FR2778408A1 - FLUORESCENT RECOMBINANT ANTIBODIES - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objets de nouveaux anticorps recombinants essentiellement caractérises par le fait que lesdits anticorps contiennent au moins un domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène et au moins un domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence, l'ADN codant pour ces anticorps, les cellules hôtes transformées par ce vecteur, un procédé de production de ces anticorps recombinants et leur utilisation en immunofluorescence.The present invention relates to novel recombinant antibodies, essentially characterized in that said antibodies contain at least one protein domain allowing the recognition of an antigen and at least one protein domain allowing the emission of a fluorescence signal, the DNA encoding these antibodies, the host cells transformed with this vector, a process for producing these recombinant antibodies and their use in immunofluorescence.
Description
Anticorps recombinants fluorescents La présente invention a pour objet deThe object of the present invention is to
nouveaux anticorps recombinants fluorescents, un procédé de production de ces anticorps new fluorescent recombinant antibodies, a process for producing these antibodies
ainsi que leur utilisation en immunofluorescence. as well as their use in immunofluorescence.
La plupart des tests rapides de diagnostic de molécules biologiques ou chimiques sont effectués à l'aide d'anticorps dont la specificité de reconnaissance permet de prouver la présence du produit recherché appelé antigène ou haptène. Les anticorps sont des protéines ou immunoglobulines, fabriquées par les cellules lymphocytaires B chez les mammifères et permettent au système immunitaire de reconnaître et d'éliminer les antigènes. La force d'interaction des anticorps avec leur cible est un élément-clé de ce processus. De plus, la diversité des anticorps produits par les cellules B est de l'ordre de 107 chez un individu non immunisé, ce qui traduit une quasi-infinie Most rapid diagnostic tests for biological or chemical molecules are carried out using antibodies whose specificity of recognition makes it possible to prove the presence of the desired product called antigen or hapten. Antibodies are proteins or immunoglobulins, made by B cells in mammals and which allow the immune system to recognize and eliminate antigens. The strength of interaction of antibodies with their target is a key element in this process. In addition, the diversity of antibodies produced by B cells is around 107 in an unimmunized individual, which translates to almost infinite
possibilité de reconnaissance d'antigènes à l'aide de ces molécules. possibility of recognition of antigens using these molecules.
Ces propriétés, associées à celle de la possibilité d'immortalisation de cellules B produisant des immunoglobulines de spécificité donnée (Kôhler G. & C. Milstein (1975) Nature 256, 495-497), font des anticorps un outil de choix pour réaliser in vitro des tests très sensibles de dépistage d'antigènes, généralement noyés dans une soupe biologique. Les tests courants (ELISA, western blot, immunocytochimrnie, immunofluorescence...) font ainsi appel à l'utilisation de deux types d'anticorps: des anticorps de spécificité These properties, combined with that of the possibility of immortalization of B cells producing immunoglobulins of given specificity (Kôhler G. & C. Milstein (1975) Nature 256, 495-497), make antibodies a tool of choice for achieving in in vitro very sensitive tests to detect antigens, generally drowned in an organic soup. Current tests (ELISA, western blot, immunocytochemistry, immunofluorescence ...) thus call for the use of two types of antibodies: specificity antibodies
précise pour la reconnaissance de l'antigène et des anticorps anti- accurate for recognition of antigen and anti
immunoglobulines contenant un marqueur qui permettent de visualiser de façon indirecte la formation du complexe antigène-anticorps (Harlow E. & D.P. Lane (1989) "Antibodies: a Laboratory Manual", cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Ces tests, dits indirects, nécessitent toujours deux étapes d'incubation et présentent une bien meilleure sensibilité que ceux, dits directs, réalisés à l'aide d'un lot unique d'anticorps à la fois marqué in vitro et capables de fixer l'antigène car le marquage chimique altère de façon immunoglobulins containing a marker which allow indirect visualization of the formation of the antigen-antibody complex (Harlow E. & D.P. Lane (1989) "Antibodies: a Laboratory Manual", cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). These tests, called indirect, always require two stages of incubation and have a much better sensitivity than those, called direct, carried out using a single batch of antibodies both labeled in vitro and capable of fixing the antigen because chemical labeling alters so
très variable la réactivité des anticorps. the reactivity of the antibodies is very variable.
Les anticorps peuvent être maintenant produits à faible taux de façon recombinante à l'aide de bactéries de type Escherichia coli (E.coli) sous la forme de fragments Fab ou fragments simple-chaîne (scFv) contenant les domaines protéiques nécessaires et suffisants à la fixation de l'antigène. En effet, le clonage des ADNc de ces segments variables des anticorps permet, après insertion de leur séquence nucléotidique dans un vecteur d'expression procaryote, de sélectionner Antibodies can now be produced recombinantly at low levels using bacteria of the Escherichia coli (E.coli) type in the form of Fab fragments or single-chain fragments (scFv) containing the protein domains necessary and sufficient for fixation of the antigen. Indeed, the cloning of the cDNAs of these variable segments of the antibodies makes it possible, after insertion of their nucleotide sequence into a prokaryotic expression vector, to select
par criblage des colonies bactériennes exprimant la spécificité voulue. by screening for bacterial colonies expressing the desired specificity.
Cette approche de fabrication de fragments d'anticorps peut être avantageusement utilisée pour produire par fusion génétique des molécules directement marquées soit avec une enzyme, soit à la biotine et ce, sans perte apparente de capacité de liaison à l'antigène (Weiss E. & G. Orfanoudakis (1994) J. Biotechnol. 33, 43-53, Weiss This approach of manufacturing antibody fragments can be advantageously used to produce, by genetic fusion, directly labeled molecules either with an enzyme or with biotin, without any apparent loss of antigen-binding capacity (Weiss E. & G. Orfanoudakis (1994) J. Biotechnol. 33, 43-53, Weiss
E., J. Chatellier & G. Orfanoudakis (1995) Prot. Exp. & Purif. 5,509- E., J. Chatellier & G. Orfanoudakis (1995) Prot. Exp. & Purif. 5.509-
517). Ces fragments d'anticorps bifonctionnels recombinants permettent ainsi de réaliser des tests de diagnostic présentant une seule étape d'incubation. Néanmoins, l'utilisation d'enzymes requiert l'introduction de substrats spécifiques à ces enzymes et des étapes de lavage après chaque incubation, sources de longues manipulations supplémentaires. De plus, le taux de production de tels immunoconjugués recombinants chez E. coli reste faible. Leur utilisation dans les tests de diagnostic actuels est en conséquence 517). These fragments of recombinant bifunctional antibodies thus make it possible to carry out diagnostic tests having a single incubation step. However, the use of enzymes requires the introduction of specific substrates for these enzymes and washing steps after each incubation, sources of additional long manipulations. In addition, the rate of production of such recombinant immunoconjugates in E. coli remains low. Their use in current diagnostic tests is therefore
limitée.limited.
