FR2720068A1 - Proteins capable of interacting with HIV-1 Nef protein - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention a pour objet des protéines capables d'interagir avec la protéine Nef du virus HW 1 ainsi que les fragments polypeptidiques de celles-ci qui présentent la même activité à l'égard de la protéine Nef. The present invention relates to proteins capable of interacting with the Nef protein of the HW 1 virus as well as the polypeptide fragments thereof which exhibit the same activity with respect to the Nef protein.
Elle a également pour objet les séquences d'acides nucléiques codant pour lesdites protéines ou leurs fragments polypeptidiques. It also relates to the nucleic acid sequences coding for said proteins or their polypeptide fragments.
Elle a également pour objet les vecteurs d'expression contenant lesdites séquences d'acides nucléiques et les microorganismes procaryotes ou les cellules eucaryotes, transformés avec lesdits vecteurs. It also relates to expression vectors containing said nucleic acid sequences and prokaryotic microorganisms or eukaryotic cells, transformed with said vectors.
Elle concerne aussi l'utilisation desdites séquences d'acides nucléiques ou des protéines ou fragments polypeptidiques correspondants pour le criblage d'agents anti-viraux anti-HIV. It also relates to the use of said nucleic acid sequences or corresponding proteins or polypeptide fragments for the screening of anti-HIV anti-viral agents.
Enfin, elle a pour objet des procédés de criblage de nouveaux agents antiviraux anti-HIV ayant une activité inhibitrice sur l'interaction entre la protéine Nef et l'une quelconque des protéines selon l'invention. Finally, it relates to methods of screening for new anti-HIV anti-viral agents having an inhibitory activity on the interaction between the protein Nef and any of the proteins according to the invention.
Le syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) provoquée par le virus
HIV est une affection grave puisque le taux de mortalité des malades atteints du
SIDA est extrêmement élevé. La recherche d'agents anti-viraux anti-HIV s'est donc intensifiée ces dernières années.Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) caused by the virus
HIV is a serious condition since the death rate of patients with
AIDS is extremely high. The search for anti-HIV anti-viral agents has therefore intensified in recent years.
Jusqu'à présent, on a principalement recherché des agents anti-viraux capables d'inhiber les protéines virales ayant une activité spécifique, telles que par exemple les protéases et les reverse-transcriptases. Up to now, we have mainly sought anti-viral agents capable of inhibiting viral proteins having a specific activity, such as for example proteases and reverse transcriptases.
Ainsi, pour le traitement du SIDA, on a déjà proposé des agents anti-viraux qui inhibent l'activité de la reverse-transcriptase. Par exemple, on utilise couramment le 3'-azido-3'-déoxy-thymidine, dénommé AZT pour inhiber la reverse-transcriptase du virus HIV. Cependant, ce produit inhibe non seulement la reverse-transcriptase du virus HIV mais également les enzymes endogènes. De plus, le virus MIV développe une résistance à ce produit, de sorte que son utilisation pour le traitement du SIDA présente certains inconvénients. Thus, for the treatment of AIDS, anti-viral agents have already been proposed which inhibit the activity of reverse transcriptase. For example, 3'-azido-3'-deoxy-thymidine, called AZT, is commonly used to inhibit the reverse transcriptase of the HIV virus. However, this product not only inhibits the reverse transcriptase of the HIV virus but also endogenous enzymes. In addition, the MIV virus develops resistance to this product, so that its use for the treatment of AIDS has certain drawbacks.
On a également recherché des agents anti-viraux capables d'inhiber les protéines virales qui interviennent au niveau de la maturation des virus, telles que notamment les protéases. A cet effet, on pourra se référer aux travaux de DARLIX (1991) (1). We have also looked for anti-viral agents capable of inhibiting the viral proteins which are involved in the maturation of viruses, such as in particular proteases. To this end, reference may be made to the work of DARLIX (1991) (1).
Les travaux, qui ont abouti à la présente invention, ont porté sur une des protéines régulatrices du virus MIV et ses interactions éventuelles avec les protéines cellulaires. The work, which led to the present invention, focused on one of the regulatory proteins of the MIV virus and its possible interactions with cellular proteins.
