' expression", ceci inclut de i'ADN circulaire extrachromosomique (tel que par exemple de l'ADN mitochondrial ou chloroplastique ; , de l'ADN ayant été intégré au(x) chromosome(s) hôte(s), le vecteur pouvant être soit répliqué de manière stable par les cellules pendant la mitose en Tant que structure autonome, intégré au
génome de l'hôte, soit maintenu dans le n0aU .' le cytoplasme de l'hôte ; "plasmide" signifie une molécule d'AD circulaire autonome capable de réplication dans une cellule, et comprend à la fois
les plasmides dits "d'expression" et les pl6sn: >?s dits "de non-expression". Si un micro-organisme ou culture cellulaire recombinante est décrit comme hôte d'un plasmide "a1 expression", ceci comprend à la fois des molécules d'ADN circulaires
lesquels elles auraient été introduites, c'esr a dire qu'elles soient opérationnelles dans de tels environnements. Or. doit comprendre également que dans le cas d'un promoteur, la séquence du promoteur inclut également des séquences transcrites entre le site de démarrage de la transcription et le codon de démarrage de la traduction ;
- "cassette a ' expression" signifie des séquences :1ucéot idLpes capables de diriger l'expression d'une séquence d'acide nucléique, ou d'un gène, codant pour un polypeptide à produire dans un organisme hôte compatible avec de telles séquences. De telles cassettes incluent au moins un promoteur et un signal de
terminaison de la transcription, et optionnellement d'autres facteurs nécessaires ou utiles à l'expression ; - "vecteur" signifie des systèmes d'expression, par exemple des projectiles enrobés d'ADN, des véhicules de transit à base d'acides nucléiques, des molécules d'acioe nucléique adaptées
pour livrer de l'acide nucléique, et de 'AD1 circulaire autoréplicant autonome, par exemple plasmides, cosmides, phagemides, etc. Si un micro-organisme ou une culture cellulaire recombinant est décrit comme hôte d'un "vecteur a ' expression", ceci inclut de i'ADN circulaire extrachromosomique (tel que par exemple de l'ADN mitochondrial ou chloroplastique ; , de l'ADN ayant été intégré au(x) chromosome(s) hôte(s), le vecteur pouvant être soit répliqué de manière stable par les cellules pendant la mitose en Tant que structure autonome, intégré au
génome de l'hôte, soit maintenu dans le n0aU .' le cytoplasme de l'hôte ; "plasmide" signifie une molécule d'AD circulaire autonome capable de réplication dans une cellule, et comprend à la fois
les plasmides dits "d'expression" et les pl6sn: >?s dits "de non-expression". Si un micro-organisme ou culture cellulaire recombinante est décrit comme hôte d'un plasmide "a1 expression", ceci comprend à la fois des molécules d'ADN circulaires
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extrachromosomiques et de !'ad ayant été ].r.Lei:e au(x) chromosome (, s ) hôte (s). Si le plasmide est maintenu par une cellule hôte, le plasmide est soit répliqué de manière stable par les cellules pendant la mitose en tant que structure autonome, soit intégré au génome de l'hôte ; - "séquence hétérologue" ou "séquence d'acide rucléique
hétérologue" signifie une séquence provenant d'une source, nu d'une espèce, étrangère à son environnement, ou si elle provient du même environnement, a été modifiée par rapport à sa forme originale. La modification de la séquence d'acide nucléique peut avoir lieu par exemple par traitement de J'acide nucléique avec une enzyme de restriction pour générer un fragment d'acide nucléique capable d'être lié de manière opérationnelle à un promoteur. La modification peut également avoir lieu par le biais de techniques comme la mutagenèse dirigée ; - "boîte" signifie une séquence d'acide nucléique à laquelle une fonction régulatrice est imputée ; - "like" signifie que la boîte et/ou la séquence d'acide nucléique à laquelle ce terme est associé, comporte une certaine
identité de séquence ou un consensus avec une ooiue et/ou une séquence d'acide nucléique connue dite de référence, de préférence une identité de séquence d'au moins 50%, de manière plus préférée une identité de séquence d'au moins 75%, et plus particulièrement une identité de séquence d'au moins 90% avec la séquence de référence. Le pourcentage d'identité de séquence est calculée sur la base d'une fenêtre de comparaison d'au moins 6 bases nucléotidiques. La déterminat ion d'une fenêtre de comparaison peut être effectuée en utilisant des algorithmes d'alignement de séquences pour déterminer une homologue avec une séquence de référence, par exemple l'algorithme d'homologie locale, l'algorithme d' alignement d'homologie, et l'algorithme de recherche de similitude, ces algorithmes existant également
sous forme informatique, connus sous les noms i-2-.P, BESTFTT, FASTA et TFASTA. Le pourcentage d'identité de séquence est obtenue en comparant la séquence de référence avec la boite et/ou la séquence d'acide nucléique ;
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- "diluée" signifie a position sur une séquence d'acidenucléique d'un élément Identifié, tel qu'une "11u5..::ell, un site de restriction, ou un codon ayant une fonction particulière. La
position qui est donnée par un chiffre se réfère à la p.'sitl-r. du début de l'élément dans la séquence d'acide nucléique, saut mention particulière, dans le sens de la lecture de cette dernière, c'est-à-dire dans le sens 5'->3' ;
boite "Prolamine-like", "P-box", "motif endosperme", "2J:v1", ou "ÉJémenr 300" signifie un motif ou élément régulateur CL. fonctionnel codant pour des protéines de réserve de nombreuses céréales, et impliqué dans le mécanisme régulateur commun médiane l'expression coordonnée des gènes reines durant le développement de l'albumen de maïs ;
- boite "G-like" signifie un motif core ACGT, dont la contribution fonctionnelle à la régulation cranscriptionneJle n' a été définie dans peu de cas, mais qui semble être nécessaire pour une expression maximale d'un promoteur ;
- boîte "enhancer" signifie des séquences d'ADH régulatrices qui peuvent agir en cis à distance, indépendamment de leur orientation et en amont ou en aval de leur promoteur cible, et qui peuvent généralement être composés de multiples motifs courts liant une combinaison de facteurs rans pour
éventuellement conférer inductibilité, spécificité tissuiaire ou une amélioration générale de l'activité a'un p nageur ; boîte "GATA" signifie un motif ou élément régulateur ou
fonctionnel qui peut être nécessaire pour l'activité de oeaucoup de promoteurs régulés par la lumière ; - boîte "asl" ou "activating séquence 1" signifie un motif ou élément régulateur ou fonctionnel provenant de préférence du
promoteur 353 du CaMV (virus de la mosaïque de chou-fleur}, pouvant conférer une expression dans les racines et pouvant jouer un rôle plus complexe dans la régulation des promoteurs par interactions synergiques avec d'autres éléments cis-activateurs, et qui peut éventuellement être inaudible par l'acide salicylique ; - boîte "as2" ou "activating séquence 2", signifie @n motif ou
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élément r0(jUd2Ur ou fonctionnel provenant de préférence du promoteur 353 du CaMV (virus de la mosaïque de chou-fleur), pouvant conférer une expression dans les tissus photosynthétiques, et pouvant présenter une activité d'activateur transcriptionel ; - boîte "céréale" signifie signifie un motif @ élément régulateur ou fonctionnel pouvant être impliquée dans
l'expression spécifique dans les grains de bilé ; - boîte "GC-riche" signifie un motif ou élément régulateur ou fonctionnel riche en nucléotides G ou C, par exemple provenant d'un gémi ni virus ; - "plante transgénique" signifie une plante ayant été obtenue par des techniques de manipulation génétique, et couvre les plantes entières obtenues par de telles manipulations, les plantes régénérées intégrant dans leur génome, ou exprimant, de telles manipulations, leur progéniture, ainsi que les organes végétaux, par exemple les racines, les tiges et les feuilles, obtenus pac ces techniques. Les plantes transgéniques selon la présente invention peuvent avoir différents niveau de ploïdie, et peuvent notamment être polyploïde, diploïde, et haploïde ; "propagule" signifie un amas ou une association de cellules végétales, structuré(e) ou non, permettant la régénération d'une plante entière, par exemples des explants, des cals, des tiges, des feuilles, des raci nes, des boutures, et même des semences.
La demanderesse de la présente invention a pris une approche différente de celle du déposant de la demande PCT discutée préalablement. En effet, la demanderesse de la présente
invention a réussi, et ce de manière surprenante, à produire des promoteurs chimériques permettant de satisfaire au besoin décrit précédemment, et notamment permettant d'augmenter le taux d'expression d'un gène ou d'une séquence d'acide nucléique, codant pour un polypeptide à produire, dans une cellule hôte, et notamment une cellule végétale, par rapport aux promoteurs existants les plus couramment utilisés. Par ailleurs, la demanderesse a réussi en même temps à produire une gamme complète de promoteurs de manière à pouvoir choisir celui qu'il
invention a réussi, et ce de manière surprenante, à produire des promoteurs chimériques permettant de satisfaire au besoin décrit précédemment, et notamment permettant d'augmenter le taux d'expression d'un gène ou d'une séquence d'acide nucléique, codant pour un polypeptide à produire, dans une cellule hôte, et notamment une cellule végétale, par rapport aux promoteurs existants les plus couramment utilisés. Par ailleurs, la demanderesse a réussi en même temps à produire une gamme complète de promoteurs de manière à pouvoir choisir celui qu'il
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convient, L d' ù 1:.. i .L i s ers e l 0 l -' d P p.L i ,...; a 1:.. ion E.'I1'vSc.,:; 1 ' environnement de sa mise en oeuvre, et ainsi de pouvoir contrôler en quelque sorte le taux d'expression d'un gène à exprimer codant pour un polypeptide à produire. Un exemple d'application de ce principe serait d'utiliser un des promoteurs moins forts de l'invention pour diriger et/ou contrôler 1'expression d'une proté i ne ou enzyme, par exemple un agent de sélection dans une plante,par exemple, la résistance aux
antibiotiques ou aux herbicides, ou une co-enzyme ou cofactcur nécessaire à l'assemblage d'une protéine plus importance, et d'utiliser un promoteur plus fort conformément à l'invention pour, par exemple, contrôler l'expression d'un polypeptide à effet thérapeutique.
Encore un autre avantage de la présente invention est que les promoteurs réalisés conformément à l'invention permettent à la fois une expression spécifique dans les grains, mais aussi une dérégulation pour promouvoir l'expression dans d'autres organes, par exemples, les feuilles, les tiges, et le système vasculaire végétal.
Par conséquent, un objet principal de la présente invention est un promoteur chimérique comprenant au moins une séquence d'acide
nucléique dérivée d'un gène codant pour une glu'énine à haut poids moléculaire de blé, et de préférence une séquence d'acide
nucléique dérivée du gène Dx5 ou D:1' de blé codant pour une gluténine à haut poids moléculaire de blé.
nucléique dérivée d'un gène codant pour une glu'énine à haut poids moléculaire de blé, et de préférence une séquence d'acide
nucléique dérivée du gène Dx5 ou D:1' de blé codant pour une gluténine à haut poids moléculaire de blé.
De préférence, le promoteur chimérique comprend au moins une séquence d'acide nucléique dérivée d' un gène codant pour une gluténine à haut poids moléculaire de blé dont la séquence est ide ntifiée sous le numéro SEQ.ID01.
De manière plus préférée, la séquence d'acide nucléique dérivée d' un gène codant pour une gluténine à haut poids moléculaire de blé correspond à une séquence choisie dans le groupe consistant
en les séquences identifiées sous les numéros SEQ.1D02, SEQ.TD03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SfQ. ID r, 52Q, IrCt', SEQ.ID09, SEQ.ID10 et SEQ.ID11, SEQ.ID12, E;Q.I.1 , SFQ. 1216, SEQ.TD17, SEQ. ID18, SEQ.ID19, SEQ.ID20, :,EQ. ID%1 0 SEQ.ID22.
en les séquences identifiées sous les numéros SEQ.1D02, SEQ.TD03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SfQ. ID r, 52Q, IrCt', SEQ.ID09, SEQ.ID10 et SEQ.ID11, SEQ.ID12, E;Q.I.1 , SFQ. 1216, SEQ.TD17, SEQ. ID18, SEQ.ID19, SEQ.ID20, :,EQ. ID%1 0 SEQ.ID22.
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En outre, la demanderesse a constaté qu'i était possible de construire des promoteurs, et notamment des promoteurs végétaux, ayant une activité promotrice intéressante à la fois dans des
plantes dicotylédones que dans des plantes xonocyéd0nes, en combinant un certain nombre de boites régulatrices ou fonctionnelles, à partir d'une séquence d'acide nucléique dérivée d' un gène codant pour une gluten! ne à haut poids moléculaire de blé telle que définie précédemment.
plantes dicotylédones que dans des plantes xonocyéd0nes, en combinant un certain nombre de boites régulatrices ou fonctionnelles, à partir d'une séquence d'acide nucléique dérivée d' un gène codant pour une gluten! ne à haut poids moléculaire de blé telle que définie précédemment.
Ainsi, un autre objet de la présente invention est un promoteur chimérique d'expression comprenant une séquence d'acide nucléique dérivée d'un gène codant pour une gluténine à haut poids moléculaire de blé comprenant en 3' une boite "TATA" et un site d'initiation (+1) de la transcription.
De préférence, le promoteur comporte en outre au moins une ooîte "enhancer" liée de manière fonctionnelle en 5' en amont de la boîte "TATA" et le site d'initiation (+1) de la transcription.
Plus préférentiellement, le promoteur comprend en outre au moins une boite "G-like", liée de manière fonctionnelle en 5' en amont de la boîte "enhancer".
Encore plus préférentiellement, le promoteur comprend en outre au moins une boîte "?-like", liée de manière fonctionnelle en en amont d'au moins la boite "enhancer".
Avantageusement, le promoteur comprend en outre au moins une boite "GATA" liée de manière fonctionnelle en 5' en amont d'au moins la boîte "enhancer".
Préf érent ieîlement , le promoteur comprend en outre au moins une boîte céréale, liée de manière fonctionnelle en 5' en amont de la boîte "enhancer".
Plus préférentiellement encore, le promoteur comprend deux
boites "céréale" contiguës liées de manière tca- i.onnel le en en amont de la boîte "enhancer".
boites "céréale" contiguës liées de manière tca- i.onnel le en en amont de la boîte "enhancer".
Selon un moae d' exécution préféré des promoteurs selon la présente invention, ceux-ci comprennent en outre au moins une boîte "asl", ou au moins un boîte "as2" ou une combinaison de boites "asl/as2", "as2/asl", ou des permutations répétées de celles-ci, liées de manière fonctionnelle en 5' an amcnt du site
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d'initiation de la transcription.
Selon un autre mode d'exécution préféré de l'invention, la ou
les boîtes "as1", "as2", "asl/as2" ou "as2/asl" ou ses permutations répétées, est liée de manière fon~ i orme: 1 e en ~va: en 3' de la boîte enhancer.
les boîtes "as1", "as2", "asl/as2" ou "as2/asl" ou ses permutations répétées, est liée de manière fon~ i orme: 1 e en ~va: en 3' de la boîte enhancer.
Selon encore un autre mode préféré de l'invention, les promoteurs comprennent en outre une boîte "GC" liée de manière fonctionnelle en amont de la boîte "enhancer".
D'une manière particulièrement préférée, le promoteur comprend deux boîtes "céréales", liées de manière fonctionnelle en 5' en amont de la boîte "enhancer, elle-même liée de manière fonctionnelle en 5' en amont d'une boîte "as2/asl".
Selon encore un autre mode d'exécution préféré des promoteurs de l'invention, ceux-ci comprennent au moins un élément choisi parmi le groupe consistant en une boîte "enhancer", une boire
"G-like", une boîte "P-like", une boîte "GATA", une boîte "céréale", une boîte "asi", une boîte "as2" et /ou une combinaison de boîtes asl/as2 ou "as2/asl", éventuellement répétées, et une boîte "GC riche", liée de manière fonctionnelle, en sens inverse, et/ou en aval en 3', du site d'initiation de la transcription.
"G-like", une boîte "P-like", une boîte "GATA", une boîte "céréale", une boîte "asi", une boîte "as2" et /ou une combinaison de boîtes asl/as2 ou "as2/asl", éventuellement répétées, et une boîte "GC riche", liée de manière fonctionnelle, en sens inverse, et/ou en aval en 3', du site d'initiation de la transcription.
Enfin, les promoteurs chimériques selon la présente invention comprennent avantageusement au moins une séquence d'acide
nucléique choisie parmi le groupe consistant en SEQ.1D02, SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.IDC/, SEQ.ID03, SEQ.TD09, SEQ.ID10, SEQ. D11, SEQ.ID12, SQ. IL' ?, SEQ.ID16, SEQ.ID17, SEQ.ID18, SEQ.ID19, SEQ. ID20, SEQ.IP21, et SEQ.ID22.
nucléique choisie parmi le groupe consistant en SEQ.1D02, SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.IDC/, SEQ.ID03, SEQ.TD09, SEQ.ID10, SEQ. D11, SEQ.ID12, SQ. IL' ?, SEQ.ID16, SEQ.ID17, SEQ.ID18, SEQ.ID19, SEQ. ID20, SEQ.IP21, et SEQ.ID22.
Encore un autre objet de la présente Invention, est une cassette d'expression comprenant au moins une séquence d'acide nucléique
promotrice, dérivée d'un gène codant pour une glucénine à haut poids moléculaire de blé, liée de manière opérationnelle à une séquence d'acide nucléique à exprimer codant pour un polypeptioe à produire, elle même liée à une séquence d'acide nucléique de terminaison de transcription.
promotrice, dérivée d'un gène codant pour une glucénine à haut poids moléculaire de blé, liée de manière opérationnelle à une séquence d'acide nucléique à exprimer codant pour un polypeptioe à produire, elle même liée à une séquence d'acide nucléique de terminaison de transcription.
De préférence, cette cassette d'expression comprend au moins une séquence d'acide nucléique promotrice, dérivée d'un gène codant
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pour une g1~ur:n ine à haut poids moléculaire ae Lé, dont ~a séquence est identifiée sous le numéro L.EQ.lT':1.
Encore plus préférentiellement, la cassette d'expression comprend au moins une séquence d'acide nucléique promotrice, dérivée d'un gène codant pour une gluten'.ne à haut poids moléculaire de blé, choisie dans le groupe consistant en Les
séquences identifiées sous les numéros SEQ.ID(\, ;F,Q.IL03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.IDC7, SÇ.=C0, SEQ.1D09, SEQ.ID10, SEQ.TD11, SEQ.ID12, SEQ.ID13, sEQ.IDv, SEQ.IT1'l, SEQ.IC18, SEQ.ID19, SEQ.1D20, SEQ.ID21 et 3EQ.lî:22. Un autre objet de la présente invention est une séquence d'acide nucléique promotrice isolée, caractérisée en ce qu'elle correspond à une séquence dérivée de la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID01.
séquences identifiées sous les numéros SEQ.ID(\, ;F,Q.IL03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.IDC7, SÇ.=C0, SEQ.1D09, SEQ.ID10, SEQ.TD11, SEQ.ID12, SEQ.ID13, sEQ.IDv, SEQ.IT1'l, SEQ.IC18, SEQ.ID19, SEQ.1D20, SEQ.ID21 et 3EQ.lî:22. Un autre objet de la présente invention est une séquence d'acide nucléique promotrice isolée, caractérisée en ce qu'elle correspond à une séquence dérivée de la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID01.
De manière préférentielle, la séquence d'acide nucléique promotrice isolée correspond à une séquence choisie parmi le groupe consistant en les séquences identifiées sous les numéros
SEQ.ID02,SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.1DC6, SEQ.TD07, SEQ.IDJd, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ.ID~2, SEQ.1D13, SEQ.ID16, SEQ.ID17, SEQ.ID18, SEQ.ID19, SEQ.IL~'0, SEQ.ID21 et SEQ, 1D22. Un autre objet de la présente invention est un vecteur
comprenant un promoteur, ou une séquence d'acioe nucléique promotrice, capable d'initier la transcription a 'une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide à produire, caractérisé en ce que le promoteur ou la séquence d'acide
nucléique promotrice correspond à un promoteur cnimérique ou à une séquence d'acide nucléique promotrice tels que définis précédemment .
SEQ.ID02,SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.1DC6, SEQ.TD07, SEQ.IDJd, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ.ID~2, SEQ.1D13, SEQ.ID16, SEQ.ID17, SEQ.ID18, SEQ.ID19, SEQ.IL~'0, SEQ.ID21 et SEQ, 1D22. Un autre objet de la présente invention est un vecteur
comprenant un promoteur, ou une séquence d'acioe nucléique promotrice, capable d'initier la transcription a 'une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide à produire, caractérisé en ce que le promoteur ou la séquence d'acide
nucléique promotrice correspond à un promoteur cnimérique ou à une séquence d'acide nucléique promotrice tels que définis précédemment .
De préférence, le vecteur est choisi dans le groupe consistant
en les vecteurs binaires identifiés sous Les n jnéros pMRT 1 2 C' , pMRTi177, pMRT1178, pMRT]179, pMRT]180, et pMRI]ii.
en les vecteurs binaires identifiés sous Les n jnéros pMRT 1 2 C' , pMRTi177, pMRT1178, pMRT]179, pMRT]180, et pMRI]ii.
Encore un autre objet de la présente invention est une planée transgénique ayant intégré de manière stable dans son génome au
moins un promoteur ou au moins une séquence d'aoije nucléique promotrice tels que définis précédemment .
moins un promoteur ou au moins une séquence d'aoije nucléique promotrice tels que définis précédemment .
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De préférence, la plante ransgénique est cnoisle parmi 1 es espèces dicotylédones, telles que la pomme de Terre, le tabac, le coton, la laitue, la tomate, le melon, le concombre, le pois, le colza, la betterave, ou le tournesol, ou les espèces monocotylédones, telles que le blé, l'orge, l'avoine, le riz, ou le maïs.
Un autre objet de la présente invention est une propagule d'ne plante transgénique telle que définie précédemment, et de préférence cette propagule est une semence.
Encore un autre objet de la présente invention est une cellule contenant un promoteur ou une séquence d'acide nucléique promotrice telle que définie précédemment, et de préférence cette cellule est une cellule végétale.
Parmi les objets préférés de l'invention, il y également une méthode d'expression d'une séquence d'acide nucléique, ou gène, codant pour un polypeptide à produire, dans une cellule, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à : - transformer la cellule avec un vecteur comprenant au moins un promoteur ou au moins une séquence d'acide nucléique promotrice telle que définie précédemment ; - faire une culture de la cellule dans des conditions permettant l'expression de la séquence d'acide nucléique, ou gène, codant pour le polypeptide.
De manière préférée, le polypeptide à produire est une enzyme ou protéine ou dérivé de ces dernières possédant une activité in
vitro et/ou chez l'homme et/ou chez l'animal, :ct-::Jite activité comprenant une activité digestive, pancréatique, biliaire, antivirale, anti-inflammatoire, pulmonaire, an: : -microbienne, nutritive, cosmétique, structurelle, sanguine, cardio-vasculaire, ophtalmique, antigénique, immjnostimuiante, et cérébrale. Des exemples de telles protéines par exemple les insulines, les interférons, les lipases gastriques,
pancréatiques, ou biliaires, les élastases, les antipretéases telles que l'alpha-1 antitrypsine, les protéines structurantes comme le collagène, les transferrines comme la lacnoferrine, les protéines dérivées du sang, comme l'hémoglobine, l'albumine
vitro et/ou chez l'homme et/ou chez l'animal, :ct-::Jite activité comprenant une activité digestive, pancréatique, biliaire, antivirale, anti-inflammatoire, pulmonaire, an: : -microbienne, nutritive, cosmétique, structurelle, sanguine, cardio-vasculaire, ophtalmique, antigénique, immjnostimuiante, et cérébrale. Des exemples de telles protéines par exemple les insulines, les interférons, les lipases gastriques,
pancréatiques, ou biliaires, les élastases, les antipretéases telles que l'alpha-1 antitrypsine, les protéines structurantes comme le collagène, les transferrines comme la lacnoferrine, les protéines dérivées du sang, comme l'hémoglobine, l'albumine
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humaine, et es cofa'2teur::> sanguins, et les drl-1 W::'y'vc:~tS comme la superoxyde dismutase.
