FR2777285A1 - PEPTIDE LIGAND HAVING SPECIFIC AFFINITY TO PROTEIN P24 OF RETROVIRUS HIV-1 - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention concerne un ligand peptidique présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la protéine p24 du virus de l'immunodéficience acquise de type 1 (VIH-1). L'invention concerne également un anticorps de type murin, ou chimérique humain-murin, présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la protéine p24 du VIH-1, la molécule d'ADN correspondant au ligand peptidique, les cassettes et vecteurs comprenant cette molécule d'ADN, un procédé de détection in vitro de l'infection par le VIH-1 à partir d'un échantillon biologique, ainsi que l'utilisation d'anticorps chimérique pour l'utilisation en tant que médicament. The present invention relates to a peptide ligand having a specific affinity for the p24 protein of acquired immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). The invention also relates to a murine or chimeric human-murine antibody having a specific affinity for the HIV-1 p24 protein, the DNA molecule corresponding to the peptide ligand, the cassettes and vectors comprising this DNA molecule, a method for in vitro detection of HIV-1 infection from a biological sample, and the use of chimeric antibody for use as a drug.
Le syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) est l'ultime étape de l'infection de l'homme par le VIH. On pense aujourd'hui que l'infection présente un caractère irréversible et la plupart du temps fatal, même si le décès survient après un temps qui peut varier considérablement d'un patient à l'autre. Alors que l'on a longtemps pensé que le virus était seul responsable de la maladie, de plus en plus d'indices suggèrent aujourd'hui que la présence de mycoplasmes prédispose à l'infection par le VIH lors d'un contact avec le virus. De même, le cytomégalovirus, présent chez de nombreux individus, semblerait favoriser le passage d'une forme d'infection à VIH asymptomatique au déclenchement du SIDA. II existe aussi une autre théorie, dénommée " HIVER ", selon laquelle la plupart des dommages causés par la maladie relèveraient de problèmes auto-immuns. Néanmoins, dans toutes ces hypothèses, I'efficacité de substances antivirales suggère fortement que le virus doit jouer un rôle important. Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) is the ultimate stage of human infection with HIV. It is now thought that the infection is irreversible and most of the time fatal, even if the death occurs after a time that can vary considerably from one patient to another. While it has long been thought that the virus was the only cause of the disease, more and more evidence now suggests that the presence of mycoplasmas predisposes to HIV infection during contact with the virus. . Similarly, cytomegalovirus, which is present in many individuals, appears to promote the transition from a form of asymptomatic HIV infection to the onset of AIDS. There is also another theory, called "WINTER", that most of the damage caused by the disease is related to autoimmune problems. Nevertheless, in all these cases, the efficacy of antiviral substances strongly suggests that the virus must play an important role.
Le SIDA est une maladie à évolution lente et des personnes séropositives sont infectieuses alors qu'elles ne manifestent aucun symptôme de la maladie pendant des années. II est donc nécessaire de pouvoir diagnostiquer l'infection par le virus le plus tôt possible. AIDS is a slowly evolving disease, and HIV-positive people are infectious when they have no symptoms of the disease for years. It is therefore necessary to be able to diagnose the infection with the virus as soon as possible.
Le génome entier du VIH a été séquencé, et les fonctions des différents gènes élucidées. La transcriptase réverse et l'intégrase virales sont produites par clivage d'une grosse protéine de fusion gag-pol, alors que les protéines de la capside virale sont produites par clivage de la protéine gag. Une protéine précurseur p55 de gag est coupée par une protéase codée par le gène pol, laquelle produit la protéine principale p24 (parfois appelée p25) et les protéines p18 et p13. The entire genome of HIV was sequenced, and the functions of the various genes elucidated. Reverse transcriptase and viral integrase are produced by cleaving a large gag-pol fusion protein, while viral capsid proteins are produced by cleavage of the gag protein. A p55 gag precursor protein is cleaved by a protease encoded by the pol gene, which produces the main protein p24 (sometimes called p25) and the p18 and p13 proteins.
L'être humain infecté par le VIH développe rapidement des titres élevés en anticorps dirigés contre les antigènes gp120, gp160, gp41 et p24. Les anticorps du sérum dirigés contre la p24 apparaissent très tôt au moment de l'infection. HIV-infected humans rapidly develop high levels of antibodies to the gp120, gp160, gp41 and p24 antigens. Serum antibodies to p24 appear very early at the time of infection.
L'homme de l'art connaît bien la structure des anticorps. Those skilled in the art are familiar with the structure of the antibodies.
Chaque anticorps est constitué de deux chaînes " légères " et de deux chaînes " lourdes ". La région de fixation de l'antigène ou site de fixation (région déterminant la complémentarité) se situe à l'extrémité aminoterminale (N-terminale) des chaînes lourde et légère et implique donc ces deux types de chaînes. Les deux chaînes se replient en une série d'amas non structurés, répartis de manière discrète, que l'on appelle les domaines.Each antibody consists of two "light" chains and two "heavy" chains. The antigen binding region or binding site (complementarity determining region) is at the amino-terminal (N-terminal) end of the heavy and light chains and thus involves both types of chains. The two chains fall into a series of unstructured, discretely distributed clusters known as domains.
Ainsi, ce que l'on appelle un a anticorps à domaine unique " (Dabs) ne comprend qu'un seul des domaines d'un anticorps donné.Thus, a so-called single domain antibody (Dabs) comprises only one domain of a given antibody.
Les domaines situés en position amino-terminale de chacune des chaînes lourdes et légères sont appelés régions variables, lesquelles comprennent des régions hypervariables qui diffèrent d'un anticorps à l'autre, le reste de ces régions variables étant constitué d'acides aminés relativement constants formant une ossature à la structure spécifique de l'anticorps. Les autres domaines de l'anticorps, particulièrement ceux en position C-terminale, sont dits constants, c'est à dire qu'ils sont identiques pour tous les anticorps d'une même classe. The amino-terminal domains of each of the heavy and light chains are called variable regions, which include hypervariable regions that differ from one antibody to another, the rest of these variable regions being relatively constant amino acids. forming a framework with the specific structure of the antibody. The other domains of the antibody, particularly those in the C-terminal position, are said to be constant, that is to say that they are identical for all the antibodies of the same class.
Bien que l'on connaisse déjà des anticorps monoclonaux de type murin et humain dirigés contre la p24, utilisés dans des immunoessais ou en tant qu'agents thérapeutiques, la demanderesse a de manière surprenante obtenu un anticorps monoclonal d'origine murine présentant une sensibilité et une spécificité élevée pour la protéine p24 du VIH-1. A partir du clone cellulaire sécrétant cet anticorps monoclonal, la demanderesse a obtenu une lignée cellulaire hybridome sécrétant cet anticorps monoclonal et a déterminé la séquence en acide désoxyribonucléique (ADN) et acides aminés dudit anticorps. Although we already know murine and human monoclonal antibodies directed against p24, used in immunoassays or as therapeutic agents, the Applicant has surprisingly obtained a monoclonal antibody of murine origin having a sensitivity and high specificity for the HIV-1 p24 protein. From the cell clone secreting this monoclonal antibody, the Applicant obtained a hybridoma cell line secreting this monoclonal antibody and determined the deoxyribonucleic acid (DNA) and amino acid sequence of said antibody.
Le premier objet de la présente invention concerne principalement un ligand peptidique et/ou équivalent peptidique présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la protéine p24 du rétrovirus HIV-1, comprenant au moins un brin peptidique correspondant à la partie N terminale de la chaîne légère et/ou la chaîne lourde d'un anticorps, la chaîne légère comprenant une suite d'acides aminés déterminant trois régions dites hypervariables L1, L2 et L3, respectivement positionnées de 70 à 99, de 145 à 165, de 262 à 285, selon la suite d'acides aminés décrite par la séquence SEQ ID No 1, et la chaîne lourde comprenant une suite d'acides aminés déterminant trois régions dites hypervariables H1,
H2 et H3, respectivement positionnées de 76 à 105, de 155 à 195, de 295 à 327, selon la suite d'acides aminés décrites par la séquence SEQ ID
No 2.The first subject of the present invention relates mainly to a peptide ligand and / or peptide equivalent having a specific affinity for the p24 protein of the HIV-1 retrovirus, comprising at least one peptide strand corresponding to the N-terminal part of the light chain and / or the heavy chain of an antibody, the light chain comprising a series of amino acids determining three so-called hypervariable regions L1, L2 and L3, respectively positioned from 70 to 99, from 145 to 165, from 262 to 285 , according to the sequence of amino acids described by the sequence SEQ ID No. 1, and the heavy chain comprising a sequence of amino acids determining three so-called hypervariable regions H1,
H2 and H3, respectively positioned from 76 to 105, from 155 to 195, from 295 to 327, according to the sequence of amino acids described by the sequence SEQ ID
No 2.
Selon la présente invention, ' équivalent " pour un peptide signifie que la structure chimique est similaire et que la fonction du peptide est identique. Un équivalent peptidique pourra donc présenter des acides aminés différents mais présentera une fonctionnalité, en l'occurence vis-àvis de la protéine p24, identique. De ce fait, un acide aminé est dit équivalent d'un autre acide aminé, lorsque leurs caractéristiques chimiques, telles polarité, hydrophobicité, et/ou basicité, et/ou acidité, et/ou neutralité, sont sensiblement les mêmes. Ainsi, une leucine est équivalente d'une isoleucine, au sens de la définition précédente. According to the present invention, "equivalent" for a peptide means that the chemical structure is similar and that the function of the peptide is identical, a peptide equivalent may therefore have different amino acids but will have a functionality, in this case vis-à-vis Thus, an amino acid is said to be equivalent to another amino acid, when their chemical characteristics, such as polarity, hydrophobicity, and / or basicity, and / or acidity, and / or neutrality, are substantially the same. For example, a leucine is equivalent to an isoleucine, as defined in the previous definition.