En dehors des trois gènes classiques gag, pol, env, qui sont communs à tous
les rétrovirus [DARLIX (1991) (1)], le génome du virus MIV 1 responsable du
SIDA, code pour plusieurs protéines régulatrices accessoires qui semblent jouer un rôle important mais non caractérisé à ce jour, tant en ce qui concerne le taux de réplication du virus dans les cellules infectées que la pathologie associée à l'infection virale [voir CULLEN (1991) (2)].Apart from the three classic genes gag, pol, env, which are common to all
retroviruses [DARLIX (1991) (1)], the genome of the MIV 1 virus responsible for
SIDA, code for several accessory regulatory proteins which seem to play an important role but not characterized to date, both with regard to the rate of replication of the virus in infected cells and the pathology associated with viral infection [see CULLEN (1991 ) (2)].
La production de particules virales infectieuses par des cellules infectées par le virus HIV 1, à savoir les lymphocytes T, T4 et les macrophages, fait intervenir de nombreuses interactions entre protéines virales et protéines cellulaires, aux différents stades du cycle viral, depuis l'entrée du virus, la reverse transcription, jusqu'à l'intégration, l'encapsidation et le bourgeonnement des vinons. A ce sujet on pourra pour plus de détail se référer aux articles de J.L. DARLIX (1991) (1) et
R. WEISS (1993) (3).The production of infectious viral particles by cells infected with the HIV 1 virus, namely T, T4 lymphocytes and macrophages, involves numerous interactions between viral proteins and cellular proteins, at the various stages of the viral cycle, from entry from virus, reverse transcription, to integration, packaging and budding of the wines. On this subject one can for more detail refer to the articles of JL DARLIX (1991) (1) and
R. WEISS (1993) (3).
La plupart de ces interactions restent non identifiées à ce jour, à l'exception de la liaison à la glycoprotéine de surface CD4, caractéristique des lymphocytes T4 également dénommés cellules T4, qui est considérée comme le récepteur du virus. Most of these interactions remain unidentified to date, except for the binding to the surface glycoprotein CD4, characteristic of T4 lymphocytes also called T4 cells, which is considered to be the receptor of the virus.
On pense que les protéines virales régulatrices entrent en interaction avec des protéines cellulaires pour exercer leur fonction. L'identification des partenaires cellulaires de protéines virales permettrait donc d'ouvrir tout un champ nouveau au développement d'inhibiteurs de ces interactions, et donc à la conception rationnelle de nouvelles classes de médicaments anti-HIV. It is believed that regulatory viral proteins interact with cellular proteins to perform their function. The identification of cellular partners of viral proteins would therefore open up a whole new field for the development of inhibitors of these interactions, and therefore for the rational design of new classes of anti-HIV drugs.
La protéine Nef, qui est décrite en détail par HOVANESSIAN (1992) (4), est l'une de ces protéines régulatrices qui constitue une des cibles privilégiées pour la mise en oeuvre d'une nouvelle stratégie anti-virale. The Nef protein, which is described in detail by HOVANESSIAN (1992) (4), is one of these regulatory proteins which constitutes one of the preferred targets for the implementation of a new anti-viral strategy.
En effet, cette protéine est exprimée très tôt au cours du cycle viral et provoque chez l'hôte infecté une forte réponse immunitaire anti-Nef. Indeed, this protein is expressed very early in the viral cycle and provokes in the infected host a strong anti-Nef immune response.
De plus, une expérience capitale, réalisée par Harry W.KESTLER et al (1991) (5), a récemment montré chez le singe que, si en culture de cellules le gène
Nef n'est pas strictement indispensable à la réplication du virus, en revanche chez un hôte infecté l'expression de Nef est essentielle à la multiplication du virus : les virus délétés de Nef ne se répliquent plus, et sont mêmes capables d'induire une protection de type vaccinal.In addition, a major experiment, carried out by Harry W. KESTLER et al (1991) (5), recently showed in monkeys that, if in cell culture the gene
Nef is not strictly essential for the replication of the virus, on the other hand in an infected host the expression of Nef is essential for the multiplication of the virus: the viruses deleted from Nef no longer replicate, and are even capable of inducing a vaccine-like protection.
D'autre part, le(s) mécanisme(s) d'action de la protéine Nef ne sont pas entièrement élucidés, mais l'un de ses effets majeurs est qu'elle provoque la diminution de l'expression de la glycoprotéine de surface CD4 ci-après dénommée
CD4 à la surface des lymphocytes T infectés comme l'a montré GARCIA et al.On the other hand, the mechanism (s) of action of the protein Nef are not fully understood, but one of its major effects is that it causes a decrease in the expression of the surface glycoprotein. CD4 hereinafter referred to as
CD4 on the surface of infected T lymphocytes as shown by GARCIA et al.
