FR2731355A1 - NOVEL IMMUNOGENS, NEW ANTIBODIES, PREPARATION METHOD AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING THE SAME - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention concerne de nouveaux immunogènes, de nouveaux anticorps obtenus par utilisation de ces immunogènes, leur procédé de préparation et des compositions pharmaceutiques les renfermant. The present invention relates to novel immunogens, novel antibodies obtained by using these immunogens, their method of preparation and pharmaceutical compositions containing them.
La molécule tat est une protéine de régulation du VIH que l'on ne trouve pas dans la particule virale mais qui est codée par le génome du VIH-1. The tat molecule is an HIV regulatory protein that is not found in the virus particle but is encoded by the HIV-1 genome.
A l'intérieur des cellules infectées, cette protéine codée par l'ADN proviral joue un rôle transactivateur de gènes viraux ou cellulaires. Cette protéine de régulation génétique peut cependant se trouver également à l'extérieur des cellules dans le milieu circulant extracellulaire, excrétée au sein de débris de cellules mortes à l'état natif ou fragmentaire ou par processus de sécrétion. Sa présence dans le milieu circulant explique l'existence d'anticorps anti-tat détectables chez certains sujets séropositifs. Dans ce contexte extracellulaire du tat le segment C terminal porteur des résidus RGD reconnus par les intégrines de surface cellulaire et la région basique de la molécule (résidus 45 - 70) vont lui permettre, comme le font les toxines bactériennes, d'agir sur les cellules non infectées de différents tissus.Ainsi la protéine tat circulante agissant comme une véritable toxine virale, peut exercer des effets nocifs sur les cellules endothéliales et en association avec le facteur de croissance
BFGF, contribuer à la néoangiogenèse du Sarcome de Kaposi caractérisant la maladie Sida. La protéine tat circulante peut également aggraver l'immunosuppression qui s'installe progressivement dans le Sida, soit par action immunosuppressive directe sur les cellules T soit en contribuant à dérégler la production d'lFNa par les cellules présentant d'antigène, appelées
APC (macrophages ou cellules dendritiques).Inside the infected cells, this protein encoded by the proviral DNA plays a transactivating role of viral or cellular genes. This genetic regulatory protein can however also be found outside the cells in the extracellular circulating medium, excreted in dead cell debris in the native or fragmentary state or by secretory process. Its presence in the circulating environment explains the existence of detectable anti-tat antibodies in certain seropositive subjects. In this extracellular context of the state, the terminal C segment bearing the RGD residues recognized by the cell surface integrins and the basic region of the molecule (residues 45-70) will allow it, as do the bacterial toxins, to act on the uninfected cells from different tissues.Thus the circulating tat protein acting as a true viral toxin, can exert harmful effects on endothelial cells and in combination with the growth factor
BFGF, contribute to neoangiogenesis of Kaposi's sarcoma characterizing AIDS disease. The circulating tat protein may also aggravate the immunosuppression that gradually sets in AIDS, either by direct immunosuppressive action on T cells or by helping to disrupt the production of IFNa by antigen presenting cells, called
APC (macrophages or dendritic cells).
Le syndrome d'immunodéficience acquise (Sida) est cliniquement défini par une immunosuppression, responsable des infections opportunistes ou par le Sarcome de Kaposi. L'immunosuppression acquise, d'installation progressive au cours de l'infection VIH, se manifeste biologiquement par la perte de réactivité immunologique des cellules T (cytostase et la diminution de production de l'IL2) après stimulation en premier lieu par les antigènes de rappel, puis par les alloantigènes et enfin par les mitogènes (PHA). Cette immunosuppression est associée à la surproduction des interférons a et y (IFNa et y). Acquired immune deficiency syndrome (AIDS) is clinically defined by immunosuppression, responsible for opportunistic infections or by Kaposi's sarcoma. Acquired immunosuppression, which is progressive in the course of HIV infection, is biologically manifested by the loss of T cell immunological reactivity (cytostasis and decreased IL2 production) after stimulation with recall, then by the alloantigens and finally by the mitogens (PHA). This immunosuppression is associated with the overproduction of interferons a and y (IFNa and y).
Les mécanismes cytopathogènes qui induisent l'immunosuppression sont complexes et font intervenir différents facteurs d'origine virale agissant soit directement sur les cellules de l'immunité, lymphocytes T et APC, soit indirectement via le réseau des cytokines. Ainsi la protéine d'enveloppe gp120 portée par la particule de VIH-1 et dont la présence extracellulaire est mesurée par la charge virale sérique peut induire directement l'anergie de cellules T de phénotype CD4. De leur côté les protéines de régulation du VIH, notamment le tat dans sa configuration extracellulaire de toxine virale circulante, semblent également induire une immunosuppression directe des cellules T ou d'autres effets pathogènes, du fait par exemple qu'in vitro les cellules T activées par un antigène de rappel ou par des anticorps anti CD3 ne prolifèrent plus en présence de la molécule tat. The cytopathogenic mechanisms that induce immunosuppression are complex and involve various factors of viral origin acting either directly on the cells of immunity, T cells and APC, or indirectly via the cytokine network. Thus, the gp120 envelope protein carried by the HIV-1 particle and whose extracellular presence is measured by the serum viral load can directly induce CD4 T-cell anergy. On the other hand, the regulatory proteins of HIV, in particular the state in its extracellular configuration of circulating viral toxin, also seem to induce direct immunosuppression of T cells or other pathogenic effects, for example because in vitro activated T cells by a booster antigen or anti-CD3 antibodies no longer proliferate in the presence of the tat molecule.
En outre la protéine tat circulante semble faciliter la surproduction par les APC d'lFNa, cytokine cytostatique et apoptogène susceptible d'amplifier l'immunosuppression et l'apoptose observés dans la maladie Sida. En effet la sécrétion d'lFNa (interféron a) par les macrophages ne semble plus, en présence de tat arrêtée par une rétrorégulation (feedback) qui à l'état normal contrôle cette production d'lFNa (période réfractaire).In addition, the circulating tat protein seems to facilitate overproduction by the APCs of IFNa, a cytostatic and apoptogenic cytokine capable of amplifying the immunosuppression and apoptosis observed in AIDS disease. In fact, secretion of IFNa (interferon a) by macrophages no longer appears in the presence of a tat arrested by feedback control which in the normal state controls this production of IFNa (refractory period).
Le Sarcome de Kaposi se manifeste diniquement par l'apparition de nodules vasculaires représentant une néoangiogenèse constituée à partir de cellules endothéliales. Ces cellules inactivées par des processus inflammatoires engendrant la production de cytokines (IFNy, IL1 et lL6) produisent du BFGF (Basic Fibroblastic Growth Factor) et se multiplient. La prolifération des cellules endothéliales activées in vitro est augmentée par la présence dans le milieu de la protéine tat. Les anticorps anti-tat bloquent in vitro les effets prolifératifs de la protéine tat. L'action du tat sur les cellules endothéliales porteuses à leur surface d'adhésine de la famille des Intégrines s'explique par la présence de la séquence RGD reconnue par ces molécules. Kaposi's sarcoma is manifested by the appearance of vascular nodules representing neoangiogenesis made from endothelial cells. These cells inactivated by cytokine-producing inflammatory processes (IFNy, IL1 and IL6) produce BFGF (Basic Fibroblastic Growth Factor) and multiply. The proliferation of activated endothelial cells in vitro is increased by the presence in the medium of the tat protein. Anti-tat antibodies block in vitro the proliferative effects of tat protein. The action of the tat on the endothelial cells bearing on their adhesin surface of the Integrin family is explained by the presence of the RGD sequence recognized by these molecules.
La néoangiogenèse qui sous-tend in vivo le sarcome de Kaposi serait donc favorisée par la protéine de régulation tat dans sa configuration extracellulaire, qui pourrait être reconnue, grâce à son fragment C terminal contenant la séquence RGD, par les intégrines des cellules endothéliales. De plus le tat pourra également agir par sa région basique riche en résidus K et R, et par conséquent susceptible de se lier à l'héparine sulfate de la matrice extracellulaire qui concentre le facteur de croissance BFGF. Ainsi la prolifération des cellules endothéliales induite par les facteurs de croissance est accrue par la présence de tat et engendre la néoangiogenèse. Cet effet sur la croissance des cellules endothéliales est réduit in vitro par l'action d'anticorps anti-tat. The neoangiogenesis that underlies Kaposi's sarcoma in vivo would therefore be favored by the tat regulatory protein in its extracellular configuration, which could be recognized by its end-C fragment containing the RGD sequence by endothelial cell integrins. In addition the tat can also act by its basic region rich in residues K and R, and therefore likely to bind to heparin sulfate extracellular matrix which concentrates the growth factor BFGF. Thus the proliferation of endothelial cells induced by growth factors is increased by the presence of tat and engenders neoangiogenesis. This effect on endothelial cell growth is reduced in vitro by the action of anti-tat antibodies.