Le demandeur, après de longues recherches, a maintenant découvert de nouveaux immunoconjugués ou anticorps recombinants The applicant, after extensive research, has now discovered new recombinant immunoconjugates or antibodies
ne présentant pas les inconvénients ci-dessus mentionnés. not having the above-mentioned drawbacks.
En effet, ces nouveaux immunoconjugués permettent d'effectuer des tests de diagnostic nécessitant une seule étape d'incubation et présentant une sensibilité de détection comparable à celle de la méthode indirecte. De plus, l'utilisation de ces immunoconjugués permet d'éviter, lors de leur révélation, l'apport dc substrats supplémentaires et les étapes de lavage après chaque incubation. La demanderesse a également découvert, de façon surprenante, que ces anticorps pouvaient être produits à un taux de production au moins aussi important, sinon plus important que celui Indeed, these new immunoconjugates make it possible to carry out diagnostic tests requiring a single incubation step and having a detection sensitivity comparable to that of the indirect method. In addition, the use of these immunoconjugates makes it possible to avoid, when they are revealed, the addition of additional substrates and the washing steps after each incubation. The Applicant has also surprisingly discovered that these antibodies can be produced at a production rate at least as great, if not greater, than that
des immunoconjugués produits jusqu'alors. immunoconjugates produced so far.
Un objet de l'invention est donc constitué par de nouveaux An object of the invention therefore consists of new
anticorps recombinants fluorescents. fluorescent recombinant antibodies.
D'autres objets de l'invention sont aussi l'ADN codant pour ces nouveaux anticorps recombinants, un vecteur contenant cet ADN Other objects of the invention are also the DNA coding for these new recombinant antibodies, a vector containing this DNA.
tout comme des cellules hôtes transformées par ce vecteur. just like host cells transformed by this vector.
Un autre objet de l'invention est constitué par un procédé de Another object of the invention is constituted by a method of
production d'anticorps recombinants fluorescents. production of fluorescent recombinant antibodies.
L'invention a encore pour objet l'utilisation de ces anticorps recombinants fluorescents en immunofluorescence et un procédé de Another subject of the invention is the use of these fluorescent recombinant antibodies in immunofluorescence and a method for
détection les mettant en oeuvre.detection implementing them.
D'autres objets de l'invention apparaîtront à la lecture de la Other objects of the invention will appear on reading the
description et des exemples qui suivent. description and examples which follow.
L'anticorps recombinant de la présente invention est essentiellement caractérisé par le fait que ledit anticorps contient au moins un domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène et au moins un domaine protéique permettant l'émission d'un The recombinant antibody of the present invention is essentially characterized in that said antibody contains at least one protein domain allowing the recognition of an antigen and at least one protein domain allowing the emission of a
signal de fluorescence.fluorescence signal.
Le domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène peut notamment correspondre à des fragments d'immunoglobulines contenant les domaines protéiques nécessaires à la fixation de l'antigène. Ces derniers peuvent, par exemple, correspondre à un fragment scFv, qui correspond à une protéine de fusion entre le domaine VH, partie variable de la chaîne lourde, (partie N-terminale) et le domaine VL, partie variable de la chaîne légère, The protein domain allowing the recognition of an antigen can in particular correspond to fragments of immunoglobulins containing the protein domains necessary for the binding of the antigen. The latter can, for example, correspond to a scFv fragment, which corresponds to a fusion protein between the VH domain, variable part of the heavy chain, (N-terminal part) and the VL domain, variable part of the light chain,
(partie C-terminale) d'un anticorps monoclonal. (C-terminal part) of a monoclonal antibody.
Un autre exemple de domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène est un fragment Fab (fragment antigen binding) obtenu lors du clivage de la molécule d'immunoglobuline notamment par la papaine. Le fragment Fab est constitué par une chaîne légère et par une des deux moitiés de la chaîne lourde de l'immunoglobuline. Les domaines protéiques permettant la reconnaissance d'un antigène préférentiellement utilisés dans le cadre de la présente Another example of a protein domain allowing the recognition of an antigen is an Fab fragment (antigen binding fragment) obtained during the cleavage of the immunoglobulin molecule, in particular by papain. The Fab fragment consists of a light chain and one of the two halves of the heavy chain of the immunoglobulin. The protein domains allowing the recognition of an antigen preferentially used within the framework of the present
invention sont les fragments scFv.invention are the scFv fragments.
Le domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence peut correspondre à toute protéine pouvant émettre de la lumière lorsqu'elle reçoit un rayonnement. Cette protéine peut, par exemple, être une protéine clonée à partir de la méduse Aequorea victoria qui peut conserver ses propriétés de fluorescence naturelle lorsqu'exprimée dans des bactéries (Chalfie M., Y. Tu, G. Euskirchen, W. Ward & D.C. Prasher (1994) Science 263, 802-805; Inouye S. & F.I. Tsuji (1994) FEBS Lett. 341, 277-280). En effet, des bactéries surexprimant cette protéine et illuminées en lumière bleue ou par des rayons ultra-violets (UV) émettent un intense signal de fluorescence verte. Cette protéine, appelée green fluorescent protein (GFP), a été The protein domain allowing the emission of a fluorescence signal can correspond to any protein capable of emitting light when it receives radiation. This protein can, for example, be a protein cloned from the jellyfish Aequorea victoria which can retain its natural fluorescence properties when expressed in bacteria (Chalfie M., Y. Tu, G. Euskirchen, W. Ward & DC Prasher (1994) Science 263, 802-805; Inouye S. & FI Tsuji (1994) FEBS Lett. 341, 277-280). Indeed, bacteria overexpressing this protein and illuminated in blue light or by ultraviolet (UV) rays emit an intense green fluorescence signal. This protein, called green fluorescent protein (GFP), has been
depuis sa première description essentiellement utilisée pour des études since its first description mainly used for studies
de localisation et de trafic intracellulaires, à la fois chez les localization and intracellular traffic, both in
procaryotes et les eucaryotes.prokaryotes and eukaryotes.