De manière préférentielle, la cellule utilisée dans cette méthode est une cellule procaryote ou eucaryote.
Plus préfèrent iellement encore, la cellule est une ce 1 iule choisie dans le groupe consistant en les cellule microbiennes, les celluJes fongiques, les cellules d'insectes, les cellules animales, et les cellules végétales, et manière encore plus préférée est une cellule végétale.
Enfin, un autre objet ae la présente invention est une méthode
d'obtention d'une plante transgénique, ou d'une prcpagule telles que définies précédemment, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à : - transformer une cellule végétale avec un vecteur comprenant au moins un promoteur ou au moins une séquence d'acide nucléique promotrice telle que définie précédemment ; - sélectionner la cellule végétale ayant intégré le promoteur ou la séquence d'acide nucléique promotrice ; - propager la cellule végétale transformée et sélectionnée, soit en culture, soit par régénération de plantes entières chimériques ou transgéniques.
d'obtention d'une plante transgénique, ou d'une prcpagule telles que définies précédemment, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à : - transformer une cellule végétale avec un vecteur comprenant au moins un promoteur ou au moins une séquence d'acide nucléique promotrice telle que définie précédemment ; - sélectionner la cellule végétale ayant intégré le promoteur ou la séquence d'acide nucléique promotrice ; - propager la cellule végétale transformée et sélectionnée, soit en culture, soit par régénération de plantes entières chimériques ou transgéniques.
DESCRIPTION DES FIGURES L'invention sera mieux comprise par la description détaillée des différents modes de réalisation donnée ci-après à titre d'exemples non limitatifs, et en se référant au dessin en annexe, dans lequel : - les Figures I, II, III et IV représentent de manière schématique des constructions de promoteurs synthétiques et chimériques conformes à l'invention. Dans la Figure 1, il s'agit de constructions comportant une série de délétions en partant du promoteur entier provenant du gène Dx5 de blé e'; codant pour une gluténine à haut poids moléculaire de blé, ainsi qu'une série de constructions comportant des répétitions d'éléments comportant
une boite "enhancer" combinée à une boîte "C;-"" Le;" ; - la Figure II représente de manière schématique des
une boite "enhancer" combinée à une boîte "C;-"" Le;" ; - la Figure II représente de manière schématique des
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constructions d'autres promoteurs synthétiques et chimériques conformes à l'invention contenant des insertions d'éléments
régulateurs et/ou fonctionnels comportant des boites "as2/3s1" combinées ; - la Figure III représente de manière schématique des constructions d'autres promoteurs synthétiques et chimériques
conformes a l'invention, contenant des insertions d'éléments régulateurs et/ou fonctionnels comportant des 'Les "as2/as2/asl" combinées ; - la Figure IV représente de manière schématique des constructions d'autres promoteurs synthétiques et chimériques conformes à l'invention, contenant des insertions d'éléments régulateurs et/ou fonctionnels comportant des boites "céréales" combinées, provenant du gène Bx7 codant pour une gluténine à haut poids moléculaire de blé, seules ou en comoinaison avec des boîtes "as2/asl", ainsi qu'une construction comportant une boite "GC riche" ; - la Figure V représente des photographies de feuilles de tabac ayant été transformées avec des vecteurs contenant les promoteurs ou séquences d'acide nucléique précédemment décrits, liés de manière fonctionnelle au gène codant pour GUS (bêta-glucuronidase) , et après révé lation histochimique, les points bleus indiquant la présence des cellules transformées par lesdites constructions, et donc l'activité du promoteur ; - les Figures VI et VII représente un graphique comparant l'activité promotrice relative aux différentes constructions après expression transitoire dans des albumens de mais. Trois jours après bombardement les feuilles sont broyées puis l'extrait brut clarifié par centrifugation. L'activité
1-glucuror.idase et l'activité luciférase sont mesurées par fluorimétrie sur un aliquote de l'extrait brut, puis le rapport activité GUS/ activité LUC est déterminé. Les histogrammes correspondent à la moyenne des rapports pour une même construction +/- Erreur Standard à la Moyenne (SEM).
régulateurs et/ou fonctionnels comportant des boites "as2/3s1" combinées ; - la Figure III représente de manière schématique des constructions d'autres promoteurs synthétiques et chimériques
conformes a l'invention, contenant des insertions d'éléments régulateurs et/ou fonctionnels comportant des 'Les "as2/as2/asl" combinées ; - la Figure IV représente de manière schématique des constructions d'autres promoteurs synthétiques et chimériques conformes à l'invention, contenant des insertions d'éléments régulateurs et/ou fonctionnels comportant des boites "céréales" combinées, provenant du gène Bx7 codant pour une gluténine à haut poids moléculaire de blé, seules ou en comoinaison avec des boîtes "as2/asl", ainsi qu'une construction comportant une boite "GC riche" ; - la Figure V représente des photographies de feuilles de tabac ayant été transformées avec des vecteurs contenant les promoteurs ou séquences d'acide nucléique précédemment décrits, liés de manière fonctionnelle au gène codant pour GUS (bêta-glucuronidase) , et après révé lation histochimique, les points bleus indiquant la présence des cellules transformées par lesdites constructions, et donc l'activité du promoteur ; - les Figures VI et VII représente un graphique comparant l'activité promotrice relative aux différentes constructions après expression transitoire dans des albumens de mais. Trois jours après bombardement les feuilles sont broyées puis l'extrait brut clarifié par centrifugation. L'activité
1-glucuror.idase et l'activité luciférase sont mesurées par fluorimétrie sur un aliquote de l'extrait brut, puis le rapport activité GUS/ activité LUC est déterminé. Les histogrammes correspondent à la moyenne des rapports pour une même construction +/- Erreur Standard à la Moyenne (SEM).
Dans la description détaillée qui suit, les traitements enzymatiques effectués avec les enzymes de restriction et les
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enzymes de modification de l'AL'N or.t été réduises soi on les recommandations du fournisseur New England "1ia's. Suite à chaque traitement enzymatique, l'ADN a systématiquement été purifié 3 l'aide des Kits QIAquick PCR Purir ioat i-n (Q1AGEN: ou Concert Rapid PCR Purification System 1,::::;18C:0 F3RL Life Technologies), ou si précisé, à l'aide des Kits QIAqJ1.\.'k Gel Extraction (QIAGEN) ou Concert Rapid Cet Extraction System (GIBCO BRL Life Technologies) selon les indications des fournisseurs. Le Thermocycleur GeneAmp FOR System 9700
utilisé est commercialisé par Perkin Elmer Tipp ~ ' Jd Ricsyste:T1.s.
EXEMPLES Exemple 1 Constructions à but comparatif (témoins).
Pour permettre 1 Ci. comparaison des promoteurs chimériques
décrits dans ce brevet, le gène uidA codant la 5-glucuroni:xase (Jefferson et al., 1986) contenant la séquence de l'intron IV2 du gène ST-LS1 de la patatine de pomme de terre (Vancanneyt et al., 1990) (uidA-IV2) a été placé sous contrôle de l'un des promoteurs de référence, et du terminateur du gène de la nopaline
synthase (term-nos) d'Agrobacterium tumefacie;.3 dans le plasmide pGEM3Z commercialisé par Promega Corp. (Madiscn, USA).
décrits dans ce brevet, le gène uidA codant la 5-glucuroni:xase (Jefferson et al., 1986) contenant la séquence de l'intron IV2 du gène ST-LS1 de la patatine de pomme de terre (Vancanneyt et al., 1990) (uidA-IV2) a été placé sous contrôle de l'un des promoteurs de référence, et du terminateur du gène de la nopaline
synthase (term-nos) d'Agrobacterium tumefacie;.3 dans le plasmide pGEM3Z commercialisé par Promega Corp. (Madiscn, USA).
1.1. Construction du témoin négatif pMRT1144.
Le plasmide pMRT1144, dépourvu de toute séquence promotrice, sert de témoin négatif. Il dérive du plasmide pGEM3Z
dans lequel la séquence uidA-IV2/term-nos a été introduite.
dans lequel la séquence uidA-IV2/term-nos a été introduite.
Dans un premier temps, 5 g du plasmide pBI221 (Clonetech, CA, USA) ont été digérés pendant : h à 37 C par les
enzymes de restriction EcoRI et BamHI. La séquence L; i d.4 sous contrôle du terminateur de la nopaline synthase a ensuite été isolée sur un gel d'agarose à 0.8% à l'aide d'.. Kit QIAquicr~ Gel Extraction .
enzymes de restriction EcoRI et BamHI. La séquence L; i d.4 sous contrôle du terminateur de la nopaline synthase a ensuite été isolée sur un gel d'agarose à 0.8% à l'aide d'.. Kit QIAquicr~ Gel Extraction .
En parallèle, 5 ug de plasmide pGEM3Z ont été digérés par le couple d'enzymes de restriction EcoRI et BamHT pendant @
h à 37 C. Le fragment vecteur a ensuite été isolé sur un gel d'agarose à 0.8% à l'aide du Kit QIAquick Gel Extraction , déphcsphorylé par 40 U de phosphatase alcaline d'intestin de
h à 37 C. Le fragment vecteur a ensuite été isolé sur un gel d'agarose à 0.8% à l'aide du Kit QIAquick Gel Extraction , déphcsphorylé par 40 U de phosphatase alcaline d'intestin de
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veau i New England Biolaos) en présence de tampon 3 (LX) à 37"C pendant 1 n.
La réaction de ligation a été réa':" ::-"';'2 avec 50 ng du fragment uidA-IV2/term-nos et 100 ng de- piasmide r<;em3, ainsi traités, dans un mélange réactionnel de 0 ud, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de T-î P.. l) "1 ligase (New England Biolabs), dans le thermocydcjr C;'2:.2r'11p PCR System 970C . Elle est constituée d'un cycle à 10 C pendant 30 sec. et de 200 cycles identiques constitués chacun des étapes
suivantes . 30 sec. à 30 C, 30 sec. à JOGe et 30 sec. à 3::oC. Des bactéries Escherichia coli DH5a, renoues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus,
sélectionnés sur milieu Luria-Bertani (LB, bactotryptone 10 g/1, extrait de levure 5 g/1, NaC1 10 g/1, pH 7. et Agar-Agar 15 g/1) supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon La méthode de lyse alcaline (Birnboin et Doly, 1983) et analysé par digestions enzymatiques. Le plasmide résultant a été appelé pGEM3Z/uidA/term-nos.
suivantes . 30 sec. à 30 C, 30 sec. à JOGe et 30 sec. à 3::oC. Des bactéries Escherichia coli DH5a, renoues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus,
sélectionnés sur milieu Luria-Bertani (LB, bactotryptone 10 g/1, extrait de levure 5 g/1, NaC1 10 g/1, pH 7. et Agar-Agar 15 g/1) supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon La méthode de lyse alcaline (Birnboin et Doly, 1983) et analysé par digestions enzymatiques. Le plasmide résultant a été appelé pGEM3Z/uidA/term-nos.
Dans un deuxième temps, afin d'insérer l'intron IV2 de 192 pb du gène de la patatine de pomme de terre dans la séquence
codante uidi'i de pGEM3Z/ uidA/ terra- nos, une portier, interne de ce gène (fragment SnaBI/BstBI de 710 pb) a été excisé puis remplacé
par la séquence équivalente contenant l'intrcn IV2 (fragment SnaBI/BstBI de 902 pb).
codante uidi'i de pGEM3Z/ uidA/ terra- nos, une portier, interne de ce gène (fragment SnaBI/BstBI de 710 pb) a été excisé puis remplacé
par la séquence équivalente contenant l'intrcn IV2 (fragment SnaBI/BstBI de 902 pb).
Pour ce faire, 10 ug du plasmide pr tM3Zi u d./terrr,-~ ont été digérés pendant 1 h à 37C par SnaBL (site de restriction situé à la position +383 pb or. aval ou ûr i nitiateur ATG du gène uidA) puis pendant 1 h à 6:)" par BstBl (site localisé à la position +1093 pb) . Le plasmide ainsi déléfé du fragment de 710 pb a été isolé sur un gel d'agarose à 0,8% à l'aide du Kit QIAquick Gel Extract ion , déphosphery Lé par 40 U de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New Englar.d Biolabs) en présence de tampon 3 (IX) à 37 C pendant 1 h.
Le fragment BstBI/SnaBI de 902 pb correspondant .à la séquence de l'intron IV2 suivie de la séquence uidA, été
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oDLenu pdr a digestion de 10 pg au piasmi. de p35S GUS 1 M (Vancanneyt et a1. , 1990) par les enzymes de restriction SnaBI (site de restriction situé à la position t-383 pb en aval du codon initiateur ATG du gène guida) pendant 1 n 2. 37 c et 3stBI (site localisé à la position +1285 pb) pendant 1 h gaz ' ; . Le fragment de 902 pb a ensuite été isolé sur un gel d'agarose à 1% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System .
La réaction de ligation a été réalisée avec 100 ng de
vecteur pC',:t3?/uidA/terru-nos et 50 ng du fragment de 902 pb EstgI/S,r=3Bi ainsi traités, dans un mélange réactionnel de li p-i en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de T4 ADN ligase (New Engiand Biolabs), dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 comme décrit précédemment. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la tonalité du mélange réacticnnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques. Le plasmide obtenu a été appelé
pMRT 144.
vecteur pC',:t3?/uidA/terru-nos et 50 ng du fragment de 902 pb EstgI/S,r=3Bi ainsi traités, dans un mélange réactionnel de li p-i en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de T4 ADN ligase (New Engiand Biolabs), dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 comme décrit précédemment. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la tonalité du mélange réacticnnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques. Le plasmide obtenu a été appelé
pMRT 144.
1. 2. Construction du témoin positif pMRT1218.
Afin de disposer d'une séquence promotrice de référence
dans lalbumen de maïs SN 87 165 (L2), le promoteur y-zéine entier de 1,7 kb (Pry-zéïne) contenu dans le plasma te p63 décrit par Reina et al. (1990), a été placé en amont de la séquence ui dA- IV2 / f e rm- nos .
dans lalbumen de maïs SN 87 165 (L2), le promoteur y-zéine entier de 1,7 kb (Pry-zéïne) contenu dans le plasma te p63 décrit par Reina et al. (1990), a été placé en amont de la séquence ui dA- IV2 / f e rm- nos .
Le promoteur y-zéïne de 1,7 kb a été obtenu par la digestion de 15 g de plasmide p63 avec les enzymes de
restriction HindIII et BamHI pendant 1 h à 37 C. Le fragment Pry-z éï ne de 1,7 kb ainsi libéré a été isclé sur un gel dagarcse à 0,8% à laide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System .
restriction HindIII et BamHI pendant 1 h à 37 C. Le fragment Pry-z éï ne de 1,7 kb ainsi libéré a été isclé sur un gel dagarcse à 0,8% à laide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System .
En parallèle, 10 ug de plasmide pX?T::2 (décrit aans la section 3.4 de lexemple 3) ont également été digérés par les
enzymes de restriction HindIII et BamHI pendant n à 37 C,. Le fragment vecteur a ensuite été isolé sur un gel d'agarose à 0,8% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System et
enzymes de restriction HindIII et BamHI pendant n à 37 C,. Le fragment vecteur a ensuite été isolé sur un gel d'agarose à 0,8% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System et
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dépnosphoryi é par 9J U de phosphatase alcaline a' intestin oe veau (New England Biolabs) en présence de tampon 3 (IX) à 37 C pendant 1 h.
La réaction de ligation a été réalisée avec 50 ('1 l de fragment promoteur y-zéïne et 100 ng de p-lasmide p'IRT11 b, ainsi traités, dans un mélange réactionnel de 10 ,, en présence au tampon T4 ADN ligase (IX) et de 40C unités de r4 Adr ligase (New England Biolabs), dans le thernocycleur GeneAmp PCR Systeem 9700 comme décrit précédemment. Des bactéries Esch0ri chi3 coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées
par la totalité du mélange réactionnel de iigaticn. D'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB
supplémenté en ampicilline (50 f1g/), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques.
par la totalité du mélange réactionnel de iigaticn. D'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB
supplémenté en ampicilline (50 f1g/), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques.
Le plasmide résultant a été appelé pMRT121S.
1.3. Construction du témoin positif pMRT1092.
Afin de disposer d'une séquence promotrice de référence
dans les tissus photosynthétiques du tac'3C (,"Ji cet Í3!la tabacum ., cultivar PBD6), le promoteur "double 3:," du virus ose la mosaïque du choux fleur (PrD35S CaMV) , a été placé en amont de la séquence uidA-IV2/term-nos.
Dans un premier temps, l'intron Zizi? de z pb du gène ae la palatine de pomme de terre a été inséré dans la séquence codante uidA à la position +383 pb comme décrit à la section
1.1. Pour ce faire, 1 ug de plasmide p31221 (Clontech, ÇA, RUSA) a été digéré pendant 1 h 30 min. à 37C par SoaBI puis, pendant 1 r 30 min, à 65 C par BstBI. Le plasmide dé! été d'un fragment de 710 pb a été isolé sur un gel d'agaicse à C,8'ë, puis purifié sur colonne d' affinité Qiaquick. Une quantité de 20 ng de
vecteur pB;221 BstBI/SnaBI et 80 ng du fragment de 902 pb BstBI/SnaBI provenant de p35S GUS INT comme décrit précédemment, ont été ligaturés pendant 1 nuit à 18 C dans un mélange
réactionnel de 10 ui, en présence du tampon F4 Ad ligase (IX) et de 400 unités d'enzyme T4 ADN ligase tNew Englanc Biolabs). Des bactéries Escher i chia coli DH:;ca, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange
dans les tissus photosynthétiques du tac'3C (,"Ji cet Í3!la tabacum ., cultivar PBD6), le promoteur "double 3:," du virus ose la mosaïque du choux fleur (PrD35S CaMV) , a été placé en amont de la séquence uidA-IV2/term-nos.
Dans un premier temps, l'intron Zizi? de z pb du gène ae la palatine de pomme de terre a été inséré dans la séquence codante uidA à la position +383 pb comme décrit à la section
1.1. Pour ce faire, 1 ug de plasmide p31221 (Clontech, ÇA, RUSA) a été digéré pendant 1 h 30 min. à 37C par SoaBI puis, pendant 1 r 30 min, à 65 C par BstBI. Le plasmide dé! été d'un fragment de 710 pb a été isolé sur un gel d'agaicse à C,8'ë, puis purifié sur colonne d' affinité Qiaquick. Une quantité de 20 ng de
vecteur pB;221 BstBI/SnaBI et 80 ng du fragment de 902 pb BstBI/SnaBI provenant de p35S GUS INT comme décrit précédemment, ont été ligaturés pendant 1 nuit à 18 C dans un mélange
réactionnel de 10 ui, en présence du tampon F4 Ad ligase (IX) et de 400 unités d'enzyme T4 ADN ligase tNew Englanc Biolabs). Des bactéries Escher i chia coli DH:;ca, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange
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rc.dWL::21 de llg3tlOn. 'ALN des clones obtenus, Sé~e'Lli~riés sur milieu LB additionné d'ampicilline (50 1HJ/::, a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques. Le plasmide obtenu a été appelé ::I%/ilu'-i'v'2.
Dans un deuxième temps, la séquence du promoteur J5S du CaMV présente au niveau du plasmide pBI2 2 1 / uldA- JV2 a été remplacée par la séquence de "PrD35S C-;;v','''. le plasmide p3I221/uidA-IV2 a été digéré pendant 10 h 30 min. à 37C par Hindill, puis les extrémités cohésives ont été rendues bouts-francs par l'action du fragment de KLenow (New England BLoiabs) pendant 30 min à 37 C. Le produit de cette réaction a
ensuite été digéré pendant une nuit à 37 C par BamHI. Le fragment d'ADN plasmidique, correspondant au vecteur délété du fragment promoteur 35S CaMV de 828 pb, a été isolé sur un gel
d'agarose à 0, 8 , puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick.
ensuite été digéré pendant une nuit à 37 C par BamHI. Le fragment d'ADN plasmidique, correspondant au vecteur délété du fragment promoteur 35S CaMV de 828 pb, a été isolé sur un gel
d'agarose à 0, 8 , puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick.
En parallèle, le promoteur D35G .aTT.' a été obtenu à partir du plasmide pJI'163. Celui-ci dérive du plasmide pJIT163 qui dérive lui-même du plasmide pJIT16J (Guérineau et Mullineaux, 1993.) .. Le plasmide pJiri63 possède un codon ATG entre les sites HindIII et Sali du polylinker. Pour supprimer cet ATG et obtenir le plasmide pJIT163A, 'ADN pxasmidique pJIT163 a été digéré par HindI:::::: et Sali, purifié sur un ge d'agarose à 0,8%, électroélué, précipité en présence de 1/10 volume d'acétate de sooium 3M pH 4,8 et de 2,j volumes d'éthanol absolu à -8::::oC pendant 30 min, centrifugé à 12000 g pendant 30 min, lavé à l'éthanol 70%, séché, soumis à l'action du fragment de Klenow (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C,
déprotéinisé par extraction avec un volume Je phénol, puis un volume de phénol : chloroforme . alcool isoamylique (25:24:1 v/v/v) et enfin un volume de chloroforme . alcool isoamylique (24:1 v/v), précipi té en présence de 1/10 volume d'acétate de
soaium 3 pH 4,8 et de 2,5 volumes a'élhanol absolu à -80 C pendant 30 min, puis centrifugé à 1200C g pendant 30 min, lavé à
l'éthanol 70 %, séché et enfin ligaturé en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et 2,5 unités d'ADN ligase TA "l\.r-:'ersL:1:) à 14 C pendant 16 n . Des bactéries Escher i en ia " =--1 DH5a, rendues
déprotéinisé par extraction avec un volume Je phénol, puis un volume de phénol : chloroforme . alcool isoamylique (25:24:1 v/v/v) et enfin un volume de chloroforme . alcool isoamylique (24:1 v/v), précipi té en présence de 1/10 volume d'acétate de
soaium 3 pH 4,8 et de 2,5 volumes a'élhanol absolu à -80 C pendant 30 min, puis centrifugé à 1200C g pendant 30 min, lavé à
l'éthanol 70 %, séché et enfin ligaturé en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et 2,5 unités d'ADN ligase TA "l\.r-:'ersL:1:) à 14 C pendant 16 n . Des bactéries Escher i en ia " =--1 DH5a, rendues
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préalablement compétentes, on été transtornées. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la
méthode de la lyse alcaline et analysé par diqesfions enzymatiques. Ensuite, dix ug de plasmide pJTm7 61 ont été digéré pendant 10h30 à 37 C par Kpnl (site 5' ou promoteur), puis les extrémités cohésives ont été rendues bouts francs par l'action de 6 unités de T4 ADN polymérase (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C. Le produit de cette réaction a ensuite été digéré pendant une nuit à 37 C par BamHI.
Le fragment d'ADN résultant de 761 pb, correspondant au
promoteur D35S CaMV a été isolé sur un gel d' aar"se à 1%, puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick. La ligation a été réalisée avec 10 ng de vecteur plasmidique et 100 ng du fragment de 761 pb, dans un mélange réactionnel de 10 ;il, en présence du
tampon T4 ADN ligase (IX) et 400 unités de 74 ADR ligase (New England Biolabs) pendant une nuit à 18 C. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange réactionnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur
milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques. Le plasmiae obtenu a été appelé pMRT1092.
promoteur D35S CaMV a été isolé sur un gel d' aar"se à 1%, puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick. La ligation a été réalisée avec 10 ng de vecteur plasmidique et 100 ng du fragment de 761 pb, dans un mélange réactionnel de 10 ;il, en présence du
tampon T4 ADN ligase (IX) et 400 unités de 74 ADR ligase (New England Biolabs) pendant une nuit à 18 C. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange réactionnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur
milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques. Le plasmiae obtenu a été appelé pMRT1092.
1.3. Description du plasmide de référence pCaMV35Sluc.
Le plasmide servant de référence interne lors de
1 ' expression transitoire est pCaMV35: luc (Torrent et as., 1997) qui contient la cassette d'expression du gène rapporteur luciférase (lue) sous contrôle du promoteur et du terminateur de l'ARN 35S du CaMV.