II apparaît donc souhaitable de bloquer l'activité nocive des protéines de régulation des rétrovirus, notamment du tat circulant dans les milieux extracellulaires (sang, lymphe, milieux interstitiels...), véritables toxines virales. It therefore appears desirable to block the harmful activity of the retrovirus regulatory proteins, in particular the circulating state in the extracellular media (blood, lymph, interstitial media, etc.), which are true viral toxins.
Or, on a trouvé avec étonnement que, tout comme les toxines bactériennes (tétanique, diphtérique ou botulique) dont l'activité toxique est neutralisée par des anticorps spécifiques, les effets nocifs des protéines virales de régulation et notamment du tat véritable toxine du VIH dans sa configuration extracellulaire - qu'ils s'exercent par l'immunosuppression des cellules T, par le dérèglement de la production de l'lFNa (interféron a) par les
APC ou par la néoangiogenèse qui sous-tend le Sarcome de Kaposi - sont abolis en présence d'anticorps spécifiques anti-tat, comme on le verra ciaprès dans la partie expérimentale.However, it has been surprisingly found that, just like bacterial toxins (tetanus, diphtheria or botulinum) whose toxic activity is neutralized by specific antibodies, the harmful effects of viral regulation proteins and in particular the true state of the HIV toxin in its extracellular configuration - that they are exerted by the immunosuppression of the T cells, by the dysregulation of the production of lFNa (interferon a) by the
APC or by the neoangiogenesis underlying Kaposi's sarcoma - are abolished in the presence of anti-tat specific antibodies, as will be seen below in the experimental part.
II en est de même avec d'autres protéines de régulation de virus tels que VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2. II serait donc souhaitable de disposer d'immunogènes capables de produire de tels anticorps, de même que disposer de tels anticorps, à des fins tant curatives que préventives. It is the same with other virus regulatory proteins such as HIV-1, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2. It would therefore be desirable to have immunogens capable of producing such antibodies, as well as having such antibodies, for both curative and preventive purposes.
C'est pourquoi la présente demande a pour objet des composés immunogènes, caractérisés en ce qu'ils dérivent d'une protéine de régulation d'un virus VI H-I, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2, par traitement chimique, physique, génétique ou immunologique, bien connu de l'état de la technique, tout en étant reconnus par des anticorps dirigés contre ladite de protéine de régulation, tout en conservant des propriétés immunogènes suffisantes pour créer des anticorps neutralisant ou bloquant ladite protéine native et tout en ayant perdu au moins 50 % des propriétés biologiques toxiques de ladite protéine native. This is why the present application relates to immunogenic compounds, characterized in that they derive from a regulatory protein of a virus VI HI, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2, by chemical treatment, physical, genetic or immunological, well known in the state of the art, while being recognized by antibodies directed against said regulatory protein, while maintaining sufficient immunogenic properties to create antibodies neutralizing or blocking said native protein and all having lost at least 50% of the toxic biological properties of said native protein.
Un traitement chimique peut être par exemple le couplage à une protéine porteuse activée par un pré-traitement à l'aide d'un aldéhyde, de préférence le glutaraldéhyde. A chemical treatment may be for example the coupling to a carrier protein activated by a pre-treatment with an aldehyde, preferably glutaraldehyde.
Un traitement physique peut être par exemple une irradiation et tout particulièrement une irradiation U.V. A physical treatment may be for example an irradiation and especially a U.V irradiation.
Un traitement immunologique peut être par exemple la formation d'un complexe immun entre le composé immunogène et un anticorps spécifique. Un traitement génétique peut être par exemple la préparation d'un peptide identique ou similaire à une séquence peptidique d'une protéine de régulation, telle que la protéine tat, par recombinaison génétique. An immunological treatment may be for example the formation of an immune complex between the immunogenic compound and a specific antibody. A genetic treatment may be, for example, the preparation of a peptide identical or similar to a peptide sequence of a regulatory protein, such as the tat protein, by genetic recombination.
Un peptide ayant une séquence identique ou similaire à une séquence peptidique d'une protéine de régulation, telle que le tat peut aussi être obtenu par synthèse peptidique conventionnelle sur résine. A peptide having a sequence identical or similar to a peptide sequence of a regulatory protein, such as tat can also be obtained by conventional peptide resin synthesis.
Tous ces procédés sont bien connus par l'état de la technique. All these methods are well known from the state of the art.
Afin de vérifier que la protéine de régulation modifiée est bien reconnue par des anticorps dirigés contre ladite protéine de régulation native, on peut par exemple vérifier immunologiquement par Elisa en présence d'anticorps spécifiques, la formation de complexes antigènes-anticorps comme on le verra ci-après dans la partie expérimentale. In order to verify that the modified regulatory protein is well recognized by antibodies directed against said native regulatory protein, one can for example immunologically verify by Elisa in the presence of specific antibodies, the formation of antigen-antibody complexes as will be seen here. -after in the experimental part.
Afin de déterminer si les propriétés immunogènes de la protéine de régulation ont été suffisamment conservées pour créer des anticorps neutralisant ladite protéine native, on peut par exemple immuniser des mammifères (lapins, rats, souris) à l'aide d'un composé immunogène selon l'invention et vérifier que les anticorps produits neutralisent les activités toxiques du tat. In order to determine whether the immunogenic properties of the regulatory protein have been sufficiently conserved to create antibodies that neutralize said native protein, it is possible, for example, to immunize mammals (rabbits, rats, mice) with the aid of an immunogenic compound according to US Pat. invention and verify that the antibodies produced neutralize the toxic activities of the state.
Afin de déterminer si la protéine de régulation modifiée a perdu au moins de 50% de ses propriétés biologiques toxiques, on peut par exemple etudier l'effet du tat inactivé sur l'immunosuppression des cellules T ou sur la néoangiogénèse. In order to determine if the modified regulatory protein has lost at least 50% of its toxic biological properties, one can for example study the effect of the inactivated state on the immunosuppression of T cells or on neoangiogenesis.
L'inactivation de la protéine de régulation tat est vérifiée par exemple par le Tat Rescue Assai utilisant un mutant de HIV non infectieux tat déficient cultivé sur la lignée cellulaire HLM-I dont la réplication dépend d'un apport exogène de tat natif. The inactivation of the tat regulatory protein is verified, for example, by the Tat Rescue Assai using a non-infectious HIV tat mutant deficient cultured on the HLM-I cell line, the replication of which depends on an exogenous supply of native tat.
Le composé immunogène peut dériver d'une quelconque des protéines de régulation des virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 et notamment nef, rev et de préférence tat des virus VIH-1 et VIH-2. The immunogenic compound may be derived from any of the control proteins of the HIV-1, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2 viruses, and especially nef, rev and preferably tat of the HIV-1 and HIV-2 viruses.
On peut aussi citer la protéine tax de HTLV-1 ou HTLV-2. We can also mention the protein tax of HTLV-1 or HTLV-2.
On peut citer également tout particulièrement le peptide
HQVSLSKQPTSQPRGD.We can also particularly mention the peptide
HQVSLSKQPTSQPRGD.