Ce domaine protéique peut également correspondre à des GFP provenant d'autres méduses ou à des variants de la GFP tels que la GFPuv (Crameri A., E.A.Whitehorn, E. Tate & W.P.C. Stemmer (1996) Nature Biotechnol 14,315-319) ou à une GFP mutée. Au sens de la présente invention, une GFP mutée correspond à: - un mutant de la GFP dont les propriétés de fluorescence de la GFP sont améliorées. De tels mutants peuvent notamment correspondre à la GFP dans laquelle la sérine (Ser 65) du chromophore a été substituée par une thréonine permettant d'obtenir une GFP présentant une fluorescence six fois plus intense, une résistance accrue à la photolyse et une insensibilité à la photoisomérisation; - un mutant de la GFP dont le spectre d'absorption et/ou d'émission est déplacé vers d'autres longueurs d'ondes; par exemple une GFP mutée, dont la tyrosine 66 de la GFP a été substituée par une histidine émet une fluorescence bleue. Un autre exemple de mutant correspond à la GFP dans laquelle la thréonine 203 a été remplacée par la tyrosine, mutant qui émet alors une lumière jaune d'une longueur d'onde supérieure à 520 nanomètres; - un mutant de la GFP dont la séquence nécessaire à l'expression de la protéine a été améliorée, tel que par exemple, la protéine appelée hRGP (humanized, red shifted green fluorescent protein) obtenue en modifiant certains codons de la GFP, mieux This protein domain can also correspond to GFPs originating from other jellyfish or to variants of GFPs such as GFPuv (Crameri A., EAWhitehorn, E. Tate & WPC Stemmer (1996) Nature Biotechnol 14,315-319) or a mutated GFP. Within the meaning of the present invention, a mutated GFP corresponds to: - a GFP mutant whose fluorescence properties of GFP are improved. Such mutants can in particular correspond to GFP in which the serine (Ser 65) of the chromophore has been substituted with a threonine making it possible to obtain a GFP having a fluorescence six times more intense, an increased resistance to photolysis and an insensitivity to photoisomerization; - a GFP mutant whose absorption and / or emission spectrum is shifted to other wavelengths; for example a mutated GFP, in which the tyrosine 66 of GFP has been replaced by a histidine emits a blue fluorescence. Another example of a mutant corresponds to GFP in which threonine 203 has been replaced by tyrosine, a mutant which then emits yellow light with a wavelength greater than 520 nanometers; - a GFP mutant whose sequence necessary for the expression of the protein has been improved, such as for example, the protein called hRGP (humanized, red shifted green fluorescent protein) obtained by modifying certain codons of GFP, better
traduite que la GFP dans les cellules humaines. translated as GFP in human cells.
Ce domaine protéique peut également comprendre d'autres protéines associées à la protéine fluorescente comme par exemple une This protein domain can also include other proteins associated with the fluorescent protein such as for example a
photoprotéine telle que l'aéquorine. photoprotein such as aequorin.
Dans le cadre de la présente invention, la GFPuv est préférentiellement utilisée comme domaine protéique permettant In the context of the present invention, GFPuv is preferably used as a protein domain allowing
l'émission d'un signal de fluorescence. the emission of a fluorescence signal.
Un peptide de jonction peut relier le domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène et le domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence. Ce peptide doit notamment permettre de faciliter la formation post-traductionnelle du domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène et du A junction peptide can link the protein domain allowing the recognition of an antigen and the protein domain allowing the emission of a fluorescence signal. This peptide should in particular make it possible to facilitate the post-translational formation of the protein domain allowing the recognition of an antigen and of
domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence. protein domain allowing the emission of a fluorescence signal.
Ce peptide de jonction peut notamment correspondre à un peptide de 5 This junction peptide can in particular correspond to a peptide of 5
à 30 acides aminés et plus particulièrement de 10 à 20 acides aminés. with 30 amino acids and more particularly with 10 to 20 amino acids.
Un peptide de jonction préféré de la présente invention est le peptide de séquence suivante: A preferred junction peptide of the present invention is the peptide of the following sequence:
ADAAPTVTSEDPRVPVEK.ADAAPTVTSEDPRVPVEK.
Les domaines protéiques et les peptides modifiés, comme par exemple par une substitution, délétion ou insertion ne modifiant pas ou améliorant les fonctions des peptides ou des protéines, par exemple de façon à augmenter la stabilité ou de favoriser le repliement Protein domains and modified peptides, such as for example by a substitution, deletion or insertion which do not modify or improve the functions of the peptides or proteins, for example so as to increase stability or promote folding
fonctionnel, sont aussi compris dans le cadre de la présente invention. functional, are also included in the context of the present invention.
Dans une forme de réalisation préférée de la présente invention, le peptide de jonction relie l'extrémité C-terminale du domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène à l'extrémité N- terminale du domaine protéique permettant l'émission In a preferred embodiment of the present invention, the junction peptide connects the C-terminal end of the protein domain allowing recognition of an antigen to the N-terminal end of the protein domain allowing the emission
d'un signal de fluorescence.of a fluorescence signal.
La présente invention a aussi pour objet une séquence d'ADN The present invention also relates to a DNA sequence
codant pour un anticorps recombinant fluorescent tel que défini ci- encoding a fluorescent recombinant antibody as defined above
dessus. Cette séquence d'ADN comprend notamment les séquences codantes pour le domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène, le domaine protéique permettant l'émission d'un signal de above. This DNA sequence comprises in particular the coding sequences for the protein domain allowing the recognition of an antigen, the protein domain allowing the emission of a signal of
fluorescence et pour le peptide de jonction. fluorescence and for the junction peptide.
La séquence codante pour un domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène peut correspondre à la séquence codante des domaines protéiques permettant la reconnaissance d'un antigène tels que décrits ci-dessus. Elle peut par exemple correspondre à The coding sequence for a protein domain allowing the recognition of an antigen can correspond to the coding sequence of the protein domains allowing the recognition of an antigen as described above. It can for example correspond to
l'ADNc d'un fragment Fab ou scFv.the cDNA of a Fab or scFv fragment.
La séquence codante pour un domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence peut correspondre à la séquence codante de l'un quelconque des domaines protéiques permettant The coding sequence for a protein domain allowing the emission of a fluorescence signal can correspond to the coding sequence of any of the protein domains allowing
l'émission d'un signal de fluorescence tels que décrits ci-avant. the emission of a fluorescence signal as described above.