1 ' expression transitoire est pCaMV35: luc (Torrent et as., 1997) qui contient la cassette d'expression du gène rapporteur luciférase (lue) sous contrôle du promoteur et du terminateur de l'ARN 35S du CaMV.
Exemple 2.
Construction de plasmides contenant la séquence promotrice entière et des séquences promotrices délétées ou dupliquées d'un gène de glutenine de haut poids moléculaire de blé.
Le promoteur entier (PrHMWG-Dx5 (GEC.'LOI) ) du gène de glutenine de haut poids moléculaire codant pour la sous-unité
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ux5, appelée aussi GluL'l-1.lJ, du blé ïlea:d;L!u-C :Lï i W;ll, âr' I V?li1 ,;F lrlL'c?i:~?t' ( Andersen et i31., 1 9 A 9 ) correspond à une séquence de 417 pb (N d'accession X12928) allant de la position -378 pb à la position - 39 pb, sur Laquelle 'i'pr.-3 . séquences potentiellement régulatrices sont identifiées et . lissées du côté
5' vers le côté 3', par rapport au point ±1 d'initiation de la transcription (Fig. 1) : une boîte prolamine like , s'étendant des positions -357 à -350 pb, - deux boires GATA s'étendant des positions -309 à -306 pb et -292 à -289 pb, - une boîte prolamine like , s'étendant des positions -252 à -246 pb, une boite G like de 8 pb, s'étendant de la position -218 à la position -211 pb,
un élément activateur de 38 pb, s'étendant de la position -186 à la position -149 pb, composé d'une mosaïque de motifs cis-activateurs putatifs : une boîte prolamine, s'étendant des positions
-182 à -176 pb, une séquence possédant une symétrie imparfaite
s' étendant des positions -178 à -Í 61 pb, . une répétition directe du pentanucléotide GCTCC entre les positions -176 et-163 pb, une boîte E , s'étendant de la posit ion -172 à la position -167,
une répét it ion directe du perr anuci éotide T1GCT entre les positions -169 et-158 pb, - une boîte "TATA", présentant le consensus TATAAAA de la position -30 à-24, - le point +1 d' initiation de la transcription (position
1.. 1 une région 5' non traduite allant de la position )-1 à la position +39 pb.
Afin d'étudier l'effet des différents éléments ces-activateurs putatifs décrits ci-dessus, une analyse fonctionnelle
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détaillée au promoteur HMWG-Dx5 ,:SQ.LI'jl) -j été réalisée. Le gène rapporteur ?idA-iV2 a été placé sous le contrôle du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.IDC1) entier et sous le contrôle des promoteurs HMWG-Dx5 (SEQ.TD01) synthétiques, présentant soit des délétions progressives de la réglons 5' , soit une délétion interne ou soit des duplications d'une portion interne.
2.1. Construction du plasmide pMRT1125.
Le plasmide pMRT1125 résulte du clonage du promoteur entier du gène de glutenine de haut poids moléculaire (FrHMWG-Dx5
(SEQ.ID01) , Fig. I) en amont du gène rapporteur ;iA-IV1' et constitue la construction de référence pour l'ensemble des promoteurs HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) synthétiques décrits Gans ce brevet.
(SEQ.ID01) , Fig. I) en amont du gène rapporteur ;iA-IV1' et constitue la construction de référence pour l'ensemble des promoteurs HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) synthétiques décrits Gans ce brevet.
Le promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) décrit par Andersen et al.
(1989) a été obtenu à partir de la cassette d'expression
FrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01) /uidA/term- nos introduite dans un plasmide pUC19 (Stratagene) selon les techniques usuelles de clonage. Dix ug du plasmide résultant (pPUCl 9-HMWG) ont été hydrolyses par EcoRI pendant 1 h à 37C et soumis à l'action de 20 U du fragment Klenow (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C en présence de 60 nmoles de chacun des #ITPs, de 1 2 pi de tampon Tris-HCL 500 mM pH 7.5 - MgC12 SOO InN et 6 pi de dithiothréitol (DTT) à 1 M. L'ADN a ensuite été digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C et le fragment promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) ainsi libéré et traité, a été Isolé sur un gel
J'agaros8 à 1,5% à l'aide du Kit QIAquick Gel Extraction . En parallèle, le fragment vecteur a été préparé à partir du
plasmide pMRT1097 (Demande de brevet français FR 9903635 non-publiée). Vingt ug de plasmide pN'RT1097 ont été aigérés pendant 1 h à 37 C par SphI et les extrémités cohésives du vecteur pMRT1097 ainsi linéarisé, ont été renoues oouts-francs
par l'action de 6 U de l' enzyme T4 Adr polymérase (New Engiand Blolabs) pendant 30 min. à 37 C. Le produit de cette réaction a ensuite été hydrolysé par BamHI et le fragment vecteur a été
isolé sur un gel d'agarose à 0.8% à l'aide ji Kit QIAquick Gel Extraction , avant d'être déphospr.cr; é par 4 3 U de
FrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01) /uidA/term- nos introduite dans un plasmide pUC19 (Stratagene) selon les techniques usuelles de clonage. Dix ug du plasmide résultant (pPUCl 9-HMWG) ont été hydrolyses par EcoRI pendant 1 h à 37C et soumis à l'action de 20 U du fragment Klenow (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C en présence de 60 nmoles de chacun des #ITPs, de 1 2 pi de tampon Tris-HCL 500 mM pH 7.5 - MgC12 SOO InN et 6 pi de dithiothréitol (DTT) à 1 M. L'ADN a ensuite été digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C et le fragment promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) ainsi libéré et traité, a été Isolé sur un gel
J'agaros8 à 1,5% à l'aide du Kit QIAquick Gel Extraction . En parallèle, le fragment vecteur a été préparé à partir du
plasmide pMRT1097 (Demande de brevet français FR 9903635 non-publiée). Vingt ug de plasmide pN'RT1097 ont été aigérés pendant 1 h à 37 C par SphI et les extrémités cohésives du vecteur pMRT1097 ainsi linéarisé, ont été renoues oouts-francs
par l'action de 6 U de l' enzyme T4 Adr polymérase (New Engiand Blolabs) pendant 30 min. à 37 C. Le produit de cette réaction a ensuite été hydrolysé par BamHI et le fragment vecteur a été
isolé sur un gel d'agarose à 0.8% à l'aide ji Kit QIAquick Gel Extraction , avant d'être déphospr.cr; é par 4 3 U de
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phusphd to;:.e alcaline 0' i Il test: i n de veau i, New Engiand Biolabs) en présence de tampon 3 (IX) à 37C pendant 1 si, Le vecteur de clonage résultant, a été appelé pGEM3-. La ligation a été réalisée avec 100 ng du fragment promoteur HMWG-Dx5 (SEQ. ID01) ainsi traité et 50 ng de plasmide
pGem3Z-l pendant 1 nuit à 16 C dans un mélange réa ~ iot:-el de 10 pi, en présence du tampon 'h4 ADN ~ : ga, (IX) et de j0 unités de T4 ADN ligase (New England Biolabs). Des bactéries Escherichia coti DHSa, rendues préalablement compétentes, cnt été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/l), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRT1125 et la séquence
promotrice HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) (SEQ.1DC1) scnématisée dans la Fig. I a été vérifiée par séquençage.
promotrice HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) (SEQ.1DC1) scnématisée dans la Fig. I a été vérifiée par séquençage.
2.2. Construction du promoteur MPrll28.
Le promoteur MPR1123 (SEQ.TD04) dérive oe PrHMWG-Dx5 (SEQ.TD01) par délétion de la séquence située en amont du nuciéotide -238, laquelle comporte les deux bo--es prolamines
live et les deux ooîtes GATA. Le fragment promoteur a été amplifié par PCR à partir de 5 ng d'ADN matrice pMRT1125
(décrit dans la section 2.1 de l'exemple 2) à l'aide de lac pmoles de chacun des 2 oligcdéscxynucléotides 5' ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG 3' contenant le site -de rest rict ion EcoRI et 5' TACggATCCCCgggg:TCTC:T Ag""' 'gTgg' gC 3' possédant le site de restriction BamH7, -;#:. présence de ci nrr.cles de chacun des dNTPs, du tampon Vent ADN pclymérase 1~; et de 2 U de Vent ADN polymérase (New England Biolabs). La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une
dénaturation à 94 CC pendant 5 min., 1 ' ADN ri été sourris à 3; cycles constitués chacun des étapes de dénatura: Lon à 94 C pendant 1 rrin. , d' hybridation à 5Q C . ;r.l,~r~t min. et d'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. Lors du dernier
live et les deux ooîtes GATA. Le fragment promoteur a été amplifié par PCR à partir de 5 ng d'ADN matrice pMRT1125
(décrit dans la section 2.1 de l'exemple 2) à l'aide de lac pmoles de chacun des 2 oligcdéscxynucléotides 5' ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG 3' contenant le site -de rest rict ion EcoRI et 5' TACggATCCCCgggg:TCTC:T Ag""' 'gTgg' gC 3' possédant le site de restriction BamH7, -;#:. présence de ci nrr.cles de chacun des dNTPs, du tampon Vent ADN pclymérase 1~; et de 2 U de Vent ADN polymérase (New England Biolabs). La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une
dénaturation à 94 CC pendant 5 min., 1 ' ADN ri été sourris à 3; cycles constitués chacun des étapes de dénatura: Lon à 94 C pendant 1 rrin. , d' hybridation à 5Q C . ;r.l,~r~t min. et d'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. Lors du dernier
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cycle, i' él..ngatic=: a été poursuivie " -;, 0, pendant. 5 min.
Le fragment d'ADN issu de l'amplification a été isolé sur un gel d'agarose à 1 . 5 à l'aide du Kit QIAqvicr~ Gel Extraction , hydrolyse par EcoRI pendant 1 h a 37 C et soumis à l'action de 20 U du fragment Klenow (New E:1g lr:nd Riolabs) pendant 30 min à 37 C en présence de 6 nnoies de chacun des dNTPs, de 1 ul de tampon Tris-HCL 500 n0J: pH 7\5 - KgC12 soc, ma et 6 pl de DTT à 1 M. L'ADN ainsi traité a ensuite été digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C.
La ligation a été réalisée avec 100 ng du fragment promoteur
MPR1126 (SEQ.ID04)ainsi traité et 50 ng de ;<as:ride pGEM3Z-l (décrit dans la section 2.1 de l'exemple 2) pendant 1 nuit à
16 C dans un mélange réactionnel de 70 pi, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de T4 AUN ligase (New England Biolabs). Des bactéries 'sc'-ri n~ia coi DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1)., a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques.
MPR1126 (SEQ.ID04)ainsi traité et 50 ng de ;<as:ride pGEM3Z-l (décrit dans la section 2.1 de l'exemple 2) pendant 1 nuit à
16 C dans un mélange réactionnel de 70 pi, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de T4 AUN ligase (New England Biolabs). Des bactéries 'sc'-ri n~ia coi DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1)., a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques.
Le plasmide obtenu a été appelé p1RT11'H et la séquence promotrice Merl128 (SEQ.ID04) schématisée dans la Fig. 1 a été vérifiée par séquençage.
2. 3. Construction du promoteur MPrll27 (SEQ.ID03) .
Le promoteur MPrll27 (SEQ.ID03) dérive du promoteur HMWG-Dx5
(SEQ, l DO 1) par délétion de la séquence située en amont du nucléotide -205, laquelle comporte les deux ooltes prolamines lise , les deux boîtes GATA et la boite Cl . Le fragment promoteur a été amplifié par PCR et traicé 1e la même manière que le promoteur MPR1128 (SEQ.ID04) (décrit d-ms la section 2.2 de l'exemple 2) excepté que les 2 oligooésoxynucléotides utilisés sont 5' ATCGGGAATTCGCAGACTGTCCAAAAA'7C 3' contenant le site de restriction FcoRT et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site de restriction BamHI.
(SEQ, l DO 1) par délétion de la séquence située en amont du nucléotide -205, laquelle comporte les deux ooltes prolamines lise , les deux boîtes GATA et la boite Cl . Le fragment promoteur a été amplifié par PCR et traicé 1e la même manière que le promoteur MPR1128 (SEQ.ID04) (décrit d-ms la section 2.2 de l'exemple 2) excepté que les 2 oligooésoxynucléotides utilisés sont 5' ATCGGGAATTCGCAGACTGTCCAAAAA'7C 3' contenant le site de restriction FcoRT et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site de restriction BamHI.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRT112 et la séquence
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promotrice M?rll2/ (s Q. ID03) schématisée -:r.s a h'ig. I a été vérifiée par séquençage.
2. 4. Construction du promoteur MPrll26 (SEQ. ID02) .
Le promoteur MPrll26 (SEQ.ID02) dérive du pi-moteur HMWG-D-5 (SF,Q.-tDo1) par délétion de la séquence située en airont du nucléotide -142, laquelle comporte les deux boites prc;laninF'.<3 like , les deux polies GATA, la oolie . gaz et l'élément activateur. Le fragment promoteur a été amplifié par FOR et
traité de la même manière que le promoteur MPR1.12 (SEQ.ID04) (décrit dans la section 2.2 de l'exemple 2; pxrepté que les 2 oiigodéso:ynucléotides utilisés sont ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC 3' contenant le si Le de restriction EcoRI et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site de restriction BamHI.
traité de la même manière que le promoteur MPR1.12 (SEQ.ID04) (décrit dans la section 2.2 de l'exemple 2; pxrepté que les 2 oiigodéso:ynucléotides utilisés sont ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC 3' contenant le si Le de restriction EcoRI et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site de restriction BamHI.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRT1126 et la séquence
promotrice MPrll26 (SEQ.ID02) schématisée dans la Fie. I a été vérifiée par séquençage.
promotrice MPrll26 (SEQ.ID02) schématisée dans la Fie. I a été vérifiée par séquençage.
2. 5. Construction du promoteur intermédiaire MPrll83.
Le promoteur MPrll83 résulte de l'insertion d'un site ae
restriction Xbal en amont du promoteur MP-R112Ô (SEQ.lD04j (décrit à la section 2. 2 de l'exemple @). Le fragment
promoteur a été amplifié par PCR à partir ase 5 r.g d'ADN matrice pMRT1128 à l'aide de 100 VrlCle3 de cnacun des ''JI igodésoxyn;1cléot ides 5' ATCggllli TTCT l-~g;'~Cg'-:(:cl-,-:;:-=- \C9':'9'gT rTAgC 3' contenant les sites de restriction EcoRI et XbaI et 5'
TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' p D s s le site de restriction BamHI, en présence de 53 rDC 1 é::?:'" .de chacun des dNTPs, de tampon Vent ADN polymérase :1X) , le 1 de Vent ADN polymérase (New England Blolabs;. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée ari,-5 le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturât ion à 94 C pendant 5 min., l'ADN a été soumis à 3C cycles constitués
chacun des étapes de dénaturation a 94 C pendant 1 min., d'hybridation à 50 C pendant 1 miu. et ;':,n,ai; -~ à 7 'C pendant min. 30 sec. Lors du dernier cycle, l'Ôlc,;;q3ti,,:,r; :ci été poursuivie à 72 C pendant 5 min.
restriction Xbal en amont du promoteur MP-R112Ô (SEQ.lD04j (décrit à la section 2. 2 de l'exemple @). Le fragment
promoteur a été amplifié par PCR à partir ase 5 r.g d'ADN matrice pMRT1128 à l'aide de 100 VrlCle3 de cnacun des ''JI igodésoxyn;1cléot ides 5' ATCggllli TTCT l-~g;'~Cg'-:(:cl-,-:;:-=- \C9':'9'gT rTAgC 3' contenant les sites de restriction EcoRI et XbaI et 5'
TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' p D s s le site de restriction BamHI, en présence de 53 rDC 1 é::?:'" .de chacun des dNTPs, de tampon Vent ADN polymérase :1X) , le 1 de Vent ADN polymérase (New England Blolabs;. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée ari,-5 le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturât ion à 94 C pendant 5 min., l'ADN a été soumis à 3C cycles constitués
chacun des étapes de dénaturation a 94 C pendant 1 min., d'hybridation à 50 C pendant 1 miu. et ;':,n,ai; -~ à 7 'C pendant min. 30 sec. Lors du dernier cycle, l'Ôlc,;;q3ti,,:,r; :ci été poursuivie à 72 C pendant 5 min.
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Le fragment d'ADN issu de l' arnçJ-"-if,--:dt.vn C" oté isolé sur un gel d'agarose à 1.5% à l'aiae du Kit C(l1Ce2:'L Rapid Gel Extraction System et hydrolysé par EcoRI pendant 1 h à 37 C. Le fragment d'ADN a ensuite été soumis à l'action de 20
U dù fragment Klenow (New England Biolabs) pendant 30 mis à 37 C en présence de 6C nmoles de chacun ces iNTPs, de 12 ul de tampon Tris-HCL 500 mM pH 7.5 - MgCi2 500 rr~" et 6 pi ae DIT à i M et digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C. La ligation a été réalisée avec 100 ng du fragment promoteur
MPrll*3 ainsi traité et 50 ng de plasmide pGem3Z-l (décrit dans la section 2.1 de l'exemple 2) pendant 1 nuit à 16 C dans
un mélange réactionnel de 10 pi, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 4C0 unités de T4 ADN 1 Lgase (New England Bioiabs). Des bactéries Escherichia coii DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu L8 supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été analysé par PCR à l'aide de 25 pmoles de chacun des 2 oligodésoxynucléotides ATCggAATTCgCAgCCATggTCCTgAACC 3' et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' , en présence de 15 nmoles
de chacun des dNTPs, du tampon Taq ADN polymérase (IX), de 75 nmoles de MgCl2 et de l, 25 U de Taq ADN polymérase (Promega
Corp.) dans un volume réactionnel de 53 pi. La réaction d'amplification a été réalisée dans le thernocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturatior à 94 C pendant 3 min., l'ADN a été soumis à 25 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 30 se\, d'hybridation à
55 C pendant: 1 min. et d'élongation à 7? C, pendant 1 min. Lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72 C pendant 5 min.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRTll33 et la séquence promotrice MPr1183 a été vérifiée par séquençage.
2.6. Construction du promoteur MPrll97 (SEQ.ID16) .
Le promoteur MPrll97 (SEQ.ID16) dérive d≤ TfPrliS 3 (décria à la section 2 . 5 de l'exemple 2) par une délécion de la séquence
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promotrice située en amont: du nuciéotide 5 pb et constitue le promoteur HMWG-Cx5 (SEQ.ID01) minimal étudié ,.Jans ce brevet.
Pour ce faire, 5 pela de plasmide piRI l7 ont été digérée successivement pendant 1 h à 37 C par Bal et Ncol. Le vecteur pMRTll83 ainsi délété du fragment Xbal/tJ.I du promoteur MPrlL83 a été isolé sur un gel d'agarose A 3,8% à l'''}C10 du Kit Concert Rapid Gel Extraction System et soumis à l'action de 20 U du fragment Klenow (New England B:o..:.3bs) pendant 30 min à 37 C en présence de 60 n[1l~)!..'3 de chacun des dNTPs, de 12 ul de tampon Tris-HCL 500 mM pH 7.5 - MgCi2 sec mM et 6 ul de DTT à 1 M.
La réaction de ligation a été réalisée avec 50 ng de plasmide
ainsi modifié dans un mélange réac-- de 10 psi, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de T4 ADN ligase (New England Biolabs) dans le thermocycleur GeneArnp PCR System 9700 , comme décrit précédemment. Des bactéries Escherichia coli DHSa, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique ces clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1) a été extrait selon la métnode de lyse alcaline et vérifié par digestions enzymatiques.
ainsi modifié dans un mélange réac-- de 10 psi, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de T4 ADN ligase (New England Biolabs) dans le thermocycleur GeneArnp PCR System 9700 , comme décrit précédemment. Des bactéries Escherichia coli DHSa, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique ces clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1) a été extrait selon la métnode de lyse alcaline et vérifié par digestions enzymatiques.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRT119"' et la séquencepromotrice MPrll97 (SEQ.ID16) est schématisée dans la Fig.
2. 7. Construction du promoteur MPrll98 (SEQ. ID17) .
Le promoteur MPrll98 (SEQ.ID17) dérive du promoteur ".'F,1 1 ' (SEQ.ID04) (décrit dans la section 2.2 de L'exemple 2) par délétion de la séquence promotrice interne s'étendant de la position-59 à la position-135 pb, laquelle est dépourvue des
éléments cis-activateurs identifiés précédemment. Il a été construit par fusion, au niveau du site de
restriction Nicol de pMRT1183 (décrit dans a section 2.5 ce l'exemple 2), d' un fragment amplifié par PCR à partir do 5 ng d'ADN matrice pMRT1128 à l'aide de 100 pmoles de chacun des
éléments cis-activateurs identifiés précédemment. Il a été construit par fusion, au niveau du site de
restriction Nicol de pMRT1183 (décrit dans a section 2.5 ce l'exemple 2), d' un fragment amplifié par PCR à partir do 5 ng d'ADN matrice pMRT1128 à l'aide de 100 pmoles de chacun des
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,-) iyc',J>2::3v:-:.r:Lcléol iJl:3 5' AICygA4.j' rC''AgA':'.j'"..JAT'J AgTggCTTTAgl.,: 3' contenant les sites de restriction EccRI et XbaI et 5' CATgCCATggCCAACACAAAAgAAgCTgg 3' possédant le site de
restriction Ncol, en présence de 50 nmoj.es ae chacun des dNTPs, de tampon ADN polymérase Vent ( 1X) et de 2 U d' ADN polymérase Vent (New England 3ic;lab-, . La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur Gene}\Elp PCR System 9700 . Après une dénaturât ion à 94 C, pendant 10 min., l'ADN a été soumis à 25 cycles constitués chacun des étapes ae dénaturation à 94 C pendant 1 min.,
d'hybridation à 55 C pendant 1 min. et o'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. Lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72 C pendant 5 min . Le fragment d'ADN issu de
l'amplification a été isolé sur un gel d'agarose à 1.5% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System et hydrolyse successivement par Ncol et Xbal, pendant 1 h à 37 C.
En paraiLèlele, le fragment vecteur a été préparé à partir du plasmide pMRT1183 par délétion ce la région promotrice de MPrll83 située en 5' du site de restriction Ncol. Pour ce faire, 5 ug de plasmide pMRTHS3 ont été digérés successivement pendant 1 h à 37 C par Xbal et NcoI et le fragment vecteur de pMRT1183 a été isolé sur un gel d'agarose à 0.8% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction
System , avant d'être déphosphorylé par 40 U de phosphatase alcaline d' intestin de veau (New Englanû Biolabs) en présence ae tampon 3 (IX) à 37 C pendant 1 h.
System , avant d'être déphosphorylé par 40 U de phosphatase alcaline d' intestin de veau (New Englanû Biolabs) en présence ae tampon 3 (IX) à 37 C pendant 1 h.
La réaction de ligation a été réalisée avec 50 ng du fragment promotejr et 100 ng de plasmide ainsi traites dans un mélange réactLonnel de 10 pi, en présence du tampon T4 ADN ligase 1:; et de 400 unités de T4 ADN ligase (New Engiand Bi. labs),d.-r.s le thermocycleur GeneAmp PCR System 97C0 , comme décrit précédemment. Des bactéries Escheri ,--:J"] 1 :1 'L] 2 DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LE supplémenté en ampiciiline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse
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alcaline et analysé par olgestions enzymatiques.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRTl19; et la séquence promotrice MPr1198 (SEQ.ID17) schématisée dans la Fig. 1 a été vérifiée par séquençage.
2.8. Construction du promoteur MPr1216 (SEQ. ID21) .
Le promoteur MPr1216 (SEQ.ID21) dérive de M?R112b' ':;Q.=CC'4:\ (décrit dans la section 2. 2 de l'exemple 2) par duplication de la séquence s'étendant des nucléotides -22b à-136 pb, laquelle comporte la boite G et l'élément activateur.