Par dérivent ou dériver d'une protéine de régulation d'un virus VIH1, VIH2, HTLV1 ou HTLV2, I'on entend que le composé immunogène peut être constitué de la totalité ou d'un fragment de la protéine de régulation et peut comporter une ou plusieurs modifications dans les acides aminés de cette protéine ou fragment telles que des délétions, substitutions, additions, ou fonctionnalisations telles qu'acylation d'acides aminés, dans la mesure où ces modifications restent dans le cadre précisé ci-dessus (absence de toxicité, caractères immunologiques).Par exemple, en général le remplacement d'un reste leucine par un reste isoleucine ne modifie pas de telles propriétés, les modifications doivent généralement concemer moins de 30 % d'acides aminés, de préférence moins de 20 % et tout particulièrement moins de 10 %. Un fragment peut comporter de 8 à 60 acides aminés par exemple et de préférence de 12 à 40 acides aminés. On peut citer par exemple les résidus 65-80 en C terminal du tat de VlH-I, un tel résidu peut comporter aussi du ou des côtés C ou N terminal de 1 à 5 acides aminés supplémentaires. By deriving or deriving from a regulatory protein of an HIV1, HIV2, HTLV1 or HTLV2 virus, it is meant that the immunogenic compound may consist of all or a fragment of the regulatory protein and may comprise a or several modifications in the amino acids of this protein or fragment such as deletions, substitutions, additions, or functionalizations such as amino acid acylation, insofar as these modifications remain within the framework specified above (absence of toxicity For example, in general the replacement of a leucine residue by an isoleucine residue does not modify such properties, the modifications must generally contain less than 30% of amino acids, preferably less than 20% and all especially less than 10%. A fragment may comprise from 8 to 60 amino acids for example and preferably from 12 to 40 amino acids. For example, C-terminal residues 65-80 may be mentioned. Such a residue may also have C- or N-terminal side (s) of 1 to 5 additional amino acids.
De manière générale, en ce qui conceme les modifications,
I'homologie ou la similitude entre l'immunogène modifié et la protéine ou partie de protéine native, ainsi que les dimensions du composé immunogène, de même que les modalités d'utilisation, ou de couplage du composé immunogène selon l'invention à une protéine immunogène telle que le toxolde tétanique, on peut en particulier se référer à WO-A 86/06 414 ou à EP-A-0.220.273 ou encore à PCT/US.86/00831, équivalents, dont l'enseignement est incorporé ici par référence.In general, as regards the modifications,
The homology or similarity between the modified immunogen and the protein or part of the native protein, as well as the dimensions of the immunogenic compound, as well as the methods of use, or coupling of the immunogenic compound according to the invention to a protein immunogenic such as tetanus toxoid, it may in particular refer to WO-A 86/06 414 or EP-A-0.220.273 or PCT / US.86 / 00831, equivalents, whose teaching is incorporated here by reference.
Les composés immunogènes selon l'invention dérivant de protéines de régulation seront appelées ci-après dans la partie expérimentale toxoldes viraux . The immunogenic compounds according to the invention derived from regulatory proteins will hereinafter be called in the experimental part viral toxids.
En effet, tout comme les toxoides bactériens classiques, ils sont dépourvus de toxicité propre, mais sont cependant capables de provoquer une immunisation par administration chez un sujet. Indeed, like conventional bacterial toxoids, they are devoid of own toxicity, but are however able to cause immunization by administration in a subject.
Les composés immunogènes selon l'invention peuvent être utilisés comme suit:
On administre à un patient un composé immunogène selon la présente invention, par exemple par voie sous-cutanée ou intramusculaire, en quantité suffisante pour être efficace sur le plan thérapeutique, à un sujet ayant besoin d'un tel traitement. La dose administrée peut aller par exemple de 100 à 1000 pg par voie souscutanée, une fois par mois pendant trois mois, puis périodiquement en fonction du taux des anticorps sériques induits, par exemple tous les 2-6 mois.The immunogenic compounds according to the invention can be used as follows:
A patient is administered an immunogenic compound according to the present invention, for example subcutaneously or intramuscularly, in an amount sufficient to be therapeutically effective, to a subject in need of such treatment. The dose administered may range, for example, from 100 to 1000 μg subcutaneously, once a month for three months, and then periodically depending on the level of serum antibodies induced, for example every 2-6 months.
Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie sous-cutanée, par voie intramusculaire, par voie intraveineuse ou par voie orale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain intervalle de temps. A composition according to the invention may be administered by any conventional route in use in the field of vaccines, in particular subcutaneously, intramuscularly, intravenously or orally. The administration may take place in single or repeated doses one or more times after a certain time interval.
C'est pourquoi la présente demande a également pour objet une composition pharmaceutique, curative ou préventive, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, un composé immunogène tel que défini ci-dessus. Le composé immunogène peut être conditionné seul ou mélangé à un excipient pharmaceutiquement acceptable tel qu'un adjuvant. This is why the present application also relates to a pharmaceutical composition, curative or preventive, characterized in that it comprises as active ingredient, an immunogenic compound as defined above. The immunogenic compound can be packaged alone or admixed with a pharmaceutically acceptable excipient such as an adjuvant.
L'invention a encore pour objet des médicaments caractérisés en ce qu'ils sont constitués des composés immunogènes tels que définis cidessus, à savoir des composés immunogènes ci-dessus pour leur utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique du corps humain ou animal, ainsi que l'utilisation d'un tel composé immunogène pour la préparation d'un médicament curatif ou préventif destiné au traitement ou à la prévention des effets nocifs des protéines de régulation ci-dessus, et notamment du tat. The subject of the invention is also medicaments characterized in that they consist of the immunogenic compounds as defined above, namely immunogenic compounds above for their use in a method of therapeutic treatment of the human or animal body, as well as the use of such an immunogenic compound for the preparation of a curative or preventive drug for the treatment or prevention of the harmful effects of the above regulatory proteins, and in particular the tat.
L'administration de composés immunogènes selon l'invention correspond à une immunothérapie active. II peut être intéressant également de procéder à une immunothérapie passive, c'est à dire de foumir à un patient directement des anticorps dont il a besoin pour neutraliser les effets nocifs des protéines de régulation des virus VI H-I, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2. The administration of immunogenic compounds according to the invention corresponds to active immunotherapy. It may also be advantageous to carry out passive immunotherapy, that is, to provide a patient directly with the antibodies he needs to neutralize the harmful effects of the regulatory proteins of the viruses VI HI, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2.
Ces anticorps anti-protéine de régulation peuvent être obtenus classiquement et à titre d'exemple après immunisation d'un mammifère, homme ou animal, à l'aide d'un composé immunogène tel que défini ci-dessus, par clonage de lymphocytes B humains transformés par le virus Epstein-Barr puis récupération des anticorps attendus sécrétés par lesdits lymphocytes B transformés, ou encore par recombinaison génétique à partir d'une librairie de phages. These anti-regulatory protein antibodies can be obtained conventionally and by way of example after immunization of a mammal, human or animal, with the aid of an immunogenic compound as defined above, by cloning of human B-lymphocytes. transformed by the Epstein-Barr virus and recovery of the expected antibodies secreted by said transformed B cells, or by genetic recombination from a library of phages.
C'est pourquoi la présente demande a également pour objet de tels procédés de préparation d'anticorps anti-protéine de régulation d'un virus VI H-I, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 et en particulier d'anticorps anti-tat ou antitat toxoîde. Therefore, the present application also relates to such methods for the preparation of antibodies to the regulatory protein of a virus VI HI, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2 and in particular anti-HIV antibodies. tat or toxoid antitat.
La présente demande a encore pour objet un anticorps antiprotéine de régulation d'un virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 et en particulier des anticorps polyclonaux ou monoclonaux obtenus à partir de sujets humains ou de mammifères immunisés par la mise en oeuvre des procédés ci-dessus décrits. The present application also relates to an antiprotein antibody for the regulation of an HIV-1, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2 virus and in particular polyclonal or monoclonal antibodies obtained from human subjects or from mammals immunized with the implementation of the methods described above.
Ces anticorps spécifiques pourront provenir:
1. soit du sujet lui-même, induits par une immunisation active (vaccination) avec une protéine de régulation biologiquement inactivée mais immunogène, notamment le tat. Un tel composé immunogène, dans le cas par exemple du tat est appelé tat-toxoide par analogie aux toxoides bactériens,
2. soit d'un organisme étranger, allo- ou xénogénique, administré au sujet par immunisation passive (sérothérapie). Les anticorps allogéniques (chez l'homme) pourront être engendrés chez des sujets non infectés volontaires après immunisation active (vaccination) avec une protéine immunogène ou ses dérivés selon l'invention, notamment du tat (tat-toxolde ou fragments peptidiques du tat).Ces anticorps administrés passivement, qu'ils soient allogéniques (humains) ou xénogéniques (animaux), pourront être des anticorps monoclonaux ou polyclonaux complets ou des fragments F(ab')2 ou
Fab de l'anticorps.These specific antibodies may come from:
1. either the subject himself, induced by active immunization (vaccination) with a biologically inactivated but immunogenic regulatory protein, especially the tat. Such an immunogenic compound, in the case for example of the state is called tat-toxoid in analogy to bacterial toxoids,
Or 2. a foreign organ, allo- or xenogeneic, administered to the subject by passive immunization (serotherapy). The allogeneic antibodies (in humans) may be generated in volunteer non-infected subjects after active immunization (vaccination) with an immunogenic protein or its derivatives according to the invention, in particular the tat (tat-toxoid or peptide fragments tat). These passively administered antibodies, whether allogeneic (human) or xenogeneic (animal), may be complete monoclonal or polyclonal antibodies or F (ab ') 2 fragments or
Fab the antibody.