Ces deux séquences codantes peuvent également être modifiées de façon à faciliter la formation post-traductionnelle des These two coding sequences can also be modified in order to facilitate the post-translational training of
domaines protéiques correspondants. corresponding protein domains.
Ces séquences peuvent être directement accolées ou reliées These sequences can be directly joined or linked
entre elles par des séquences de jonction. between them by junction sequences.
Au sens de la présente invention, les séquences d'ADN codantes comprennent aussi les séquences dégénérées, les variants alléliques et les séquences mutées qui ne modifient pas ou qui améliorent les fonctions des séquences peptidiques codées, par exemple de façon à permettre d'augmenter la production des anticorps recombinants, d'augmenter leur stabilité ou de favoriser leur Within the meaning of the present invention, the coding DNA sequences also include degenerate sequences, allelic variants and mutated sequences which do not modify or which improve the functions of the coded peptide sequences, for example so as to make it possible to increase the production of recombinant antibodies, increase their stability or promote their
repliement fonctionnel.functional folding.
Ces modifications de la séquence d'ADN peuvent être These changes in DNA sequence can be
effectuées en utilisant des techniques connues de l'homme du métier. performed using techniques known to those skilled in the art.
De même, les techniques de mutation sont connues de l'homme du métier. Un autre objet de l'invention est aussi un vecteur contenant une séquence d'ADN codant pour un anticorps recombiné telle que définie ci- dessus et un promoteur de transcription permettant d'induire Likewise, mutation techniques are known to those skilled in the art. Another subject of the invention is also a vector containing a DNA sequence coding for a recombinant antibody as defined above and a transcription promoter making it possible to induce
l'expression de cette séquence d'ADN dans une cellule hôte. expression of this DNA sequence in a host cell.
La séquence d'ADN comprenant l'information génétique nécessaire pour l'expression des anticorps de la présente invention peut être comprise dans tout vecteur couramment utilisé par l'homme du métier. Ce vecteur pourra être adapté en fonction des cellules, eucaryotes ou procaryotes, dans lesquelles la production d'anticorps The DNA sequence comprising the genetic information necessary for the expression of the antibodies of the present invention can be included in any vector commonly used by those skilled in the art. This vector can be adapted according to the cells, eukaryotic or prokaryotic, in which the production of antibodies
est effectuée.is done.
Préférentiellement, pour les procaryotes, ce vecteur est un plasmide comprenant au moins une origine de réplication et un gène Preferably, for prokaryotes, this vector is a plasmid comprising at least one origin of replication and a gene
marqueur permettant de sélectionner les cellules recombinées. marker for selecting recombinant cells.
Préférentiellement, pour les cellules eucaryotes, ce vecteur comporte un gène marqueur permettant de sélectionner les cellules Preferably, for eukaryotic cells, this vector comprises a marker gene making it possible to select the cells
recombinées et, facultativement, une origine de réplication eucaryote. recombinant and, optionally, an origin of eukaryotic replication.
De tels vecteurs sont, par exemple le vecteur pcDNA/Amp, commercialisé par la société In Vitrogen, qui comporte l'origine de réplication du virus SV40 et une cassette de clonage permettant d'insérer le gène d'intérêt en aval du promoteur fort hCMV (human cytomegalovirus). D'autres vecteurs, dont les divers éléments génétiques nécessaires à la réplication et à la transcription sont issus d'SV40 (pZeoSV, pSG5), du virus d'Epstein-Barr (pREP), du virus du sarcome de rous (pRc/RSV), du MMTV (pMAMneo) peuvent aussi être Such vectors are, for example the vector pcDNA / Amp, sold by the company In Vitrogen, which comprises the origin of replication of the SV40 virus and a cloning cassette making it possible to insert the gene of interest downstream of the strong promoter hCMV (human cytomegalovirus). Other vectors, including the various genetic elements necessary for replication and transcription, come from SV40 (pZeoSV, pSG5), Epstein-Barr virus (pREP), sarcoma virus (pRc / RSV) ), MMTV (pMAMneo) can also be
utilisés dans le cadre de la présente invention. used in the context of the present invention.
Les vecteurs utilisables dans le cadre de la présente invention comporteront notamment un promoteur de transcription en amont des séquences codantes. Ces promoteurs de transcription sont couramment utilisés par l'homme du métier et sont, par exemple, les promoteurs The vectors which can be used in the context of the present invention will in particular comprise a promoter for transcription upstream of the coding sequences. These transcription promoters are commonly used by those skilled in the art and are, for example, promoters
arabinose ou lactose.arabinose or lactose.
Un objet de l'invention est également une cellule hôte An object of the invention is also a host cell
transformée avec un vecteur tel que défini ci-dessus. transformed with a vector as defined above.
Les cellules procaryotes ou eucaryotes pouvant être utilisées dans le cadre de l'invention sont des cellules dans lesquelles il est possible d'exprimer l'information génétique décrite ci-dessus et dans lesquelles la formation post-traductionnelle du domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène et du domaine protéique The prokaryotic or eukaryotic cells which can be used within the framework of the invention are cells in which it is possible to express the genetic information described above and in which the post-translational formation of the protein domain allowing the recognition of antigen and protein domain
permettant l'émission d'un signal de fluorescence est possible. allowing the emission of a fluorescence signal is possible.
Comme cellules procaryotes, on peut citer, entre autres, les cellules d'E.coli, de Bacillus subtilis ou les souches non pathogènes de As prokaryotic cells, mention may be made, inter alia, of E. coli cells, of Bacillus subtilis or non-pathogenic strains of
Salmonella ou de Staphylococcus.Salmonella or Staphylococcus.
Comme cellules eucaryotes, on peut notamment citer les As eukaryotic cells, mention may in particular be made of
cellules CHO ou COS.CHO or COS cells.
Dans le cadre de la présente invention, les cellules procaryotes sont préférentiellement utilisées, et plus In the context of the present invention, prokaryotic cells are preferably used, and more
préférentiellement celles d'E. coli. preferably those of E. coli.
Un autre objet de l'invention consiste en un procédé de production d'anticorps recombinants tel que défini ci-dessus essentiellement caractérisé en ce qu'il consiste à introduire dans des cellules procaryotes ou eucaryotes l'information génétique nécessaire pour l'expression desdits anticorps comprenant au moins une séquence codante pour un domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène et une séquence codante pour un domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence, lesdites séquences étant en amont d'un promoteur de transcription, puis à induire Another object of the invention consists in a process for producing recombinant antibodies as defined above, essentially characterized in that it consists in introducing into prokaryotic or eukaryotic cells the genetic information necessary for the expression of said antibodies comprising at least one coding sequence for a protein domain allowing the recognition of an antigen and a coding sequence for a protein domain allowing the emission of a fluorescence signal, said sequences being upstream of a transcription promoter, then at induce
l'expression desdits anticorps et à isoler ces derniers. the expression of said antibodies and to isolate the latter.