Il a été construit par clonage dans le vecteur pGEK3Z-l (décrit dans la section 2. 1 de l'exempte 2), des deux fragments promoteurs suivants : - Le fragment 5' MPr1216 (SEQ. ID21) , synthétisé par PCR, a
été amplifié à partir de 5 ng d'ADN matrice pMRTH28 à l'aide de 100 pmoles de chacun des 2 oligodéscxynucléotides 5' ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC 3' contenant le site de restriction EcoRI et 5' gCTCTAgACCAACACAAAAgAAgCTgg 3' possédant le site de restriction Xbal, en présence de 50 nmoles de chacun des dNTPs, de tampon Vent ADN polymérase (1X) et de 2 U de Vent
AUN polymérase (New England BiolaDS). La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturation à 94C pendant 10 min., l'ADN a été soumis à 25 cycles constitués
chacun des étapes de dénaturat ion à 94C pendant min., d'hybridation à 55 C pendant 1 min. et d'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. Lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72 C pendant 5 min. Le fragment d'ADN issu de
l'amplification PCR a été isolé sur un gel " gC1è::"'Y'3C à 1.5% a l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System et hydrolyse par EcoRI pendant 1 h à 37 C. le fragment d'ADN a ensuite été soumis à l' action de 20 U du fragment Klenow (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C en présence de 60 nmoles
de chacun des dNTPs, de 12 pi de tampon Tris-HCL 5CC mM pH 7 . 5 MgC12 500 llM et 6 pi de DTT à 1 M et digéré par Xbal pendant 1 h à 5 1 c .
été amplifié à partir de 5 ng d'ADN matrice pMRTH28 à l'aide de 100 pmoles de chacun des 2 oligodéscxynucléotides 5' ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC 3' contenant le site de restriction EcoRI et 5' gCTCTAgACCAACACAAAAgAAgCTgg 3' possédant le site de restriction Xbal, en présence de 50 nmoles de chacun des dNTPs, de tampon Vent ADN polymérase (1X) et de 2 U de Vent
AUN polymérase (New England BiolaDS). La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturation à 94C pendant 10 min., l'ADN a été soumis à 25 cycles constitués
chacun des étapes de dénaturat ion à 94C pendant min., d'hybridation à 55 C pendant 1 min. et d'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. Lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72 C pendant 5 min. Le fragment d'ADN issu de
l'amplification PCR a été isolé sur un gel " gC1è::"'Y'3C à 1.5% a l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System et hydrolyse par EcoRI pendant 1 h à 37 C. le fragment d'ADN a ensuite été soumis à l' action de 20 U du fragment Klenow (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C en présence de 60 nmoles
de chacun des dNTPs, de 12 pi de tampon Tris-HCL 5CC mM pH 7 . 5 MgC12 500 llM et 6 pi de DTT à 1 M et digéré par Xbal pendant 1 h à 5 1 c .
- Le fragment 3' MPrl216 (SEQ.ID21) , obt0I1. par l'hydrolyse
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je 1) ug du plasmide pIRT1183 avec les .:fI:':'1.L'2 de restriction Xbal et BarnHI, a été isolé sur ur. gel d' agar G à 1.:)% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System .
La réaction de ligation a été réalisée avec 50 ng da fragment 5' MPrl216 (SEQ.ID21) , 50ng du fragment
MPrl216 (SEQ.ID21) ainsi traités et 5 1'1 ng de plasmide pCem3Z-l dans un mélange réactionnel de 1.0 n1, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de T4 ADN ligase zen England Biolabs), dans le thermocycLeur GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment. Des bactéries 5'::::herichÍa coli DH5a, rendues préalablement compétences, ont été transformées par la totalité du mélange réactionneL de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été analysé par PCR à
l'aide de 10 pmoles de chacun des 2 0:' ig()désa:yn lcléor:. ides 5' ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC 3' et TACggATCCCCggggATCTCTAg'TTTgTggTgC 3' dans le t :ler[D.ocyl 811r GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment.
MPrl216 (SEQ.ID21) ainsi traités et 5 1'1 ng de plasmide pCem3Z-l dans un mélange réactionnel de 1.0 n1, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de T4 ADN ligase zen England Biolabs), dans le thermocycLeur GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment. Des bactéries 5'::::herichÍa coli DH5a, rendues préalablement compétences, ont été transformées par la totalité du mélange réactionneL de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été analysé par PCR à
l'aide de 10 pmoles de chacun des 2 0:' ig()désa:yn lcléor:. ides 5' ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC 3' et TACggATCCCCggggATCTCTAg'TTTgTggTgC 3' dans le t :ler[D.ocyl 811r GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment.
Le plasmide obtenu, a été appelé p"RTl%-6 et la séquence promotrice MPrl216 (SEQ.:D21) schématisée dans la Fig. I a été vérifiée par séquençage.
2.9. Construction du promoteur MPr1217 (SEQ. ID22) .
Le promoteur MPr1217 (SEQ.ID22) dérive de MPR112R
;SEQ. i,04 ) (décrit dans la section 2 . 2 j.e l'exemple 2) par tripl icaticr. en répétit ion directe de la séquence s'étendant des nucléotides -225 à -136 pb, laquelle comporte Ici DolLe G et l'élément activateur.
;SEQ. i,04 ) (décrit dans la section 2 . 2 j.e l'exemple 2) par tripl icaticr. en répétit ion directe de la séquence s'étendant des nucléotides -225 à -136 pb, laquelle comporte Ici DolLe G et l'élément activateur.
Le promoteur MPrl217 (SEQ. I22 a été construit par l'insertion , au niveau du site de restriction Xbal de pMRTll'?3 (décrit dans la section 2 . 5 de l'exemple 2), de ceux fragments promoteurs identiques synthétisés par PCR à partir de 5 ng d'ADN matrice à l'aide de 100 pmoles de chacun des 2
oligodésoxynucléotides 5' ATCggAATTCTAçACgCCgAr [7vCgTggCTTTAgC 3' contenant les sites de restriction EcoRI et Xoal et 5' gCTCTAgACCAACACAAAAgAAgCTgg 3' possédant le site ce restriction Xbal, en présence de 50 nmoles de cnacun des dUT :'3, de tampon
oligodésoxynucléotides 5' ATCggAATTCTAçACgCCgAr [7vCgTggCTTTAgC 3' contenant les sites de restriction EcoRI et Xoal et 5' gCTCTAgACCAACACAAAAgAAgCTgg 3' possédant le site ce restriction Xbal, en présence de 50 nmoles de cnacun des dUT :'3, de tampon
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Vent ADN rase (IX) et de 2 U de Veut Ai -II polymérase vzw Englana Biolabs). La réaction d'ampli f i~ati::.-~ par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp Par System 9700 .
Après une dénaturation à 94 C pendant 10 n:n., l'ADN a été soumis à 25 cycles constitués chacun des étapes de dénaturât ion à 94 C pendant 1 min., d'hybridation à 55 C pendant 1 min. et d'élongation à 72 C pendant 1 min. 3C sec. Lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72 C pendant 5 min. Le fragment d'ADN issu de l'amplification PCR a été isolé sur un
ge L d'agarose à 1.5% à l'aide du Kit Concert Rapio Gel Extraction System et hydrolyse par Xbal pendant 1 h à 37 C.
ge L d'agarose à 1.5% à l'aide du Kit Concert Rapio Gel Extraction System et hydrolyse par Xbal pendant 1 h à 37 C.
En parallèle, le fragment vecteur a été préparé à partir 10 pg de plasmide pMRT1183 par digestion enzymatique du site de restriction XbaI, situé en 5' de MPrll83, pendant 1 h à 37 C. Le fragment vecteur ainsi linéarisé a été déphosphorylé par 40 U de phosphatase alcaline d' intestin de veau (New England Biclabs) en présence de tampon 3 (IX) à 37 C pendant 1 h.
La réaction de ligation a été réalisée avec 50 ng de fragment promoteur et 100 ng de fragment vecteur ainsi préparé dans un mélange réactionnel de 10 l, en présence du tampon ADN
ligase i'4 IX (new England Biolabs) et de bzz unités d'ADN ligase T4 (New England Biclabs) dans le thermocycleur GeneAm? PCR, System 9700 , comme décrit précédemment. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été analysé par PCR à l'aide de 10 pmoles de chacun des
oligodésozynucléotides 5' ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC 3' et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' dans le ther-noï,.le :r GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment.
ligase i'4 IX (new England Biolabs) et de bzz unités d'ADN ligase T4 (New England Biclabs) dans le thermocycleur GeneAm? PCR, System 9700 , comme décrit précédemment. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été analysé par PCR à l'aide de 10 pmoles de chacun des
oligodésozynucléotides 5' ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC 3' et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' dans le ther-noï,.le :r GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment.
Le plasmide obtenu a été appelé p>IRT12~7 er la séquence promotrice MPrl217 (SEQ.ID22) schématisée dans la Fig. 1, vérifiée par séquençage présente la délétion d'un C à la position -317, 4 pb en amont d' une boîte G 'ike.
Exemple 3.
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Construction de plasmides contenant des séquences promotrices chimériques.
3.1. Construction du promoteur MPr1130 (SEQ.ID05) .
Le promoteur MPr]130 (SQ.ID05) résulte .je l'insertion à la position -65 pb de PrHMWG-Dx5 (SEQ. -;-D01) d'une séquence de 55 pb correspondant à une duplication du morif as-2 i Larn et Ctua, 1989) et au motif as-1 (Lam et al., 19-,'! du CaMV 35S. Il a été construit en fusionnant par extension par chevauchement
( splicing overlap extension ) le fragment 5' MFrH30 (SEQ.'DC5) et le fragment 3' MPril30 (SEQ.1D05) synthétisés par PCR.
( splicing overlap extension ) le fragment 5' MFrH30 (SEQ.'DC5) et le fragment 3' MPril30 (SEQ.1D05) synthétisés par PCR.
Le fragment 5' MPr113C (3EQ. 1D ; ) a été amplifié par PCR à partir de 5 ng d'ADN matrice pUC19-HMMG (décrit dans la section 2.1 de l'exemple 2) à l'aide de CI pmoies de chacun des 2 oligodésoxynucléot ides 5' TACgf\ATTCCCAg'.TTTgAgTggCCgT Ag 3' contenant le site de restriction HVoRI et 5' TgCgTCATCCCTTACgTCAgTggAgATATCACATCAATCTTgATATCACATCAATCACggTgAg gTTTgTTTAgCCTAAg 3' possédant la séquence de 5bpb correspondant
à une duplication du motif as-2 (Lam et Chua, i989) et au motif as-i (Lam et al., 1989) du CaMV 355, en présence de 10 nmoies de chacun des dNTPs, de tampon Vent ADN pclyméra:e ; (IX) et de 2 C de Vent ADN polymérase (New England I3iolabs' dans un volume réactionnel de 50 pi. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmo PCR System 9700 .
Après une dénaturation à 94 C pendant 5 min., ;'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturât ion à 94 C' pendant min . , d'hybridation à 55 C pencant 1 min. e d'élongation à 72 C pendant 1 min. 3C sec. Lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72 C pendant 5 min. Quarante ul du milieu réactionnel PCR ont ensu ite été soumis à l' action de 12. 5 U du fragment Klenow (New England Biolaos'. en
présence de 20 nmoles de chacun des dNTPs pendant 10 min. à 37 C. Le produit PCR ainsi traité a ensuite été isolé sur un gel d'agarose à 1.5%à l'aide du Kit QIAquick Gel Extraction .
à une duplication du motif as-2 (Lam et Chua, i989) et au motif as-i (Lam et al., 1989) du CaMV 355, en présence de 10 nmoies de chacun des dNTPs, de tampon Vent ADN pclyméra:e ; (IX) et de 2 C de Vent ADN polymérase (New England I3iolabs' dans un volume réactionnel de 50 pi. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmo PCR System 9700 .
Après une dénaturation à 94 C pendant 5 min., ;'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturât ion à 94 C' pendant min . , d'hybridation à 55 C pencant 1 min. e d'élongation à 72 C pendant 1 min. 3C sec. Lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72 C pendant 5 min. Quarante ul du milieu réactionnel PCR ont ensu ite été soumis à l' action de 12. 5 U du fragment Klenow (New England Biolaos'. en
présence de 20 nmoles de chacun des dNTPs pendant 10 min. à 37 C. Le produit PCR ainsi traité a ensuite été isolé sur un gel d'agarose à 1.5%à l'aide du Kit QIAquick Gel Extraction .
Le fragment 3' MPrll30 (SEQ.ID05 a été synthétisé et traité de la même manière que le fragment 5' MPrll3ù
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(;C:,.1'!:j excepté, que les 2 llgJE's~vj/nW ~P~:tl.es utilisés sont 5' A1'':j ,T g1'g AT ATCAAgATTgAT gT gAT ATCTCCACTgACgl'Al\gg ,;;AT gACcjCACACg CF,gCC ATggTCCTgAACCTTC 3' possédant la séquence de 5b pb correspondant
à une duplication du motif as-2 (Lam et Chua, 1989) et au 0,,,tif as-1 (Lam et 31" 1989) du CaMV bzz, et TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' conter. ,:.t le site ce rest ri ct ion BamHI.
Le fragment 5' MPr1130 (SEQ.ID05) et le fragment 3' MPrll30 (SEQ.ID05) ont ensuite été assemblés par extension
par chevauchement pour générer le fragment MPrii30 (SEQ.IDC5! . Pour ce faire, une amplification PCR a été effectuée à partir de 7.5 l de chacun des deux produits FCR ainsi traités à
l'aide de 20 pmoles de chacun des 0: 190dé::3c:X:jlflu::::léotides 5' TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3' contenant le site de restriction EcoRI et TACggATCCCCggggATClCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site de restriction BamHI en présence de 10 nmoles de chacun des dNTPs, de tampon Vent ADN polymérase (IX) et de U de Vent ADN polymérase (New England Biolabs) dans un volume réactionnel de 50 l. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 .
par chevauchement pour générer le fragment MPrii30 (SEQ.IDC5! . Pour ce faire, une amplification PCR a été effectuée à partir de 7.5 l de chacun des deux produits FCR ainsi traités à
l'aide de 20 pmoles de chacun des 0: 190dé::3c:X:jlflu::::léotides 5' TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3' contenant le site de restriction EcoRI et TACggATCCCCggggATClCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site de restriction BamHI en présence de 10 nmoles de chacun des dNTPs, de tampon Vent ADN polymérase (IX) et de U de Vent ADN polymérase (New England Biolabs) dans un volume réactionnel de 50 l. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 .
Après une dénaturation à 94 C pendant 5 min., 'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturât ion à 94 C pendant 1 min., d'hybridation à 55 C pendant 1 min. et d'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. Lors du dernier cycle, l'élongation a é é poursuivie à 72 C pendant 5 min. Le fragment MPrll30 (SEQ.ID05) ainsi synthétisé a été isolé sur un gel d'agarose à 1 . 5 à l'aide au Kit QIAquick 3e Extraction . Ce fragment a ensuite été hydrolyse par EcoR@
pendant 1 h à 37 C et soumis à l'action de 20 'J du fragment Klenow (New England Biolabs) pendant 30 min d 37 Cc en présence de 60 nmoles de chacun des dNTPs, de 12 pi ie tampon Tris-HCL 500 rrM pli 7,5 - MgC12 500 mM et 6 de ul de DT : à i M. Enfin, le fragment MPrll30 (SEQ.ID05) a été digéré par BmHI pendant n à 37 C.
La ligation a été réalisée avec 100 . du fragment
pendant 1 h à 37 C et soumis à l'action de 20 'J du fragment Klenow (New England Biolabs) pendant 30 min d 37 Cc en présence de 60 nmoles de chacun des dNTPs, de 12 pi ie tampon Tris-HCL 500 rrM pli 7,5 - MgC12 500 mM et 6 de ul de DT : à i M. Enfin, le fragment MPrll30 (SEQ.ID05) a été digéré par BmHI pendant n à 37 C.
La ligation a été réalisée avec 100 . du fragment
<Desc/Clms Page number 33>
MPrll3U (: EjQ.l.G5) ainsi traité et 50 ng do picismide pGeir.3Z-l (décrit dans la section 2.1 de l'exemple 2) pendant 1 nuit à
16 C dans un mélange réactionnel de 10 ul, en présence de 1 pi du tampon T4 ADN ligase (lX) et de 400 unités je z4 Adr ligase (New England Biolabs) . Des bactéries Eschrihi3 coït i DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été rranstormées par la totalité du mélange réactionnel de Ligation. L'ADN p~c1sr;i:iique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en
ampicilline (50 mg/1), a été analysé par P"R à l'aide de 25 pmoles de chacun des 2 0 1 -'L g 0 s c u,- -'L é 0,--- es 5' TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3' et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRT1130 et la séquence promotrice MPrll30 (SEQ.ID05) schématisée cans la Fig. titi a été vérifiée par séquençage.
3.2. Construction du promoteur MPrll31 (SEQ. ID06) .
Le promoteur MPrll31 (SEQ. IDJ6) résulte de l'insertion à la position -65 pb de PrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01) (décrit dans la section 2.1 de l'exemple 2) , d' une séquence de 38 pb
correspondant au motif as-2 (Lam et Chua, 19989) et au motif as-1 (Lam et al., 1989) du CaMV 35S. Il a été construit en fusionnant par extension par chevauchement ( splicing overlap extension ) , le fragment 5' MPrll31 (SEQ.LD06) et le fragment 3' MPrll31 (SEQ.ID06) synthétisés par PCR.
correspondant au motif as-2 (Lam et Chua, 19989) et au motif as-1 (Lam et al., 1989) du CaMV 35S. Il a été construit en fusionnant par extension par chevauchement ( splicing overlap extension ) , le fragment 5' MPrll31 (SEQ.LD06) et le fragment 3' MPrll31 (SEQ.ID06) synthétisés par PCR.
Le fragment 5' MPrll31 (SEQ.ID06) a été synthétisé
et traité de la même manière que le fragment 5' IIPrl 1 .
et traité de la même manière que le fragment 5' IIPrl 1 .
(S2Q.IDCS) (décrit dans la section 3.1 de l'exemple 3), excepté que les 2 oligodésoxynucléotides utilisés sont 5' TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3' contenant le site de restriction EcoRI et 5'
TaCgTCATCC::ITACgTCAgTggAgATATCACATCP 1 T CACg , = gA.; T r gT ' ,Ag CCT'a 3' possédant la séquence de 38 pb correspondant au motif as-2 (las et Chua, 1989) et au motif as-1 (Lare et .;> I . , 19?9) du CaMV 35S.
TaCgTCATCC::ITACgTCAgTggAgATATCACATCP 1 T CACg , = gA.; T r gT ' ,Ag CCT'a 3' possédant la séquence de 38 pb correspondant au motif as-2 (las et Chua, 1989) et au motif as-1 (Lare et .;> I . , 19?9) du CaMV 35S.
Le fragment 3' MPrll31 (SEQ,1D6) a été synthétisé
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CL traité oe la même manière que le fragment J' MPrll3G (:'EQ. IL;05 (décrit dans la section 3.1 de L'exemple 3), excepté que les 2 oligodésoxynucléotides utilisés sont 5' AT'TgATgTgATATCCCACTgACgTAAgggATgA,CACACü ~',AaCt'~7TggTC'.ig~1h^"TT; 3' possédant la séquence de 38 pb correspondant- au no t. - as-2 (Lam et Chua, 1989) et au motif as-1 (Lam et c3., 1 '].:: Cj) du CaMV 3:'::S, et 5' TACggATCCCCggggATCTCri\9'=H-;:"I'gr::'(:;:(:'gr 3' contenant le site de restriction BamHI.
Le fragment 5' MPrll31 (SEQ.ID06) et le fragment
3' M?rli31 (SEQ.ID06) ont ensuite été assemblés par extension par chevauchement pour générer le fragment MPrll31 (SEQ.ID06)
. Pour ce faire, une amplification PCR a été effectuée à partir de 7.5 pi de chacun des deux produits PCR ainsi traités à l'aide de 20 pmoles de chacun des oligodésoxynucléctides 5' TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3' contenant le site de restriction Ec oRI et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site de restriction BamHI en présence de 10 nmoles
de chacun des dNTPs, de tampon Vent ADN polynÓrase (IX) et de 2 U de Vent ADN polymérase (New England Biclabs) dans un volume
réactionnel de 50 pi. La réaction d'amplification par FCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp FCR System 97CC .
3' M?rli31 (SEQ.ID06) ont ensuite été assemblés par extension par chevauchement pour générer le fragment MPrll31 (SEQ.ID06)
. Pour ce faire, une amplification PCR a été effectuée à partir de 7.5 pi de chacun des deux produits PCR ainsi traités à l'aide de 20 pmoles de chacun des oligodésoxynucléctides 5' TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3' contenant le site de restriction Ec oRI et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site de restriction BamHI en présence de 10 nmoles
de chacun des dNTPs, de tampon Vent ADN polynÓrase (IX) et de 2 U de Vent ADN polymérase (New England Biclabs) dans un volume
réactionnel de 50 pi. La réaction d'amplification par FCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp FCR System 97CC .
Après une dénaturation à 94 C pendant 5 min., 1..' ADX a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94C pendant mien., d'hybridation à 55 C,' pendant 1 min. et d'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. Lors du dernier
cycle, ]'élongation a été poursuivie à 72 C pendant 5 min. Le fragment MPrll31 (SEQ. ID06) ainsi synthétisé a été isolé
sur un gel d'agarose à 1.5% à l'aide du Kit QlAquick Gel Extraction . Ce fragment a ensuite été hydrolyse par EcoRI pendant 1 h à 37 C et soumis à l'action de .:'CI U du fragment
i\lenmv (New England Biolabs) pendant 30 rai ri o 3": "e en présence de 60 nmoles de chacun des dNTPs, de 12 pi de tampon Tris-HCL 500 mM pH z.5 - MgC12 500 mM et 6 de pi de DÎT à M. Enfin, le fragment MPrll31 (SEQ.ID06) a été digéré par BamHI pendant 1 n à 37 C.
La iigation a été réalisée avec 100 ng du fragment
cycle, ]'élongation a été poursuivie à 72 C pendant 5 min. Le fragment MPrll31 (SEQ. ID06) ainsi synthétisé a été isolé
sur un gel d'agarose à 1.5% à l'aide du Kit QlAquick Gel Extraction . Ce fragment a ensuite été hydrolyse par EcoRI pendant 1 h à 37 C et soumis à l'action de .:'CI U du fragment
i\lenmv (New England Biolabs) pendant 30 rai ri o 3": "e en présence de 60 nmoles de chacun des dNTPs, de 12 pi de tampon Tris-HCL 500 mM pH z.5 - MgC12 500 mM et 6 de pi de DÎT à M. Enfin, le fragment MPrll31 (SEQ.ID06) a été digéré par BamHI pendant 1 n à 37 C.
La iigation a été réalisée avec 100 ng du fragment
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MPri 130 (SL.IC05) ainsi traité eT~ 50 ng Ctc: plasinide pGem3Z-l (décrit- dans la section 2.1 de lexemple 2) pendant 1 nuit à 16 C dans un mélange réactionnel de 10 pi, en présence de 1 pi du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de T4 ADN ligase (New England Biolabs). Des bactéries E'sceri..hia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline
(5C mg/1 ) , a été analysé par PCR à l'aide de 25 pmoles de chacun des 2 oligcyjésoxynucléot ides 5' TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3' et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRT1131 et la séquence promotrice MPr1131 (SEQ.ID06) schématisée dans la Fig. II a été vérifiée par séquençage.
3.3. Construction du promoteur MPrll35 (SEQ. ID09) .
Le promoteur MPrll35 (SEQ. 1DC9) dérive du promoteur MPr1130 (SEQ.ID05) (décrit dans la section 3.1 de l'exemple 3) par délétion de la séquence située en amont du nucléotide --293, laquelle comporte les deux boites prclamines like et les deux boites GATA.
Le fragment promoteur a été amplifié par PCR à partir de
5 ng d'ADN matrice pMRT1130 à l'aide de 100 pnoles de chacun des 2 CH igodé30;:,lDucléot ides 5' ATCGGAATTCCAGAACLAGGATTACGCCG 3' contenant le site de restriction EcoRI et 5' TACggATC'CCCggggATC'TCTAgTTTgTggTgC 3' posséc3nt le site de restriction BamHI, en présence de 50 nmoles ce chacun des dNTPs, du tampon Vent ADN polymérase (IX) et de 2 de Vent ADN pclymérase (New England Biolabs). La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAnp PCR
System 9700 . Après une dénaturation à 94 C pendant 5 min., l'ADN a été soumis à 25 cycles constitués chacun des étapes de dénaturat ion à 94 C pendant 1 min . , d'hybridation à 55 C pendant
1 min. et d'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. Lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 7v c pondant 1 min.