(1991) (6).(1991) (6).
Cet effet de la protéine Nef a été mis en évidence aussi bien dans les cellules
T humaines que dans les cellules T murines. Des travaux récents tels que ceux de l.M. BRADY et al. (1993) (7) ont en effet montré que l'expression de la protéine
Nef dans des souris transgéniques perturbe le développement des cellules T porteuses de CD4, dénommées ci-après cellules T CD4+, dans le thymus et provoque ainsi la disparition de CD4 à la surface des cellules T CD4+. Ainsi la protéine Nef pourrait intervenir dans le dysfonctionnement du système immunitaire et la suppression des cellules T CD4+ qui sont associés aux infections par le virus HIV. This effect of the protein Nef has been demonstrated in cells as well
Human T than in murine T cells. Recent work such as that of 1M BRADY et al. (1993) (7) have indeed shown that the expression of the protein
Nave in transgenic mice disrupts the development of CD4-carrying T cells, hereinafter called CD4 + T cells, in the thymus and thus causes the disappearance of CD4 on the surface of CD4 + T cells. Thus the protein Nef could intervene in the dysfunction of the immune system and the suppression of the CD4 + T cells which are associated with infections by the HIV virus.
Etant donné que la diminution de l'expression de CD4 à la surface des cellules T n'a pas été observée au niveau de la transcription et que la synthèse globale de CD4 ne semble pas affectée, on pense que la protéine Nef intervient en bloquant l'étape de post-traduction, ce qui favoriserait la séquestration intracellulaire de CD4 dans les cellules exprimant la protéine Nef. Ce mécanisme de séquestration n'est toutefois pas encore connu. Certains chercheurs pensent que la protéine Nef augmente l'endoeytose de CD4 [AIKEN et al. (1994) (8)] alors que d'autres ont observé que CD4 est retenu au niveau de l'appareil de Golgi [J.M. Since the decrease in the expression of CD4 on the surface of T cells has not been observed at the level of transcription and that the overall synthesis of CD4 does not seem to be affected, it is believed that the protein Nef intervenes by blocking l post-translational step, which would promote the intracellular sequestration of CD4 in cells expressing the protein Nef. This sequestration mechanism is not yet known, however. Some researchers believe that the protein Nef increases the endoeytosis of CD4 [AIKEN et al. (1994) (8)] while others have observed that CD4 is retained at the level of the Golgi apparatus [J.M.
BRADY et al (7)].BRADY et al (7)].
Cet état de la technique montre que la protéine Nef joue un rôle régulateur important pour la multiplication du virus MIV in vivo et les inventeurs de la présente demande ont trouvé trois nouvelles protéines qui interagissent spécifiquement avec la protéine Nef du virus MIV 1. This state of the art shows that the Nef protein plays an important regulatory role for the multiplication of the MIV virus in vivo and the inventors of the present application have found three new proteins which interact specifically with the Nef protein of the MIV 1 virus.
Ainsi la présente invention a pour objet les protéines A, B et C de séquences respectives [SEQ ID No.2, No.4, et No.6] représentées sur les figures 1, 2 et 3 ainsi que les variants de celles-ci résultant de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou plusieurs acides aminés ou leurs fragments polypeptidiques, lesdits variants ou fragments conservant l'activité d'interaction vis-à-vis de la protéine Nef. Thus the subject of the present invention is proteins A, B and C of respective sequences [SEQ ID No.2, No.4, and No.6] represented in FIGS. 1, 2 and 3 as well as the variants thereof resulting from the addition, deletion and / or replacement of one or more amino acids or their polypeptide fragments, said variants or fragments retaining the interaction activity with respect to the protein Nef.
L'invention a également pour objet les séquences d'acides nucléiques à savoir les séquences d'ADN génomiques, les séquences d'ADNc ou d'ARNm, qui comprennent, ou sont constituées, par un enchaînement de nucléotides codant pour l'une quelconque des protéines ou fragments polypeptidiques ci-dessus. A subject of the invention is also the nucleic acid sequences, namely the genomic DNA sequences, the cDNA or mRNA sequences, which comprise, or consist of, a sequence of nucleotides encoding any one proteins or polypeptide fragments above.