Par anticorps anti-protéine de régulation., I'on entend des anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou des fragments F(ab')2 ou Fab de ces anticorps ou encore des anticorps anti-protéine de régulation obtenus par construction génétique à partir d'une librairie de phages. The expression "anti-regulatory protein antibody" is intended to mean monoclonal or polyclonal antibodies or F (ab ') 2 or Fab fragments of these antibodies or else anti-regulatory protein antibodies obtained by genetic construction from a phage library.
Les anticorps allogéniques d'origine humaine sont: - soit polyclonaux - pouvant être obtenus chez des sujets séronégatifs volontaires immunisés avec un composé immunogène selon l'invention, notamment du tat-toxo-lde ou des fragments peptidiques de tat - soit monoclonaux à partir de clones spécifiques de cellules B transformées par le virus EBV de ces individus immunisés (lignées B EBV spécifiques). Allogeneic antibodies of human origin are: - either polyclonal - obtainable in volunteers seronegative subjects immunized with an immunogenic compound according to the invention, in particular tat-toxoid or tat peptide fragments - either monoclonal from EBV-transformed B-cell specific clones of these immunized individuals (specific EBV-B lines).
Les anticorps xénogéniques proviennent d'animaux hyperimmunisés avec un composé immunogène selon l'invention, notamment du tat ou ses dérivés (tat-toxoîde, fragments peptidiques de tat), et sont - soit polyclonaux provenant d'animaux hyperimmunisés, - soit monoclonaux, obtenus après hybridation selon la technique que Kohler et
Milstein de cellules spléniques ou d'adénocytes avec une lignée myélomateuse, type x63, notamment x63AG3.The xenogeneic antibodies come from animals hyperimmunized with an immunogenic compound according to the invention, in particular from the tat or its derivatives (tat-toxoid, peptide fragments of tat), and are either polyclonal from hyperimmunized animals, or monoclonal, obtained after hybridization according to the technique that Kohler and
Milstein of spleen cells or adenocytes with a myeloma line, type x63, in particular x63AG3.
La présente demande a encore pour objet un procédé de préparation d'anticorps anti-protéine de régulation d'un virus VIH-1, VIH-2,
HTLV-1 ou HTLV-2, caractérisé en ce que l'on immunise un mammifère, homme ou animal, avec un composé immunogène tel que défini ci-dessus.The present application also relates to a process for the preparation of anti-protein for the regulation of an HIV-1 virus, HIV-2,
HTLV-1 or HTLV-2, characterized in that a mammal, man or animal, is immunized with an immunogenic compound as defined above.
La présente invention a aussi pour objet un procédé de préparation d'anticorps monoclonaux anti-protéine de régulation d'un virus VIH1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2, caractérisé en ce que l'on utilise des cellules B provenant d'individus immunisés par un composé immunogène selon la présente invention, lesdites cellules B étant transformées par le virus EBV et produisant des anticorps spécifiques anti-protéine de régulation d'un virus VIH1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2. The subject of the present invention is also a process for the preparation of monoclonal antibodies against the regulatory protein of an HIV1, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2 virus, characterized in that B cells from of individuals immunized with an immunogenic compound according to the present invention, said B cells being transformed by the EBV virus and producing specific anti-regulatory protein antibodies of an HIV1, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2 virus.
Les cellules EBV + ci-dessus peuvent être cultivées de manière à produire les anticorps attendus. Ces cellules, comme on l'a vu, proviennent notamment de malades immunisés par une protéine de régulation native, ou par un composé immunogène selon l'invention. The EBV + cells above can be cultured to produce the expected antibodies. These cells, as we have seen, come in particular from patients immunized with a native regulatory protein, or with an immunogenic compound according to the invention.
La présente demande a encore pour objet un procédé de préparation d'anticorps selon l'invention monoclonaux, dirigés contre une protéine de régulation d'un virus VIH-I, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 inactivée ou non, caractérisé en ce que l'on prépare des hybridomes de mammifère, notamment de souris à partir de splénocytes ou adénocytes notamment de souris immunisées par une protéine de régulation native ou un composé immunogène selon l'invention, et de cellules de myélome, de préférence de lignée x63, selon les procédés bien connus de l'état de la technique (Kohler et
Milstein).The present application also relates to a process for preparing monoclonal antibodies according to the invention, directed against a protein for the regulation of an HIV-1 virus, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2 inactivated or not, characterized in that mammalian hybridomas, in particular mice, are prepared from splenocytes or adenocytes, in particular from mice immunized with a native regulatory protein or an immunogenic compound according to the invention, and from myeloma cells, preferably from lineage cells. x63, according to the well known methods of the state of the art (Kohler et al.
Milstein).
La présente demande a également pour objet un procédé d'obtention d'anticorps anti-protéine de régulation d'un virus VI H-I, VIH-2,
HTLV-1 ou HTLV-2, par la technologie de recombinaison génétique, caractérisé en ce que l'on utilise à titre d'immunogène un composé immunogène tel que défini ci-dessus.The subject of the present application is also a process for obtaining antibodies to the regulatory protein of a virus VI HI, HIV-2,
HTLV-1 or HTLV-2, by genetic recombination technology, characterized in that an immunogenic compound as defined above is used as immunogen.
La présente demande a encore pour objet des fragments F(ab')2 ou Fab desdits anticorps ; ceux-ci peuvent être obtenus par digestion enzymatique par exemple. The present application also relates to F (ab ') 2 or Fab fragments of said antibodies; these can be obtained by enzymatic digestion for example.
La présente invention a tout autant pour objet un procédé d'immunisation passive de sujets contaminés par le virus VIH, utilisant des anticorps spécifiques anti-protéine de régulation de la multiplication du virus
VIH et spécialement anti-tat neutralisant ou bloquant les effets nocifs de cette protéine dans sa configuration extracellulaire et préparés comme indiqué cidessus, ou des fragments F(ab')2 ou F(ab) de ces anticorps.Another subject of the present invention is a process for the passive immunization of subjects contaminated with the HIV virus, using specific anti-protein antibodies for regulating the multiplication of the virus.
HIV and especially anti-tat neutralizing or blocking the harmful effects of this protein in its extracellular configuration and prepared as indicated above, or fragments F (ab ') 2 or F (ab) of these antibodies.
La présente demande a aussi pour objet un procédé d'immunisation active anti-VIH ou Sida utilisant un composé immunogène décrit ci-dessus, associé à une protéine constitutive (ou de structure) d'un virus
VIH, notamment la glycoprotéine d'enveloppe gp 120 ou gp 160 ou un fragment peptidique modifié ou non de celles-ci, ou au virus VIH inactivé, ou au virus
VIH deplété de son ARN génomique par exemple par hydrolyse alcaline.The present application also relates to a method of active immunization against HIV or AIDS using an immunogenic compound described above, associated with a constitutive protein (or structure) of a virus
HIV, including gp 120 or gp 160 envelope glycoprotein or a modified or unmodified peptide fragment thereof, or inactivated HIV virus, or the virus
HIV depleted of its genomic RNA for example by alkaline hydrolysis.
L'invention a encore pour objet un procédé d'immunisation active anti-VIH ou - Sida utilisant un composé immunogène décrit ci-dessus, associé à un ou plusieurs immunogènes à base de cytokines inactivées et spécialement l'interféron a, leTGFss ou le TNF. The subject of the invention is also an active anti-HIV or AIDS immunization method using an immunogenic compound described above, combined with one or more immunogens based on inactivated cytokines and especially interferon a, TGFss or TNF. .