5 ng d'ADN matrice pMRT1130 à l'aide de 100 pnoles de chacun des 2 CH igodé30;:,lDucléot ides 5' ATCGGAATTCCAGAACLAGGATTACGCCG 3' contenant le site de restriction EcoRI et 5' TACggATC'CCCggggATC'TCTAgTTTgTggTgC 3' posséc3nt le site de restriction BamHI, en présence de 50 nmoles ce chacun des dNTPs, du tampon Vent ADN polymérase (IX) et de 2 de Vent ADN pclymérase (New England Biolabs). La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAnp PCR
System 9700 . Après une dénaturation à 94 C pendant 5 min., l'ADN a été soumis à 25 cycles constitués chacun des étapes de dénaturat ion à 94 C pendant 1 min . , d'hybridation à 55 C pendant
1 min. et d'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. Lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 7v c pondant 1 min.
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Le fragment d'ADN issu de l' aTT;p~1f .3f-1JI a été isoé sur un gel d'agarose à 2% à l'aide du Kit QIAquick Gel Extraction et hydrolyse par EcoRI pendant 1 h à 37 C. Le fragment a ensuite été soumis à inaction de 20 T au fragment
Klenow (New England Biolabs) pendant 30 rr.in ,\ 37 c en présence de 60 Df:1C]c.?S de chacun des dNTPs, de 12 ni :, tampon Tris-HCL 500 rc1'1 pi .5 - MgC12 500 mM et 6 ul de DTT à 1 M et digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C.
Klenow (New England Biolabs) pendant 30 rr.in ,\ 37 c en présence de 60 Df:1C]c.?S de chacun des dNTPs, de 12 ni :, tampon Tris-HCL 500 rc1'1 pi .5 - MgC12 500 mM et 6 ul de DTT à 1 M et digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C.
La ligation a été réalisée avec 100 ng du fragment
promoteur MPrll35 (SEQ.ID09) ainsi traité et 50 ng de plasmide pGem3Z-l (décrit dans la section 2.1 de l'exemple 2i pendant 1 nuit à 16 C dans un mélange réactionnel de 10 l, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de T4 ADN ligase (New
England Biolabs). Des bactéries Escherichia cjli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (Sa mg/1), a été analysé par PCR à laide de 25 pmcles de chacun
des 2 oligodésoxynucléotides 5' ATCGGAATTCGTG77GGCAAAC7GC 3' et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRTli 35 et la séquence promotrice MPrll35 (SEQ. ID09) schématisée Tins la Fig. III a été vérifiée par séquençage.
promoteur MPrll35 (SEQ.ID09) ainsi traité et 50 ng de plasmide pGem3Z-l (décrit dans la section 2.1 de l'exemple 2i pendant 1 nuit à 16 C dans un mélange réactionnel de 10 l, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de T4 ADN ligase (New
England Biolabs). Des bactéries Escherichia cjli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (Sa mg/1), a été analysé par PCR à laide de 25 pmcles de chacun
des 2 oligodésoxynucléotides 5' ATCGGAATTCGTG77GGCAAAC7GC 3' et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRTli 35 et la séquence promotrice MPrll35 (SEQ. ID09) schématisée Tins la Fig. III a été vérifiée par séquençage.
3.4. Construction du promoteur MPrll38 (SEQ.ID12) .
Le promoteur MPrll38 (SEQ,ID12; dérive ic promoteur MPrll31 (SEQ.TD06) (décrit dans la section 3.2 de l'exemple 3) par délétion de la séquence située en amont 1 . ~-.a.-~éti  - 2 if, laquelle comporte les deux boîtes prolairines like et les deux boites GATA.
Le promoteur MPrll38 (SEQ,ID12; dérive ic promoteur MPrll31 (SEQ.TD06) (décrit dans la section 3.2 de l'exemple 3) par délétion de la séquence située en amont 1 . ~-.a.-~éti  - 2 if, laquelle comporte les deux boîtes prolairines like et les deux boites GATA.
Le fragment promoteur a été amplifié par PCR à partir de
5 ng d'ADN matrice pMRT1131, traité et obtenu de la même manière que le promoteur MPrll35 (SEQ.ID09) (décrit dans la section 3.3 de 1' exemple 3).
5 ng d'ADN matrice pMRT1131, traité et obtenu de la même manière que le promoteur MPrll35 (SEQ.ID09) (décrit dans la section 3.3 de 1' exemple 3).
Le plasmide obtenu a été appelé pl.1RC;:1;3;'; et la séquence promotrice MPrll38 (SEQ.ID12) schématisée dans la Fig. Il a
<Desc/Clms Page number 37>
été vérifiée par séquençage.
3.5. Construction du promoteur MPrll37 (SEQ.ID11) .
Le promoteur 'Prll37 (SQ.1D11) dérive du promoteur i\Prll31 (SEQ.ID06) (décrit dans la section ?.2 de l'exemple r) par délétion de la séquence située en amont Ii rtucléotido -243, laquelle comporte les deux boîtes prolamines 1 i.. ke , les deux belles GATA et la boîte G like.
Le fragment promoteur a été amplifié par FCR à partir de
5 ng d'ADN matrice pMRT1131 à l'aide de 100 pmoles de chacun des oligodésoxynucléotides 5' ATCGGGAATTCGCAGACTGTCCAAAAATC contenant le site de restriction EcoRI et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site ce restriction BamHI, traité et obtenu de la même manière que le
promoteur MFrll35 (SEQ.ID09) (décrit dans a section z.3 de l'exemple 3 ) .
5 ng d'ADN matrice pMRT1131 à l'aide de 100 pmoles de chacun des oligodésoxynucléotides 5' ATCGGGAATTCGCAGACTGTCCAAAAATC contenant le site de restriction EcoRI et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site ce restriction BamHI, traité et obtenu de la même manière que le
promoteur MFrll35 (SEQ.ID09) (décrit dans a section z.3 de l'exemple 3 ) .
Le plasmide obtenu a été appelé p';;\T l7 et la séquence promotrice MPrll37 (SEQ.TD11) schématisée dans la Fig. II a été vérifiée par séquençage.
3.6. Construction du promoteur MPrll34 (SEQ. ID08) .
Le promoteur Mari134 (SEQ.ID08) dérive du promoteur MPrll30 (SEQ. ID05) (décrit dans la section 3.1 de l'exemple 3) par délétion de la séquence située en amont du nucléotide -260, laquelle comporte les deux boîtes prolamines like , les deux boites GATA et la boîte G like.
Le fragment promoteur a été amplifié par PCR à partir de
ng d'ADN matrice pMRT1130 à l'aide de 100 p:r,=Ies de chacun des 2 7nucléotides 5' ATCGGGAATTCGCAGCTGTCCAAAAATC 3' contenant le site de restriction EcoRI et 5'
TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédas' le site de restriction BamHI, traité et obtenu de la même manière due le promoteur MPrll35 (SEQ.ID09) (décrit dans la section 3.3 de 1' exemple 3 ) .
ng d'ADN matrice pMRT1130 à l'aide de 100 p:r,=Ies de chacun des 2 7nucléotides 5' ATCGGGAATTCGCAGCTGTCCAAAAATC 3' contenant le site de restriction EcoRI et 5'
TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédas' le site de restriction BamHI, traité et obtenu de la même manière due le promoteur MPrll35 (SEQ.ID09) (décrit dans la section 3.3 de 1' exemple 3 ) .
Le plasmide obtenu a été appelé p,~RT~ f4 et la séquence promotrice MPrll34 (SEQ.ID08) schématisée (lens la L g . I I1 a été vérifiée par séquençage.
3.7. Construction du promoteur MPrll36 (SEQ.ID10) .
<Desc/Clms Page number 38>
Le promoteur lFrllt, (5EQ.1D1C) dérive du promoteur MP.rll31 (SEQ.ID06) (décrit dans la section 3. de J'exempte 3) par délétion de la séquence située en amont 0...1 nucléocide -If 0, laquelle comporte les deux boîtes prclamines liek , les deux boites GATA, la boîte G like et l'élément activateur.
Le fragment promoteur a été amplifié par PCR à partir de 5 ng d'ADN matrice pMRT1131 à l'aide de 100 p:r aes de chacun des 2 oligodésoxynucléctides 5' ATCGGAATTCG7GTTGGCAAACTGC 3' contenant le site de restriction EcoRI et TACY(jATCCCCggggATCTCTAg1TTgTggTgC 3' possédant Le site de restriction BamHI, traité et obtenu de la même manière que le promoteur MPrll35 (SEQ.1D09) (décrit dans la section 3. 3 de 1' exemple 3).
Le plasmide obtenu a été appelé pMRTJ136 et la séquence promotrice MPrll36 (SEQ.ID10) schématisée dans la Fie. II a été vérifiée par séquençage.
3.8. Construction du promoteur MPrll33 (SEQ. ID07) .
Le promoteur MPrll33 (SEQ,IDC7) dérive du promoteur MPrll30 (SEQ.ID05) (décrit dans la section 3.2 de l'exemple 30
par délétion de la séquence située en amont dj nucléotide -1 9l, laquelle comporte les deux boîtes prolamines like , les deux boîtes GATA, la boîte G like et l'élément activateur.
par délétion de la séquence située en amont dj nucléotide -1 9l, laquelle comporte les deux boîtes prolamines like , les deux boîtes GATA, la boîte G like et l'élément activateur.
Le fragment promoteur a été amplifié par PCR à partir de
5 ng d'ADN matrice pMRT1130 à l'aide de 100 prr ï 1 es de chacun des 2 oligodésoxynucléotides 5' ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC 3' contenant le site de restriction EcoRI et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site de restriction BamHI, traité et obtenu de la même manière que le
promoteur MPrll35 (SEQ,ID09) (décrit dans 1. section 3.3 de 1' exemple 3).
5 ng d'ADN matrice pMRT1130 à l'aide de 100 prr ï 1 es de chacun des 2 oligodésoxynucléotides 5' ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC 3' contenant le site de restriction EcoRI et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site de restriction BamHI, traité et obtenu de la même manière que le
promoteur MPrll35 (SEQ,ID09) (décrit dans 1. section 3.3 de 1' exemple 3).
Le plasmide obtenu a été appelé pMRTI133 et la séquence promotrice MPrll33 (SEQ.ID07) schématisée chns la Fig. III a été vérifiée par séquençage.
3.9. Construction du promoteur MPrll39 (SEQ. ID13) .
Le promoteur MPrll39 (SEQ.ID13) résulte de l'insertion
à la position -405 pb de MPrll31 (SEQ.IPC6! (décrit dans la
à la position -405 pb de MPrll31 (SEQ.IPC6! (décrit dans la
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section 3.2 oe l'exemple 3,, d'une séquence; i. 6i pb qui inclue la duplication de la boîte Céréale dj pr -:. te,Ir du gène de glutenirie de haut poids moléculaire codant pour la sous-unité Box7 (PrHMWG-Bx7) du olé hexaploide Tritic\::i 3<?st:i','[F!? r. c\Cheyer.'7e (Anderson et al., 1998).
Le promoteur t<l'rll39 (SEQ.ID13) ,1 ('! amplifié par P5R à partir de 5 ng j'An: matrice p '~W '1 3: .~ l' iide ..:.:.e 100 pmcdes de chacun des 2 oligcdé3C:CYTljc:léoides 5' '1' ACcJi\..i\'l''I'CCTC\jACAT 9 g1'1' AgAlqT1'1'TgAgT gCCgCCACT AC';' (. ::J\CA,T 9 g1'T ,g ]:\J\g1'1'T TgAgTggCCgTAgATTTgC 3' contenant le site de restriction EcoRT et les deux boites Céréale décrites précédemment et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site de
restriction BamHI, en présence de 50 nmolcs de chacun des dNT?s, du tampon Vent ADN polymérase (IX) et de 2 U de Vent ADN polymérase (New England Biolabs). La réaction d'amplification
par PCR a été réalisée dans le ther:Tc"'h.y'C:;112" Ger.eAr:TO PCR System 9700 . Après une dénaturation à 94 C pendant 5 min., l'ADN a été soumis à 25 cycles constitués chacun ces étapes de dénaturation à 94 C pendant 1 min., d'hybridation à 55 C pendant 1 min. et d'élongaticn à 72 C pendant 1 min. 30 sec. Lors du
dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72 C, pendant min.
restriction BamHI, en présence de 50 nmolcs de chacun des dNT?s, du tampon Vent ADN polymérase (IX) et de 2 U de Vent ADN polymérase (New England Biolabs). La réaction d'amplification
par PCR a été réalisée dans le ther:Tc"'h.y'C:;112" Ger.eAr:TO PCR System 9700 . Après une dénaturation à 94 C pendant 5 min., l'ADN a été soumis à 25 cycles constitués chacun ces étapes de dénaturation à 94 C pendant 1 min., d'hybridation à 55 C pendant 1 min. et d'élongaticn à 72 C pendant 1 min. 30 sec. Lors du
dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72 C, pendant min.
Le fragment d'ADN issu de l'amplification a été isolé
sur un gel d'agarose à 2% à l'aide du Kit QiAcuick Gel Extraction et hydrolyse par EcoRI pendant 1 h à 37 z. Le fragment d'ADN a ensuite été soumis à l'action de 20 U du fragment Klenow (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C en
présence de 60 nmoles de chacun des dNTPs, de 12 pi do tampon Tris-HCL 500 [[11'1 pH 7.5 - MgC12 500 rnr-1 et. 6 1 do DIT à 1 et digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C.
sur un gel d'agarose à 2% à l'aide du Kit QiAcuick Gel Extraction et hydrolyse par EcoRI pendant 1 h à 37 z. Le fragment d'ADN a ensuite été soumis à l'action de 20 U du fragment Klenow (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C en
présence de 60 nmoles de chacun des dNTPs, de 12 pi do tampon Tris-HCL 500 [[11'1 pH 7.5 - MgC12 500 rnr-1 et. 6 1 do DIT à 1 et digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C.
La ligation a été réalisée avec 100 ng du fragment
promoteur MPrli39 (SEQ.ID13) ainsi traité et- 50 ng Ge plasmide ?Gem3Z-l (décrit dans la section 2. de ' e~ wç 1e ) pendant nuit 3 ]6 C dans un mélange réactionnel ie 1" pi, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités ce T4 ADN ligase (New England Biolabs). Des bactéries Escercti ccii DH5a, rendues
promoteur MPrli39 (SEQ.ID13) ainsi traité et- 50 ng Ge plasmide ?Gem3Z-l (décrit dans la section 2. de ' e~ wç 1e ) pendant nuit 3 ]6 C dans un mélange réactionnel ie 1" pi, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités ce T4 ADN ligase (New England Biolabs). Des bactéries Escercti ccii DH5a, rendues
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préalablement compétentes, ont été translJtn.: par la t,t~ïi~é an mélange réactionnel de ligation. L'ADM pla5n,idique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/' ) , a été analysé par PCR à laide de 2'- pmoles ce chacun des 2 oligodésoxynuciéotides 5' ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG V et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC ' dans le thermocycleur Genelunp PCR System 9700 , comme décrit créée.gemment.
Le plasmide obtenu a été appelé pXRT1139 et la séquence promotrice MPrll39 (SEQ.ID13) schématisée dans la Fig. IV a été vérifiée par séquençage.
3. 10. Construction du promoteur MPr1200 (SEQ. ID19) .
Le promoteur MPrl200 (SEQ.ID19) résulte de l'insertion à la position -263 pb de MPrll38 (SEQ.ID12) (décrit dans la section 3. 4 de l'exemple 3), d'une séquence de 79 pb qui inclue la duplication de la boîte Céréale du promoteur du gène de glutenine de haut poids moléculaire codant pour la sous-unité
Bx7 (PrHMWG-Bx7) du blé hexaploïde Tri ticum aestivum L. cv Cheyenne (Anderson et al., 1998).
Bx7 (PrHMWG-Bx7) du blé hexaploïde Tri ticum aestivum L. cv Cheyenne (Anderson et al., 1998).
Le promoteur MPrl200 (SEQ.ID19) a été construis par clonage dans le vecteur pGEM3Z-1 (décrit dans la section 2. 1 de l'exemple 2), des deux fragments promoteurs suivants : - Le fragment 5' MPrl200 (SEQ.ID19) , synthétisé par FCR, a été amplifié à partir de 5 ng d'ADN matrice pMRT1139 (décrit
dans la section 3.9 de l'exemple 3) à l'aide de 100 pmoles de chacun des 2 oligodésoxynucléotides 5' T.Cg.=,A'l'1CCTCgACTgq 3' contenant le site de restriction EcoRI et 5' gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3' possédant le site de restriction
Xoal, en présence de 50 nmoles de chacun des dNTPs, de tampon Vent ADN polymérase (IX) et de 2 U de Vent ADN polymérase (New England Biolabs). La réaction d'amplification par FCR. a été réalisée canes le thermocycleur GeneAmp PCR System 9730 .
dans la section 3.9 de l'exemple 3) à l'aide de 100 pmoles de chacun des 2 oligodésoxynucléotides 5' T.Cg.=,A'l'1CCTCgACTgq 3' contenant le site de restriction EcoRI et 5' gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3' possédant le site de restriction
Xoal, en présence de 50 nmoles de chacun des dNTPs, de tampon Vent ADN polymérase (IX) et de 2 U de Vent ADN polymérase (New England Biolabs). La réaction d'amplification par FCR. a été réalisée canes le thermocycleur GeneAmp PCR System 9730 .
Après une dénaturation à 94 C pendant 10 min., l'ADN a été soumis à 25 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation
à 94 C pendant 1 min., d'hybridation à 53 C fendant 1 min. et d'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72'" C pendant min. Le
à 94 C pendant 1 min., d'hybridation à 53 C fendant 1 min. et d'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72'" C pendant min. Le
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fragment d'ADN issu de 1 ' amplif icaLion PCP a 6:~,'; Isolé sur un gel d'agarose à 1 . 5 ci l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System et hydrolysé par Ecc21 perdant 1 h à z..
Le fragment d'ADN a ensuite été soumis à l'action de 20 U du fragment Ken()'d (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C en prése nce de 60 nmoles de chacun des dNTPs, ic 12 . de tampon Tris-HCL 500 r1. pH 7.5 - MgC12 500 rr H et 6 un de DIT à ; M purs digéré par XbaI pendant 1 h à 37 C.
- Le fragment 3' MPrl200 (SEQ.1D19) , synthétisé par PCR, a
été amplifié à partir de 5 ng d'ADN matrice pMKT1138 à l'aide de 100 pmoles de chacun des 2 cligàés:,=~yrnuc iéctp des 5' ATCggAATTCTAgACgCCgATTACgTggCTTTAgC 3' contenant le site de restriction EcoRI et XbaI et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site de restriction BamHI, en présence de 50 nmcles de chacun des dNTPs,
de tampon Vent ADN polymérase ( 1X; et de U de Vent ADN polymérase (New England Biolabs) dans le t herrT:ccyc 1 eu r GeneAmp PCR System 9700 dans les mêmes conditions que le fragment 5' MPr120C (SEQ.ID19) . Le fragment d'ADN issu de l'amplification
FCR a été isolé sur un gel d'agarose à 1.5 à l'aide du Kilt Concert Rapid Gel Extraction System et hydrolyse
successivement par Xbal et BamHI pendant 1 h à 37 C.
été amplifié à partir de 5 ng d'ADN matrice pMKT1138 à l'aide de 100 pmoles de chacun des 2 cligàés:,=~yrnuc iéctp des 5' ATCggAATTCTAgACgCCgATTACgTggCTTTAgC 3' contenant le site de restriction EcoRI et XbaI et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site de restriction BamHI, en présence de 50 nmcles de chacun des dNTPs,
de tampon Vent ADN polymérase ( 1X; et de U de Vent ADN polymérase (New England Biolabs) dans le t herrT:ccyc 1 eu r GeneAmp PCR System 9700 dans les mêmes conditions que le fragment 5' MPr120C (SEQ.ID19) . Le fragment d'ADN issu de l'amplification
FCR a été isolé sur un gel d'agarose à 1.5 à l'aide du Kilt Concert Rapid Gel Extraction System et hydrolyse
successivement par Xbal et BamHI pendant 1 h à 37 C.
La réaction de ligation a été réalisée avec 50 ng du fragment 5' MPrl200 (SEQ.ID19) , 5C ng du fragment 3' MPrl200 (SEQ,ID19) ainsi traités et 50 ng de plasmide pGem3Z-l dans un mélange réactionnel ce 10 ul, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de 14 ADN ligase (New England 3io- abs) , dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment. Des bâcher Les Eseh?rjchi(1 coli Di-15a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu 1B supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été analysé par PCR à
Laide de 10 pmoles de chacun des e,1::.qüdé,c;'.::':"":G21éu'::.ides 5' ATCggAATTCgCAgCCATggTCCTgAACC 3' et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' dans le thermocycleur
Laide de 10 pmoles de chacun des e,1::.qüdé,c;'.::':"":G21éu'::.ides 5' ATCggAATTCgCAgCCATggTCCTgAACC 3' et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' dans le thermocycleur
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GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRT1200 et la séquence promotrice MPrl200 (SEQ.ID19) schématisée dans à zing. IV a été vérifiée par séquençage.
3.11. Construction du promoteur MPrl213 (SEQ. ID20) .
Le promoteur MPrl213 (SEQ.ID20) résulte de l'insertion en amont de la position-225 pb de MPR1128 :SEQ.ID04) (décrit dans la sect ion 2.2 de l'exemple 2), d'une séquence de 79 pb qui inclue la duplication de la boîte Céréale du promoteur du gène de glutenine de haut poids moléculaire codant pour la
sous-unité Bx7 (PrHMWG-Bx7) du blé hexaploïde 7riLicum aestivum L. cv Cheyenne (Anderson et al., 1998).
sous-unité Bx7 (PrHMWG-Bx7) du blé hexaploïde 7riLicum aestivum L. cv Cheyenne (Anderson et al., 1998).
Le promoteur MPrl213 (SEQ.ID20) a été construit par clonage dans le vecteur pGEM3Z-l (décrit dans la section 2.1 de l'exemple 2), des deux fragments promoteurs suivants : - Le fragment 5' MPrl213 (SEQ. ID20) , synthétisé par PCR, a été amplifié à partir de 5 ng d'ADK matrice pMRT1139 (décrit
dans la section 3.9 de l'exemple 3) à l'aide de 100 prr.eles de chacun des 2 oligodésoxynucléotides 5' TACgAATTCCTCgACATgg 3' contenant le site de restriction EcoRI et 5' gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3' possédant le site ce restriction Xbal, en présence de 50 nmoles de chacun des dNTPs, de tampon
Vent ADN polymérase (IX) et de 2 U de Vent ADN polymérase (new England Biolabs). La réaction d'amplificaticn par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 .
Après une dénaturation à 94 C pendant 1C mien., l'ADK a été soumis à 25 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 1 min., d'hybridation à 55 C pendant 1 min. et d'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. Lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72 C pendant 5 min. Le fragment d'ADN issu de l'amplification PCR a été isolé sur un gel d'agarose à 1.5% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel
Extraction System et hydrolysé par EcoRI pendant 1 h à 37 C,. Le fragment d'ADN a ensuite été soumis à l'action de 20 U du fragment Klenow (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C en présence de 60 nmoles de chacun des dNTPs, ce 12 l de tampon
dans la section 3.9 de l'exemple 3) à l'aide de 100 prr.eles de chacun des 2 oligodésoxynucléotides 5' TACgAATTCCTCgACATgg 3' contenant le site de restriction EcoRI et 5' gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3' possédant le site ce restriction Xbal, en présence de 50 nmoles de chacun des dNTPs, de tampon
Vent ADN polymérase (IX) et de 2 U de Vent ADN polymérase (new England Biolabs). La réaction d'amplificaticn par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 .