Pour introduire dans ces cellules l'information génétique telle que définie ci-dessus, il est par exemple possible de les transformer par électroporation. Il est aussi possible d'effectuer une transformation To introduce genetic information into these cells as defined above, it is for example possible to transform them by electroporation. It is also possible to perform a transformation
par la méthode au Ca C12.by the Ca C12 method.
Conformément au procédé de la présente invention, l'expression des anticorps recombinants fluorescents de l'invention peut être intracellulaire ou extracellulaire. Le choix du site d'expression se fera de manière à obtenir des domaines protéiques actifs et de façon à obtenir un taux de production des anticorps optimal. Le choix du site d'expression des anticorps pourra être contrôlé en introduisant dans l'information génétique ou en y délétant des séquences signal connues de l'homme du métier codant pour un peptide - signal permettant d'exporter dans le milieu extracellulaire les According to the process of the present invention, the expression of the fluorescent recombinant antibodies of the invention can be intracellular or extracellular. The choice of the expression site will be made so as to obtain active protein domains and so as to obtain an optimal antibody production rate. The choice of the antibody expression site can be controlled by introducing into the genetic information or by deleting therein signal sequences known to those skilled in the art coding for a peptide - signal making it possible to export to the extracellular medium.
anticorps recombinants.recombinant antibodies.
Lorsque les anticorps de la présente invention sont produits par des cellules eucaryotes ou procaryotes, notamment d'E. coli, When the antibodies of the present invention are produced by eukaryotic or prokaryotic cells, in particular of E. coli,
l'expression desdits anticorps est préférentiellement intracellulaire. the expression of said antibodies is preferably intracellular.
Pour induire l'expression des anticorps, il suffira d'ajouter au milieu de culture le produit de régulation du promoteur utilisé. Par exemple, le promoteur arabinose est induit en présence d'arabinose. Pour isoler les anticorps recombinants, il est possible, lorsque la production est intracellulaire, de lyser les cellules par To induce the expression of the antibodies, it will suffice to add the promoter regulation product used to the culture medium. For example, the arabinose promoter is induced in the presence of arabinose. To isolate the recombinant antibodies, it is possible, when the production is intracellular, to lyse the cells by
exemple par sonnication et de recueillir le lysat ainsi obtenu. example by ringing and collecting the lysate thus obtained.
Facultativement, avant la préparation du lysat, les cultures peuvent Optionally, before the preparation of the lysate, cultures can
être incubées de 1 à 3 jours en chambre froide. be incubated for 1 to 3 days in a cold room.
Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, avant la préparation du lysat, les cultures induites sont incubées à 4 C In a preferred embodiment of the present invention, before the preparation of the lysate, the induced cultures are incubated at 4 ° C.
pendant 48 heures.for 48 hours.
Une purification, par exemple, par affinité, peut ensuite facultativement être réalisée sur le lysat obtenu. Il est aussi possible Purification, for example, by affinity, can then optionally be carried out on the lysate obtained. It is also possible
de réaliser une purification sur support hydrophobe. to carry out a purification on a hydrophobic support.
Lorsque la production est extracellulaire, le liquide extracellulaire pourra être récolté, et facultativement, purifié. Les méthodes de purification effectuées sont celles connues de l'homme du When production is extracellular, the extracellular fluid can be harvested, and optionally purified. The purification methods carried out are those known to those skilled in the art.
métier.job.
La présente invention a également pour objet l'utilisation des The present invention also relates to the use of
anticorps recombinants décrits ci-dessus en immunofluorescence. recombinant antibodies described above in immunofluorescence.
Les anticorps de la présente invention peuvent être utilisés, par exemple, en immunofluorescence indirecte. Dans ce cas, après avoir mis en présence l'antigène et un anticorps spécifique de cet antigène, on procède à une nouvelle étape d'hybridation consistant à détecter les couples anticorps-antigène formés en utilisant des anticorps recombinants fluorescents de la présent invention possédant un domaine peptidique capable de reconnaître l'anticorps spécifique de l'antigène et possédant un domaine protéique permettant l'émission The antibodies of the present invention can be used, for example, in indirect immunofluorescence. In this case, after having brought the antigen and an antibody specific for this antigen into play, a new hybridization step is carried out consisting in detecting the antibody-antigen pairs formed using fluorescent recombinant antibodies of the present invention having a peptide domain capable of recognizing the antibody specific for the antigen and having a protein domain allowing the emission
d'un signal de fluorescence.of a fluorescence signal.
Préférentiellement, les anticorps recombinants fluorescents sont utilisés en immunofluorescence directe. Cette méthode consiste à fixer directement l'anticorps recombinant fluorescent sur la préparation antigènique étudiée. Cette méthode directe présente Preferably, the fluorescent recombinant antibodies are used in direct immunofluorescence. This method consists in directly fixing the fluorescent recombinant antibody on the antigenic preparation studied. This direct method presents
l'avantage de pouvoir être réalisée en une seule étape d'hybridation. the advantage of being able to be carried out in a single hybridization step.
Deux types d'anticorps recombinants, permettant l'émission de deux signaux fluorescents différents, peuvent aussi être utilisés. Il est donc possible d'obtenir des molécules de détection associant une spécificité donnée de reconnaissance à celle d'un marquage différentiel de couleur, ce qui permet de détecter plusieurs cibles à la fois en une seule étape d'incubation et est très utile en particulier dans Two types of recombinant antibodies, allowing the emission of two different fluorescent signals, can also be used. It is therefore possible to obtain detection molecules associating a given specificity of recognition with that of a differential color marking, which makes it possible to detect several targets at the same time in a single incubation step and is very useful in particular. in
des expériences de co-localisation intracellulaire. intracellular co-location experiments.
Un autre objet de l'invention est aussi un procédé de détection d'un antigène comportant au moins une étape au cours de laquelle ledit antigène est hybridé à un anticorps recombinant tel que défini ci-dessus et contenant un domaine protéique permettant la reconnaissance dudit antigène. Ce procédé peut, par exemple, consister en un procédé d'immunofluorescence directe ou en un procédé d'immunofluorescence indirecte, ledit antigène étant dans ce dernier Another object of the invention is also a method for detecting an antigen comprising at least one step during which said antigen is hybridized to a recombinant antibody as defined above and containing a protein domain allowing the recognition of said antigen . This method may, for example, consist of a direct immunofluorescence method or of an indirect immunofluorescence method, said antigen being in the latter
cas l'anticorps utilisé pour la première hybridation anticorps-antigène. the antibody used for the first antibody-antigen hybridization.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention The following examples are intended to illustrate the invention
sans pour autant présenter un caractère limitatif. without being limiting in nature.