La présente demande a également pour objet un procédé d'immunisation active caractérisé en ce que l'on utilise à titre d'immunogène un composé immunogène tel que défini ci-dessus associé à un adjuvant d'immunité minéral, huileux ou de synthèse, ou encore un composé immunogène tel que défini ci-dessus couplé ou associé à une protéine augmentant son immunogénicité. The present application also relates to an active immunization method characterized in that an immunogenic compound as defined above is used as an immunogen combined with an adjuvant for mineral, oily or synthetic immunity, or still another immunogenic compound as defined above coupled or associated with a protein increasing its immunogenicity.
Ces immunisations peuvent être réalisées tant à titre curatif qu'à titre préventif. These immunizations can be carried out both as a curative and as a preventive measure.
A titre d'immunogène pour tous les procédés ci-dessus et ciaprès, on utilise de préférence un dérivé de la protéine tat. As an immunogen for all the above and below processes, a derivative of the tat protein is preferably used.
La présente invention a encore pour objet un procédé d'hyperimmunisation de sujets séronégatifs ou séropositifs VIH-1, VIH-2,
HTLV-1 ou HTLV-2, caractérisé en ce que l'on utilise un immunogène tel que défini ci-dessus, pour la production de sérums humains hyperimmuns, lesquels peuvent être particulièrement destinés à la sérothérapie passive par administration d'anticorps spécifiques purifiés ou de leurs fragments F(ab')2 ou
Fab..The subject of the present invention is also a process for hyperimmunisation of seronegative or seropositive subjects HIV-1, HIV-2,
HTLV-1 or HTLV-2, characterized in that an immunogen as defined above is used for the production of hyperimmune human sera, which may be particularly intended for passive serotherapy by administration of purified specific antibodies or of their fragments F (ab ') 2 or
Fab ..
L'invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif curatif ou préventif, au moins un anticorps anti-protéine de régulation d'un virus tel que défini ci-dessus ou obtenu selon les procédés ci-dessus. The invention further relates to a pharmaceutical composition comprising, as a curative or preventive active principle, at least one anti-virus regulatory protein antibody as defined above or obtained according to the above methods.
L'invention a enfin pour objet l'utilisation d'un composé immunogène ou d'un anticorps ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des effets nocifs d'une protéine de régulation d'un virus
VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2.The invention finally relates to the use of an immunogenic compound or an antibody above for the preparation of a medicament for the treatment of the harmful effects of a protein for regulating a virus
HIV-1, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2.
En résumé et notamment, la présente invention a pour objet l'usage à titre préventif, ou curatif chez le sujet séropositif ou atteint d'ARC/Sida d'anticorps spécifiques de manière à bloquer l'action nocive d'une protéine de régulation d'un virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 et notamment du tat circulant. Ces anticorps spécifiques pourront provenir: 1. du sujet lui-même, induits par une immunisation active (vaccination) avec du tat biologiquement inactivé mais immunogène, appelé tat-toxoide par analogie aux toxoîdes bactériens ou 2. d'un organisme étranger, allo- ou xénogénique, administré au sujet par immunisation passive (sérothérapie).Les anticorps allogéniques (chez l'homme) pourront être engendrés chez des sujets non infectés volontaires après immunisation active (vaccination) avec une protéine de régulation telle que le tat ou ses dérivés (tat-toxoide ou fragments peptidiques du tat). Ces anticorps administrés passivement, qu'ils soient allogéniques (humains) ou xénogéniques (animaux), pourront être des anticorps monoclonaux ou polyclonaux complets ou des fragments F(ab')2 ou
Fab de l'anticorps.In summary and in particular, the subject of the present invention is the preventive or curative use in the subject who is seropositive or suffering from ARC / AIDS of specific antibodies so as to block the harmful action of a regulatory protein. an HIV-1 virus, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2 and in particular the circulating state. These specific antibodies may come from: 1. the subject himself, induced by active immunization (vaccination) with a biologically inactivated but immunogenic state, called tat-toxoid by analogy with bacterial toxoids or 2. from a foreign organism, allo- or xenogeneic, administered to the subject by passive immunization (serotherapy). Allogeneic antibodies (in humans) may be generated in non-infected volunteers after active immunization (vaccination) with a regulatory protein such as the tat or its derivatives ( tat-toxoid or peptide fragments of the tat). These passively administered antibodies, whether allogeneic (human) or xenogeneic (animal), may be complete monoclonal or polyclonal antibodies or F (ab ') 2 fragments or
Fab the antibody.
Par tat-toxoide on entend une protéine tat traitée par des agents chimiques (aldéhydes) ou physiques ou modifiés par voie chimique. Ces traitements ont fait perdre à la molécule les propriétés biologiques du tat circulant (immunosuppression des cellules T; néoangiogenèse des cellules endothéliales; blocage de l'effet antiviral de l'lFN sur les macrophages) mais préservent les propriétés susceptibles d'induire la formation des anticorps, lorsque présente et préparée de manière appropriée, couplée ou non à un "carrier', agrégée ou non, en présence ou non d'adjuvant. By tat-toxoid is meant a tat protein treated with chemical agents (aldehydes) or physical or chemically modified. These treatments have caused the molecule to lose the biological properties of the circulating state (immunosuppression of T cells, endothelial cell neoangiogenesis, blocking of the antiviral effect of IFN on macrophages) but preserve the properties likely to induce the formation of antibody, when present and suitably prepared, coupled or not to a "carrier", aggregated or not, in the presence or absence of adjuvant.
On a élargi la notion de tat-toxoide aux fragments peptidiques immunogènes de tat c'est-à-dire une séquence peptidique du tat susceptible d'induire la formation des anticorps anti-tat lorsqu'elle est présentée de manière appropriée, couplée à un carrier ou non, en présence ou non d'adjuvant. The concept of tat-toxoid has been extended to immunogenic peptide fragments of tat, that is, a peptide sequence of the tat capable of inducing the formation of anti-tat antibodies when suitably presented, coupled with a carrier or not, in the presence or absence of adjuvant.
Les anticorps allogéniques d'origine humaine sont: - soit polyclonaux - pouvant être obtenus chez des sujets séronégatifs volontaires immunisés avec du tat-toxoide ou des fragments peptidiques de tat - soit monoclonaux à partir de clones spécifiques de cellules B transformées par le virus EBV de ces individus immunisés (lignées B EBV spécifiques). The allogeneic antibodies of human origin are: - either polyclonal - obtainable in HIV seronegative subjects immunized with tat-toxoid or peptide fragments of tat - or monoclonal from EBV-transformed B-cell specific clones of these immunized individuals (specific EBV B lines).
Les anticorps xénogéniques provenant d'animaux hyperimmunisés avec du tat ou ses dérivés (tat-toxoide, fragments peptidiques de tat) - soit polyclonaux provenant d'animaux hyperimmunisés, - soit monoclonaux - obtenus après hybridation selon la technique que Kolher et
Milstein de cellules spléniques ou d'adénocytes avec une lignée myélomateuse, type x63, notamment x63AG3.The xenogeneic antibodies derived from animals hyperimmunized with the tat or its derivatives (tat-toxoid, peptide fragments of tat) - either polyclonal from hyperimmunized animals, or - monoclonal - obtained after hybridization according to the technique that Kolher and
Milstein of spleen cells or adenocytes with a myeloma line, type x63, in particular x63AG3.
L'invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques. The invention also relates to pharmaceutical compositions.
a) Une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent préventif ou curatif un toxoîde viral ou un fragment ou analogue de protéine de régulation, notamment du tat selon l'invention. a) A pharmaceutical composition comprising, as a preventive or curative agent, a viral toxoid or a regulating protein fragment or analog, in particular the tat according to the invention.
b) Une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent préventif ou curatif des anticorps anti-tat produits à partir d'organismes immunisés contre ladite protéine ou ses fragments F(ab')2 ou Fab, selon l'invention. b) A pharmaceutical composition comprising, as a preventive or curative agent, anti-tat antibodies produced from organisms immunized against said protein or its F (ab ') 2 or Fab fragments, according to the invention.
En outre l'invention propose également un kit comprenant une composition pharmaceutique vaccinale qui en plus du principe actif (tat-toxoîde ou ses dérivés ou anticorps anti-tat) peut comprendre un adjuvant etlou un autre immunogène à propriétés anti-rétrovirus. In addition, the invention also provides a kit comprising a vaccine pharmaceutical composition which, in addition to the active ingredient (tat-toxoid or its derivatives or anti-tat antibodies) may comprise an adjuvant and / or another immunogen with anti-retrovirus properties.