Les ligands peptidiques selon l'invention peuvent être tels qu'à l'état natif, lorsqu'il s'agit d'un anticorps monoclonal par exemple, ou modifiés chimiquement. Par modification chimique, on entend toute altération chimique d'au moins un groupement fonctionnel de la séquence peptidique, préservant substantiellement ,voire augmentant, les propriétés biologiques de ladite séquence peptidique vis-à-vis de l'antigène p24 du VIH-1. Font notamment partie des modifications chimiques considérées précédemment, le remplacement d'un acide aminé de la série L par un acide aminé de la série D, une modification des chaînes latérales des acides aminés, telle qu'une acétylation des fonctions amine, une carboxyméthylation des fonctions thiols, une estérification des liaisons peptidiques telles que des liaison carba, retro-inverso, réduites et méthylène-oxy. The peptide ligands according to the invention may be such as in the native state, when it is a monoclonal antibody for example, or chemically modified. By chemical modification is meant any chemical alteration of at least one functional group of the peptide sequence, substantially preserving, or even increasing, the biological properties of said peptide sequence vis-à-vis the HIV-1 p24 antigen. In particular, the chemical modifications considered previously include the replacement of an amino acid of the L series with a D-series amino acid, a modification of the amino acid side chains, such as an acetylation of the amine functions, a carboxymethylation of the amino acids. thiol functions, an esterification of peptide bonds such as carba, retro-inverso, reduced and methylene-oxy bonds.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le ligand peptidique comprend un brin peptidique comprenant la chaîne légère et la chaîne lourde d'un anticorps correspondant respectivement à la séquence
SEQ ID No 1 et SEQ ID No 2. In a preferred embodiment according to the invention, the peptide ligand comprises a peptide strand comprising the light chain and the heavy chain of an antibody respectively corresponding to the sequence
SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2.
Dans un autre mode de réalisation selon l'invention, le ligand comprend un brin peptidique qui consiste en la chaîne légère et/ou la chaîne lourde d'un anticorps correspondant respectivement à la séquence
SEQ ID No 1 et SEQ ID No 2.In another embodiment according to the invention, the ligand comprises a peptide strand which consists of the light chain and / or the heavy chain of an antibody respectively corresponding to the sequence
SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le ligand est un anticorps. In a preferred embodiment according to the invention, the ligand is an antibody.
Dans un mode de réalisation très préféré selon l'invention, le ligand est un anticorps monoclonal d'origine murine, dénommé dans la présente invention " 13B5 ". In a very preferred embodiment according to the invention, the ligand is a monoclonal antibody of murine origin, referred to in the present invention as "13B5".
Dans un autre mode de réalisation selon l'invention, le ligand est un anticorps de type chimérique, constitué de régions dites constantes d'origine humaine et de régions dites hypervariables d'origine murine. In another embodiment according to the invention, the ligand is a chimeric type antibody consisting of so-called constant regions of human origin and so-called hypervariable regions of murine origin.
De tels anticorps peuvent être également dénommés anticorps recombinants. Pour l'assemblage des molécules de type immunoglobuline tétramère complète et l'expression d'anticorps actifs, on fusionne les inserts d'ADN recombinant codant pour les régions variables ( comprenant les régions hypervariables des chaînes lourdes et légères), avec un ADN codant pour des régions constantes des chaînes lourdes et légères, puis on les transfère à l'intérieur de cellules hôtes appropriées, par exemple après incorporation dans des vecteurs hybrides. Such antibodies may also be called recombinant antibodies. For the assembly of the complete tetramer immunoglobulin-like molecules and the expression of active antibodies, the recombinant DNA inserts encoding the variable regions (including the hypervariable regions of the heavy and light chains) are fused with a DNA coding for constant heavy and light chain regions, and then transferred into appropriate host cells, for example after incorporation into hybrid vectors.
Du fait que la séquence du fragment Fab de l'anticorps 13B5 est divulguée dans la présente invention, l'homme de l'art peut fabriquer, en utilisant la technologie de l'ADN recombinant avec des cellules hôtes telles que levures ou bactéries, divers fragments d'anticorps comprenant les régions hypervariables citées ci-dessus, et qui gardent leur spécificité envers la p24. Since the Fab fragment sequence of the 13B5 antibody is disclosed in the present invention, those skilled in the art can make, using recombinant DNA technology with host cells such as yeasts or bacteria, various antibody fragments comprising the hypervariable regions mentioned above, and which keep their p24 specificity.
Dans encore un autre mode de réalisation, le ligand comprend un marqueur. Un tel anticorps est dénommé conjugué. Le dit conjugué peut être fabriqué à partir d'un fragment dudit anticorps, dans la mesure où ce dernier garde sa spécificité envers la p24. Le marqueur peut être par exemple une enzyme, un marqueur de type fluorescent, un marqueur de type chémiluminescent, une avidine , une biotine, ou un anticorps marqué de manière radioactive. In yet another embodiment, the ligand comprises a marker. Such an antibody is called conjugate. The said conjugate can be made from a fragment of said antibody, insofar as the latter retains its p24 specificity. The label may be, for example, an enzyme, a fluorescent type label, a chemiluminescent label, an avidin, a biotin, or a radioactively labeled antibody.
Les enzymes utilisées pour les conjugués d'anticorps de l'invention sont, par exemple, la peroxidase de Raiford, la phosphatase alkaline, la béta-D-galactosidase, la glucose oxydase, la glucoamylase,
I'anhydrase carbonique, l'acétylcholinestérase, le lysosyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6-phosphatase déhydrogénase.The enzymes used for the antibody conjugates of the invention are, for example, Raiford peroxidase, alkaline phosphatase, beta-D-galactosidase, glucose oxidase, glucoamylase,
Carbonic anhydrase, acetylcholinesterase, lysosyme, malate dehydrogenase or glucose-6-phosphatase dehydrogenase.
Les marqueurs utilisés pour les conjugués de type fluorescent selon l'invention peuvent être de la fluorescéine, du fluorochrome, de la rhodamine. The markers used for the fluorescent type conjugates according to the invention may be fluorescein, fluorochrome or rhodamine.
Les marqueurs de type chémiluminescent sont par exemple les esters d'acridium du luminol. The chemiluminescent type markers are, for example, acridium esters of luminol.
Dans de tels conjugués, les anticorps ou fragments d'anticorps sont liés au partenaire de conjugaison directement ou par un groupement espaceur ou agent chélatant. In such conjugates, antibodies or antibody fragments are bound to the conjugation partner directly or through a spacer group or chelating agent.
Comme exemple d'agents chélatants, on peut citer l'acide éthylène-diaminetétraacétique (EDTA), I'acide diéthylènetriaminepentaacétique (DPTA), le 1,4,8,1 1-tétra azatétradécane, I'acide 1,4,8,11tétraazatradécane-1,4,8,11-tétraacétique, l'acide 1-oxa-4,7,12,15tétraaza heptadécane-4,7,12,15-tétraacétique, ou du même genre. Examples of chelating agents that may be mentioned include ethylene diaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DPTA), 1,4,8,1-tetra azatetradecane, 1,4,8-acid, 11ttraazatradecane-1,4,8,11-tetraacetic acid, 1-oxa-4,7,12,15tetraaza heptadecane-4,7,12,15-tetraacetic acid, or the like.
Les anticorps marqués de manière radioactive selon la présente invention contiennent par exemple de l'iode radioactive (I123, I125, I131), du tritium (H ), du carbone (C14), du souffre (S35), de l'yttrium (Y90), du technétium (TC99m), ou autre du même genre. The radioactively labeled antibodies according to the present invention contain, for example, radioactive iodine (I123, I125, I131), tritium (H), carbon (C14), sulfur (S35), yttrium (Y90). ), technetium (TC99m), or the like.
Les ligands peptidiques selon la présente invention, marqués de manière radioactive avec de l'iode, sont obtenus à partir des ligants selon la présente invention par iodation connue oer se, par exemple avec de l'iodure de potassium ou de sodium radioactif et un réactif chimiquement oxydant, tel que l'hypochlorite de sodium, la chloramine T ou du même genre, ou un réactif enzymatiquement oxydant, tel que la lactoperoxidase et la glucose oxydase. Les ligands selon la présente invention peuvent également être couplés à l'yttrium par exemple par chélation avec le
DPTA.The peptide ligands according to the present invention, radioactively labeled with iodine, are obtained from the ligands according to the present invention by known iodization, for example with potassium or radioactive sodium iodide and a reagent. chemically oxidizing, such as sodium hypochlorite, chloramine T or the like, or an enzymatically oxidizing reagent, such as lactoperoxidase and glucose oxidase. The ligands according to the present invention can also be coupled to yttrium for example by chelation with the
DTPA.