Exemple 1Example 1
la. Anticorps recombinants fluorescents "scFv lFl-GFPuv": Le fragment peptidique scFv 1F1 correspond à un fragment d'anticorps simple- chaîne 1F1 dirigé contre l'oncoprotéine E6 du virus HPV16. La figure 1-A décrit la séquence peptidique du fragment scFv 1Fl. Ce fragment scFv lF1 comporte dans le sens Nt --> Ct, le domaine VH de l'anticorps 1FI, un peptide de jonction et le domaine VL de l'anticorps monoclonal WFl. Le C-terminus du domaine VH est associé au N-terminus du domaine VL par le biais du peptide de jonction dont the. Fluorescent recombinant antibodies "scFv 1Fl-GFPuv": The peptide fragment scFv 1F1 corresponds to a single-chain antibody fragment 1F1 directed against the E6 oncoprotein of the HPV16 virus. Figure 1-A describes the peptide sequence of the scFv 1Fl fragment. This scFv lF1 fragment comprises, in the Nt -> Ct direction, the VH domain of the 1FI antibody, a junction peptide and the VL domain of the WF1 monoclonal antibody. The C-terminus of the VH domain is associated with the N-terminus of the VL domain by means of the junction peptide whose
la séquence a été soulignée dans la figure 1-A. the sequence has been outlined in Figure 1-A.
Le fragment peptidique "GFPuv" correspond à celui de la GFPuv décrit par Crameri (Crameri A., E.A.Whitehorn, E. Tate & The peptide fragment "GFPuv" corresponds to that of the GFPuv described by Crameri (Crameri A., E.A. Whitehorn, E. Tate &
W.P.C. Stemmer (1996) Nature Biotechnol. 14, 315-319). W.P.C. Stemmer (1996) Nature Biotechnol. 14, 315-319).
Le C-terminus du fragment peptidique scFv 1F1 est associé au N-terminus de la GFPuv par le biais d'un peptide de jonction de 18 The C-terminus of the scFv 1F1 peptide fragment is associated with the N-terminus of GFPuv via an 18 junction peptide
résidus suivant: ADAAPTVTSEDPRVPVEK. following residues: ADAAPTVTSEDPRVPVEK.
lb. Anticorps recombinants fluorescents "scFv 1F4-GFPuv": Le fragment peptidique scFv 1F4 correspond à un fragment d'anticorps à simple chaîne 1F4 dirigé contre l'oncoprotéine E6 du virus HPV16. La figure 1-B décrit la séquence peptidique du fragment scFv 1F4. Ce fragment scFv 1F4 comporte dans le sens Nt -> Ct le domaine VH de l'anticorps 1F1, un peptide de jonction et le domaine VL de l'anticorps monoclonal 6F4. Le C- terminus du domaine VH est associé au N-terminus du domaine VL par le biais du peptide de lb. Fluorescent recombinant antibodies "scFv 1F4-GFPuv": The peptide fragment scFv 1F4 corresponds to a single chain antibody fragment 1F4 directed against the E6 oncoprotein of the HPV16 virus. Figure 1-B describes the peptide sequence of the scFv 1F4 fragment. This scFv 1F4 fragment comprises in the direction Nt -> Ct the VH domain of the 1F1 antibody, a junction peptide and the VL domain of the 6F4 monoclonal antibody. The C-terminus of the VH domain is associated with the N-terminus of the VL domain via the peptide of
jonction dont la séquence a été soulignée dans la figure 1-B. junction whose sequence has been underlined in the figure 1-B.
Le fragment peptidique "GFPuv" correspond à celui de la GFPuv décrit par Crameri (Crameri A., E.A.Whitehorn, E. Tate & The peptide fragment "GFPuv" corresponds to that of the GFPuv described by Crameri (Crameri A., E.A. Whitehorn, E. Tate &
W.P.C. Stemmer (1996) Nature Biotechnol. 14, 315-319). W.P.C. Stemmer (1996) Nature Biotechnol. 14, 315-319).
Le C-terminus du fragment peptidique scFv 1F4 est associé au N-terminus de la GFPuv par le biais d'un peptide de jonction de 18 The C-terminus of the scFv 1F4 peptide fragment is associated with the N-terminus of GFPuv via an 18-junction peptide
résidus suivant: ADAAPTVTSEDPRVPVEK. following residues: ADAAPTVTSEDPRVPVEK.
Exemple 2Example 2
Production des anticorps recombinants "scFvlFl-GFPuv" et "scFv Production of recombinant antibodies "scFvlFl-GFPuv" and "scFv
1F4-GFPuv" chez E. coli.1F4-GFPuv "in E. coli.
Dans les figures 2-A, 2-B, 3 et 4: - XhoI, XbaI, SacI, SpeI et Eco RI désignent des sites de restriction; - ColEl ori, M13 ori et Amp R, désignent respectivement l'origine de réplication chez E. coli, l'origine de réplication M13 et le gène de résistance à l'ampicilline; - la séquence "VH" correspond à la séquence codante du segment VH de l'anticorps 1F1; la séquence "VL" correspond à la séquence codante du segment VL de l'anticorps 1F1; -la séquence "GFPuv" code la GFPuv; - la séquence "liaison" correspond à la séquence codante du peptide de jonction, dont la séquence est soulignée dans la figure 1-A; - la séquence "Lac Z" code la [3-galactosidase; - la séquence "rmBTlT2" représente une séquence terminateur de transcription; - P BAD représente le promoteur arabinose; la séquence "ara C" désigne le gène qui code pour la protéine AraC qui joue le rôle de répresseur du promoteur BAD en absence d'arabinose et le rôle d'inducteur transcriptionel en présence d'arabinose; - la séquence "signal" correspond à la séquence codante pour le peptide signal; - la séquence "tag" code pour un peptide marqueur; In FIGS. 2-A, 2-B, 3 and 4: - XhoI, XbaI, SacI, SpeI and Eco RI denote restriction sites; - ColEl ori, M13 ori and Amp R, respectively denote the origin of replication in E. coli, the origin of replication M13 and the ampicillin resistance gene; - the sequence "VH" corresponds to the coding sequence of the VH segment of the 1F1 antibody; the sequence "VL" corresponds to the coding sequence of the VL segment of the 1F1 antibody; -the sequence "GFPuv" codes the GFPuv; - The "binding" sequence corresponds to the coding sequence of the junction peptide, the sequence of which is underlined in FIG. 1-A; - the sequence "Lac Z" codes for [3-galactosidase; - The sequence "rmBTlT2" represents a transcription terminator sequence; - P BAD represents the arabinose promoter; the sequence "ara C" designates the gene which codes for the protein AraC which plays the role of repressor of the promoter BAD in the absence of arabinose and the role of transcriptional inducer in the presence of arabinose; - the "signal" sequence corresponds to the coding sequence for the signal peptide; - the "tag" sequence codes for a marker peptide;
- "RBS" désigne le site de liaison du ribosome. - "RBS" designates the ribosome binding site.