Après une dénaturation à 94 C pendant 1C mien., l'ADK a été soumis à 25 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 1 min., d'hybridation à 55 C pendant 1 min. et d'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. Lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72 C pendant 5 min. Le fragment d'ADN issu de l'amplification PCR a été isolé sur un gel d'agarose à 1.5% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel
Extraction System et hydrolysé par EcoRI pendant 1 h à 37 C,. Le fragment d'ADN a ensuite été soumis à l'action de 20 U du fragment Klenow (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C en présence de 60 nmoles de chacun des dNTPs, ce 12 l de tampon
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Tris-HCL 500 rrI pH '7.5 - MgCl2 z00 ma et 6 [il de L.T à 1 M et digéré par XbaI pendant 1 h à 37 C.
- Le fragment 3' MPr1213 (SEQ.ID20) , obtenu par hydrolyse de 5 ug du plasmide pMRT1183 (décrit dans la section 2. 5 de l'exemple 2) avec les enzymes de restriction Xbal et BamHI, a été isolé sur un gel d'agarose à 1.5% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System .
La réaction de ligation a été réalisée avec 50 zig fragment 5' MPrl213 (SEQ.ID20) , 50 ng du fragment 3' MPrl213 (SEQ.ID20) ainsi traités et 50 ng de piasmide pGem3Z-l dans un mélange réactionnel de 10 l, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de T4 ADN ligase (New England Biolabs), dans le thermccycleur GeneAmp PCR System
9700 , comme décrit précédemment. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été analysé par PCR à
laide de 10 pmoles de chacun des 2 oligodésozynucléot ides 5' TACgAATTCCTCgACATgg 3' et 5' gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3' dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment.
9700 , comme décrit précédemment. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été analysé par PCR à
laide de 10 pmoles de chacun des 2 oligodésozynucléot ides 5' TACgAATTCCTCgACATgg 3' et 5' gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3' dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRTl)13 et la séquence promotrice MPrl213 (SEQ.ID20) schématisée dans la Fig. IV a été vérifiée par séquençage.
3. 12. Construction du promoteur MPrll99 (SEQ. ID18) .
Le promoteur MPrll99 (SEQ.ID18) résulte de l'insertion 'ci la position -224 pb de MPR1128 (SEQ.ID04) (décrit dans la section 2 . 2 de l'exemple 2), d' une séquence de 27 pb qui inclue
l'élément GC-riche de la région intergénique du virus des stries du maïs (MSV) (Fenoll et al., 1990).
l'élément GC-riche de la région intergénique du virus des stries du maïs (MSV) (Fenoll et al., 1990).
Le promoteur MPrll99 (SEQ.ID18) a été amplifié par PCR
à partir de 5 ng d'ADN matrice part1128 à l'aide de 100 pmoles de chacun des 2 oiigodésoxynucléot ides ATCGGAATTCAAATGGGCCGGACCGGGCCGGCCCAGCCCGATTA.'~'. : G GCI' 1 T AGC contenant l'élément GC-riche précédemment décrit et les
à partir de 5 ng d'ADN matrice part1128 à l'aide de 100 pmoles de chacun des 2 oiigodésoxynucléot ides ATCGGAATTCAAATGGGCCGGACCGGGCCGGCCCAGCCCGATTA.'~'. : G GCI' 1 T AGC contenant l'élément GC-riche précédemment décrit et les
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dites de restriction EcoRI et Xbal et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site de
restriction BamHI, en présence de 50 rime les de chacun des d1'lFs, du tampon Vent ADN polymérase (IX) et de @ U de Vent ADN polymérase (New Engiand Biolabs). La réaction d'amplification
par PCR a été réalisée dans le thermocycif ir GeneArr.p L'CR System 9700 . Après une dénaturation à 94' Ci pendant 5 min., l' ADN a été soumis à 25 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 1 min., d'hybridation à 55 C pendant 1 min. et d'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. Lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72 C pendant 1 min.
* Le fragment d'ADN issu de l'amplification a été isolé
sur un gel d' agarose à 1 . 5 à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System et hydrolysé par EcoRI pendant 1 h à 37 C. Le fragment a ensuite été soumis à l'action de 20 U du fragment
Klenow (New England Biolabs) pendant 30 mien zal 37 C en présence de 60 nmoles de chacun des dNTPs, de 12 l de tampon Tris-HCL 500 mM pH 7.5 - MgC12 500 mM et 6 l de DTT à 1 M et digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C.
sur un gel d' agarose à 1 . 5 à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System et hydrolysé par EcoRI pendant 1 h à 37 C. Le fragment a ensuite été soumis à l'action de 20 U du fragment
Klenow (New England Biolabs) pendant 30 mien zal 37 C en présence de 60 nmoles de chacun des dNTPs, de 12 l de tampon Tris-HCL 500 mM pH 7.5 - MgC12 500 mM et 6 l de DTT à 1 M et digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C.
La ligation a été réalisée avec !Or- ng du fragment promoteur MPrll99 (SEQ.ID18) ainsi traité et 50 ng de plasmide pGem3Z-l (décrit dans la section 2.1 de l'exemple 2) par cycles PCR dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 dans les conditions décrites précédemment. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées
par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été analysé par FCR à
laide de 25 pmoles de chacun des 2 0l ~godés.~nu.léotides 5' ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG 3' et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' dans le thernccycleur GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment.
par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été analysé par FCR à
laide de 25 pmoles de chacun des 2 0l ~godés.~nu.léotides 5' ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG 3' et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' dans le thernccycleur GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment.
Le plasmide obtenu a été appelé n7R T 1 i ?a:r:ut et la séquence promotrice MPrll99 (SEQ.ID18) mut correspondante, vérifiée par séquençage, présente une mutation dans la séquence
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leader non traduite à la position + 27. Pour rétablir la séquence M?rll99 (SEQ.ID18) non mutée, le fragment 5' MPrll99 (SEQ.ID18) s'étendant de la position -251 à -58 pb a été
cloné à la place du fragment 5' April83 s'étendant de La position -225 à -58 pb.
Pour ce faire, 10 ug de plasmide pMRTll99mut ont été digérés par EcoRI pendant 1 h à 37C et soumis -A l'action de 20 U du fragment Klenow (New England Biclabs) pendant 30 min à 37 Ce, en présence de 60 nmoles de chacun des dNTPs, de 12 l de tampon
Tris-HCL 500 mM pH 7.5 - MgC12 500 mM et 6 y~1~ de DTT à 1 M.
Tris-HCL 500 mM pH 7.5 - MgC12 500 mM et 6 y~1~ de DTT à 1 M.
Après une digestion par Ncol pendant 1 h à 37 C, le fragment 5' MPrll99 (SEQ.ID18) a été isolé sur un gel d'agarose à 1.5% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System .
En parallèle, 5 pg de plasmide pMRT113 (décrit dans la section 2.5 de l'exemple 2) ont été digérés pendant 1 h à 37 C par Xbal et soumis à 7'action de 20 U ou fragment Klenow (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C en présence de 60 nmoles de chacun des dNTPs, de 12 l de tampon Tris-HCL 500 mM pH 7.5 -
MgC12 500 mu et 6 ul de DTT à 1 M. Après une par Ncol, le vecteur pMRT1183 ainsi délété du fragment 5' MPR1183 a
été isolé sur un gel d'agarose à C, 8 à l'aide ru Kit Concert Rapid Gel Extraction System et déphosphcrylé par 40 U de phosphatase alcaline d' intestin de veau (New England Biolabs) en présence de tampon 3 (1X) à 37 C pendant 1 h.
MgC12 500 mu et 6 ul de DTT à 1 M. Après une par Ncol, le vecteur pMRT1183 ainsi délété du fragment 5' MPR1183 a
été isolé sur un gel d'agarose à C, 8 à l'aide ru Kit Concert Rapid Gel Extraction System et déphosphcrylé par 40 U de phosphatase alcaline d' intestin de veau (New England Biolabs) en présence de tampon 3 (1X) à 37 C pendant 1 h.
La réaction de ligation a été réalisée avec 100 ng du fragment 5' MPrll99 (SEQ.ID18) mut et '-)Ci ng du plasmido
pMRT1183 ainsi traités, dans un mélange réactionnel de 10 u, en présence du tampon T4 ADN ligase (lX) et de z unités de T4 ADN ligase (New England Biolabs), dans le thermocycleur GeneArr.p PCR System 9700 , comme décrit précédemment. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestion enzymatique.
pMRT1183 ainsi traités, dans un mélange réactionnel de 10 u, en présence du tampon T4 ADN ligase (lX) et de z unités de T4 ADN ligase (New England Biolabs), dans le thermocycleur GeneArr.p PCR System 9700 , comme décrit précédemment. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestion enzymatique.
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Le plasmide obtenu a été appelé pMR'ni99 et la séquence promotrice MPrll99 (SEQ.ID18) est schématisée dans la Fig. IV.
Exemple 4.
Construction des plasmides binaires contenant les promoteurs MPrll30 (SEQ.ID05) , MPrll31 (SEQ.ID06) , MPrll35 (SEQ. ID09) , MPrll38 (SEQ.ID12) , MPrll39 (SEQ.ID13) et MPr1092, utilisés lors de la transformation stable du tabac.
4.1. Construction du plasmide binaire pMRT1177.
Le plasmide binaire pMRTl1 7 a été obtenu par insertion de la cassette d'expression MPrll30 ; SEQ . D05 /uidA-IV2/term-nos de pMRT 1130 (décrit dans la section 3.1 de l'exemple 3) dans le site EcoRI du plasmide binaire pMRTll1S (remanie de brevet FR Ci (, 1112 non publiée).
Pour ce faire, 10 ug de plasmide piIRT1 ,3G ont été digérés successivement par EcoRI et Omni pendant 1 h à 3 C. La cassette d'expression a ensuite été isolée sur un gel d'agarose à 0,8% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System .
En parallèle, 10 ug de plasmide binaire pM;Tll',-8 ont été digérés par EcoRI pendant 1 h à 37 C. Le fragment vecteur linéarisé a ensuite été déphosphorylé par 40 U de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) en présence de
tampon 3 (IX) à 37 C pendant 1 h. La ligation a été réalisée avec 50 ng de la cassette
d'expression et 100 ng de plasmide pMRT1118 ainsi traités pendant 1 nuit à 16 C dans un mélange réactionnel de 10 l, en
présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de bzz unités de T4 Ace ligase (nec England Biolabs). Des bactéries Eschericnia coli :i5a, rendues préalablement compétentes, on: été transformées par la totalité du mélange réactionnel de Ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémerité en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques.
En parallèle, 10 ug de plasmide binaire pM;Tll',-8 ont été digérés par EcoRI pendant 1 h à 37 C. Le fragment vecteur linéarisé a ensuite été déphosphorylé par 40 U de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) en présence de
tampon 3 (IX) à 37 C pendant 1 h. La ligation a été réalisée avec 50 ng de la cassette
d'expression et 100 ng de plasmide pMRT1118 ainsi traités pendant 1 nuit à 16 C dans un mélange réactionnel de 10 l, en
présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de bzz unités de T4 Ace ligase (nec England Biolabs). Des bactéries Eschericnia coli :i5a, rendues préalablement compétentes, on: été transformées par la totalité du mélange réactionnel de Ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémerité en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques.
Le plasmide obtenu, appelé prv1RTll 77, a été transféré dans la souche d' Agrobacteri um tumefaci en.:: 1JBAI4G selon la technique décrite par Holsters et al. (1978'. 'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu 2y ( bactctryptone
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10 g/i, extrait de levure 10 g/l, NaCl g/1, . 7 .. et Agar-Agar 15 g/1 ) supplémenté en rifampicine (50 mg/1) et en Kanam.yc~ne (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline, modifiée en ajoutant du lysozyme (25 mg/ml) dans le tampon de resuspension des cellules. L'ADN plasmidique a été analysé par
digestions enzymatiques et le clone d'agrobacté-ie obtenu a été appelé A1177.
4.2. Construction du plasmide binaire pMRT1178.
Le plasmide binaire pMRT1178 a été obtenu par insertion
de la cassette d'expression MFrî131 (SEQ.ID06) /uidA-IV2/terrn-nos dans le site EcoRI du plasmide oinaire p^iRT111, décrit dans la section 4.1 de l'exemple 4, excepté que la cassette d'expression a été isolée à partir du plasmide pMRT1131 (décrit dans la section 3. 2 de l'exemple 3).
de la cassette d'expression MFrî131 (SEQ.ID06) /uidA-IV2/terrn-nos dans le site EcoRI du plasmide oinaire p^iRT111, décrit dans la section 4.1 de l'exemple 4, excepté que la cassette d'expression a été isolée à partir du plasmide pMRT1131 (décrit dans la section 3. 2 de l'exemple 3).
Le plasmide résultant a été appelé pMRT1178 et a été
transféré dans la souche d'Agrc:bacterium tll:netaciens L=LAI4C4 selon le protocole décrit précédemment en section 4.1 de l'exemple 4. Le clone d'agrobactérie obtenu a été appelé A1178.
transféré dans la souche d'Agrc:bacterium tll:netaciens L=LAI4C4 selon le protocole décrit précédemment en section 4.1 de l'exemple 4. Le clone d'agrobactérie obtenu a été appelé A1178.
4.3. Construction du plasmide binaire pMRT1179.
Le plasmide binaire pMRT1179 a été obtenu par insertion
de la cassette d'expression Mur1135 ,SEQ.IDC9) /uidA-IV2/term-::os dans le site EcoRI du plasmide binaire pMRT1118, décrit dans la section 4.1 de l'exemple 4, excepté que la cassette d'expression a été isolée à partir du plasmide pMRT1135 (décrit dans la section 3.3 de l'exemple 3).
de la cassette d'expression Mur1135 ,SEQ.IDC9) /uidA-IV2/term-::os dans le site EcoRI du plasmide binaire pMRT1118, décrit dans la section 4.1 de l'exemple 4, excepté que la cassette d'expression a été isolée à partir du plasmide pMRT1135 (décrit dans la section 3.3 de l'exemple 3).
Le plasmide résultant a été appelé pMRT1179 et a été transféré dans la souche d'AgrobacteriwYi tUJ[lèfacit:?1J5 LEA4 4 04 selon le protocole décrit précédemment en section 4.1 de exemple
Le clone d'agrobactérie obtenu a été appelé A1179.
Le clone d'agrobactérie obtenu a été appelé A1179.
4.4. Construction du plasmide binaire pMRT1180.
Le plasmide binaire pMRT1180 a été obtenu par insertion de la cassette d'expression MPr1138 (SEQ.ID12)
/uidA- I V2;'term-ros dans le site EcoRI du plasmide binaire pMRT'1118, décrit dans la section 4.1 de l'exemple 4, excepté que la cassette d'expression a été isolée à partir du plasmide pMRT1138 (décrit dans la section 3.4 de l'exemple 3).
/uidA- I V2;'term-ros dans le site EcoRI du plasmide binaire pMRT'1118, décrit dans la section 4.1 de l'exemple 4, excepté que la cassette d'expression a été isolée à partir du plasmide pMRT1138 (décrit dans la section 3.4 de l'exemple 3).
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Le plasmide résultant. a été appelé îRT ; 80 et a été transféré dans la souche 'tit'OW'tE-'Y'1 1T Lulr,....::faciens LBA4 4 04 selon le protocole décrit précédemment t en section 4.1 de l'exemple 4 . Le clone d'agrobactérie obtenu a été appelé A1180.
4. 5. Construction du plasmide binaire pMRT1181.
Le plasmide binaire pMRTII''!l a été obtenu par insertion de la cassette d'expression Merl1339 (SEQ.1D13 / ui dA- IV2 / term- nos dans le site EcoRI du plasmide Dina i re pMRT1118, décrit dans la section 4.1 de l'exemple 4), excepté que la cassette d'expression a été isolée à partir du plasmide
pt-'IRT1139 (décrit. dans la section 3.9 de l'exemple 3).
pt-'IRT1139 (décrit. dans la section 3.9 de l'exemple 3).
Le plasmide résultant a été appelé pMRT1181 et a été transféré dans la souche d'Agrobacterium tumefaciens LBA4404 selon le protocole décrit précédemment en section 4. 1 de l'exemple 4. Le clone d'agrobactérie obtenu a été appelé A1181.
4.6. Construction du plasmide binaire pMRT1182.
Le plasmide binaire pMRT1182 a été obtenu par insertion du fragment promoteur PrD35S CaMV et de la séquence
uidA-lV2/term-:ios dans le plasmide binaire pMRi'lîl.
uidA-lV2/term-:ios dans le plasmide binaire pMRi'lîl.
PrD35S CaMV a été isolé en digérant 10 ug du plasmide pJIT163# successivement par Kpnl et par Hir.dIII pendant 1 h à
37 C. Le fragment de 743 pb correspondant à PrD35S Camp a été séparé sur gel d'agarose à 0,8%, puis purifié à laide du Kit QIAquick Gel Extraction .
La séquence uidA-IV2/term-nos a été obtenue par la digestion de 4 ug de plasmide pMRT1092 avec HindIII et EcoRI pendant 1 h à 37 C. Le fragment de 2,2 kb correspondant à la
séquence uidA-IV2/term-nos a été séparé sur gei a'agarose à 0,8%, puis purifié à l'aide du Kit QIAquicK Gel Extraction .
En parallèle, 10 pg de plasmide binaire pTRT 11s ont été digérés successivement par KpnI et EcoRI pendant 1 h à 37 C. Le fragment vecteur linéarisé a ensuite été déphcsphorylé par 40 U de phosphatase alcaline d' intestin de veau (New England Biolabs) en présence de tampon 3 (IX), pendant 1 h à 37 C.
37 C. Le fragment de 743 pb correspondant à PrD35S Camp a été séparé sur gel d'agarose à 0,8%, puis purifié à laide du Kit QIAquick Gel Extraction .
La séquence uidA-IV2/term-nos a été obtenue par la digestion de 4 ug de plasmide pMRT1092 avec HindIII et EcoRI pendant 1 h à 37 C. Le fragment de 2,2 kb correspondant à la
séquence uidA-IV2/term-nos a été séparé sur gei a'agarose à 0,8%, puis purifié à l'aide du Kit QIAquicK Gel Extraction .
En parallèle, 10 pg de plasmide binaire pTRT 11s ont été digérés successivement par KpnI et EcoRI pendant 1 h à 37 C. Le fragment vecteur linéarisé a ensuite été déphcsphorylé par 40 U de phosphatase alcaline d' intestin de veau (New England Biolabs) en présence de tampon 3 (IX), pendant 1 h à 37 C.
La ligation a été réalisée en présence de 100 ng de
plasmide binaire, 50 ng du fragment PrD35S CaMV et. 50 ni du
plasmide binaire, 50 ng du fragment PrD35S CaMV et. 50 ni du
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fragment correspondant, à la séquence uiû:-1'~~,':rro-::s dans ur. volume réactionnel de 20 uj, en présence du tampon T4 ADN ligase (1X) et 400 unités d'enzyme T4 ADN ligase (leva Engiand Biolabs). L' incubation a été réalisée par cycles PCR dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 comme décrit précédemment. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du milieu réactionnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en Kanamycine (50 ng/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques.
Le plasmide résultant a été appelé pMRT1182 et a été
transféré dans la souche d'Agroacterium tumefaciens LBA4404 selon le protocole décrit précédemment en section 4.1 de l'exemple 4. Le clone d'agrobactérie obtenu a été appelé A1182.
transféré dans la souche d'Agroacterium tumefaciens LBA4404 selon le protocole décrit précédemment en section 4.1 de l'exemple 4. Le clone d'agrobactérie obtenu a été appelé A1182.
Exemple 5.
Construction du plasmide binaire pMRT1207 contenant le promoteur MPrll39 (SEQ. ID13) , utilisé lors de la transformation stable du Mais.
Le plasmide binaire pMRT1207 a été obtenu par insertion de la cassette d'expression MPr]139 (SEQ.ID13)
!uiàA-IV2/term-nos de pMRT 1139 dans le site HpaI du plasmide binaire pMRT1195 (Demande de brevet FR 99 '. ' 12 non publiée).
!uiàA-IV2/term-nos de pMRT 1139 dans le site HpaI du plasmide binaire pMRT1195 (Demande de brevet FR 99 '. ' 12 non publiée).
Pour ce faire, 7 ug de plasmide pXRT1139 ont été digérés successivement par EcoRI et XmnI pendant 1 h à 37 C. La cassette d'expression a ensuite été isolée sur un gel d'agarose à 0,7% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System et soumis
à l'action de 20 U du fragment Kïenow (new England Biolabs) pendant 30 min. à 37 C en présence de 60 nmoles de chacun des
dNTPs, de 12 pl de tampon MgCl2 (500 mM) et de 6 nul de DIT (1M).
à l'action de 20 U du fragment Kïenow (new England Biolabs) pendant 30 min. à 37 C en présence de 60 nmoles de chacun des
dNTPs, de 12 pl de tampon MgCl2 (500 mM) et de 6 nul de DIT (1M).
En parallèle, 5 g de plasmide binaire pMRT1195 ont été digérés par HpaI pendant 1 h à 37 C. Le fragment vecteur linéarisé a ensuite été déphosphorylé par 4(: eT de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Eioldbs) en présence de tampon 3 (IX) à 37 C pendant 1 h.
La ligation a été réalisée avec 100 ng de la cassette
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Ij'e,<prE:'3Surl ê:" 10 ni de plasmide pMRTli9j .ainsi traités, par cycles PUR dans le thermocycleur GeneAmp rCR System 9700 comme décrit précédemment. Des bactéries Esctriria c-1i DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en
Kanamycine (50 mg/1), a été extrait seL.::..~1 méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques.
Le plasmide obtenu, appelé pMRTl207, a été transféré comme décrit en section 4.1 de l'exemple 4, dans la souche
d'llgrobacterium tumefaciens LBA4404-pSB1, laquelle dérive de la souche d'Agrotlacterium tumefaciens LBA4404 suite à l'intégration du plasmide pSBl (Demande de brevet FH 9?1 '. 112 Lon publiée,' selon le protocole décrit précédemment pour l'obtention de A1177. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu 2YT supplémenté en rifampicine (50 mg/1), en Kanamycine (50 mq/1) et en tétracycline (5 mg/1) a été extraie selon la méthode de lyse alcaline, modifiée en ajoutant du lysozyme (25 mg/ml) dans le tampon de. resuspension des cellules. L'ADN plasmidique a été analysé par digestions enzymatiques et le clone d'agrobactérie obtenu a été appelé A1207,
Exemple 6.
d'llgrobacterium tumefaciens LBA4404-pSB1, laquelle dérive de la souche d'Agrotlacterium tumefaciens LBA4404 suite à l'intégration du plasmide pSBl (Demande de brevet FH 9?1 '. 112 Lon publiée,' selon le protocole décrit précédemment pour l'obtention de A1177. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu 2YT supplémenté en rifampicine (50 mg/1), en Kanamycine (50 mq/1) et en tétracycline (5 mg/1) a été extraie selon la méthode de lyse alcaline, modifiée en ajoutant du lysozyme (25 mg/ml) dans le tampon de. resuspension des cellules. L'ADN plasmidique a été analysé par digestions enzymatiques et le clone d'agrobactérie obtenu a été appelé A1207,
Exemple 6.
Mesure et comparaison de l'activité des différents promoteurs en expression transitoire dans le maïs et le tabac.
6. 1 Préparation des extraits végétaux.
6.1.1. Obtention et préparation des grains de maïs.
Les expériences d'expression transitoire ont été réalisées sur l'albumen de maïs SN 87 165 (L2), prélevés sur des plants de maïs cultivés au phytotron à 24 C, sous 60% bzz6 d'hygrométrie et une photopériode de 16 n lumière 8 h obscurité.
Douze jours après pollinisation (DAP), les épis de mais
ont été prélevés en stérilisés dans un bain je domestus à 2cl%, sous agitation pendant 5 min. Suite à l'élimination du domestos par des rinçages successifs à l'eau déionisée stérile, le
ont été prélevés en stérilisés dans un bain je domestus à 2cl%, sous agitation pendant 5 min. Suite à l'élimination du domestos par des rinçages successifs à l'eau déionisée stérile, le
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péricarpe et la couche de cellules aleurones ont soigneusement été éliminés en conditions stériles. Des coupes tangentiel-,Les de l'albumen ainsi extrait ont été réalisées et placées sur du papier filtre imbibé de milieu minimum de Murashige et Skoog (MS 5524, Sigma).