La liaison de l'enzyme avec l'anticorps selon la présente invention peut être réalisée en faisant réagir un anticorps selon la présente invention avec un réactif de couplage, par exemple, le glutaraldéhyde, le périodate, la N,N'-O-phénylènedimaléimide, le N-(m-maléimidobenzoyl oxy)-succinimide, le N-(3-[2'-pyridyldithio]-propionoxy)-succinimide, le N éthyl-N'-(3-diméthylamino-propyl)-carbodiimide. Les conjugués avec de la biotine sont préparés par exemple en faisant réagir l'anticorps selon la présente invention avec un ester activé de la biotine tel que l'ester de biotine N-hydroxysuccinimide. Les conjugués avec un marqueur fluorescent ou chemiluminescent sont préparés en présence d'un réactif de couplage, par exemple ceux cités ci-dessus, ou par une réaction avec de l'isothiocyanate, de préférence de l'isothyocyanate de fluorescéine. The binding of the enzyme with the antibody according to the present invention can be carried out by reacting an antibody according to the present invention with a coupling reagent, for example, glutaraldehyde, periodate, N, N'-O-phenylenedimaleimide N- (m -maleimidobenzoyloxy) -succinimide, N- (3- [2'-pyridyldithio] -propionoxy) -succinimide, N-ethyl-N '- (3-dimethylamino-propyl) -carbodiimide. Conjugates with biotin are prepared, for example, by reacting the antibody according to the present invention with an activated ester of biotin such as the biotin ester N-hydroxysuccinimide. Conjugates with a fluorescent or chemiluminescent label are prepared in the presence of a coupling reagent, for example those mentioned above, or by reaction with isothiocyanate, preferably fluorescein isothiocyanate.
Dans encore un autre mode de réalisation, le ligand est reconnu par un conjugué anticorps-marqueur. In yet another embodiment, the ligand is recognized by an antibody-label conjugate.
Dans la mesure où l'on préfère utiliser dans des immunoessais les ligands selon la présente invention, par révélation par un autre anticorps marqué, le ligand selon la présente invention comprendra de ce fait une partie utile pour la reconnaissance de ce deuxième anticorps marqué. On utilisera particulièrement les chaînes lourdes constantes de type murin ou humain dans le cas où le ligand soit un anticorps. In so far as it is preferred to use in immunoassays the ligands according to the present invention, by revelation with another labeled antibody, the ligand according to the present invention will thus comprise a useful part for the recognition of this second labeled antibody. In particular, the constant heavy chains of the murine or human type will be used in the case where the ligand is an antibody.
Les anticorps de la présente invention peuvent être digérés par des protéases. On obtient alors plusieurs fragments dénommés, Fab, Fab' et Fc. The antibodies of the present invention can be digested with proteases. We then obtain several fragments called Fab, Fab 'and Fc.
L'avantage potentiel des fragments d'anticorps est qu'ils peuvent être fabriqués assez facilement par des bactéries ou des levures. The potential benefit of antibody fragments is that they can be made relatively easily by bacteria or yeasts.
Comme l'homme de l'art le sait, la technologie des anticorps à domaine unique (Dabs) offre la possibilité de cloner des molécules ressemblant à des anticorps dans des bactéries et de cribler des millions d'anticorps beaucoup plus simplement que des anticorps monoclonaux.As one skilled in the art knows, single-domain antibody (Dabs) technology offers the possibility of cloning antibody-like molecules into bacteria and screening millions of antibodies much more simply than monoclonal antibodies. .
Un exemple d'une telle réalisation est donné dans l'exemple 2. An example of such an embodiment is given in Example 2.
Un second objet selon l'invention est un procédé de détection de la p24 du VIH-1 dans un échantillon biologique comprenant la mise en contact dudit échantillon avec au moins un ligand selon l'invention, et la mesure du complexe ligand-p24 formé. A second object according to the invention is a method for detecting the p24 of HIV-1 in a biological sample comprising bringing said sample into contact with at least one ligand according to the invention, and measuring the ligand-p24 complex formed.
Un troisième objet selon l'invention est un Kit de diagnostic pour détecter une infection par le VIH-1 comprenant au moins un ligand selon l'invention. A third object according to the invention is a diagnostic kit for detecting an HIV-1 infection comprising at least one ligand according to the invention.
Un quatrième objet selon l'invention est l'utilisation des anticorps de type chimérique humain-murin selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à traiter des patients atteints d'une infection par le VIH-1. A fourth object of the invention is the use of human-murine chimeric antibodies according to the invention for the preparation of a medicament for treating patients with HIV-1 infection.
Un cinquième objet selon l'invention est la molécule d'ADN codant pour un ligand peptidique selon la revendication 1. A fifth object according to the invention is the DNA molecule encoding a peptide ligand according to claim 1.
Comme exemple d'une telle molécule, on peut citer les séquences d'acides nucléiques des séquences SEQ ID N01 et 2. As an example of such a molecule, mention may be made of the nucleic acid sequences of the sequences SEQ ID N01 and 2.
Les Figures 1 et 2 représentent respectivement la séquence en acides aminés des chaînes légère et lourde du fragment Fab de l'anticorps 1 3B5 avec les régions hypervariables encadrées, codées par les séquences
SEQ ID N01 et 2.Figures 1 and 2 respectively represent the amino acid sequence of the light and heavy chains of the Fab fragment of the antibody 1 3B5 with the hypervariable regions framed, coded by the sequences
SEQ ID N01 and 2.
La figure 3 représente les résultats d'un test ELISA indirect selon l'exemple 3. En abscisse est représenté la concentration en anticorps (,ug/ml), et en ordonnée la mesure de DO (densité optique) à 405 nm. FIG. 3 represents the results of an indirect ELISA test according to example 3. On the abscissa is represented the concentration of antibodies (μg / ml), and on the ordinate the measurement of OD (optical density) at 405 nm.
Les séquences SEQ ID No 1 et SEQ ID No 2 représentent respectivement les séquences en nucléotides et en acides aminés de la chaîne légère et de la chaîne lourde du fragment Fab de l'anticorps 13B5. The sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 respectively represent the nucleotide and amino acid sequences of the light chain and of the heavy chain of the Fab fragment of the 13B5 antibody.
Un sixième objet selon l'invention est les cassettes d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, permettant l'expression d'ADN codant pour un ligand peptidique selon l'invention, les vecteurs comprenant les cassettes d'expression décrites ci-dessus, et les cellues issues d'un organisme eucaryote ou procaryote comprenant une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. A sixth object according to the invention is the functional expression cassettes in a cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism, allowing the expression of DNA encoding a peptide ligand according to the invention, the vectors comprising the cassettes of expression described above, and the cells from an eukaryotic or prokaryotic organism comprising an expression cassette or a vector according to the invention.
Exemple i : Séquençage de la partie Fab de l'anticorps 13B5
1) Procédé d'obtension de l'anticorps
a) Préparation de cellules de rate de souris immunisées avec de la protéine recombinante p24.Example 1 Sequencing of the Fab Portion of the 13B5 Antibody
1) Method of obtension of the antibody
a) Preparation of Spleen Cells from Mice Immunized with Recombinant P24 Protein
On a utilisé comme antigène une protéine recombinante p24 HIV-1, des souris femelles de l'espèce BALB/C et de la souche BALB/C
BYJICO (fournies par IFFA Credo), et la lignée myélomateuse SP2/0-AG14.
b) Protocole d'immunisation
Les souris ont été immunisées à 15 jours d'intervalle à l'aide de 3 injections par voie intra-péritonéale (IP) associant 50 p9 d'antigène et de l'adjuvant complet de Freund (ACF) pour la première injection et de l'adjuvant incomplet de Freund (AIF) pour les autres injections.
c) Fusion
On réalise la fusion selon la technique classique décrite par G.A recombinant p24 HIV-1 protein, female BALB / C mice and BALB / C strain were used as antigen.
BYJICO (provided by IFFA Credo), and myeloma SP2 / 0-AG14.
b) Immunization protocol
The mice were immunized at 15-day intervals using 3 injections intraperitoneally (IP) combining 50 μl of antigen and Freund's complete adjuvant (ACF) for the first injection and the Incomplete Freund's adjuvant (AIF) for other injections.
c) Fusion
The fusion is carried out according to the conventional technique described by G.
Kôhler et C. Milstein (Nature 256. 495-497 (1997)).
d) Culture en suspension
On a utilisé un milieu de base : Iscove's Modified Dulbecco
Medium (IMDM) additionné de bicarbonate de sodium (3024 mg/l), de 10% de sérum de veau foetal (SVF), de pH 6,7 à 7,3, et à température 250C.Kohler and C. Milstein (Nature 256. 495-497 (1997)).
d) Suspended culture
A base medium was used: Iscove's Modified Dulbecco
Medium (IMDM) supplemented with sodium bicarbonate (3024 mg / l), 10% fetal calf serum (FCS), pH 6.7 to 7.3, and temperature 250C.
Les réactifs additionnels étaient l'insuline 4 mg/l, le 2mercaptoéthanol (10 pM), I'éthanolamine (20 HM), la pénicilline (100
U/ml), la streptomycine (50 /Jg/ml). Additional reagents were insulin 4 mg / l, 2mercaptoethanol (10 μM), ethanolamine (20 μM), penicillin (100 μM),
U / ml), streptomycin (50 μg / ml).
Les cellules hétérolploides obtenues ont été sub-cultivées tous les deux ou trois jours.
e) Congélation des cellules
On a utilisé un milieu de composition: IMDM additionné de 10% de sérum de veau foetal (SVF) et 10% de diméthyl sulfoxide (DMSO
Sigma).Heterolploid cells obtained were subcultured every two or three days.
e) Freezing cells
A composition medium: IMDM supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) was used.
Sigma).
La concentration cellulaire était de 3,6 x 106 cellules par ampoules (2 x 106 cellules/ml). The cell concentration was 3.6 x 106 cells per ampule (2 x 10 6 cells / ml).
On a effectué une congélation lente des cellules à -800C dans du milieu IMDM-SVF 10%-DMSO 10%, pendant 24 à 72 heures, puis on a conservé les cellules dans de l'azote liquide à -18O0C. Slow cell freezing was performed at -800C in 10% IMDM-10% FBS-10% DMSO medium for 24 to 72 hours, then the cells were stored in liquid nitrogen at -1800C.