Le plasmide plFl-GFPuv, représenté à la figure 2-A, a été obtenu en fusionnant la séquence codante de la GFPuv à l'extrémité C-terminale du scFvlFl codé par le plasmide pscFewlF1. Le plasmide pscFewlFl, représenté sur la figure 2-B, est un plasrnide obtenu en clonant séquentiellement les séquences codantes VH et VL de The plasmid plFl-GFPuv, represented in FIG. 2-A, was obtained by fusing the coding sequence of GFPuv at the C-terminal end of the scFvlFl coded by the plasmid pscFewlF1. The plasmid pscFewlFl, represented on the figure 2-B, is a plasrnide obtained by cloning sequentially the coding sequences VH and VL of
l'anticorps iFl dans pscFew, pscFew étant dérivé de pGE20 (G. the iFl antibody in pscFew, pscFew being derived from pGE20 (G.
Orfanoudakis, B. Karim, D. Bourel & E. Weiss (1993) Bacterially expressed Fabs of monoclonal antibodies neutralysing TNF in vitro Orfanoudakis, B. Karim, D. Bourel & E. Weiss (1993) Bacterially expressed Fabs of monoclonal antibodies neutralysing TNF in vitro
retain full binding and biological activity. Molec. Immunol. 30, 1519- retain full binding and biological activity. Molec. Immunol. 30, 1519-
1528).1528).
Puis, le segment scFvlFl-GFPuv du plasmnide plFl-GFPuv a été amplifié par PCR (Polymerase Chain Reaction) avec les amorces 5'AAAATGGCTAGCCAGGTGAACTCTCGAGTCCGGet 'TATGCAGAATTCATTATITGTAGAGCTCATCCATGC de manière à isoler un segment scFvlFl-GFPuv ne comprenant pas de séquence signal Then, the scFvlFl-GFPuv segment of the plasmid plFl-GFPuv was amplified by PCR (Polymerase Chain Reaction) with the primers 5'AAAATGGCTAGCCAGGTGAACTCTCGAGTCCGG and 'TATGCAGAATTCATTATITGTAGAGCTCATCCATGC in order to isolate a segmentf sc signalv not segment
ou séquence "pel B", de façon à obtenir une expression intracellulaire. or "pel B" sequence, so as to obtain an intracellular expression.
Puis cet amplificat, ainsi que le plasmide pBAD-GFPuv commercialisé par la société Clontech, ont été digérés par les enzymes de restriction NheI et EcoRI, puis ligués in vitro avec l'ADN ligase, Then this amplificate, as well as the plasmid pBAD-GFPuv marketed by the company Clontech, were digested with the restriction enzymes NheI and EcoRI, then ligated in vitro with DNA ligase,
commercialisée par Amersham.marketed by Amersham.
Le plasmide ainsi obtenu, nommé pBAD1F1-GFPuv-ApelB est représenté à la figure 3. Le détail de la fusion scFv-GFPuv a été représenté sur la figure 4. La séquence nucléotidique du peptide de The plasmid thus obtained, named pBAD1F1-GFPuv-ApelB is represented in FIG. 3. The detail of the scFv-GFPuv fusion was represented in FIG. 4. The nucleotide sequence of the peptide of
jonction est indiquée en italique.junction is indicated in italics.
Des cellules XL-1 blue d'E. coli, commercialisées par la société Stratagène, ont ensuite été transformées avec ce plasmide XL-1 blue cells from E. coli, sold by the company Stratagène, were then transformed with this plasmid
pBADlFl1-GFPuv-ApelB par électroporation. pBADlFl1-GFPuv-ApelB by electroporation.
Les colonies obtenues après transformation avec ce vecteur pBAD-1F1GFPuv-ApelB sur boîte de Pétri contenant de l'arabinose, après avoir été incubées pendant 48 heures à 4 C, sont fluorescentes The colonies obtained after transformation with this vector pBAD-1F1GFPuv-ApelB on a petri dish containing arabinose, after having been incubated for 48 hours at 4 ° C., are fluorescent
sous illumination aux UV.under UV illumination.
Des colonies scFvlF4-GFP ont été obtenues en utilisant le même protocole, mais en partant du plasmide pscFewlF4, obtenu en remplaçant le segment VL de pscFewlFl par la séquence codante du ScFvlF4-GFP colonies were obtained using the same protocol, but starting from the plasmid pscFewlF4, obtained by replacing the VL segment of pscFewlFl with the coding sequence of the
domaine VL de l'anticorps 6F4.VL domain of the 6F4 antibody.
Les cellules ainsi obtenues ont été lysées par sonnication et les protéines présentes dans le surnageant de lyse ont été analysées par western-blot. I1 a été constaté que les produits de fusion scFvlFl-GFP et scFvlF4-GFP avaient un poids moléculaire apparent de taille The cells thus obtained were lysed by ringing and the proteins present in the lysis supernatant were analyzed by western blot. It was found that the fusion products scFvlFl-GFP and scFvlF4-GFP had an apparent size molecular weight
attendue, d'environ 60 kDa.expected, around 60 kDa.