L'invention concernent notamment les séquences d'ADNc représentées par:
a) l'une quelconque des séquences ID No.1, No. 3, ou No. 5 représentées sur les figures 1, 2 et 3
b) les séquences d'ADN hybridant de manière stricte avec l'une quelconque des séquences ci-dessus ou un fragment de celles-ci
c) les séquences d'ADN qui en raison de la dégénérescence du code génétique résultent des séquences a) et b) ci-dessus et code pour l'une quelconque des protéines telles que définies ci-dessus;
d) les séquences d'ARNm et d'ADN correspondantes.The invention relates in particular to the cDNA sequences represented by:
a) any of the sequences ID No.1, No. 3, or No. 5 shown in Figures 1, 2 and 3
b) DNA sequences strictly hybridizing with any of the above sequences or a fragment thereof
c) the DNA sequences which, due to the degeneracy of the genetic code result from the sequences a) and b) above and code for any of the proteins as defined above;
d) the corresponding mRNA and DNA sequences.
Les séquences d'ADNc selon l'invention ont été trouvées par criblage d'une banque d'ADNc de cellules Jurkat (lignée lymphocytaire T humaine, ATCC nHB 152) avec la protéine virale Nef du virus HIV 1 à l'aide du système génétique double hybride de levure. The cDNA sequences according to the invention were found by screening a cDNA library of Jurkat cells (human T lymphocyte line, ATCC nHB 152) with the viral protein Nef of the HIV 1 virus using the genetic system. double yeast hybrid.
Ce système double hybride, basé sur la détection des interactions protéineprotéine par activation d'un gène rapporteur, His3 ou ss-galactosidase sous le contrôle de domaines de l'activateur transcriptionnel Gal4 dans la levure, a été décrit pour la première fois par FIELDS et SONG (1989) (9). This double hybrid system, based on the detection of protein-protein interactions by activation of a reporter gene, His3 or ss-galactosidase under the control of domains of the transcriptional activator Gal4 in yeast, was described for the first time by FIELDS and SONG (1989) (9).
Dans ce système, l'interaction entre les deux protéines hybrides testées permet l'expression du gène His 3 et la croissance des levures sans histidine d'une part, ainsi que l'expression du gène ss-galactosidase d'autre part qui donne une coloration bleue en présence de son substrat X-Gal. In this system, the interaction between the two hybrid proteins tested allows the expression of the His 3 gene and the growth of yeasts without histidine on the one hand, as well as the expression of the ss-galactosidase gene on the other hand which gives a blue color in the presence of its X-Gal substrate.
Ce criblage, qui sera décrit plus en détail dans la partie expérimentale, a permis d'isoler trois clones positifs, ci-après dénommés clone 3, clone 20 et clone 26A, qui ont été caractérisés par séquençage d'ADN sur séquenceur automatique
Applied Biosystem avec la technique des terminateurs de chaîne décrite dans l'ouvrage de SAMBROOK, FRITSCH et MANIATIS (1989) (10).This screening, which will be described in more detail in the experimental part, made it possible to isolate three positive clones, hereinafter called clone 3, clone 20 and clone 26A, which were characterized by DNA sequencing on automatic sequencer
Applied Biosystem with the chain terminator technique described in the book by SAMBROOK, FRITSCH and MANIATIS (1989) (10).
Une recherche dans les banques de séquences d'ADN a montré que les clones 3 et 20 sont des séquences nouvelles pour lesquelles aucune homologie n'a été retrouvée. A search in the DNA sequence banks has shown that clones 3 and 20 are new sequences for which no homology has been found.
Les séquences respectivement de ces clones sont les séquences SEQ ID No. 1 et No. 3 et leurs séquences d'acides aminés déduites sont les séquences SEQ ID
No.2 et No.4.The sequences of these clones respectively are the sequences SEQ ID No. 1 and No. 3 and their deduced amino acid sequences are the sequences SEQ ID
No.2 and No.4.