2) Production d'anticorps in vivo
On utilise des souris femelles ayant de 4 à 6 semaines, de l'espèce BALB/C, de la souche BALB/C BYJICO (IFFA Credo).2) In vivo antibody production
4- to 6-week old female mice, BALB / C species, BALB / C BYJICO strain (IFFA Credo) are used.
On a préparé une suspension cellulaire du clone 13B5 que l'on a centrifugé à 200 G pendant 10 minutes à 250C. Puis on a remis en suspension les cellules dans du NaCI 9 à raison de 106 cellules/ml. A cell suspension of clone 13B5 was prepared which was centrifuged at 200 G for 10 minutes at 250C. The cells were then resuspended in NaCl 9 at 10 6 cells / ml.
On a injecté 106 cellules dans chaque souris par voie intrapéritonéale. In each mouse, 106 cells were injected intraperitoneally.
On a ensuite récolté le liquide ascite après 10 jours +/- 2 jours. The ascites fluid was then collected after 10 days +/- 2 days.
3) Identification de l'anticorps 13B5 sécrété par 'hybridome.
a) ELISA indirect.3) Identification of the 13B5 antibody secreted by hybridoma.
a) Indirect ELISA.
On a utilisé pour 'ELISA indirect des plaques de polystyrène
Maxisorb NUNC (commercialisée par la société Polylabo Paul Block sous la référence 4-39454), coatées avec 100 1ll d'antigènes p24 recombinante à 1 ,ug/ml en tampon bicarbonate (NaHCO3 0,05M; pH 9,6). On a laissé la plaque incuber pendant une nuit à 220C.Indirect ELISA was used for polystyrene plates.
Maxisorb NUNC (sold by the company Polylabo Paul Block under the reference 4-39454), coated with 100 μl of recombinant p24 antigens at 1 μg / ml in bicarbonate buffer (0.05M NaHCO3, pH 9.6). The plate was allowed to incubate overnight at 220C.
On a saturé avec 100 ijI de tampon PBS (50 mM Phosphate et 150 mM NaCI, pH 7,2) additionné de 1 % d'extrait de lait lyophilisé Régilait durant 1 heure à 370C. It was saturated with 100 μl of PBS buffer (50 mM Phosphate and 150 mM NaCl, pH 7.2) supplemented with 1% freeze dried milk extract.
On a ajouté 100 l de surnageant de culture ou de liquide d'ascite, obtenu au paragraphe précédent, dilués en PBS-Tween 20 à 0,05%, puis on a laissé incuber une heure à 370C. 100 μl of culture supernatant or ascites fluid, obtained in the previous paragraph, diluted in 0.05% PBS-Tween 20, were added and incubated for one hour at 37 ° C.
On a ajouté ensuite 100 'il d'immunoglobulines anti-lg (H+L) de souris conjuguées à la phosphatase-alcaline (Jackson Laboratories
Référence 115-055-062) dilué au 1/2000 dans du tampon PBS-BSA 1% (phosphate buffer saline-bovine serum albumine), pendant une heure à 370C.100 μl of anti-Ig (H + L) immunoglobulin from phosphatase-alkaline conjugated mice were then added (Jackson Laboratories
Reference 115-055-062) diluted 1/2000 in 1% PBS-BSA buffer (saline-bovine serum albumin phosphate buffer) for one hour at 370C.
On a alors ajouté 100 ,ul de p-nitrophényl phosphate ((pNPP), commercialisé par bioMérieux, référence 60002990) à la concentration de 2 mg/ml dans de la DEA-HCL (commercialisé par bioMérieux, référence 60002989), pH 9,8, et on a laisser incuber 30 minutes à 370C. 100 μl of p-nitrophenyl phosphate ((pNPP), marketed by bioMérieux, reference 60002990) at a concentration of 2 mg / ml in DEA-HCL (marketed by bioMérieux, reference 60002989), pH 9, was then added. 8, and incubate 30 minutes at 370C.
On a ensuite bloqué la réaction avec 100 l de NaOH 1N. The reaction was then blocked with 100 l of 1N NaOH.
On effectue 3 lavages entre chaque étape avec 300 pI de PBS
Tween 20 à 0,05% et un lavage supplémentaire en eau distillée avant d'ajouter le pNPP.3 washes are carried out between each step with 300 μl of PBS
Tween 20 at 0.05% and an additional wash in distilled water before adding the pNPP.
L'ELISA montre que l'anticorps 13B5 reconnait spécifiquement la p24 du HIV-1. L'anticorps 13B5 est d'isotype IgG1,k.
b) Utilisation de l'anticorps 13B5 en Western-blot:
On a déposé la p24 sur SDS-Tricine PAGE 16,5% (Tricine
Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis for the
Separation of Proteins in the Range from 1 to 100kDa; Hermann Schägger and Gebhard von Jagow, Analytical Biochemistry 166, 368-379 (1987)) puis on l'a transférée électriquement sur une membrane de nitrocellulose (Hybond C Amersham). On a ensuite saturé la membrane par une solution
PBS-Régilait 3% pendant 20 minutes à température ambiante. La membrane a ensuite été reprise puis mise à incuber dans une solution de
PBS-Régilait 3% Tween 0,05% contenant l'anticorps 13B5 dilué à 10,ag/ml, à température ambiante, pendant 1 heure 30 minutes. On a alors repris la membrane, on l'a lavée 3 fois en PBS-Tween 0,05%, puis incubée en présence d'un conjugué, anticorps anti-souris marqué à la phosphatase alcaline, dilué à environ 1 ,ug/ml, pendant 1 heure à température ambiante.The ELISA shows that the 13B5 antibody specifically recognizes the p24 of HIV-1. The 13B5 antibody is IgG1 isotype, k.
b) Use of the 13B5 antibody in Western blot:
The p24 was deposited on SDS-Tricine PAGE 16.5% (Tricine
Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis for the
Separation of Proteins in the Range from 1 to 100kDa; Hermann Schägger and Gebhard von Jagow, Analytical Biochemistry 166, 368-379 (1987)) and then electrically transferred to a nitrocellulose membrane (Hybond C Amersham). The membrane was then saturated with a solution
PBS-Regulated 3% for 20 minutes at room temperature. The membrane was then taken up and incubated in a solution of
PBS-Regilait 3% 0.05% Tween containing 13B5 antibody diluted to 10 μg / ml at room temperature for 1 hour 30 minutes. The membrane was then taken up, washed 3 times with PBS-0.05% Tween, and then incubated in the presence of a conjugate, anti-mouse antibody labeled with alkaline phosphatase, diluted to approximately 1 μg / ml. for 1 hour at room temperature.
On effectue la révélation des conjugués par une solution de béta-naphtyl acide phosphate 0,5mg/ml et la O-Dianisidine 0,5mg/ml dans du tampon tétraborate 12,07g/l, MgS04 1,2g/l, pH 9. Une bande unique est observée de poids moléculaire attendu, environ 27000, compatible avec le poids moléculaire théorique de la p24, 26707. L'anticorps 13B5 reconnaît de façon spécifique la p24 en western-blot.
c) Test sandwich antigène p24:
Les expériences suivantes ont été effectuées en Vidas (commercialisé par bioMérieux) sur le modèle suivant:
On a adsorbé de la p24 diluée dans du PBS à 0,5 pg/ml, 350 pl par cône Vidas.The conjugates are clarified with a solution of beta-naphthyl phosphate acid 0.5 mg / ml and O-Dianisidine 0.5 mg / ml in tetraborate buffer 12.07 g / l, MgSO4 1.2 g / l, pH 9. A single band is observed of expected molecular weight, about 27,000, compatible with the theoretical molecular weight of p24, 26707. The 13B5 antibody specifically recognizes p24 in Western blot.
c) Antigen sandwich test p24:
The following experiments were performed in Vidas (marketed by bioMérieux) on the following model:
P24 diluted in PBS at 0.5 μg / ml, 350 μl per Vidas cone was adsorbed.
On a lavé avec 600,ul de tampon PBS-Tween 20 à 0,1%. It was washed with 600 μl of PBS-Tween 20 0.1% buffer.
On a saturé par 400 pI de tampon Tris 200 mM, NaCI 150 mM, acide maléique 200 mM, NaOH 150 mM, Tween 20 à 0,05% et pH 6,1. It was saturated with 400 μl of 200 mM Tris buffer, 150 mM NaCl, 200 mM maleic acid, 150 mM NaOH, 0.05% Tween 20 and pH 6.1.
On a lavé par 600 p de tampon PBS-Tween 20 à 0,1%. It was washed with 600 μl of 0.1% PBS-Tween 20 buffer.
On a dilué l'anticorps 13B5 une première fois 1000 fois à environ 10 pg/ml, puis de 10 en 10, dans un tampon Tris 100 mM, NaCI 300 mM, Tween 20 à 5 %, BSA 2%, Régilait 0,2%, pH 7. L'anticorps 13B5 est ensuite ajouté et incubé à 370C. Antibody 13B5 was diluted a first time 1000 times to about 10 μg / ml, then 10 to 10, in 100 mM Tris buffer, 300 mM NaCl, 5% Tween 20, 2% BSA, 0.2% Regilait %, pH 7. The 13B5 antibody is then added and incubated at 370C.
On lave ensuite par 600 l de tampon PBS-Tween 200,1%. It is then washed with 600 l of PBS-Tween 200.1% buffer.
On met ensuite à incuber à 370C 100 ng de p24, couplée à la biotine, dans 400 p de tampon PBS Régilait 0,25%, Tween 20 à 0,05%. 100 ng of p24, coupled with biotin, are then incubated at 370 ° C. in 400 μl of 0.25% Regilait PBS buffer and 0.05% Tween 20.
On lave ensuite par 600 pI de tampon PBS-Tween 20 à 0,1 %. Then washed with 600 μl PBS-Tween 20 0.1% buffer.