6. 1.2. Culture in vitro du tabac, préparation des feuilles.
Les expériences d'expression transitoire ont été
réalisées sur des feuilles de tabac (h'ictiar,. tabacum L.) au cultivar PBD6 âgées de 6 semaines. Des graines masures de tabac cv. PBD6 ont été stérilisées pendant 10 min 'Jans une solution d'hypochlorite de calcium saturée (70 g/1), puis rincées trois fois pendant 5 min dans l'eau déionisée stérile. Les graines stériles ont été déposées sur milieu MS20 (Murashige et Skoog, 1962) et incubées pendant 6 semaines en cnambre de culture (température constante de 24 C, photopériode 16 h lumière 8 h obscurité).
réalisées sur des feuilles de tabac (h'ictiar,. tabacum L.) au cultivar PBD6 âgées de 6 semaines. Des graines masures de tabac cv. PBD6 ont été stérilisées pendant 10 min 'Jans une solution d'hypochlorite de calcium saturée (70 g/1), puis rincées trois fois pendant 5 min dans l'eau déionisée stérile. Les graines stériles ont été déposées sur milieu MS20 (Murashige et Skoog, 1962) et incubées pendant 6 semaines en cnambre de culture (température constante de 24 C, photopériode 16 h lumière 8 h obscurité).
Afin de minimiser la destruction des cellules du mésophylle foliaire lors de la transformation par biolistique, les 2 feuilles principales des plants de tabac PBD6 âgés de 6 semaines ont été prélevées 24 h avant transformation, déposées, face ad-ligneuse vers le haut, sur le milieu de plasmolyse douce BY3 (Sels MS-5519 4,4 g/1, myoincsitol 100 mg/l, thiamine 1
mg/1, KH PO. 2C mg/1, Saccharose 30 g/1, Sorbitol 45, g/1, 2,4 D 1 mg/1, agar 8 g/1, pH 5,8), et placées en chambre de culture (température constante de 25 C, photopériode 16 h lumière / 8 h obscurité).
mg/1, KH PO. 2C mg/1, Saccharose 30 g/1, Sorbitol 45, g/1, 2,4 D 1 mg/1, agar 8 g/1, pH 5,8), et placées en chambre de culture (température constante de 25 C, photopériode 16 h lumière / 8 h obscurité).
6.2. Adsorption de l'ADN plasmidique sur des microparticules de tungsten ou d'or.
La transformation par biolistique a nécessité le dépôt préalable de l'ADN sur des microparticuies sphériques en tungsten ou en or, stérilisées 10 min dans l'éthancl absolu (99,98%, à moins de 0,02% d'eau), lavées quatre fois dans l'eau déionisée stérile, et conservées à -20 C dans une solution de glycérol à 50% pendant 4 semaines maximum.
La concentration de l'ensemble des plasmides contrôles
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et essais, utilisés durant La trrmformât on été ajustée à 1 mg/ml. Dans chacune des expériences de transformation où l'activité du promoteur étudié a été évaluée par un dosage
luminométrique, un contrôle interne de référence (pCaMV35Sluc) a été cotransformé afin de normaliser les varia: ons de ] 'activité GUS entre les différentes expériences ;Le:-. e et al., xi 1 Cependant, lorsque l'activité du promoteur étudié a été déterminée par un test histochimique, le plasmide de référence n'a pas été co-transformé.
L'enrobage de l'ADN sur les particules ainsi préparées a été réalisé en enceinte stérile à flux laminaire. Une fraction aliquote de 1,8 mg de suspension de particules stériles dans 30 l de glycérol 50%, a été mélangée vigoureusement au vortex pendant 1 min., puis pendant 10 sec. avec 20 l de la suspension d'ADN contenant 5 pg de l'un des plasmides à tester et 2 g du plasmide de référence pCaMV35Sluc. Puis, 20 l de CaCl 2, 5 M ont été ajoutés eL mélangés vigoureusement pendant 10 sec. Ensuite, 20 l de spermidine 0,1 M ont été ajoutés au mélange et l'ensemble a été agité au vortex pendant 30 sec. supplémentaires. L'enrobage de l'ADN sur les billes a été poursuivi en incubant le mélange dans la glace pendant 15 min, puis les billes enrobées ont été centrifugées à faible vitesse pendant 5 sec et lavées deux fois dans l'éthanol absolu. Les particules ainsi enrobées ont été remises en suspension dans 32 l d'éthanol absolu, mélangées vigoureusement au vortex pendant 15 sec., puis immédiatement réparties en 4 fractions aliquotes identiques sur les disques "macrocarriers" stériles du système Biolistic PDS-1000/He préparés selon es recommandations du fournisseur (Bio-Rad, Hercule, USA). L'ensemble "support du macrocarrier / macrocarrier portant le dépôt de particules", a été séché pendant 5 min.
6.3. Transformation transitoire des extraits végétaux par biolistique.
6.3.1. Bombardement des albumens de maïs et expression transitoire.
Le bombardement des albumens de maïs a été effectué à
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l'aide du système 2ulslic FDS-lOCO/He en suivant, les recommandations générales du fournisseur (Bio-Rad, Hercule, USA) concernant les manipulations et montages des différents éléments de l'appareil. Chaque albumen a été bombardé deux fois
successivement par des particules de tungsien de 0.6 un de diamètre, en suivant les caractéristiques de t i r suivantes : la pression d'hélium choisie pour accélérer les particules est de 6200 k?a (900 psi), - l'échantillon végétal est placé à 6 cm de la zone d'accélération des billes, - le tir est effectué sous une atmosphère en dépression de 27mm de mercure.
Suite au bombardement, les albumens ont été laissées dans les mêmes dispositions et ont été incubés 24 h à l'obscurité dans une chambre de culture à 26 C, afin de permettre l'expression transitoire des transgènes introduits dans les cellules.
6. 3.2. Bombardement des tissus foliaires de tabac et expression transitoire.
Le bombardement des feuilles de tabac a été effectué de la même manière que le bombardement des albumens de maïs, à deux exceptions près : - les échantillons ont été bombardés par des particules d'or de 1 m de diamètre, - les échantillons ont été placés à 9 cm de la zone d'accélération des billes.
Après bombardement les feuilles ont été laissées dans les mêmes dispositions et ont été incubées 46 n en chambre de
culture (température constante de 25 C, pnotopériode 16 h lumière 8 h obscurité) afin de permettre l'expression transitoire des transgènes introduits dans les cellules.
culture (température constante de 25 C, pnotopériode 16 h lumière 8 h obscurité) afin de permettre l'expression transitoire des transgènes introduits dans les cellules.
6.4. Révélation et évaluation de l'activité des différents promoteurs par coloration histochimique.
6.4.1. Révélation de l'expression B-glucuronidase.
Une révélation de l'expression de la j-g':uCL:rOnirj3.3R a
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été réalisée par coloration histochimique comme décrit pdr Jeffersson et al. (1937). Suite à la période d'incubation en chambre de culture, les extraits végétaux ont été incubés en
présence du substrat X-Gluc de la 3-,lcur .riuase ( 5-bromc, 4-chloro, 3-indolyl glucuronide 500 mg/1), dans du tampon
phosphate 0,1 M, Triton X100 à 0,05%, pH 7,0, pendant z4 h à 37 C.
présence du substrat X-Gluc de la 3-,lcur .riuase ( 5-bromc, 4-chloro, 3-indolyl glucuronide 500 mg/1), dans du tampon
phosphate 0,1 M, Triton X100 à 0,05%, pH 7,0, pendant z4 h à 37 C.
Après coloration, les albumens de mais ont directement été analysés ou conservés stérilement à 4 C plusieurs semaines, alors que les feuilles de tabac ont été dépigmentées par deux passages successifs dans des bains d'éthanol à 95% pendant respectivement 3 et 12 h, puis rincées dans l'eau distillée et séchées à plat entre deux feuilles de cellophane.
L'activité promotrice des différentes constructions a été évaluée par l'estimation du nombre et de l'intensité des points bleus révélés sur chaque extrait végétal.
6.4.2. Evaluation qualitative de l'activité des promoteurs dans l'albumen de maïs.
La révélation histochimique de l'expression de la
(3-glucuronidase a permis didentifier trois catégories de promoteurs : - Les albumens bombardés par la construction pMRT1197, pMRT1126, pMRT1127 et pMRT1199 présentent systématiquement un nombre de points bleus inférieur à 10. La présence de spots bleus sur les albumens transformés avec la construction pMRT1197, indique que la séquence de 96 pb de M?rll97 (SEQ.ID16) constitue la séquence promotrice minimale du promoteur HMWG-Dx5
, SEQ. 1D01 ) , capable de diriger une activité *.ranscriptionnelle de base dans l' albumen de maïs. L' absence de spots bleus sur les
albumens bombardés par la construction pMFRT1.44, laquelle est dépourvue de séquence promotrice (témoin négatif), témoigne de la fonctionnalité des promoteurs regroupés dans cette catégorie.
(3-glucuronidase a permis didentifier trois catégories de promoteurs : - Les albumens bombardés par la construction pMRT1197, pMRT1126, pMRT1127 et pMRT1199 présentent systématiquement un nombre de points bleus inférieur à 10. La présence de spots bleus sur les albumens transformés avec la construction pMRT1197, indique que la séquence de 96 pb de M?rll97 (SEQ.ID16) constitue la séquence promotrice minimale du promoteur HMWG-Dx5
, SEQ. 1D01 ) , capable de diriger une activité *.ranscriptionnelle de base dans l' albumen de maïs. L' absence de spots bleus sur les
albumens bombardés par la construction pMFRT1.44, laquelle est dépourvue de séquence promotrice (témoin négatif), témoigne de la fonctionnalité des promoteurs regroupés dans cette catégorie.
- Les albumens bombardés par les constructions pMRT1128, pMRT1213, pMRT1216, pMRT1217, pMRT1136, pMRT1137, pMRT1135 et pMRT1138 présentent en moyenne un nombre de points bleus équivalent aux albumens transformés par les constructions
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pIRI'1! i. : (PrHMWG-Dx5 (SEQ. ID01) ) et pMRTL21b ;ry-zéïne, témoin positif).
- Enfin, Les albumens bombardés par les constructions,
pMRT1130, pMRT1131, pMRT1139 et part, 12 présentent une coloration bleue intense et diffuse qui rend difficile le comptage du nombre de points bleus, mais laisse suggérer que les
promoteurs MPrll30 (SEQ.ID05) , MPrll31 (SF.Q.ICC6) MPrll39 (SEQ.ID13) et MPrl200 (SEQ.ID19) sont très fortement actifs dans l'albumen de maïs 12 jours après pollinisation.
pMRT1130, pMRT1131, pMRT1139 et part, 12 présentent une coloration bleue intense et diffuse qui rend difficile le comptage du nombre de points bleus, mais laisse suggérer que les
promoteurs MPrll30 (SEQ.ID05) , MPrll31 (SF.Q.ICC6) MPrll39 (SEQ.ID13) et MPrl200 (SEQ.ID19) sont très fortement actifs dans l'albumen de maïs 12 jours après pollinisation.
6.4.3. Evaluation quantitative de l'activité des promoteurs dans les feuilles de tabac.
Les résultats des tests histochimiques effectués sur les feuilles de tabac transformées par les constructions pMRT1125 (PrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01) ) , pMRT1130, pMRT1131, pMRT11@3,
pMRT1134, pMRT1135, pMRT1136, pMRT1137, pM?Tl138 et pMRT1092 (PrD35S du CaMV, témoin positif) rapportés sur la figure V, ont permis de classer les promoteurs étudiés dans quatre catégories. Sur les feuilles bombardées avec la construction pMRT1125
(FrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01) ) aucun spot bleu n'a été observé. Les feuilles bombardées avec les constructions part1133, pMRT34, pMRTH36 et pMRTll37 présentent en moyenne uri nombre de points bleus compris entre 50 et 100. Les feuilles transformées par les constructions pMRT1135, pMRT1138 et pMRT1139 (résultat non montré), présentent un nombre important de points bleus, équivalent à celui observé sur les feuilles bombardées avec la construction de référence pMRT1092 (PrD35S da CaMV). Enfin, Les
feuilles bombardées par les constructions pMRT1130 et pMn113, présentent un nombre de spots bleus diffus et intenses, beaucoup plus élevé que les feuilles bombardées par la construction de référence pMRT1092 (PrD35S du CaMV).
pMRT1134, pMRT1135, pMRT1136, pMRT1137, pM?Tl138 et pMRT1092 (PrD35S du CaMV, témoin positif) rapportés sur la figure V, ont permis de classer les promoteurs étudiés dans quatre catégories. Sur les feuilles bombardées avec la construction pMRT1125
(FrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01) ) aucun spot bleu n'a été observé. Les feuilles bombardées avec les constructions part1133, pMRT34, pMRTH36 et pMRTll37 présentent en moyenne uri nombre de points bleus compris entre 50 et 100. Les feuilles transformées par les constructions pMRT1135, pMRT1138 et pMRT1139 (résultat non montré), présentent un nombre important de points bleus, équivalent à celui observé sur les feuilles bombardées avec la construction de référence pMRT1092 (PrD35S da CaMV). Enfin, Les
feuilles bombardées par les constructions pMRT1130 et pMn113, présentent un nombre de spots bleus diffus et intenses, beaucoup plus élevé que les feuilles bombardées par la construction de référence pMRT1092 (PrD35S du CaMV).
A la lumière de ces résultats, plusieurs informations essentielles peuvent être dégagées : - les séquences activatrices as-1 et as-2 du CaMV 35S dérégulent
l'activité du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.1DC1) dans les feuilles de tabac, - les séquences activatrices as-1 et as-2 du CaMV 35S agissent
l'activité du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.1DC1) dans les feuilles de tabac, - les séquences activatrices as-1 et as-2 du CaMV 35S agissent
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CIL synergie avec des motifs cis-I.é'J.JlClt~'c:.l::3 présents dans le promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.IDC1) . La boîte G like semble être l'un des éléments clés de ce contrôle combinat cire . Les boîtes GATA, en association avec la boîte G like et les séquences activatrices as-1 et as-2 du CaMV 35S, sont peut être
responsables de l'activité très élevée de MPrll30 (S=Q,TDC) et MPrll31 (SEQ.IDC6) , la dupli cation de la séquence activatrice as-2 du CaMV 35S ne confère pas un effet additif positif notable, - les poîtes céréales , en association avec les séquences activatrices as-1 et as-2 du CaMV 35S, semblent conférer un effet transcriptionnel négatif dans les feuilles de tabac.
En conclusion, le promoteur D35S du CaMV étant communément rapporté dans la littérature comme étant un promoteur chimérique apportant une augmentation de l'activité promotrice du gène rapporteur GUS de l'ordre de 8 à 12 fois supérieure à celle apportée par le promoteur 35S du CaMV (Kay et
al., 1987), les promoteurs MPrll35 ,SEQ.;J9) , MPrll3Ï (SEQ.ID12) , MPrll39 (SEQ.ID13) , MPrll30 (SEQ.ID05) et MPrll31 (SEQ. ID06) sont certainement les promoteurs chimériques, actifs dans les feuilles de tabac, les plus forts décrit à ce jour.
al., 1987), les promoteurs MPrll35 ,SEQ.;J9) , MPrll3Ï (SEQ.ID12) , MPrll39 (SEQ.ID13) , MPrll30 (SEQ.ID05) et MPrll31 (SEQ. ID06) sont certainement les promoteurs chimériques, actifs dans les feuilles de tabac, les plus forts décrit à ce jour.
Les promoteurs MPrll33 (SEQ.ID07) , MPrll34 (SEQ.IDC8) ,
MPrll36 (SFQ.IDIO) et MPrll37 (SEQ.IDU) , plus faiblement actifs dans les feuilles de tabac présente également un intérêt, dans la mesure où ils peuvent diriger l'expression de gènes de résistance pour permettre la sélection des plantes transgéniques, au même titre que les promoteurs de type "nos" par exemple.
MPrll36 (SFQ.IDIO) et MPrll37 (SEQ.IDU) , plus faiblement actifs dans les feuilles de tabac présente également un intérêt, dans la mesure où ils peuvent diriger l'expression de gènes de résistance pour permettre la sélection des plantes transgéniques, au même titre que les promoteurs de type "nos" par exemple.
6.5. Quantification de l'activité des différents promoteurs dans l'albumen de maïs par dosage luminométrique de l'expression de la B-glucuronidase.
Les albumens précédemment transformés par biolistique ont été congelés à l'azote liquide et broyées à l'aide d' une tige de verre montée sur une perceuse. La poudre a ensuite été décongelée dans du tampon d'extraction (Tris Phosphate 25 mM pH 7,8, Dithiothréitol 2 mM, acide
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1, -aiamiru:.;clohexane, t;, , N' , N'-tétracétiqe 2 [[2<, glycérol 1C %, Triton X100 1%) à raison de 1 ml de tampon pour 250 mg de tissu. Le mélange a été homogénéisé puis incubé pendant 1 h à 4 C avant d'être clarifié par centrifugatior, pendant 5 min à 16060 g.
L'activité GUS rez,, été mesurée sur 10 pi n ' extrait crut clarifié, à l'aide du kit de détection "GUS-Lignt chemiluminescent reporter gene assay" (Tropix Inc., Bedford,
USA) selon les recommandations du fournisseur. La mesure de l'émission de lumière a été effectuée par un luminomètre Lumat LB 9507 (EGG-Berthold, Bad Wildbad, Allemagne).
USA) selon les recommandations du fournisseur. La mesure de l'émission de lumière a été effectuée par un luminomètre Lumat LB 9507 (EGG-Berthold, Bad Wildbad, Allemagne).
En parallèle, l'activité luciférase a été mesurée sur 10 ul d'extrait brut clarifié, à l'aide du kit de détection "Luciférase assay system" (Promega Corp., Madison, USA) selon les recommandations du fournisseur. La mesure de l'émission de lumière a été effectuée à l'aide du luminomètre Lumat L3 9507 placé en chambre froide à 4 C.
Les résultats sont rapportés en Fig. VI et VII. Pour chaque essai (trois demi albumens = un extrait brut), le rapport entre l'activité -glucuronidase et l'activité luciférase mesurées au luminomètre, a été calculé. La moyenne d'au moins 5 essais indépendants par construction et l'erreur standard à la moyenne ont été déterminées.
Pour analyser l'effet des différentes modifications apportées à chacun des promoteurs décrits dans ce brevet, lesdits promoteurs ont été répartis en deux groupes distincts.
Le groupe I (Fig. VI) est constitué des promoteurs qui permettent de réaliser une dissection fonctionnelle détaillée du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) et le groupe II (Fig. VII) renferme les promoteurs qui permettent de déterminer l'effet des divers éléments cis-activateurs étudiés dans ce brevet, en
association avec le promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.TL.01) . le groupe T renferme les promoteurs Marli28, M?rll27 (SEQ.ID03) , MPrll26 (SEQ.ID02) , h'Pr119î ;E%.ID16) , MPrll99 (SEQ.ID17) , MPrl216 (SEQ. ID21) , MPr121@ ;SEQ.ID22) , le promoteur de référence HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) et la construction
association avec le promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.TL.01) . le groupe T renferme les promoteurs Marli28, M?rll27 (SEQ.ID03) , MPrll26 (SEQ.ID02) , h'Pr119î ;E%.ID16) , MPrll99 (SEQ.ID17) , MPrl216 (SEQ. ID21) , MPr121@ ;SEQ.ID22) , le promoteur de référence HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) et la construction
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,À référence pMRT11414 tC~'IT,, L:. négatif), laquelle est dépourvue de séquence promotrice (Fig. VI). Les résultats des dosages luminométriques permettent de dégager plusieurs constatations : les délétions progressives de la région 5' du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) entraîne une diminution progressive de l'activité relative moyenne conférée par ces
promoteurs. La séquence promotrice entière de PrHM;G-Da5 (SEQ.ID01) de 417 pb semble donc nécessaire peur permettre une
activité maximale du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.L1Jl) . - la faible différence d'activité enregistrée entre les
promoteur MPR1128 (SEQ.1D04) et PrHMWG-Jx:S (SEQ.ID01) montre que la séquence située en amont du nucléotide -238 ne contient pas les éléments cis-activateurs majeurs, responsables de l'activité du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) . la diminution significative d'activité entre les promoteurs MPR1128 (SEQ.ID04) et MPrll27 (SEQ.ID03) laisse suggérer que la séquence située en amont du nucléotide -205, laquelle renferme une boîte G like, joue un rôle capital
pour l'activité du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ. ID07 ) .
- la faible différence d'activité enregistrée entre les promoteur MPrll27 (SEQ.ID03) et MPrl126 ;SEQ.IG21 ne permet pas de conclure quant au rôle réel de 1' élément enhancer.
- l'activité très faible du promoteur M?rll97 (SEQ.ID16) , mais supérieure à celle obtenue avec la construction pMRT1144 qui ne contient pas de promoteur, indique que la séquence minimale de 96 pb de PrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01) confère un niveau de transcription de base.
- La faible activité de MPri i98 ( EQ. C;1 î ) comparée à celle de MPR1128 (SEQ.ID04) indique que la séquence de
?rHMKG-Dx5 (SEQ.ID01) s'étendant des nucléon ides -59 à -135, bien que dépourvue d'éléments cis-activateurs putatifs, joue un rôle prépondérant dans l'activité du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) . Ce résultat laisse supposer que la fonctionnalité et par conséquent, l'accessibilité des facteurs trans-activateurs sur la boîte G et sur l'élément activateur, dépendent de la distance qui les sépare de la bo-te
?rHMKG-Dx5 (SEQ.ID01) s'étendant des nucléon ides -59 à -135, bien que dépourvue d'éléments cis-activateurs putatifs, joue un rôle prépondérant dans l'activité du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) . Ce résultat laisse supposer que la fonctionnalité et par conséquent, l'accessibilité des facteurs trans-activateurs sur la boîte G et sur l'élément activateur, dépendent de la distance qui les sépare de la bo-te
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TATA.
- La duplication de la séquence de MPR1128 (SEQ.IDC4) s' étendant des nucléotides -136 à -225, laquelle abrite la boîte G et l'élément activateur, confère au promoteur MPr1216
(SEQ.ID21) une activité f3-91ucuronidase au moins aussi élevée que celle dirigée par PrHMWG-Ox5 (SEQ.TD01) . Par contre, la triplication de cette même séquence dans le promoteur MPrl217 (SEQ.ID22) ne présente pas deffet additif supplémentaire. le groupe II renferme les promoteurs, MPrll28, MPrl213 (SEQ.ID20) , MPrll99 (SEQ.ID18) , MPrll36 (SEQ.ID10) , MPr1137 (SEQ.ID11) , MPr1138 (SEQ.ID12) , MPr1131 (SEQ.ID06) , MPrll35 (SEQ.ID09) , MPrll30 (SEQ.ID05) , MPrll39 (SEQ.ID13) , MPrl200 (SEQ.ID19) , le promoteur de référence HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) et le promoteur y-zéïne qui sert de témoin positif (Fig. VII). De la même manière que pour les promoteurs du groupe I, les résultats des dosages luminométriques permettent de dégager plusieurs constatations : - la fusion des séquences activatrices as-2 (Lam et Chua, 1989) et as-1 (Lam et al., 1989) du CaMV 35S, à la
position -65 pb du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.I'O1) et des promoteurs HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) dérivés, pctentiaiise très fortement l'activité des promoteurs MPr1130 (SEQ.ID05) , MPrll31 (SEQ.ID06) , MPrll36 (SEQ.ID10) , MPr1137 (SEQ.ID11) , M?rll35 (SEQ.ID09) et MPrll38 (SEQ.ID12) résultants. A titre indicatif, les promoteurs MPrll31 (SEQ.ID06) et MPrll30 (SEQ.ID05) sont respectivement 3. 2 et 3.8 fois plus actifs que le promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) .