Un troisième clone positif, clone 26A, est l'homologue d'une séquence codant pour une protéine de rat, la protéine B-COP, non encore clonée ni cartographiée chez l'homme. La séquence du clone 26A est la séquence SEQ ID
No. 5 et sa séquence d'acides aminés déduite est la séquence SEQ ID No. 6. La comparaison des séquences protéiques entre le clone 26A et ss-COP de rat est montrée sur la figure 4. En fait le clone 26A code pour un fragment C-terminal de la protéine ss-COP humaine et présente une très forte homologie, entre 95 et 98% avec la protéine de rat [DUDEN el al. (1991) (11)]. La protéine ss-COP de rat entière comprends 900 résidus. On pense que son homologue humain possède une taille similaire si l'on en juge d'une part par l'importante homologie qui a été présentement détectée dans la partie C-terminale, et d'autre part par la taille de l'ARN messager humain qui est très voisine de celle de l'ARN messager de la t3-
COP de rat (3,2kb contre 3,4kb). Les résultats de clonage en double-hybride en levure montrent donc que pour l'interaction de ss-COP humaine avec Nef, seuls les 303 résidus au maximum de l'extrémité C-terminale de ss-COP sont nécessaires.A third positive clone, clone 26A, is the homolog of a sequence coding for a rat protein, the protein B-COP, not yet cloned or mapped in humans. The sequence of clone 26A is the sequence SEQ ID
No. 5 and its deduced amino acid sequence is sequence SEQ ID No. 6. The comparison of the protein sequences between clone 26A and rat ss-COP is shown in FIG. 4. In fact clone 26A codes for a C-terminal fragment of the human ss-COP protein and has a very strong homology, between 95 and 98% with the rat protein [DUDEN el al. (1991) (11)]. The whole rat ss-COP protein comprises 900 residues. Its human counterpart is thought to have a similar size if we judge on the one hand by the significant homology which has been detected in the C-terminal part, and on the other hand by the size of the messenger RNA human which is very close to that of the messenger RNA of t3-
Rat COP (3.2kb versus 3.4kb). The cloning results in yeast double-hybrid therefore show that for the interaction of human ss-COP with Nef, only the maximum 303 residues of the C-terminal end of ss-COP are necessary.
La protéine ss-COP est une protéine de l'appareil de Golgi qui a été décrite par exemple par R.DUDEN et al. (1991) (11). Elle n'est pas connue ni suspectée jusqu a présent pour son action avec la protéine Nef du virus HIV 1. On notera d'ailleurs qu'elle n'est pas connue pour l'endocytose. Son interaction avec la protéine Nef du virus HIV 1 est donc tout à fait surprenante. The ss-COP protein is a protein of the Golgi apparatus which has been described for example by R.DUDEN et al. (1991) (11). It is neither known nor suspected until now for its action with the Nef protein of the HIV 1 virus. It should also be noted that it is not known for endocytosis. Its interaction with the Nef protein of the HIV 1 virus is therefore quite surprising.
On comprendra aisément que l'interaction mise en évidence ci-dessus ouvre une nouvelle voie pour la recherche de médicaments anti-viraux anti-HIV. It will be readily understood that the interaction highlighted above opens up a new path for the search for anti-viral anti-HIV drugs.
Ainsi, selon un autre aspect la présente invention a pour objet l'utilisation des séquences d'acides nucléiques selon l'invention ou des protéines A, B et C pour le criblage d'agents susceptibles d'inhiber l'interaction entre l'une des protéines A, B,
C de l'invention et la protéine Nef du virus MIV 1.Thus, according to another aspect, the subject of the present invention is the use of the nucleic acid sequences according to the invention or of proteins A, B and C for the screening of agents capable of inhibiting the interaction between one proteins A, B,
C of the invention and the Nef protein of the MIV 1 virus.
A titre d'exemple d'inhibiteurs appropriés, on peut citer les fragments peptidiques qui représentent des séquences partielles, soit de la protéine Nef, soit de l'une des protéines A, B ou C. On peut également sélectionner des inhibiteurs soit à partir de banques aléatoires de peptides, à la surface de phages [Scott J. et
Smith G. (1990) (27)], soit en utilisant des oligonucléotides de synthèse aléatoires, selon la technique de type SELEX [Tuerk et Gold (1990) (28)]. Cette technique permet d'isoler à partir d'un pool très large d'oligonucléotides, ceux qui vont avoir une grande affinité pour la protéine d'intérêt, dans le cas présent, soit l'une des protéines A, B ou C, soit la protéine Nef. Ils sont dénommés aptamers. Parmi ces aptamers, on pourra sélectionner ceux qui inhibitent l'interaction avec la protéine
Nef par le criblage ci-après.By way of example of suitable inhibitors, mention may be made of peptide fragments which represent partial sequences, either of the Nef protein or of one of the proteins A, B or C. It is also possible to select inhibitors either from of random peptide banks on the surface of phages [Scott J. and
Smith G. (1990) (27)], or using random synthetic oligonucleotides, according to the SELEX type technique [Tuerk and Gold (1990) (28)]. This technique makes it possible to isolate, from a very large pool of oligonucleotides, those which will have a great affinity for the protein of interest, in the present case, either one of the proteins A, B or C, or the protein Nef. They are called aptamers. Among these aptamers, we can select those which inhibit the interaction with the protein
Nave by the screening below.