On met alors à incuber le conjugué steptavidine-phosphatasealcaline à 370C dans 400 pI de tampon Tris 100 mM, BSA 0,25%, NaCI 300 mM, Tween 20 à 0,25%, Régilait 0,25%, pH 7,4. The steptavidin-phosphatasalkaline conjugate is then incubated at 370 ° C. in 400 μl of 100 mM Tris buffer, 0.25% BSA, 300 mM NaCl, 0.25% Tween 20, 0.25% Regilait, pH 7.4.
On lave ensuite par 600 pI de tampon PBS-Tween 200,1%. It is then washed with 600 μl of PBS-Tween 200.1% buffer.
Après révélation des conjugués p24/anticorps 13B5/p24biotine/streptavidine-phosphatase-alcaline, on détecte un signal positif qui caractérise la présence de l'anticorps 13B5. L'anticorps 13B5 reconnait spécifiquement la p24 dans un test sandwich antigène. After revealing the p24 / 13B5 / p24biotin / streptavidin-alkaline phosphatase conjugates, a positive signal is detected which characterizes the presence of the 13B5 antibody. The 13B5 antibody specifically recognizes p24 in an antigen sandwich test.
4) Extraction des ARNm produits par les cellules hybridomes. 4) Extraction of mRNAs produced by hybridoma cells.
L'ARN total des cellules hybridomes a été extrait suivant une technique dérivée de la méthode de Chomczynski (1987) en utilisant le kit
CLONsep TM (commercialisé par Clontech). La purification d'ARNm à partir de l'ARN total a été réalisée à partir du kit mRNA separator (TM) de
CLONTECH.The total RNA of the hybridoma cells was extracted according to a technique derived from the method of Chomczynski (1987) using the kit
CLONsep TM (marketed by Clontech). Purification of mRNA from total RNA was performed from the mRNA separator (TM) kit of
Clontech.
Environ 30 pg de l'ARNm ont été obtenus à partir de 108 cellules d'hybridomes avec une pureté raisonnable (A260/A280= =
5) Transcription réverse en ADNc
Les molécules d'ARNm ont été transcrites réversement en ADN complémentaires simples brins suivant le protocole du kit Advantage TM
CLONTECH à partir d'amorces aléatoires d'ADN de six mers et de la transcriptase réverse du virus MMLV.About 30 μg of the mRNA was obtained from 108 hybridoma cells with reasonable purity (A260 / A280 = =
5) Reverse transcript in cDNA
The mRNA molecules were reverse transcribed into single-stranded complementary DNA according to the Advantage TM kit protocol.
CLONTECH from six-sea DNA random primers and MMLV virus reverse transcriptase.
6) Sélection et amplification du gène codant pour le fragment
Fab de l'anticorps 13B5
La solution d'ADNc contenait un mélange de tous les ADNc simples brins issus de la transcription réverse de tous les ARNm produits par les cellules hybridomes. Aussi était-il nécessaire de sélectionner et d'amplifier l'ADN avec des amorces d'ADN préalablement choisies.6) Selection and amplification of the gene coding for the fragment
13B5 antibody Fab
The cDNA solution contained a mixture of all single-stranded cDNAs derived from the reverse transcription of all the mRNAs produced by the hybridoma cells. Thus, it was necessary to select and amplify the DNA with previously selected DNA primers.
- choix des amorces d'ADN:
Le séquençage N-terminal des chaînes légère et lourde a été réalisé de manière automatique par dégradation d'Edman. Seuls les 10 premiers acides aminés de la chaîne légère ont pu être déterminés:
EIVLTQSPAI. II semble que le premier acide aminé N-terminal de la chaîne lourde était protégé par un groupe acétyl, devenu ainsi non modifiable chimiquement par l'isothiocyanate de phényl. A partir de la séquence peptidique N-terminale de la chaîne légère, de l'usage des codons chez la souris et de la stabilité des amorces d'ADN, il a été possible de définir des oligonucléotides dégénérés. de 5' vers 3':
VLK2 GAA ATT GTK CT(G,C) AC(C,T) CAG TCT CC (oligo direct)
CLKB GTT GAA GCT CTT GAC (A,G) AT GGG (oligo réverse)
D'autre part, le choix d'amorces d'ADN pour la chaîne lourde a été réalisé à partir des séquences connues des chaînes lourdes de souris de type IgGl,k (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest. Fifth edition, 1991). de 5' vers 3':
VHA GAG GTG CAG CT(G,T) CAG CAG TC(A,T) GG (oligo direct)
CH GTC CAC CTT GGT GCT GCT (oligo réverse)
- résultats de PCR:
Des essais de PCR ont été réalisés à différentes températures d'hybridation, avec différentes concentrations d'ADNc et d'amorces d'ADN. Pour évaluer la stringence des réactions, des contrôles ont été réalisés dans les mêmes conditions avec une seule amorce d'ADN par milieu réactionnel afin d'éliminer les conditions d'amplification non spécifiques.- choice of DNA primers:
N-terminal sequencing of light and heavy chains was done automatically by Edman degradation. Only the first 10 amino acids of the light chain could be determined:
EIVLTQSPAI. It appears that the first N-terminal amino acid of the heavy chain was protected by an acetyl group, thus becoming non-chemically modifiable by phenyl isothiocyanate. From the N-terminal peptide sequence of the light chain, codon usage in mice, and stability of DNA primers, it has been possible to define degenerate oligonucleotides. from 5 'to 3':
VLK2 GAA ATT GTK CT (G, C) AC (C, T) CAG TCT CC (direct oligo)
CLKB GTT GAA GCT GAC CTT (A, G) AT GGG (reverse oligo)
On the other hand, the choice of DNA primers for the heavy chain has been made from the known heavy chain sequences of mouse type IgG1, k (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest. 1991). from 5 'to 3':
VHA GAG GTG CAG CT (G, T) CAG CAG TC (A, T) GG (direct oligo)
CH GTC CAC CTT GGT GCT GCT (reverse oligo)
- PCR results:
PCR assays were performed at different hybridization temperatures, with different concentrations of cDNA and DNA primers. To evaluate the stringency of the reactions, controls were carried out under the same conditions with a single DNA primer per reaction medium in order to eliminate non-specific amplification conditions.
10 à 100 ng d'ADNc ont été utilisés par PCR. 10 to 100 ng of cDNA were used by PCR.
Les réactions de PCR ont été réalisées dans un mélange réactionnel de 50 pI variant suivant la chaîne à amplifier (cf Tableau I). The PCR reactions were carried out in a reaction mixture of 50 pI varying according to the chain to be amplified (cf Table I).
Le milieu réactionnel contenait un mélange de deux ADN polymérases: TAQ et PWO (Expand Long Template system de Boerhinger
Mannheim).The reaction medium contained a mixture of two DNA polymerases: TAQ and PWO (Boerhinger Expand Long Template system
Mannheim).
Le tableau I suivant présente les mélanges réactionnels de PCR des chaînes légère et lourde du fragment Fab de l'anticorps 13B5. The following Table I shows the PCR reaction mixtures of the light and heavy chains of the Fab fragment of the 13B5 antibody.
Tableau I
<tb> Milieu <SEP> réactionnel <SEP> Chaîne <SEP> lé <SEP> ère <SEP> Chaîne <SEP> lourde
<tb> ADNc <SEP> ( g) <SEP> 0,01 <SEP> 0,1
<tb> Amorces <SEP> d'ADN <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> pour <SEP> VHA
<tb> (pmoles) <SEP> 10 <SEP> pour <SEP> CH
<tb> dNTP <SEP> (mM) <SEP> 0,2 <SEP> 0,2
<tb> M <SEP> Cl2 <SEP> (mM) <SEP> 1,75 <SEP> 1,75
<tb> ol <SEP> mérases <SEP> (unités) <SEP> 2,8 <SEP> 2,8
<tb>
L'amplification a commencé par une dénaturation de 2 minutes à 940C puis s'est poursuivie par 30 cycles identiques comprenant une phase de dénaturation de 30 secondes à 940C, une phase d'hybridation de 30 sec à 60"C puis une phase d'élongation de 2 minutes à 68 C. <tb> Medium <SEP> reaction <SEP> String <SEP><SEP><SEP> String <SEP> heavy
<tb> cDNA <SEP> (g) <SEP> 0.01 <SEP> 0.1
<tb> Primers <SEP> of DNA <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> for <SEP> HAV
<tb> (pmoles) <SEP> 10 <SEP> for <SEP> CH
<tb> dNTP <SEP> (mM) <SEP> 0.2 <SEP> 0.2
<tb> M <SEP> Cl2 <SEP> (mM) <SEP> 1.75 <SEP> 1.75
<tb> ol <SEP> merases <SEP> (units) <SEP> 2.8 <SEP> 2.8
<Tb>
The amplification began with a denaturation of 2 minutes at 940C and then continued with 30 identical cycles comprising a denaturation phase of 30 seconds at 940C, a hybridization phase of 30 sec at 60 ° C and then a phase of elongation of 2 minutes at 68 C.
Après ces cycles, le milieu réactionnel a été soumis à une élongation de 6 minutes à 680C, puis conservé à 40C.After these cycles, the reaction medium was subjected to an elongation of 6 minutes at 680C, then stored at 40C.
L'analyse des produits de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose 1,5% de 8 pI du mélange réactionnel, a montré l'existence d'un produit fortement majoritaire correspondant à la taille des fragments attendus dans les deux cas (680 pb environ pour chaque chaîne). Analysis of the PCR products by 1.5% agarose gel electrophoresis of 8 μl of the reaction mixture, showed the existence of a strongly predominant product corresponding to the size of the fragments expected in both cases (680 bp). about for each string).