Enfin l'invention propose une composition pharmaceutique sous une forme galénique conventionnelle. En particulier on associe le principe actif selon l'invention en quantité suffisante pour être efficace d'un point de vue thérapeutique avec un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Finally the invention provides a pharmaceutical composition in a conventional dosage form. In particular, the active ingredient according to the invention is combined in an amount sufficient to be therapeutically effective with a pharmaceutically acceptable diluent or carrier.
EXPéRIENCE 1:
EFFETS PATHOGENES DE LA PROTEINE TAT CIRCULANTE
Immunosuppression des cellules T en présence de tat:
L'effet du tat sur des lymphocytes T activés du sang périphérique a été recherché. Des cellules mononuclées (PMBC) et des lymphocytes T (HLA 35 DR-) isolés par immunomagnétisme ont été activés par des anticorps anti
CD3 en présence ou en absence de la molécule tant. Après 5 jours de culture, la prolifération cellulaire a été mesurée par incorporation de thymidine H3. Les résultats ont montré que le tat inhibait la prolifération des cellules T HLA DR (85% d'inhibition à la concentration de 1,5 mg par ml). Cette inhibition disparaît en présence d'anticorps spécifique anti-Lat (Intracel, U.K).EXPERIENCE 1:
PATHOGENIC EFFECTS OF THE CIRCULATING TAT PROTEIN
Immunosuppression of T cells in the presence of tat:
The effect of the tat on activated T cells of peripheral blood has been investigated. Mononuclear cells (PMBC) and immunologically isolated T cells (HLA 35 DR-) were activated by
CD3 in the presence or absence of the molecule both. After 5 days of culture, cell proliferation was measured by incorporation of H3 thymidine. The results showed that the tat inhibited the proliferation of HLA DR T cells (85% inhibition at the concentration of 1.5 mg per ml). This inhibition disappears in the presence of anti-Lat specific antibody (Intracel, UK).
EXPéRIENCE 2
EFFETS PATHOGENES DE LA PROTEINE TAT CIRCULANTE:
Inhibition de l'effet de l'lFN sur les macrophages en présence de tat:
L'effet du tat sur l'action antivirale de l'IF Na a été mesuré par le test biologique conventionnel en utilisant la mesure du pouvoir cytopathogène du virus VSV sur les cellules MDBK.EXPERIENCE 2
PATHOGENIC EFFECTS OF THE CIRCULATING TAT PROTEIN:
Inhibition of the effect of IFN on macrophages in the presence of tat:
The effect of tat on the antiviral action of IF Na was measured by the conventional bioassay using the measurement of cytopathic potency of VSV virus on MDBK cells.
Effet du tat sur l'lFN exogène
Des doses croissantes de tat ont permis d'inhiber dès de faibles concentrations suivant une courbe dose effet, le pouvoir anti-viral de l'lFN exogène. Dans une expérience représentative, L'effet protecteur de l'lFNa apparent jusqu'à la dilution 1/4800 (correspondant à 150 U.l.) est réduit à la dilution 1/300 en présence de 40 ug de tat.A la dilution 4 800 de l'lFN exogène le titre de VSV est passé de 103,8 (échantillons IFN sans tat) à 105,5 (échantillons IFN en présence de tant). Dans ces expériences, I'inhibition de l'effet anti-viral de l'lFNa par la molécule tat est supprimée en présence d'anticorps spécifiques anti-tat (Intracel, U.K).Effect of tat on the exogenous IFN
Increasing doses of tat have been shown to inhibit the anti-viral potency of exogenous IFN at low dose-response concentrations. In a representative experiment, the protective effect of the apparent IFNa up to 1/4800 dilution (corresponding to 150 IU) is reduced to 1/300 dilution in the presence of 40 μg of tat. exogenous IFN the titre of VSV increased from 103.8 (IFN samples without tat) to 105.5 (IFN samples in the presence of so). In these experiments, the inhibition of the anti-viral effect of IFNa by the tat molecule is suppressed in the presence of anti-tat specific antibodies (Intracel, UK).
EXPERIENCE 3
MISE EN EVIDENCE CHEZ LES SUJETS INFECTES PAR LE VIH-1 DE LA
PROTEINE TAT DANS SA CONFIGURATION EXTRACELLULAIRE:
Présence d'anticorps anti-tat dans le sérum de patients séropositifs:
a) Une étude par Elisa des anticorps anti-tat sériques utilisant comme antigène la molécule tat native a été réalisée chez 50 sujets séropositifs et 15 sujets séronégatifs. Tous les sérums des sujets séronégatifs et 20 sérums de séropositifs n'ont pas révélé la présence d'anticorps anti-tat avec une densité optique inférieure au seuil (cut off) (D.O. = 0,250). Parmi les 30 sérums de sujets infectés par le VIH, qui ont dépassé le seuil, 6 ont une DO supérieure à 0,500. Aucune corrélation apparente n'a pu être faite entre la présence d'anticorps anti-tat d'une part, I'état clinique et le nombre de cellules
CD4 par mm3 de sang d'autre part.EXPERIENCE 3
HIGHLIGHTS IN HIV-1 INFECTED SUBJECTS
TAT PROTEIN IN ITS EXTRACELLULAR CONFIGURATION:
Presence of anti-tat antibodies in the serum of HIV-positive patients:
a) An Elisa study of serum anti-tat antibodies using the native tat molecule as antigen was performed in 50 seropositive and 15 seronegative subjects. All sera from seronegative subjects and 20 sera from seropositive did not reveal the presence of anti-tat antibodies with a cut off optical density (OD = 0.250). Of the 30 sera from HIV-infected individuals who exceeded the threshold, 6 had an OD greater than 0.500. No apparent correlation could be made between the presence of anti-tat antibodies on the one hand, the clinical condition and the number of cells
CD4 per mm3 of blood on the other hand.
b) Une étude par Elisa d'anticorps anti-tat sériques utilisant comme antigènes différents peptides du tat a été réalisée chez des sujets séropositifs à différents stades de l'évolution de leur infection VIH - sujets asymptomatiques ; patients présentant des manifestations cliniques pré-Sida (ARC) et patients atteints de Sida. Les résultats de cette étude sont les suivants:
1) Les séquences peptidiques du tat
MEPVDPRLEPWKHPG (résidus 1 - 15 en N terminal)
HQVSLSKQPTSQPRGD (résidus 65 - 80 en C terminal) ont été reconnues par la grande majorité des sérums de séropositifs et par aucun sérum de séronégatifs (contrôles). Les réactions ont été fortement positives mais aucune corrélation n'a pu être montrée en rapport avec l'évolution de l'infection VIH et le nombre de CD4 des sujets.b) An Elisa study of serum anti-tat antibodies using as different antigens peptides of the tat was carried out in seropositive subjects at different stages of the evolution of their HIV infection - asymptomatic subjects; patients with pre-AIDS clinical manifestations (ARC) and patients with AIDS. The results of this study are as follows:
1) The peptide sequences of the tat
MEPVDPRLEPWKHPG (residues 1 - 15 in N terminal)
HQVSLSKQPTSQPRGD (C-terminal residues 65-80) have been recognized by the vast majority of seropositive sera and by no seronegative serum (controls). Reactions were strongly positive but no correlation could be shown in relation to the course of HIV infection and the number of CD4 subjects.
2) Les autres séquences étudiées n'ont pas été reconnues de manière notable par les sérums qu'ils soient d'individus séropositifs ou contrôles (voir Tableau 1). Seuls quelques rares sérums pour chaque séquence ont montré une densité optique supérieure au seuil (2 fois la moyenne des sérums contrôles). 2) The other sequences studied have not been appreciably recognized by the sera whether they are seropositive or control individuals (see Table 1). Only a few rare sera for each sequence showed an optical density greater than the threshold (2 times the average of the control sera).
TABLEAU 1
<tb> <SEP> Sujets <SEP> infectés* <SEP> Sujets <SEP> contrôles
<tb> <SEP> (72 <SEP> sérums) <SEP> ( <SEP> <SEP> 10 <SEP> sérums
<tb> Résidus <SEP> peptidiques <SEP> du <SEP> Sérums <SEP> D.O. <SEP> moyenne <SEP> Sérums <SEP> D. <SEP> 0.
<tb><tb><SEP> Infected <SEP> Subjects * <SEP> Subjects <SEP> Controls
<tb><SEP> (72 <SEP> sera) <SEP>(<SEP><SEP> 10 <SEP> sera
<tb><SEP> Peptide Residues <SEP> of <SEP> Serums <SEP> DO <SEP> Mean <SEP> Serums <SEP> D. <SEP> 0.