L'activité de liaison à E6 des scFv-GFP (lFl et 1F4) contenus dans le surnageant de lyse des bactéries induites a été testée par dot-blot. Des quantités variables de protéines purifiées MBP (Maltose Binding Proteine) et MBP-E6 ont été immobilisées sur languette de nitrocellulose, puis incubées en présence de la préparation bactérienne. La fixation des scFv-GFP anti E6 a été révélée à l'aide d'anticorps polyclonaux de lapin anti-GFP commercialisés par la société Clontech et d'imrnmunoglobulines de chèvres anti-anticorps de lapins marquées à la phosphatase alcaline, commercialisée par la société Dakopatts. La coloration de la fixation des réactifs est obtenue par incubation des languettes dans une solution de NBT/BCIP, commercialisée par la société Promega. La fixation des molécules scFv-GFP sur les protéines purifiées MPE-E6 a The E6 binding activity of the scFv-GFP (1F1 and 1F4) contained in the lysis supernatant of the induced bacteria was tested by dot-blot. Variable quantities of purified proteins MBP (Maltose Binding Protein) and MBP-E6 were immobilized on a nitrocellulose strip, then incubated in the presence of the bacterial preparation. The binding of anti-E6 scFv-GFP was revealed using anti-GFP rabbit polyclonal antibodies marketed by the company Clontech and rabbit anti-rabbit immunoglobulins labeled with alkaline phosphatase, marketed by the company Dakopatts. The coloring of the binding of the reagents is obtained by incubation of the strips in a NBT / BCIP solution, sold by the company Promega. The binding of scFv-GFP molecules to purified proteins MPE-E6 has
été aisément détectée.was easily detected.
La bi-fonctionnalité des scFv-GPF exprimés dans ces conditions a été mise en évidence en observant au microscope à fluorescence ces anticorps recombinants interagissant spécifiquement avec le peptide de E6 immobilisé sur des billes d'agarose. La protéine MBP fusionnée à la séquence peptidique de E6 reconnue par les anticorps a été fixée covalemment sur des billes d'agarose activées au CNBr, commercialisées par la société Pharmacia, puis incubée au froid pendant 16 heures avec agitation en présence de lysat bactérien contenant les produits scFvlFl-GFP ou scFvlF4-GFP. Après lavage en conditions douces, les billes ont été montées entre lame et lamelle et observées au microscope à fluorescence avec le filtre FITC. Une intense couleur verte répartie principalement à la surface des billes a été visualisée dans ces conditions démontrant ainsique les conditions établies de production de scFv-GFP permettaient d'obtenir des molécules bi- fonctionnelles. Pour démontrer que les molécules responsables de cette fluorescence étaient bien celles précédemment révélées sur western-blot, les protéines présentes sur les billes traitées The bi-functionality of the scFv-GPF expressed under these conditions was demonstrated by observing under a fluorescence microscope these recombinant antibodies interacting specifically with the E6 peptide immobilized on agarose beads. The MBP protein fused to the peptide sequence of E6 recognized by the antibodies was covalently fixed on agarose beads activated with CNBr, marketed by the company Pharmacia, then incubated in the cold for 16 hours with shaking in the presence of bacterial lysate containing the scFvlFl-GFP or scFvlF4-GFP products. After washing under mild conditions, the beads were mounted between slide and coverslip and observed under a fluorescence microscope with the FITC filter. An intense green color distributed mainly on the surface of the beads was visualized under these conditions, thus demonstrating the established conditions for production of scFv-GFP made it possible to obtain bi-functional molecules. To demonstrate that the molecules responsible for this fluorescence were indeed those previously revealed on western-blot, the proteins present on the treated beads
pour l'observation au microscope ont été analysées sur gel SDS-PAGE- for observation under the microscope were analyzed on SDS-PAGE gel
(électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec dodécylsulfate de sodium). Il a été observé que les peptides retenus correspondent d'un point de vue poids moléculaire apparent exclusivement au produit (electrophoresis on polyacrylamide gel with sodium dodecyl sulfate). It has been observed that the peptides selected correspond from an apparent molecular weight point of view exclusively to the product.
scFv-GFP identifié à l'aide d'anticorps anti-GFP. scFv-GFP identified using anti-GFP antibodies.
Exemple 3Example 3
Test d'immunofluorescence directe: détection en une étape de la protéine E6 exprimée dans des cellules en culture. Des cellules COS fixées en présence d'acétone /méthanol ont été incubées avec un échantillon de molécules scFvlFl-GFP et scFvlF4-GFP purifiées par affinité sur billes. Les cellules COS utilisées sont une lignée transformée de cellules de rein de singe qui Direct immunofluorescence test: detection in one step of the E6 protein expressed in cells in culture. COS cells fixed in the presence of acetone / methanol were incubated with a sample of scFvlF1-GFP and scFvlF4-GFP molecules purified by affinity on beads. The COS cells used are a transformed line of monkey kidney cells which
expriment transitoirement le polypeptide E6. transiently express the E6 polypeptide.
Après cette unique étape de traitement, les billes sont alors After this single processing step, the beads are then
observées au microscope à fluorescence. observed under a fluorescence microscope.
Cette expérience a clairement démontré qu'une incubation avec les fragments d'anticorps associés avec la GFP par fusion génétique permet de détecter sans équivoque par fluorescence la protéine E6 exprimée et localisée dans le noyau des cellules COS transfectées. Cette expérience de marquage direct a aussi été réalisée avec des extraits bruts bactériens contenant les molécules scFv-GFP. Dans ce cas, le signal vert nucléaire est un peu moins visible car il est noyé dans un intense bruit de fond de couleur jaune présent au niveau de This experiment clearly demonstrated that an incubation with the antibody fragments associated with GFP by genetic fusion makes it possible to unequivocally detect by fluorescence the protein E6 expressed and located in the nucleus of the transfected COS cells. This direct labeling experiment was also carried out with crude bacterial extracts containing the scFv-GFP molecules. In this case, the nuclear green signal is a little less visible because it is drowned in an intense yellow background noise present at
toutes les structures cellulaires.all cellular structures.
Enfin, il est à noter que le microscope et les équipements annexes utilisés pour cette visualisation de la coloration nucléaire des cellules COS avec les scFv-GFPs purifiés sont les mêmes que ceux qui sont utilisés en routine pour des détections classiques par immunofluorescence indirecte; il peut donc en être déduit que la sensibilité de détection avec le produit recombinant en une seule étape Finally, it should be noted that the microscope and the additional equipment used for this visualization of the nuclear staining of COS cells with the purified scFv-GFPs are the same as those which are used routinely for conventional detections by indirect immunofluorescence; it can therefore be deduced therefrom that the detection sensitivity with the recombinant product in a single step
est comparable à celle de la méthode indirecte. is comparable to that of the indirect method.
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|---|---|---|---|
| FR9805901A FR2778408A1 (en) | 1998-05-11 | 1998-05-11 | FLUORESCENT RECOMBINANT ANTIBODIES |
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