7) Clonage
Les produits de PCR ont été clonés dans le vecteur pTAg (R & D
Systems) pour la chaîne lourde et dans le vecteur pUAg (R & D Systems) pour la chaîne légère. les bactéries issues des cellules de type DHi (R & D
Systems) ont été transformées avec ces plasmides issus de la ligation puis étalées sur milieu Luria broth (LB) solide additionné d'Ampicilline, d'lPTG, de Tétracycline et d'X-gal. Les colonies blanches ont ensuite été analysées par digestion de leur ADN plasmidique préalablement extrait (avec EcoRI et Hindlil pour le plasmide pTAg et EcoRI seul pour le plasmide pUAg).7) Cloning
The PCR products were cloned into the pTAg vector (R & D
Systems) for the heavy chain and in the pUAg vector (R & D Systems) for the light chain. bacteria from DHi type cells (R & D
Systems) were transformed with these plasmids from ligation and spread on solid Luria broth (LB) medium supplemented with Ampicillin, IPTG, Tetracycline and X-gal. The white colonies were then analyzed by digestion of their previously extracted plasmid DNA (with EcoRI and HindIII for the plasmid pTAg and EcoRI alone for the plasmid pUAg).
8) Production et séquençage de l'ADN codant pour le fragment
Fab de l'anticorps 13B5
L'ADN plasmidique a été extrait suivant le protocole du Kit
Qiagen plasmid midi. Cette technique est basée sur une lyse alcaline modifiée suivie d'une purification sur colonne échangeuse d'anions.8) Production and Sequencing of the DNA Encoding the Fragment
13B5 antibody Fab
Plasmid DNA was extracted according to the Kit protocol
Qiagen plasmid midi. This technique is based on modified alkaline lysis followed by purification on anion exchange column.
Environ 100 pg d'ADN plasmidique a pu être extrait à partir de chaque culture de 50 ml (LB-ampicilline).About 100 μg of plasmid DNA could be extracted from each 50 ml (LB-ampicillin) culture.
L'ADN plasmidique d'un clone pour chaque chaîne a été séquencé manuellement sur le brin direct et réverse en utilisant des oligonucléotides internes à la séquences des gènes. Afin d'éviter des possibles erreurs d'interprétation des séquences dues au fait des erreurs de la polymérase lors de l'amplification, 5 autres clones contenant le gène codant pour la chaîne légère et 5 autres clones contenant le gène codant pour la chaîne lourde ont été séquencés entièrement dans les deux sens. The plasmid DNA of a clone for each chain was sequenced manually on the forward strand and reversed using oligonucleotides internal to the gene sequence. In order to avoid possible errors of interpretation of the sequences due to the errors of the polymerase during the amplification, 5 other clones containing the gene encoding the light chain and 5 other clones containing the gene coding for the heavy chain have been sequenced entirely in both directions.
Le séquençage de ces 10 clones a été réalisé sur un séquenceur automatique. Après correction des spectres et alignement des séquences de chaque clone (environ 4 à 6 séquences par clones), une séquence consensus pour chacun a été déduite en remplaçant les bases ambigues par un N. Une séquence en acides aminés a été déduite de ces séquences en nucléotides pour chaque clone puis toutes ces séquences en acides aminés ont été alignées pour la chaîne lourde et pour la chaîne légère du fragment Fab de l'anticorps 13B5. Les ambiguités résiduelles s'exprimant au niveau des acides aminés ont été levées par une relecture des spectres aux endroits problématiques.Sequencing of these 10 clones was performed on an automatic sequencer. After correcting the spectra and aligning the sequences of each clone (approximately 4 to 6 sequences per clone), a consensus sequence for each was deduced by replacing the ambiguous bases with an N. An amino acid sequence was deduced from these sequences by nucleotides for each clone and then all these amino acid sequences were aligned for the heavy chain and for the light chain of the Fab fragment of the 13B5 antibody. Residual ambiguities expressed at the amino acid level were lifted by a re-reading of the spectra at problematic locations.
On a obtenu les séquences en acide aminé des chaînes lourde et légère présentées à la figure 1 et à la figure 2. The amino acid sequences of the heavy and light chains shown in Figure 1 and Figure 2 were obtained.
Exemple 2: Description d'un procédé de réalisation d'un anticorps recombinant à partir de la séquence du Fab13B5. Example 2: Description of a method for producing a recombinant antibody from the sequence of Fab13B5.
Le procédé décrit a pour objectif de réaliser un anticorps recombinant ou ScFv (Single chain Fv) à partir des clones codant respectivement pour les chaînes lourde et légère du Fab. On utilisera pour effectuer ce procédé le kit Pharmacia " Recombinant Phage antibody system " (référence 27 9401-01, 27902-01, 279043-01).
a) Clonage des régions variables des chaînes lourde et légère:
Les gènes codant pour les régions hypervariables des chaînes lourde (VH) et légère (VL) seront amplifiées par PCR, à partir des plasmides isolés au cours de l'exemple 1, paragraphe 7, clonage, à l'aide d'amorces choisies dans les régions " framework " des régions variables des immunoglobulines. On utilisera dans la suite les kits de Pharmacia. Les produits de PCR résultant seront ensuite assemblés, à l'aide d'un linker, en un seul gène (750 pb) unique codant pour un Scfv.The method described has the objective of producing a recombinant antibody or ScFv (single chain Fv) from the clones coding respectively for the heavy and light chains of the Fab. The Pharmacia kit "Recombinant Phage antibody system" (reference 27 9401-01, 27902-01, 279043-01) will be used for this process.
a) Cloning of the variable regions of the heavy and light chains:
The genes coding for the hypervariable regions of the heavy (VH) and light (VL) chains will be amplified by PCR, starting from the plasmids isolated in example 1, paragraph 7, cloning, using primers chosen from the "framework" regions of the variable regions of immunoglobulins. Pharmacia kits will be used in the following. The resulting PCR products will then be assembled, using a linker, into a single single gene (750 bp) encoding a Scfv.
On obtiendra le fragment Scfv constitué des régions VH et VL séparées par la séquence peptidique (GGGGS)3. The Scfv fragment consisting of the VH and VL regions separated by the peptide sequence (GGGGS) 3 will be obtained.
On procèdera ensuite à l'amplification du gène Scfv avec des amorces spécifiques des extrémités 5' du VH et 3' du VL et contenant respectivement les sites de restriction Sfil et Notl. The Scfv gene will then be amplified with primers specific for the 5 'ends of the VH and 3' of the VL and containing respectively the SfiI and NotI restriction sites.
On digérera ensuite le produit d'amplification résultant par des enzymes de restriction Sfil et Notl, puis on liguera avec le phagémide pCANTAB5E préalablement ouvert par les enzymes de restriction Sfil et
Notl .
b) Expression du Scfv:
Afin d'exprimer le Scfv, des bactéries E.coli de type SupE (TG1) seront transformées par le pCANTAB5E contenant le gène du Scfv.The resulting amplification product will then be digested with Sfil and NotI restriction enzymes, followed by ligation with phagemid pCANTAB5E previously opened with restriction enzymes SfiI and
Notl.
b) Expression of Scfv:
In order to express Scfv, SupE type E.coli bacteria (TG1) will be transformed by pCANTAB5E containing the Scfv gene.
Les colonies contenant le phage seront infectées par un phage helper
M13K07 pour produire des phages recombinants qui contiennent le gène codant pour le ScfV. Ces phages recombinants expriment par ailleurs à leur surface une ou plusieurs copies de Scfv sous forme de protéine de fusion Scfv-g3p.Phage-containing colonies will be infected by phage helper
M13K07 to produce recombinant phages that contain the gene encoding ScfV. These recombinant phages also express on their surface one or more copies of Scfv in the form of Scfv-g3p fusion protein.
On sélectionnera un phage recombinant produisant un Scfv fonctionnel. On réalisera la sélection en ELISA par fixation des phages à l'antigène spécifique du Scfv, puis on mettra en évidence des complexes formés à l'aide d'un anticorps anti-phage M13 et d'un conjugué anticorps anti-espèce marqué à la phosphatase-alcaline (ou peroxydase). On réalisera 3 cycles consécutifs sélection/enrichissement afin d'obtenir une population de phages exempte de phages n'exprimant pas le Scfv. Après sélection, on utilisera les phages recombinants exprimant le Scfv pour infecter des bactéries E.coli HB2151 (souche non suppressive) afin de produire l'anticorps recombinant sous forme soluble. A recombinant phage producing a functional Scfv will be selected. The selection will be carried out by phage binding ELISA to Scfv-specific antigen, then complexes formed using an anti-M13 phage antibody and a labeled anti-species antibody conjugate will be demonstrated. alkaline phosphatase (or peroxidase). Three consecutive selection / enrichment cycles will be performed to obtain a phage-free phage population that does not express Scfv. After selection, recombinant phages expressing Scfv will be used to infect E. coli HB2151 bacteria (non-suppressive strain) to produce the recombinant antibody in soluble form.
L'homme du métier pourra ainsi obtenir, en utilisant notamment le Kit Pharmacia, des anticorps recombinants correspondant à la partie Fab de l'anticorps 13B5. Those skilled in the art will thus be able to obtain, using in particular the Pharmacia Kit, recombinant antibodies corresponding to the Fab portion of the 13B5 antibody.
Exemple 3 : spécificité et sensibilité de l'anticorps 13B5
Résultats d'un test ELISA indirect:
La protéine p24 est adsorbée sur une plaque ELISA de type
Maxisorb de NUNC (polystyrène) dans du PBS à raison de 25 ng par puits pendant 2 heures à 370C.Example 3 Specificity and Sensitivity of the 13B5 Antibody
Results of an indirect ELISA test:
The p24 protein is adsorbed on an ELISA plate of the type
Maxisorb of NUNC (polystyrene) in PBS at 25 ng per well for 2 hours at 370C.