<Tb>
<SEP> tat <SEP> positifs** <SEP> positifs** <SEP> moyenne
<tb> <SEP> 1-15 <SEP> 67 <SEP> 0,43 <SEP> 0 <SEP> 0,08
<tb> <SEP> 9-20 <SEP> 0 <SEP> 0,26 <SEP> 0
<tb> <SEP> 22-37 <SEP> 7 <SEP> 0,78 <SEP> 0 <SEP> 0,41
<tb> <SEP> 36-50 <SEP> 5 <SEP> 0,86 <SEP> O <SEP> 0,65 <SEP>
<tb> <SEP> 46 <SEP> - <SEP> 60 <SEP> 6 <SEP> 0,53 <SEP> 0 <SEP> 0,40
<tb> <SEP> 52-60 <SEP> 2 <SEP> 0,32 <SEP> 0 <SEP> 0,38
<tb> <SEP> 56 <SEP> - <SEP> 70 <SEP> 0 <SEP> 0,19 <SEP> 0 <SEP> 0,20
<tb> <SEP> 65 <SEP> - <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 1,01 <SEP> 0 <SEP> 0,08
<tb> * Les sujets infectés par le VIH sont à des stades variés; sujets asymptomatiques, patients atteints d'ARC et patients atteints de Sida.<SEP> positive <SEP> positive ** <SEP> positive ** <SEP> average
<tb><SEP> 1-15 <SEP> 67 <SEP> 0.43 <SEP> 0 <SEP> 0.08
<tb><SEP> 9-20 <SEP> 0 <SEP> 0.26 <SEP> 0
<tb><SEP> 22-37 <SEP> 7 <SEP> 0.78 <SEP> 0 <SEP> 0.41
<tb><SEP> 36-50 <SEP> 5 <SEP> 0.86 <SE> O <SEP> 0.65 <SEP>
<tb><SEP> 46 <SEP> - <SEP> 60 <SEP> 6 <SEP> 0.53 <SE> 0 <SEP> 0.40
<tb><SEP> 52-60 <SEP> 2 <SEP> 0.32 <SEP> 0 <SEP> 0.38
<tb><SEP> 56 <SEP> - <SEP> 70 <SEP> 0 <SEP> 0.19 <SEP> 0 <SEP> 0.20
<tb><SEP> 65 <SEP> - <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 1.01 <SEP> 0 <SEP> 0.08
<tb> * HIV-infected individuals are at various stages; asymptomatic subjects, ARC patients and AIDS patients.
" La réaction est considérée positive (seuil) lorsque la densité optique est 2 fois supérieure à la moyenne des séronégatifs. "The reaction is considered positive (threshold) when the optical density is 2 times higher than the average seronegative.
3) II est intéressant de noter que la séquence la plus réactive (AA 65 - 80) est celle contenant les résidus RGD reconnus par les intégrines. 3) It is interesting to note that the most reactive sequence (AA 65-80) is that containing the RGD residues recognized by the integrins.
EXEMPLE 1
PREPARATION DE LA PROTEINE TAT IMMUNOGENE (TAT-TOXOIDE):
Inactivation de la protéine tat en présence de formaldéhyde
A une solution de tat (1 mg/ml) dans du phosphate disodique 70 mM, pH 8,0, on ajoute du formaldéhyde à la concentration finale 33 mM.EXAMPLE 1
PREPARATION OF THE IMMUNOGEN TAT PROTEIN (TAT-TOXOIDE):
Inactivation of the tat protein in the presence of formaldehyde
To a solution of tat (1 mg / ml) in 70 mM disodium phosphate, pH 8.0, formaldehyde is added to the final concentration 33 mM.
Le mélange est incubé à 37 "C pendant 1,3,5,7 et 9 jours. A la fin de chacune des périodes d'incubation, un échantillon est prélevé et la réaction avec le formaldéhyde bloquée par addition de glycine à la concentration finale 100 mM. The mixture is incubated at 37 ° C for 1,3,5,7 and 9 days At the end of each incubation period, a sample is taken and the reaction with formaldehyde blocked by adding glycine to the final concentration 100 mM.
Chaque prélèvement est dialysé pendant 1 nuit à 4"C contre 100 fois son volume de PBS (tampon phosphate salin). Each sample is dialyzed for 1 night at 4 ° C against 100 times its volume of PBS (phosphate buffered saline).
EXEMPLE 2
PREPARATION DE LA PROTEINE TAT IMMUNOGENE (TAT-TOXOIDE)
Inactivation de la protéine tat en présence de glutaraldéhyde
A une solution de tat (1 mg/ml) dans du phosphate disodique 70 mM, pH 8,2 on ajoute du glutaraldéhyde à la concentration finale, soit 0,026 M, soit 0,0026 M. On laisse la réaction avec le glutaraldéhyde se poursuivre pendant des temps divers variant de 1 mn à 3 h. Après le temps de réaction choisi, à la température du laboratoire, la réaction est bloquée par addition de glycine à la concentration finale de 100 mM. Les différents prélèvements sont dialysés, pendant 16 heures, à 4"C, contre 100 fois leur volume de PBS.EXAMPLE 2
PREPARATION OF THE IMMUNOGEN TAT PROTEIN (TAT-TOXOIDE)
Inactivation of the tat protein in the presence of glutaraldehyde
To a solution of tat (1 mg / ml) in disodium phosphate 70 mM, pH 8.2 is added glutaraldehyde to the final concentration, ie 0.026 M, or 0.0026 M. The reaction is allowed to continue glutaraldehyde for various times varying from 1 minute to 3 hours. After the chosen reaction time, at laboratory temperature, the reaction is blocked by adding glycine to the final concentration of 100 mM. The various samples are dialyzed for 16 hours at 4 ° C., compared to 100 times their volume of PBS.
EXEMPLE 3
PREPARATION DE LA PROTEINE TAT IMMUNOGENE (TAT-TOXOIDE)
Inactivation et couplage simultané à la toxine tétanique du tat
A un mélange de toxine tétanique et de tat dans un rapport molaire de 1 à 15, dans un tampon phosphate 70 mM - 100 mM (pH variant de 6,8 à 8,2) on a ajouté du glutaraldéhyde à la concentration finale (variant de 0,0026 M à 0,026 M) et on laisse la réaction d'inactivation et de couplage s'effectuer pendant des temps variables (3-15 mn) à la température du laboratoire. La réaction est bloquée par addition de glycine à la concentration finale 100 mM et les différents prélèvements sont dialysés pendant 16 heures, à 4"C, contre 100 fois leur volume de PBS.EXAMPLE 3
PREPARATION OF THE IMMUNOGEN TAT PROTEIN (TAT-TOXOIDE)
Inactivation and simultaneous coupling with tetanus toxin
To a mixture of tetanus toxin and tat in a molar ratio of 1 to 15, in 70 mM-100 mM phosphate buffer (pH ranging from 6.8 to 8.2) was added glutaraldehyde at the final concentration (varying from from 0.0026 M to 0.026 M) and the inactivation and coupling reaction is allowed to proceed for varying times (3-15 min) at laboratory temperature. The reaction is blocked by the addition of glycine at the final concentration of 100 mM and the various samples are dialyzed for 16 hours at 4 ° C compared to 100 times their volume of PBS.
EXEMPLE 4
POUVOIR IMMUNOGENE DES TAT-TOXOIDES
Tat-toxo-lde immunogène chez la souris: Anticorps par Elisa
Le pouvoir immunogène des différentes préparations de tat inactivé, soit par le formaldéhyde (tat-toxoîde), soit par le glutaraldéhyde (tat- polan), soit après couplage à la toxine tétanique (conjugué tat-toxine tétanique), c'est à dire des composés immunogènes des exemples 1 à 3, a été déterminé chez la souris.EXAMPLE 4
IMMUNOGENIC POWER OF TAT-TOXOIDS
Tat-toxo-lde immunogen in mice: Antibodies by Elisa
The immunogenic power of the various preparations of inactivated tat, either by formaldehyde (tat-toxoid) or by glutaraldehyde (tat-polan), or after coupling with tetanus toxin (tat-tetanus toxoid conjugate), that is to say immunogenic compounds of Examples 1 to 3 was determined in the mouse.