Le criblage défini ci-dessus peut par exemple être réalisé en utilisant le système double hybride en levure dans lequel des cellules de levure co-exprimant la protéine Nef et l'une des protéines A, B ou C selon l'invention sont cultivées sur des milieux dépourvus en histidine en présence de la substance à tester. The screening defined above can for example be carried out using the double hybrid yeast system in which yeast cells co-expressing the protein Nef and one of the proteins A, B or C according to the invention are cultured on media lacking histidine in the presence of the test substance.
Ce criblage peut aussi être effectué in vitro en utilisant la protéine Nef et l'une des protéines A, B ou C, l'une des protéines étant immobilisée sur un support approprié et l'autre étant marquée par un moyen quelconque utilisé dans les procédés de détection de substances biologiques, ce moyen de marquage pouvant être par exemple un isotope radioactif, un agent luminescent, de la biotine ou un anticorps spécifique. This screening can also be carried out in vitro using the protein Nef and one of the proteins A, B or C, one of the proteins being immobilized on an appropriate support and the other being labeled by any means used in the methods. for detecting biological substances, this labeling means possibly being for example a radioactive isotope, a luminescent agent, biotin or a specific antibody.
L'une des protéines sera de préférence immobilisée sous la forme d'une protéine de fusion avec la glutathion S-transférase (GST) sur des billes d'agaroseglutathion, la GST servant d'agent de couplage de ladite protéine sur les billes. One of the proteins will preferably be immobilized in the form of a fusion protein with glutathione S-transferase (GST) on agaroseglutathione beads, the GST serving as a coupling agent for said protein on the beads.
A cet effet, on peut avantageusement utiliser le test de scintillation à proximité (SPA) décrit par BOSWORTH et al. (1989) (12) et commercialisé par
Amersham. Ce test consiste à marquer par un élément radioactif, par exemple le tritium l'une des protéines et à immobiliser l'autre protéine sur des billes magnétiques ou sur des billes d'agarose-glutathion (GSH). L'effet inhibiteur des substances à tester sur l'interaction des deux protéines peut être facilement détectée sans séparation des espèces radio-actives liées ou libres selon les protocoles décrits par BOSWORTH et al. (12). To this end, the proximity scintillation test (SPA) described by BOSWORTH et al. (1989) (12) and marketed by
Amersham. This test consists in labeling one of the proteins with a radioactive element, for example tritium, and in immobilizing the other protein on magnetic beads or on agarose-glutathione (GSH) beads. The inhibitory effect of the substances to be tested on the interaction of the two proteins can be easily detected without separation of the linked or free radioactive species according to the protocols described by BOSWORTH et al. (12).
On peut également utiliser la technique "Surface Plasmon Resonances" décrite par KARLSSON et al. (1991) (13) utilisant le Biacore commercialisé par
Pharmacia, pour isoler les inhibiteurs de l'interaction entre la protéine Nef et l'une quelconque des protéines A, B ou C selon l'invention.One can also use the "Surface Plasmon Resonances" technique described by KARLSSON et al. (1991) (13) using the Biacore marketed by
Pharmacia, to isolate the inhibitors of the interaction between the Nef protein and any of the proteins A, B or C according to the invention.
L'activité inhibitrice des agents ainsi sélectionnés pourra être vérifiée par des tests sur des cellules T CD4+ ou sur des animaux transgéniques infectés par le virus HIV 1. The inhibitory activity of the agents thus selected can be verified by tests on CD4 + T cells or on transgenic animals infected with the HIV 1 virus.
L'invention a aussi pour objet les microorganismes procaryotes et les cellules eucaryotes transformés à l'aide d'un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN selon l'invention. Ce vecteur d'expression, qui peut être par exemple sous la forme d'un plasmide, doit comporter, en plus de la séquence d'ADN de l'invention, les moyens nécessaires à son expression, tels que notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de replication et de préférence un marqueur de sélection. La transformation des microorganismes et des cellules eucaryotes est une technique bien connue de l'homme de métier, qui pourra aisément déterminer en fonction du microorganisme à transformer les moyens nécessaires à l'expression de la séquence d'ADN selon l'invention. The subject of the invention is also the prokaryotic microorganisms and the eukaryotic cells transformed using an expression vector containing a DNA sequence according to the invention. This expression vector, which may for example be in the form of a plasmid, must comprise, in addition to the DNA sequence of the invention, the means necessary for its expression, such as in particular a promoter, a terminator of transcription, an origin of replication and preferably a selection marker. The transformation of microorganisms and eukaryotic cells is a technique well known to those skilled in the art, who can easily determine, depending on the microorganism to be transformed, the means necessary for the expression of the DNA sequence according to the invention.