On a ensuite saturé la plaque par 200 ml de tampon PBS
Tween 20 à 0,05% BSA 3% pendant 2 heures à 370C.The plate was then saturated with 200 ml of PBS buffer.
Tween 20 at 0.05% BSA 3% for 2 hours at 370C.
L'anticorps 13B5 couplé à la biotine est ensuite dilué à 1 pg/ml, puis de 4 en 4 dans du tampon PBS-Tween 20 à 0,05% BSA 1%. On a alors mis 200 pI par puits de chaque dilution à incuber avec la p24 pendant 2 heures à 370C. The 13B5 antibody coupled to the biotin is then diluted to 1 μg / ml and then 4 to 4 in PBS-Tween 20 0.05% BSA 1% buffer. 200 μl per well of each dilution was then incubated with p24 for 2 hours at 370 ° C.
On a ensuite mis 200 ,ul par puits d'une dilution de streptavidine phosphatase alcaline à 0,5 pg/ml dans du tampon PBS
Tween 20 à 0,05% BSA 1 %, à incuber pendant 30 minutes à 370C.200 μl per well of a 0.5 μg / ml dilution of streptavidin alkaline phosphatase in PBS buffer was then added.
Tween 20 at 0.05% BSA 1%, incubate for 30 minutes at 370C.
On a révélé les complexes p24/anticorps 13B5 biotinilés/streptavidine-phosphatase-alcaline par 100 pI d'une solution de pNPP (p-nitrophényl phosphate > en tampon diéthanolamine 1M/MgCI2 0,5 mM pH 9 pendant 15 minutes à 370C. On a alors bloqué la réaction par addition de 100 pI de NaOH 1M. La densité optique est lue à 405 nm. P24 / biotinylated antibody / streptavidin-alkaline phosphatase complexes were revealed per 100 μl of a solution of pNPP (p-nitrophenyl phosphate) in 1 M diethanolamine buffer / 0.5 mM MgCl 2 pH 9 for 15 minutes at 370 ° C. The reaction was then blocked by the addition of 100 μl 1M NaOH and the optical density read at 405 nm.
Après chaque étape, la plaque est lavée 3 fois par du tampon
PBS-Tween 20 à 0,05%.After each step, the plate is washed 3 times with buffer
PBS-Tween 20 at 0.05%.
Le test ELISA indirect a été effectué pour l'anticorps 13B5 ainsi que pour des anticorps polyclonaux anti-p24 et deux autres anticorps monoclonaux 23A5 et 15F8 décrits dans les références bibliographiques 1, 2 et 3. Les résultats sont donnés par la figure 3. The indirect ELISA test was carried out for the 13B5 antibody as well as for polyclonal anti-p24 antibodies and two other monoclonal antibodies 23A5 and 15F8 described in the references 1, 2 and 3. The results are given in FIG.
L'anticorps 13B5 reconnaît la p24 en ELISA indirect. II donne un signal de détection supérieur à ceux obtenus pour les autres anticorps et le signal maximum de détection est atteint pour une concentration en anticorps de environ 0,2 pg/ml. Les anticorps polyclonaux et les anticorps monoclonaux 15F8 et 23A5 donnent, en revanche, un signal de détection maximum pour une concentration en anticorps nettement supérieure, de environ 1 ,ug/ml pour le 15F8 et le polyclonal, et supérieur à 1 pg/ml pour le 23A5. The 13B5 antibody recognizes p24 as an indirect ELISA. It gives a detection signal higher than those obtained for the other antibodies and the maximum detection signal is reached for an antibody concentration of about 0.2 μg / ml. On the other hand, polyclonal antibodies and monoclonal antibodies 15F8 and 23A5 give a maximum detection signal for a significantly higher antibody concentration of about 1 μg / ml for 15F8 and polyclonal and greater than 1 μg / ml for the 23A5.
Ces résultats montrent que l'anticorps 13B5 reconnaît le p24 avec une affinité supérieure à celle des anticorps polyclonaux et des anticorps monoclonaux 15F8 et 23A5. These results show that the 13B5 antibody recognizes p24 with greater affinity than polyclonal antibodies and monoclonal antibodies 15F8 and 23A5.
REFERENCE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Immune response to a major epitope of p24 during infection with human immunodeficiency virus type 1 and implications for diagnosis and prognosis.B. Janvier, A. Baillou, Ph. Archinard, M. Mounier, B.BIBLIOGRAPHIC REFERENCE
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Herbmann, S. Emiliani, F. Jean, M. Resnicoff, F. Traincard and C. Devaux.2. Clonal analysis of murine B cell response to the human immunodeficiency virus type 1 gag p17 and p25 antigens. V. Robert
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Mandrand, A. Goudeau and F. Barin. Journal of Virology (1990) 64 n09:4258-4263. Mandrand, A. Goudeau and F. Barin. Journal of Virology (1990) 64: 9 4258-4263.
LISTE DE SEQUENCES
(I) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: BIOMERIEUX
(B) RUE: CHEMIN DE L'ORME
(C) VILLE: MARCY L'ETOILE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 69280
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Anticorps monoclonal et de rives d'un tel anticorps réagissant contre un épitope
de la p24 du V1H- I
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 624 paires de bases
(B) TYPE: ADN génomique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN génomique de la chaîne légère du Fabl3B5 (iii) CARACTERISTIQUES:
CDRIl: de 70 à 99
CDR21: de 145 à 165
CDR31: de 262 à 285
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCAGCCATCACAGCTGCATCTCTGGGGCAAAAGGTCACC 1 + + + + + + 60
CTTTAACACGACTGGGTCAGAGGTCGGTAGTGTCGACGTAGAGACCCCGTTTTCCAGTGG
E I V L T Q S P A I T A A S L G Q K V T
ATCACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGC
61 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 120 TAGTGGACGTCACGGTCGAGTTCACATTCAATGTACGTGACCATGGTCGTCTTCAGTCCG
I T C S A S S S V S Y M H W Y Q Q K S G
ACCTCCCCCAAACCATGGATTTATGAAATATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGC 121 + + ---±--- + + - --- + - + 180
TGGAGGGGGTTTGGTACCTAAATACTTTATAGGTTTGACCGAAGACCTCAGGGTCGAGCG T SP K P Wl Y E ISK LAS G V PAR
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAA 181 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 240
AAGTCACCGTCACCCAGACCCTGGAGAATGAGAGAGTGTTAGTCGTCGTACCTCCGACTT
F S G S G S G T S Y S L T I S S M E A E
GATGCTGCCATTTATTACTGCCAGCAGTGGAATTATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACA 241 + + + + + + 300
CTACGACGGTAAATAATGACGGTCGTCACCTTAATAGGTAAGTGCAAGCCGAGCCCCTGT
D A A I Y Y C Q Q W N Y P F T F G S G T
AAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGT 301 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 360
TTCAACCTTTATTTTGCCCGACTACGACGTGGTTGACATAGGTAGAAGGGTGGTAGGTCA
K L E I K R A D A A P T V S I F P P S S
GAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAA 361 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 420
CTCGTCAATTGTAGACCTCCACGGAGTCAGCACACGAAGAACTTGTTGAAGATGGGGTTT
E Q L T S G G A S V V C F L N N F Y P K
GACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGT 421 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 480
CTGTAGTTACAGTTCACCTTCTAACTACCGTCACTTGCTGTTTTACCGCAGGACTTGTCA
D I N V K W K I D G S E R Q N G V L N S TGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACC 481 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 540
ACCTGACTAGTCCTGTCGTTTCTGTCGTGGATGTCGTACTCGTCGTGGGAGTGCAACTGG
W T D Q D S K D S T Y S M S S T L T L T
AAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACT 541 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 600
TTCCTGCTCATACTTGCTGTATTGTCGATATGGACACTCCGGTGAGTGTTCTGTAGTTGA
K D E Y E R H N S Y T C E A T H K T S T
TCACCCATCGTCAAGAGCTTCAAC 601 ---------±--------±--- 624
AGTGGGTAGCAGTTCTCGAAGTTG SP IV K SF N (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 642 paires de bases
(B) TYPE:ADN génomique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Adn génomique de la chaîne lourde
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: (iii) CARACTERISTIQUES:
CDR1H: de 76 à 105
CDR2H: de 155 à 195
CDR3H: de 295 à 327
GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATG
1 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 60
CTCCACGTCGACGTCGTCAGACCCCGACTTGACCGTTCTGGACCCCGGAGTCACTTCTAC
E V Q L Q Q S G A E L A R P G A S V K M
TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGCTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGG
61 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 120 AGGACGTTCCGAAGACCGATGTGGAAATGATCGATGTGCTACGTGACCCATTTTGTCTCC
S C K A S G Y T F T S Y T M H W V K Q R
CCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCAGTGGTTATAGTAATTAC
121 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 180
GGACCTGTCCCAGACCTTACCTAACCTATGTAATTAGGATCGTCACCAATATCATTAATG
P G Q G L E W I G Y I N P S S G Y S N Y
AATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAC
181 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 240
TTAGTCTTCAAGTTCCTGTTCCGGTGTAACTGACGTCTGTTTAGGAGGTCGTGTCGGATG
N Q K F K D K A T L T A D K S S S T A Y
ATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTTCAAGACCGGTG
241 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 300
TACGTTGACTCGTCGGACTGTAGACTCCTGAGACGTCAGATAATGACAAGTTCTGGCCAC