Des souris swiss de 18-209 ont été immunisées par 2 injections sous-cutanées de l'immunogène des exemples 1, 2 et 3 en présence d'adjuvant complet de Freund, la seconde pratiquée 3 semaines après la 1 ère avec 5 mg de préparation en émulsion en présence d'adjuvant incomplet de Freund. Swiss 18-209 mice were immunized by 2 subcutaneous injections of the immunogen of Examples 1, 2 and 3 in the presence of Freund's complete adjuvant, the second one performed 3 weeks after the first with 5 mg of preparation. in emulsion in the presence of incomplete Freund's adjuvant.
15 jours après l'injection de rappel, des prélèvements sanguins ont été pratiqués par voie intracardiaque. Les anticorps anti-tat ont été déterminés dans les sérums par Elisa. La densité optique a été mesurée à 490 nm. 15 days after the booster injection, blood samples were taken intracardially. Anti-tat antibodies were determined in sera by Elisa. The optical density was measured at 490 nm.
Les résultats obtenus, résumés dans le Tableau 2, montrent que toutes les préparations de tat sont immunogènes à des degrés divers, hormis le conjugué tat-TT traité pendant un temps court (3 minutes) par la glutaraldéhyde, qui s'est avéré toxique et a tué les souris en 24 heures (TT trop faiblement inactivé). The results obtained, summarized in Table 2, show that all the preparations of tat are immunogenic to varying degrees, except for the tat-TT conjugate treated for a short time (3 minutes) by glutaraldehyde, which proved to be toxic and killed the mice in 24 hours (TT too weakly inactivated).
TABLEAU 2
<tb> <SEP> PréDarations <SEP> Taux <SEP> d'anticorPs <SEP> anti-tat
<tb> <SEP> Densité <SEP> Optique <SEP> (D.O)
<tb> <SEP> Tat-toxoïde <SEP> (1 <SEP> jours) <SEP> 0,320
<tb> <SEP> Tat-toxoïde <SEP> (3 <SEP> jours) <SEP> 0,465
<tb> <SEP> Tat-toxoïde <SEP> (5 <SEP> jours) <SEP> 0,998
<tb> <SEP> Tat-toxoïde <SEP> (9 <SEP> jours) <SEP> 0,807
<tb> <SEP> Tat <SEP> -polan <SEP> (1 <SEP> mn;) <SEP> 0,026 <SEP> M <SEP> 0,718
<tb> <SEP> Tat <SEP> -polan <SEP> (15 <SEP> mn;) <SEP> 0,026 <SEP> M <SEP> 1,564
<tb> <SEP> Tat <SEP> -polan <SEP> (60 <SEP> mn;) <SEP> 0,0026 <SEP> M <SEP> 1,065
<tb> <SEP> Tat <SEP> -polan <SEP> (3h;) <SEP> 0,0026 <SEP> M <SEP> 0,194
<tb> <SEP> conjugué <SEP> tat <SEP> - <SEP> TT <SEP> (3 <SEP> mn; <SEP> 0,0026M) <SEP> toxique
<tb> <SEP> conjugué <SEP> tat <SEP> - <SEP> TT <SEP> (15 <SEP> mn; <SEP> 0,0026M) <SEP> 1,987
<tb> conjugué <SEP> tat <SEP> - <SEP> TT <SEP> (6 <SEP> min; <SEP> 0,026M) <SEP> 0,824
<tb> conjugué <SEP> tat <SEP> - <SEP> TT <SEP> (15 <SEP> mn; <SEP> 0,026M) <SEP> 1,642
<tb>
EXEMPLE 5
TOXICITE AIGUE
La toxicité des préparations de tat-toxolde et de tat-polan a été déterminée par injection sous-cutanée à la souris Swiss de 18-209. Les préparations de tat-toxoïde (7 jours) et tat-polan (15 mn; 0,026 M) ont été administrées à la dose de 100 pg par souris. Les animaux ont été observés pendant 7 jours.<tb><SEP> PreDarations <SEP> Anti-tat <SEP> rate of anti-tat <SEP>
<tb><SEP> Density <SEP> Optical <SEP> (DO)
<tb><SEP> Tat-toxoid <SEP> (1 <SEP> days) <SEP> 0.320
<tb><SEP> Tat-toxoid <SEP> (3 <SEP> days) <SEP> 0.465
<tb><SEP> Tat-toxoid <SEP> (5 <SEP> days) <SEP> 0.998
<tb><SEP> Tat-toxoid <SEP> (9 <SEP> days) <SEP> 0.807
<tb><SEP> Tat <SEP> -polan <SEP> (1 <SEP>min;)<SEP> 0.026 <SEP> M <SEP> 0.718
<tb><SEP> Tat <SEP> -polan <SEP> (15 <SEP>min;)<SEP> 0.026 <SEP> M <SEP> 1.564
<tb><SEP> Tat <SEP> -polan <SEP> (60 <SEP>min;)<SEP> 0.0026 <SEP> M <SEP> 1.065
<tb><SEP> Tat <SEP> -polan <SEP>(3h;)<SEP> 0.0026 <SEP> M <SEP> 0.194
<tb><SEP> conjugate <SEP> tat <SEP> - <SEP> TT <SEP> (3 <SEP>min;<SEP> 0.0026M) <SEP> toxic
<tb><SEP> Conjugate <SEP> tat <SEP> - <SEP> TT <SEP> (15 <SEP>mn;<SEP> 0.0026M) <SEP> 1,987
<tb> conjugate <SEP> tat <SEP> - <SEP> TT <SEP> (6 <SEP>min;<SEP> 0.026M) <SEP> 0.824
<tb> conjugate <SEP> tat <SEP> - <SEP> TT <SEP> (15 <SEP>min;<SEP> 0.026M) <SEP> 1.642
<Tb>
EXAMPLE 5
ACUTE TOXICITY
The toxicity of the tat-toxoid and tat-polan preparations was determined by subcutaneous injection in the Swiss mouse of 18-209. The preparations tat-toxoid (7 days) and tat-polan (15 min, 0.026 M) were administered at a dose of 100 μg per mouse. The animals were observed for 7 days.
Aucun signe manifeste de toxicité n'a été observé. Le poids des animaux a continué de crottre. L'examen macroscopique des organes à l'autopsie n'a pas permis de révéler d'anomalies. No overt signs of toxicity were observed. The weight of the animals continued to grow. Macroscopic examination of organs at autopsy did not reveal abnormalities.
EXEMPLE 6
ANTICORPS ANTI-TAT
On a préparé des anticorps anti-tat comme suit: on a isolé la fraction
IgG sur une colonne de protéine G à partir de sérums de souris immunisées avec du tat-polan. Les fragments F(ab')2 ont été également préparés à partir de la fraction IgG isolée par digestion pepsique. La réactivité immunologique de ces fractions a été vérifiée par Elisa. EXAMPLE 6
ANTI-TAT ANTIBODIES
Anti-tat antibodies were prepared as follows: the fraction was isolated
IgG on a G protein column from mouse sera immunized with tat-polan. The F (ab ') 2 fragments were also prepared from the isolated IgG fraction by pepsic digestion. The immunological reactivity of these fractions was verified by Elisa.
LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM:NEOVACS
(B) RUE : 117, rue Vieille du Temple
(C ) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL 75003
(ii) TITRE DE L'INVENTION : Nouveaux immunogènes, de nouveaux anticorps, leur procédé de préparation et des compositions pharmaceutiques les renfermant.SEQUENCE LIST (1) GENERAL INFORMATION:
(i) DEPOSITOR:
(A) NAME: NEOVACS
(B) STREET: 117, rue Vieille du Temple
(C) CITY: PARIS
(E) COUNTRY: FRANCE
(F) POSTAL CODE 75003
(ii) TITLE OF THE INVENTION: New immunogens, new antibodies, process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES 1
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C ) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release # 1.0, Version # 1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQUENCE ID NO : 1 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 acides aminés (B) TYPE : acide aminé
(C ) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 1 :
His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Pro Arg Gly Asp
1 5 10 15 (iii) NUMBER OF SEQUENCES 1
(iv) COMPUTER-READABLE FORM:
(A) SUPPORT TYPE: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release # 1.0, Version # 1.25 (EPO) (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO: 1:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 16 amino acids (B) TYPE: amino acid
(C) NUMBER OF BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
His Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Ser Pro Gln Gln Pro Arg Gly Asp
1 5 10 15
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