Le microorganisme procaryote préféré aux fins de l'invention est E.Coli alors que l'on utilise de préférence, Sacharromvces cerevisiae comme levure. The preferred prokaryotic microorganism for the purposes of the invention is E.Coli, whereas Sacharromvces cerevisiae is preferably used as yeast.
A titre d'exemples de cellules eucaryotes qui conviennent aux fins de l'invention on peut citer notamment les cellules COS, CHO, SF9, Jurkat etc., toutes répertoriées à l'ATCC. As examples of eukaryotic cells which are suitable for the purposes of the invention, mention may in particular be made of COS, CHO, SF9, Jurkat etc. cells, all of which are listed in the ATCC.
L'invention a aussi pour objet les cellules eucaryotes co-transformées avec des vecteurs d'expression contenant la séquence d'ADN codant pour la protéine
Nef d'une part et une séquence codant pour l'une quelconque des protéines A, B ou
C d'autre part, lesdits vecteurs d'expression contenant en plus des moyens utiles à leur expression, y compris dans le système double hybride en levure.A subject of the invention is also eukaryotic cells co-transformed with expression vectors containing the DNA sequence coding for the protein.
Nef on the one hand and a sequence coding for any one of the proteins A, B or
C on the other hand, said expression vectors additionally containing means useful for their expression, including in the double hybrid yeast system.
Enfin, l'invention a pour objet les vecteurs d'expression définis ci-dessus, qui comportent en plus des moyens nécessaires à leur expression une séquence d'ADN choisie parmi les séquences SEQ ID No. 1, No.3 et No. 5. Finally, the subject of the invention is the expression vectors defined above, which comprise, in addition to the means necessary for their expression, a DNA sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 1, No.3 and No. 5 .
Les protéines A, B, C et leurs fragments peptidiques de même que des fragments peptidiques de la protéine Nef sont des inhibiteurs potentiels de l'interaction entre la protéine Nef et les protéines cellulaires contenant les séquences SEQ ID No.2, No.4 ou No. 6 et peuvent donc de ce fait être utilisés comme agents anti-viraux anti-HIV. La présente invention a donc aussi pour objet, les agents anti-viraux anti-HIV qui sont constitués par les protéines A, B et
C ou leurs fragments peptidiques ayant conservé l'activité d'interaction avec la protéine Nef, ou par des fragments peptidiques de la protéine Nef capables d'inhiber la liaison de la protéine Nef avec des protéines cellulaires contenant les protéines A, B ou C.Proteins A, B, C and their peptide fragments as well as peptide fragments of the Nef protein are potential inhibitors of the interaction between the Nef protein and the cellular proteins containing the sequences SEQ ID No.2, No.4 or No. 6 and can therefore therefore be used as anti-viral anti-HIV agents. The present invention therefore also relates to the anti-HIV anti-viral agents which consist of the proteins A, B and
C or their peptide fragments which have retained the activity of interaction with the Nef protein, or by peptide fragments of the Nef protein capable of inhibiting the binding of the Nef protein with cellular proteins containing the proteins A, B or C.
Les protéines et fragments polypeptidiques selon l'invention peuvent être obtenus par la technique du génie génétique qui comprend les étapes de:
- culture d'un microorganisme transformé ou de cellules eucaryotes transformées à l'aide d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention, et
- récupération de la protéine ou du fragment polypeptidique produit par ledit microorganisme ou lesdites cellules eucaryotes.The proteins and polypeptide fragments according to the invention can be obtained by the technique of genetic engineering which comprises the steps of:
- culture of a transformed microorganism or of eukaryotic cells transformed using a nucleic acid sequence according to the invention, and
- recovery of the protein or polypeptide fragment produced by said microorganism or said eukaryotic cells.
Cette technique est bien connue de l'homme de métier. Pour plus de détail la concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après : Recombinant DNA technology I, Editors Ales Prokop, Rakesh K Bajpai ; Annals of the New-York
Academy of Sciences, volume 646, 1991.This technique is well known to those skilled in the art. For more details concerning it, reference may be made to the following work: Recombinant DNA technology I, Editors Ales Prokop, Rakesh K Bajpai; Annals of the New-York
Academy of Sciences, volume 646, 1991.