(SEQ.ID21) une activité f3-91ucuronidase au moins aussi élevée que celle dirigée par PrHMWG-Ox5 (SEQ.TD01) . Par contre, la triplication de cette même séquence dans le promoteur MPrl217 (SEQ.ID22) ne présente pas deffet additif supplémentaire. le groupe II renferme les promoteurs, MPrll28, MPrl213 (SEQ.ID20) , MPrll99 (SEQ.ID18) , MPrll36 (SEQ.ID10) , MPr1137 (SEQ.ID11) , MPr1138 (SEQ.ID12) , MPr1131 (SEQ.ID06) , MPrll35 (SEQ.ID09) , MPrll30 (SEQ.ID05) , MPrll39 (SEQ.ID13) , MPrl200 (SEQ.ID19) , le promoteur de référence HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) et le promoteur y-zéïne qui sert de témoin positif (Fig. VII). De la même manière que pour les promoteurs du groupe I, les résultats des dosages luminométriques permettent de dégager plusieurs constatations : - la fusion des séquences activatrices as-2 (Lam et Chua, 1989) et as-1 (Lam et al., 1989) du CaMV 35S, à la
position -65 pb du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.I'O1) et des promoteurs HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) dérivés, pctentiaiise très fortement l'activité des promoteurs MPr1130 (SEQ.ID05) , MPrll31 (SEQ.ID06) , MPrll36 (SEQ.ID10) , MPr1137 (SEQ.ID11) , M?rll35 (SEQ.ID09) et MPrll38 (SEQ.ID12) résultants. A titre indicatif, les promoteurs MPrll31 (SEQ.ID06) et MPrll30 (SEQ.ID05) sont respectivement 3. 2 et 3.8 fois plus actifs que le promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) .
- les séquences activatrices ans-2 et as-1 du CaMV 35S agissent en synergie avec les éléments cis-act ivateurs du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) . La diminution progressive de l'activité des promoteurs MPrll31 (SEQ.ID36) , MPr1138
(SEQ.ID12) , MPrll37 (SEQ.ID11) et MPril36 I D 1 1-ul qui coïncide respectivement avec les délétions 5' progressives du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) en témoigne.
- la comparaison des promoteurs MPrll30 (SEQ.ID05) et MPrll35 (SEQ.ID09) avec les promoteurs MPr1131 (SEQ.ID06) et
(SEQ.ID12) , MPrll37 (SEQ.ID11) et MPril36 I D 1 1-ul qui coïncide respectivement avec les délétions 5' progressives du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) en témoigne.
- la comparaison des promoteurs MPrll30 (SEQ.ID05) et MPrll35 (SEQ.ID09) avec les promoteurs MPr1131 (SEQ.ID06) et
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MFrll33 (Sr'Q.ID12) respect! vénerie , indique que 'La duplication de la séquence activatrice as-2 du CaMV 35S n'engendre pas un effet activateur additif significatif.
- la fusion des boîtes céréales du promoteur du gène de gluténine de haut poids moléculaire codant pour la sous-unité
Bx7 du blé hexaploïde Tri ti cum aestlvum L.cv :nwr,n, (Andersen et al., 1998) en amont des promoteurs :-<?rl' (SEQ.1D06) et MPrll38 (SEQ.ID12) améliore très fortement l'activité des
promoteurs MPrll39 (SEQ.ID13) et 2IPr-rC!0 (SEQ.ID19) résultants. A titre indicatif, l'activité de MPrll39 ,SEQ.ID13) et de MPrl200 (SEQ. ID19) est environ 5.5 fois plus élevée que celle du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.TD01) .
Bx7 du blé hexaploïde Tri ti cum aestlvum L.cv :nwr,n, (Andersen et al., 1998) en amont des promoteurs :-<?rl' (SEQ.1D06) et MPrll38 (SEQ.ID12) améliore très fortement l'activité des
promoteurs MPrll39 (SEQ.ID13) et 2IPr-rC!0 (SEQ.ID19) résultants. A titre indicatif, l'activité de MPrll39 ,SEQ.ID13) et de MPrl200 (SEQ. ID19) est environ 5.5 fois plus élevée que celle du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.TD01) .
- La faible activité du promoteur MPrl213 (SEQ.ID2C) , lequel correspond à la fusion des boites céréales en amont du promoteur MPrll28, laisse suggérer que les boites céréales agissent en synergie avec les séquences activatrices as-2 et as-1 du CaMV 35S pour potentialiser l'activité des promoteurs MPrll39 (SEQ.ID13) et MPrl200 (SEQ.ID19) .
- Enfin, la fusion de l'élément: GC-riche de la région intergénique du virus des stries du mais (MSV) en amont du promoteur MPR1128 (SEQ.ID04) ne contribue pas à augmenter l'activité du promoteur MPr1199 (SEQ.IDlb) résultant. Au contraire, l'élément GC-riche semble conférer un effet légèrement inhibiteur.
En conclusion, les promoteurs MPrll39 (SQ.IDi3) et MPrl200 (SEQ.ID19) étant respectivement et 3,9 fois plus actifs que le promoteur Pry-zéïne, lequel est communément utilisé en biotechnologie végétale pour diriger l'expression des protéines à des taux élevés, sont incontestablement des outils puissants capables d'améliorer le taux d'expression ces protéines hétérologues dans l'albumen de maïs. Par ailleurs, il est à noter que les promoteurs MPrll30 (SEQ.ID05) , MPr1131
(SEQ.ID06) , MPrll35 (SEQ.ID09) , MPrll38 (,2E:Q.ID12) , MPrll37 (SEQ.ID11) et MPrll36 (SEQ. ID10) confèrent une activité de la (3-glucuronidase dans lalbumen de maïs au moins aussi importante
que celle obtenue avec le promoteur Pry-r.éine. Enfin, les
(SEQ.ID06) , MPrll35 (SEQ.ID09) , MPrll38 (,2E:Q.ID12) , MPrll37 (SEQ.ID11) et MPrll36 (SEQ. ID10) confèrent une activité de la (3-glucuronidase dans lalbumen de maïs au moins aussi importante
que celle obtenue avec le promoteur Pry-r.éine. Enfin, les
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promoteurs defficacité moindre sont également Liés [::.t'ô::. éo ô3r: L 5 dans la mesure où ils peuvent être utilisés pour assurer le contrôle de l' expression de gènes de résistance ou de gènes codant pour des protéines enzymatiques.
Exemple 7.
Expression et évaluations de l'activité des différents promoteurs en expression stable dans le maïs et le tabac.
7.1. Transformation génique stable du maïs par Agrobacterium tumefaciens.
La technique utilisée est décrite par Ishida et al.
(Il 996) . Des embryons immatures de 1,0 à ],2 mm de long (9 à 14 jours après pollinisation) ont été lavés dans le milieu LS-inf, puis immergés dans la suspension d'agrobactéries, préparée comme décrit par Ishida et al. (1996), soumis au vortex pendant 30 sec., et incubés à température ambiante pendant 5 min. Les embryons immatures ainsi traités ont été cultivés sur milieu LS-AS à l'obscurité à 25 C pendant 3 jours, puis transférés sur milieu LSD 1,5 supplémenté en phosphinotricine à 5 mg/1 et céfotaxime à 250 mg/1, à l'obscurité à 25 C pendant 2 semaines et enfin, placés sur milieu LSD 1,5 supplémenté en phosphinotricine à 10 mg/1 et céfotaxime à 250 mg/l, à l'obscurité à 25 C pendant 3 semaines. Les cals de type I ainsi générés ont été isolés , fragmentés et transférés sur milieu LSD 1,5 supplémenté en phosphinotricine à 10 mg/l et céfotaxime à 250 mg/l, à l'obscurité à 25 C per.dant 3 semaines. Puis, les cals de type I, qui ont proliféré, ont été isolés et placés sur milieu LSZ supplémenté en phosphinotricine à 5 mg/1 et céfotaxime à 250 mg/1, sous photopériode 16 heures lumière 8 heures obscurité à 25 C pendant 2 à 3 semaines. Les plant aies régénérées ont ensuite été transférées sur milieu LSF sous photopériode 16 heures lumière/ 8 heures obscurité à 25 C pendant 1 à 2 semaines, puis, en phytotron et en serre.
7.2. Transformation génique stable du tabac par Agrobacterium tumefaciens.
La transformation du tabac (Nicotiana tabacum L., du cultivar PBD6) a été réalisée en infectant des disques foliaires
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isolés à partir de plantâtes ce tabac in vitro âgées de 6
semaines par des agrobactéries recombirantes selon la méthode décrite par Horsch et al. (1985).
semaines par des agrobactéries recombirantes selon la méthode décrite par Horsch et al. (1985).
Toutes les cultures in vitro sont réalisées dans une enceinte climatisée dont l'intensité lumineuse est de 200
yE.m-2.s-l, la photopériode de 16 heures lanière b heures obscurité et, la température de 25 C.
Hors mis pour l'étape initiale de coculture, les étapes de régénération, de développement et d'enracinement ont été réalisées sur divers milieux sélectifs supplémentés en bactériostatique, à savoir l'augmentin à 400 mg/l et en agent
sélectif, à savoir la kanamycine à 200 ou 100 rli 1.
yE.m-2.s-l, la photopériode de 16 heures lanière b heures obscurité et, la température de 25 C.
Hors mis pour l'étape initiale de coculture, les étapes de régénération, de développement et d'enracinement ont été réalisées sur divers milieux sélectifs supplémentés en bactériostatique, à savoir l'augmentin à 400 mg/l et en agent
sélectif, à savoir la kanamycine à 200 ou 100 rli 1.
Les différen tes étapes et les milieux utilisés sont les suivants : - Après une préculture des agrobactéries dans 5 ml de milieu 2YT (bacto-tryptone 10 g/1, extrait de levure 5 g/l, NaCl 5 g/1, pH 7,2) supplémenté en CaCl~ 6 mM final et en antibiotiques adéquats à 28 C pendant 48 heures, une culture dans 10 ml de milieu 2YT supplémenté en CaC12 et antibiotiques est réalisée à 28 C pendant une nuit. La culture est ensuite centrifugée à 3000 g pendant 10 min. et les bactéries sont resuspendues dans 10 ml de MS30 liquide (M0404 à 4,4 g/1 commercialisé par SIGMA supplémenté en saccharose 30 g/1, pH 5,7).
- La coculture est réalisée en plaçant les explants foliaires découpés à partir des feuilles des plantules in vitro d'environ
1 cm au contact de la suspension d'agrcba;,tér:es diluée au z dans MS30 liquide pendant 20 min. Puis, les explants ainsi traités sont séchés rapidement sur papier filtre et placés sur un milieu de coculture (MC) solide (MS30, Benzyl Amino Purine
(BAP) à 1 mg/1, Acide Indole-3 Acétique .:ANA) à 0,1 rr.g/ 1 , agar-agar à 8 g/1) pendant 48 heures dans l'enceinte climatisée.
1 cm au contact de la suspension d'agrcba;,tér:es diluée au z dans MS30 liquide pendant 20 min. Puis, les explants ainsi traités sont séchés rapidement sur papier filtre et placés sur un milieu de coculture (MC) solide (MS30, Benzyl Amino Purine
(BAP) à 1 mg/1, Acide Indole-3 Acétique .:ANA) à 0,1 rr.g/ 1 , agar-agar à 8 g/1) pendant 48 heures dans l'enceinte climatisée.
- Les explants traités sont ensuite placés sur un milieu de régénération solide (MC solide, augmentin à 400 mg/l, kanamycine à 200 mg/1). Un repiquage des explants sur le même milieu est effectué après 2 semaines.
- Après 2 semaines, les bourgeons sont repiqués sur un milieu de
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développement solide (M0404 à 4,4 g/1 commercialisé par SIGMA supplémenté en saccharose 20 g/l, pH 5, @ (MS20 liquide),
augmentin à 400 mg/1, kanamycine à 100 mag/1, agar-agar à S g/1}.
augmentin à 400 mg/1, kanamycine à 100 mag/1, agar-agar à S g/1}.
- Après 2 semaines, les plantules transformées sont repiquées sur milieu d'enracinement solide identique au milieu de développement. L'enracinement dure 2 à 3 semaines, au terme duquel les plantules sont sorties au phytotron en pots Giffy pendant 10 jours (photopériode 16 heures lumière 8 heures obscurité, 23 C et 70% d'hygrométrie), puis, passées en serre.
7.3. Mesure de l'activité B-glucuronidase dans les plants de maïs et de tabac.
Pour mesurer l'activité B-gJu2uroniàase, les échantillons prélevés sur les plantes transgéniques ont été congelés à l'azote liquide et broyés à l'aide d'une tige de verre adaptée sur une perceuse. La poudre a ensuite été resuspendue dans du tampon d'extraction (Tris Phosphate 25 mM pH
7,8, Dithiothréitol 2 mM, acide L, 2-..iaminocyclohexane, N,N,N',N'-tétracétique 2 mM, glycérol 10 %, Triton X100 1 %) à raison de 1 ml de tampon pour 250 mg de tissu. Le mélange a été homogénéisé puis incubé pendant 1 h à 4 C avant d'être clarifié par centrifugation pendant 5 min à 16060 g.
7,8, Dithiothréitol 2 mM, acide L, 2-..iaminocyclohexane, N,N,N',N'-tétracétique 2 mM, glycérol 10 %, Triton X100 1 %) à raison de 1 ml de tampon pour 250 mg de tissu. Le mélange a été homogénéisé puis incubé pendant 1 h à 4 C avant d'être clarifié par centrifugation pendant 5 min à 16060 g.
L'activité GUS a été mesurée sur 1C ul d'extrait brut clarifié à l'aide du kit de détection "GUS-Light chemiluminescent reporter gene assay" (Tropix Inc., Bedford, USA) selon les recommandations du fournisseur. La mesure de
l'émission de lumière a été effectuée à l'aide d'un Llmin8mètre Lumat LB 9507 (EGG-Berthold, Bad Wildbad, Allemagne; .
l'émission de lumière a été effectuée à l'aide d'un Llmin8mètre Lumat LB 9507 (EGG-Berthold, Bad Wildbad, Allemagne; .
La quantité de protéine totales présentes dans l'extrait brut a été mesurée selon la technique de Bradford (1976), en
utilisant le réactif "Bio-Rad protein assay" (Bio-Rad, l"ILcc:'"1efl, Allemagne).
utilisant le réactif "Bio-Rad protein assay" (Bio-Rad, l"ILcc:'"1efl, Allemagne).
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Référer.ces citées
Anderson O.D., Green F.C., Yip R.f., Hallord K.G., Shewry P.R. and Malpica-Rcmero J-M. (1989). Nucleotide séquences of the teo high-molecular-weight glutenin genes from the D-genome of a hexaploid bread wheat, Triticum aestivum L. acv Cheyenne. Nucleie Acids Research 17, 461-462.
Anderson O.D., Green F.C., Yip R.f., Hallord K.G., Shewry P.R. and Malpica-Rcmero J-M. (1989). Nucleotide séquences of the teo high-molecular-weight glutenin genes from the D-genome of a hexaploid bread wheat, Triticum aestivum L. acv Cheyenne. Nucleie Acids Research 17, 461-462.
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Claims (35)
- [REVENDICATIONS] 1) Promoteur chimérique d'expression comprenant au moins une séquence d'acide nucléique dérivée d'un gène codant pour une gluténine à haut poids moléculaire de blé.
- 2) Promoteur chimérique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence d'acide nucléique dérivée du gène Dx5 ou Bx7de blé codant pour une glutens ne à haut poids moléculaire de blé.
- 3) Promoteur chimérique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence d'acide nucléique dérivée d'un gène codant pour une gluténine à haut poids moléculaire de blé, dont la séquence est identifiée sous le numéro SEQ.ID01.
- 4) Promoteur chimérique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence d'aciae nucléique dérivée d'un gène codant peur une gluténine à haut poids moléculaire de blé consiste en une choisie dans le groupe consistant en les séquences identifiées sous les numéros
SEQ.ID02, SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, S'Q.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID08, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ.ID12, SEQ.ID13,SEQ. ID16, SEQ. ID17, SEQ.ID18, SEQ.ID19, et SEQ.ID20, SEQ.ID21 et SEQ.ID22. - 5) Promoteur chimérique d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique dérivée d'un gène codant pour une gluténine à haut poids moléculaire de blé comprenant en 3' une boîte "TATA" et un site d'initiation (+1) de la transcription.
- 6) Promoteur chimérique d'expression selon la revendicat ion 5, caractérisé en ce qu'il comporte en outre au moins une boîte "enhancer" liée de manière fonctionnelle en 5' en amont de la boîte "TATA" et le site d'initiation (+1) de la transcription.
- 7) Promoteur chimérique d'expression selon l'une quelconque de la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une boîte "G-li::e", liée de<Desc/Clms Page number 67>manière fonctionnelle en 3' en amont de 1 boîte "enhancer" .
- 8) Promoteur chimérique d'expression selon L'une quelconque des revendications 6 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une boite "P-ike", liée de manière fonctionnelle en 5' en amont d'au moins la boîte "enhancer".
- 9) Promoteur chimérique d'expression se' 011 l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une boîte "GATA" liée de manière fonctionnelle en 5' en amont d'au moins la boite "enhancer".
- 10) Promoteur chimérique d'expression selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérise en ce qu'il comprend en outre au moins une boîte céréale, liée de manière fonctionnelle en 5' en amont de la boite "enhancer".
- 11) Promoteur chimérique selcn la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend deux boîtes "céréale" contiguës liées de manière fonctionnelle en 5' en amont de la boîte "enhancer".
- 12) Promoteur chimérique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une boîte "as1", ou au moins un boîte "as2" ou une combinaison de boites "asl/as2", "as2/asl", ou des permutations répétées de celles-ci, liées de manière fonctionnelle en 5' an amont du site d' initiation de la transcription.
- 13) Promoteur chimérique selon la revendication 12, caractérisé en ce que la ou les boîtes "as1", "as2", "asl/as2" ou "as2/asl" ou ses permutations répétées, est liée de manière fonctionnelle en aval en 8' de la boîte enhancer.
- 14) Promoteur chimérique selon l'une quelconque des revendications 6 à 13 précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une boîte "GC riche" liée ce manière fonctionnelle en amont de la boîte "enhancer".<Desc/Clms Page number 68>
- 15) Frondeur chimérique selon l'une quelconque des revendications 6 à 14 précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend deux boîtes "céréales", liées de manière fonctionnelle en 5' en amont de la boîte "enhancer, elle-même liée de manière fonctionnelle en 5' en amont d'une boite "as2/asl".
- 16) Promoteur chimérique selon ~'une quelconque des revendications 5 à 15 précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un él ément choisi parmi le groupe
consistant en une boîte "enhancer", une b, L t e "(':;-1 i ke", une boîte "P-like", une boîte "GATA", une boîte "céréale", une boîte "asi", une boîte "as2" et/ou une combinaison de boîtes asl/as2 ou "as2/asl", éventuellement répétées, et une boîte "GC riche", liée de manière fonctionnelle, en sens inverse, et/ou en aval en 3', du site d'initiation de la transcription. - 17) Promoteur chimérique selon l'une quelconque des revendications 6 à 16 précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence choisie parmi le groupe
consistant en SEQ.ID02, SEQ.CD03, SEQ.DC4, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID08, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11,
SEQ.ID12, SEQ.ID13, SEQ.ID16, SEQ.ID17, SJQ.1P8, SEQ.ID19, SEQ.ID20, SEQ.ID21 et SEQ.ID22. - 18) Cassette d'expression comprenant au moins une séquence d'acide nucléique dérivée d'un gène codant pour une gluténine à haut poids moléculaire de blé, liée de manière opérationnelle à une séquence d'acide nucléique à exprimer codant pour un polypeptide à produire, elle même liée à une séquence d'acide nucléique de terminaison de transcription.
- 19) Cassette d'expression selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence d'acide nucléique dérivée d'un gène codant pour une gluténine à haut poids moléculaire de blé, dont la séquence est identifiée sous le numéro SEQ.ID01.
- 20) Cassette d'expression selon la revendication 18 caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique<Desc/Clms Page number 69>SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID08, S,Q.ID09, SEQ.ID1C, SEQ.ID11, SEQ.ID12, SEQ.ID13, SEQ.7D16, SF:Q.ID17, 2EQ,ID1S, SEQ.ID19, SEQ.ID20, SEQ.ID21 et SEQ. lI)?22.
dérivée d'un gène cédant pour une glutens ne à haut poids moléculaire de blé consiste en au moins une séquence choisie dans le groupe consistant en les séquences identifiées sous les numéros SEQ.ID02, SEQ.ID03, SEQ.ID04, - 21) Séquence d'acide nucléique promotrice isolée, caractérisée en ce qu'elle correspond à une séquence dérivée de la séquence identifiée sous le numéro SEQ.ID01.
- 22) Séquence d'acide nucléique promotrice isolée, caractérisée en ce qu'elle correspond à une séquence choisie dans le groupe consistant en les séquences identifiées sous les numéros SEQ.IDC2, SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID08, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ.ID12, SEQ.ID13, SEQ.ID16, SEQ.ID17, SEQ.ID18, SEQ.ID19, SEQ.ID20, SEQ.ID21 et SEQ.ID22.
- 23) Vecteur comprenant un promoteur, ou une séquence d'acide nucléique promotrice, capable d'initier la transcription d'une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide à produire, caractérisé en ce que le promoteur ou la séquence d'acide nucléique promotrice correspond à un promoteur ou à une séquence d'acide nucléique promotrice selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 ou 21 ou 22.
- 24) Vecteur se-on la revendication 23, caractérise en ce qu'il est choisi dans le groupe consistant: en les vecteurs
binaires identifiés sous les numéros pMRT12c7, pMR'11177, pMRT1178, pMRT1179, pMRT1180, et pMRT1181. - 25) Plante transgénique ayant intégré de manière stable dans son génome au moins un promoteur ou au moins une séquence d'acide nucléique promotrice selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 ou 21 ou 22 respectivement.
- 26) Plante transgénique selon la revendication 25, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les espèces<Desc/Clms Page number 70>Jicutylédcaes, telles que la :::OLT.e de Lei le Ubac, le coton, la laitue, la tomate, le melon, le concombre, le pois, le colza, la betterave, ou le tournesol, ou les espèces monocotylédones, telles que le blé, l'orge, l'avoine, le riz, ou le maïs.
- 27) Propagule d' une plante transgénique selon l'une quelconque des revendications 25 ou 26.
- 28) Propagule d'une plante transgénique selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elle est une semence.
- 29) Cellule contenant un promoteur ou une séquence d'acide nucléique promotrice selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 ou 21 ou 22 respectivement.
- 30) Cellule selon la revendication 29, caractérisée en ce qu'elle est une cellule végétale.
- 31) Méthode d'expression d'une séquence a'acide nucléique, ou gène, codant pour un polypeptide à produire, dans une cellule, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à : - transformer la cellule avec un vecteur comprenant: au moins un promoteur ou au moins une séquence d'acide nucléique promotrice selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 ou 21 à 22 ; - faire une culture de la cellule dans des conditions permettant l'expression de la séquence d'acide nucléique, ou gène, codant pour le polypeptide.
- 32) Méthode selon la revendication 31, caractérisée en ce que la cellule est une cellule procaryote ou eucaryote.
- 33) Méthode selon l'une quelconque des revendications 31 ou 32, caractérisée en ce que la cellule est une cellule choisie dans le groupe consistant en les cellules microbiennes, les cellules fongiques, les cellules d'insectes, les cellules animales, et les cellules végétales.
- 34) Méthode selon l'une quelconque des revendications 31 à 33, caractérisée en ce que la cellule est ,.ne cellule<Desc/Clms Page number 71>végétale.
- 35) Méthode d'obtention d'une plante transgénique selon l'une quelconque des revendications 25 ou 26, ou d'une propagule selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à : - transformer une cellule végétale avec un vecteur comprenant au moins un promoteur ou au moi ns une séquence d'acide nucléique promotrice selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 ou 21 ou 22 ; - sélectionner la cellule végétale ayant intégré le promoteur ou la séquence d'acide nucléique promotrice ; - propager la cellule végétale transformée et sélectionnée, soit en culture, soit par régénération de plantes entières chimériques ou transgéniques.
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