M Q L S S L T S E D S A V Y Y C S R P V
GTACGACTGGGGTACAACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCTCCACTCTCACAGTCTCCTCA
301 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 360
CATGCTGACCCCATGTTGAAACTGATGACCCCGGTTCCGAGGTGAGAGTGTCAGAGGAGT
V R L G Y N F D Y W G Q G S T L T V S S
GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAAC 361 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 420
CGGTTTTGCTGTGGGGGTAGACAGATAGGTGACCGGGGACCTAGACGACGGGTTTGATTG
A K T T P P S V Y P L A P G S A A Q T N
TCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACC 421 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 480
AGGTACCACTGGGACCCTACGGACCAGTTCCCGATAAAGGGACTCGGTCACTGTCACTGG
S M V T L G C L V K G Y F P E P V T V T
TGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGAC 481 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 540
ACCTTGAGACCTAGGGACAGGTCGCCACACGTGTGGAAGGGTCGACAGGACGTCAGACTG
W N S G S L S S G V H T F P A V L Q S D
CTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTC 541 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 600
GAGATGTGAGACTCGTCGAGTCACTGACAGGGGAGGTCGTGGACCGGGTCGCTCTGGCAG
L Y T L S S S V T V P S S T W P S E T V
ACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGAC 601 ---------±--------±--------±--------±- 642
TGGACGTTGCAACGGGTGGGCCGGTCGTCGTGGTTCCACCTG
T C N V A H P A S S T K V D SEQUENCE LIST
(I) GENERAL INFORMATION:
(i) DEPOSITOR:
(A) NAME: BIOMERIEUX
(B) STREET: ROAD OF THE ORME
(C) CITY: MARCY THE STAR
(E) COUNTRY: FRANCE
(F) POSTAL CODE: 69280
(ii) TITLE OF THE INVENTION: Monoclonal and strand antibodies of such an antibody reacting against an epitope
of the p24 of V1H-I
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 2
(iv) COMPUTER-DEPENDABLE FORM
(A) SUPPORT TYPE: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Version 1.30 (EPO)
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 624 base pairs
(B) TYPE: Genomic DNA
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Fabl3B5 light chain genomic DNA (iii) CHARACTERISTICS:
CDRIl: from 70 to 99
CDR21: 145 to 165
CDR31: from 262 to 285
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCAGCCATCACAGCTGCATCTCTGGGGCAAAAGGTCACC 1 + + + + + + 60
CTTTAACACGACTGGGTCAGAGGTCGGTAGTGTCGACGTAGAGACCCCGTTTTCCAGTGG
EIVLTQSPAITAASLGQKVT
ATCACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGC
61 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± -------- ± --- ----- + 120 TAGTGGACGTCACGGTCGAGTTCACATTCAATGTACGTGACCATGGTCGTCTTCAGTCCG
ITCSASSSVSYMHWYQQKSG
ACCTCCCCCAAACCATGGATTTATGAAATATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGC 121 + + --- --- ± --- + + - --- + - + 180
TGGAGGGGGTTTGGTACCTAAATACTTTATAGGTTTGACCGAAGACCTCAGGGTCGAGCG T SP KP WI YE ISK LAS GV BY
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAA 181 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± -------- ± - ------ + 240
AAGTCACCGTCACCCAGACCCTGGAGAATGAGAGAGTGTTAGTCGTCGTACCTCCGACTT
FSGSGSGTSYSLTISSMEAE
GATGCTGCCATTTATTACTGCCAGCAGTGGAATTATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACA 241 + + + + + + 300
CTACGACGGTAAATAATGACGGTCGTCACCTTAATAGGTAAGTGCAAGCCGAGCCCCTGT
DAAIYYCQQWNYPFTFGSGT
AAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGT 301 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± -------- ± - ------ + 360
TTCAACCTTTATTTTGCCCGACTACGACGTGGTTGACATAGGTAGAAGGGTGGTAGGTCA
KLEIKRADAAPTVSIFPPSS
GAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAA 361 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± -------- ± - ------ + 420
CTCGTCAATTGTAGACCTCCACGGAGTCAGCACACGAAGAACTTGTTGAAGATGGGGTTT
EQLTSGGASVVCFLNNFYPK
GACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGT 421 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± -------- ± - ------ + 480
CTGTAGTTACAGTTCACCTTCTAACTACCGTCACTTGCTGTTTTACCGCAGGACTTGTCA
DINVKWKIDGSERQNGVLNS TGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCTCGGTTGACC 481 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± -------- ± - ------- + 540
ACCTGACTAGTCCTGTCGTTTCTGTCGTGGATGTCGTACTCGTCGTGGGAGTGCAACTGG
WTDQDSKDSTYSMSSTLTLT
AAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACT 541 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± -------- ± - ------ + 600
TTCCTGCTCATACTTGCTGTATTGTCGATATGGACACTCCGGTGAGTGTTCTGTAGTTGA
KDEYERHNSYTCEATHKTST
TCACCCATCGTCAAGAGCTTCAAC 601 --------- ± -------- ± --- 624
AGTGGGTAGCAGTTCTCGAAGTTG SP IV K SF N (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 642 base pairs
(B) TYPE: Genomic DNA
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) MOLECULE TYPE: Genomic DNA of the heavy chain
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: (iii) CHARACTERISTICS:
CDR1H: from 76 to 105
CDR2H: from 155 to 195
CDR3H: from 295 to 327
GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATG
1 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± -------- ± --- ----- + 60
CTCCACGTCGACGTCGTCAGACCCCGACTTGACCGTTCTGGACCCCGGAGTCACTTCTAC
EVQLQQSGAELARPGASVKM
TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGCTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGG
61 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± -------- ± --- ----- + 120 AGGACGTTCCGAAGACCGATGTGGAAATGATCGATGTGCTACGTGACCCATTTTGTCTCC
SCKASGYTFTSYTMHWVKQR
CCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCAGTGGTTATAGTAATTAC
121 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± -------- ± --- ----- + 180
GGACCTGTCCCAGACCTTACCTAACCTATGTAATTAGGATCGTCACCAATATCATTAATG
PGQGLEWIGYINPSSGYSNY
AATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAC
181 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± -------- ± --- ----- + 240
TTAGTCTTCAAGTTCCTGTTCCGGTGTAACTGACGTCTGTTTAGGAGGTCGTGTCGGATG
NQKFKDKATLTADKSSSTAY
ATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTTCAAGACCGGTG
241 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± -------- ± --- ----- + 300
TACGTTGACTCGTCGGACTGTAGACTCCTGAGACGTCAGATAATGACAAGTTCTGGCCAC
MQLSSLTSEDSAVYYCSRPV
GTACGACTGGGGTACAACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCTCCACTCTCACAGTCTCCTCA
301 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± -------- ± --- ----- + 360
CATGCTGACCCCATGTTGAAACTGATGACCCCGGTTCCGAGGTGAGAGTGTCAGAGGAGT
VRLGYNFDYWGQGSTLTVSS
GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAAC 361 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± -------- ± - ------ + 420
CGGTTTTGCTGTGGGGGTAGACAGATAGGTGACCGGGGACCTAGACGACGGGTTTGATTG
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTN
TCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACC 421 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± -------- ± - ------ + 480
AGGTACCACTGGGACCCTACGGACCAGTTCCCGATAAAGGGACTCGGTCACTGTCACTGG
SMVTLGCLVKGYFPEPVTVT
TGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGAC 481 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± -------- ± - ------ + 540
ACCTTGAGACCTAGGGACAGGTCGCCACACGTGTGGAAGGGTCGACAGGACGTCAGACTG
WNSGSLSSGVHTFPAVLQSD
CTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTC 541 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± -------- ± - ------ + 600
GAGATGTGAGACTCGTCGAGTCACTGACAGGGGAGGTCGTGGACCGGGTCGCTCTGGCAG
LYTLSSSVTVPSSTWPSETV
ACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGAC 601 --------- ± -------- ± -------- ± -------- ± - 642
TGGACGTTGCAACGGGTGGGCCGGTCGTCGTGGTTCCACCTG
TCNVAHPASSTKVD
Claims (15)
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9804876A FR2777285B1 (en) | 1998-04-10 | 1998-04-10 | PEPTIDE LIGAND WITH SPECIFIC AFFINITY TO HIV-1 RETROVIRUS P24 PROTEIN |
| AU31519/99A AU3151999A (en) | 1998-04-10 | 1999-04-09 | Peptide ligand having specific affinity for the hiv1 retrovirus p24 protein |
| PCT/FR1999/000831 WO1999053063A1 (en) | 1998-04-10 | 1999-04-09 | PEPTIDE LIGAND HAVING SPECIFIC AFFINITY FOR THE HIV1 RETROVIRUS p24 PROTEIN |
| EP99913376A EP1068319A1 (en) | 1998-04-10 | 1999-04-09 | PEPTIDE LIGAND HAVING SPECIFIC AFFINITY FOR THE HIV1 RETROVIRUS p24 PROTEIN |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9804876A FR2777285B1 (en) | 1998-04-10 | 1998-04-10 | PEPTIDE LIGAND WITH SPECIFIC AFFINITY TO HIV-1 RETROVIRUS P24 PROTEIN |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2777285A1 true FR2777285A1 (en) | 1999-10-15 |
| FR2777285B1 FR2777285B1 (en) | 2000-05-19 |
Family
ID=9525401
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9804876A Expired - Fee Related FR2777285B1 (en) | 1998-04-10 | 1998-04-10 | PEPTIDE LIGAND WITH SPECIFIC AFFINITY TO HIV-1 RETROVIRUS P24 PROTEIN |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1068319A1 (en) |
| AU (1) | AU3151999A (en) |
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Also Published As
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