Ils peuvent également être préparés par les synthèses peptidiques classiques bien connues de l'homme de métier. They can also be prepared by conventional peptide syntheses well known to those skilled in the art.
Les acides nucléiques selon l'invention peuvent être préparés par synthèse chimique et génie génétique en utilisant les techniques bien connues de l'homme de métier et décrites par exemple par SAMBROOK et al. (1989) (10). The nucleic acids according to the invention can be prepared by chemical synthesis and genetic engineering using techniques well known to those skilled in the art and described for example by SAMBROOK et al. (1989) (10).
Par exemple, la synthèse des séquences d'ADNc selon l'invention peut être effectuée par amplification des ARNm de cellules humaines à l'aide de la méthode
PCR (Polymerase Chain Reaction), comme décrit par exemple par Goblet et al (1989) (14), en utilisant des oligonucléotides synthétiques comme amorces, définis à partir des séquences d'ADN SEQ ID No.1, No.3 et No.5. Des amorces appropriées pour la synthèse de la protéine C sont constituées par exemple par les oligonucléotides ci-après:
amorce 5'
CGAATTAACCCTCACTAAAGAAG GATGG CCTCGTG CCGGAAATTATCC
amorce 3' ACGCGTCGACTAAGGGAAAGGCTTAAATTATTGCTG. For example, the synthesis of the cDNA sequences according to the invention can be carried out by amplification of the mRNAs of human cells using the method
PCR (Polymerase Chain Reaction), as described for example by Goblet et al (1989) (14), using synthetic oligonucleotides as primers, defined from the DNA sequences SEQ ID No.1, No.3 and No. 5. Primers suitable for the synthesis of protein C consist, for example, of the following oligonucleotides:
5 'primer
CGAATTAACCCTCACTAAAGAAG GATGG CCTCGTG CCGGAAATTATCC
3 'primer ACGCGTCGACTAAGGGAAAGGCTTAAATTATTGCTG.
Le fragment d'acides nucléiques amplifié peut être ensuite cloné selon les techniques décrites dans Ausubel F.M. et al. (1989) (15). The amplified nucleic acid fragment can then be cloned according to the techniques described in Ausubel F.M. et al. (1989) (15).
L'invention va être maintenant décrite en détail à l'aide de l'exposé expérimental ci-après. The invention will now be described in detail using the experimental description below.
Une grande partie de l'ensemble des techniques décrites dans ces sections, bien connues de l'homme de métier, est exposée en détail dans l'ouvrage de
SAMBROOK et al. (1989) (10) ou dans l'ouvrage de AUSUBEL et al. (1989) (15).A large part of all the techniques described in these sections, well known to those skilled in the art, are described in detail in the work by
SAMBROOK et al. (1989) (10) or in the work of AUSUBEL et al. (1989) (15).
Les autres méthodes utilisées ainsi que les moyens génétiques mis en oeuvre sont décrits dans les références bibliographiques qui sont répertoriées à la fin de la description. L'ensemble des références ainsi répertoriées sont incorporées à la présente description à titre de références. The other methods used as well as the genetic means used are described in the bibliographical references which are listed at the end of the description. All the references thus listed are incorporated into the present description by way of references.
La description ci-après sera mieux comprise à l'aide des figures 1 à 8. The description below will be better understood with the aid of FIGS. 1 to 8.
- la figure 1 est la séquence de la protéine A [SEQ ID No. 2] et la séquence d'ADNc [SEQ ID No. 1] codant pour cette protéine;
- la figure 2 est la séquence de la protéine B [SEQ ID No. 4] et la séquence d'ADNc [SEQ ID No. 3] codant pour cette protéine;
- la figure 3 est la séquence de la protéine C [SEQ ID No. 6] et la séquence d'ADNc [SEQ ID No. 5] codant pour cette protéine;
- la figure 4 est la comparaison des séquences protéiques du clone 26A (séquence inférieure) et de ss-COP de rat (séquence supérieure);
- la figure 5 est la photographie de boîtes de Pétri montrant la croissance de cellules de levure cotransformées par les plasmides contenant SNF1 + SNF4 ; Nef + B-COP-Cter; 5-COP-Cter; Nef, SNF1 + B-COP-Cter ou SNF4 sur milieu en présence d'histidine (His+) et sur milieu en l'absence d'histidine (His-)
- la figure 6 est la photographie d'une immunoempreinte (Western blot) montrant l'interaction de la protéine Nef avec t3-COP-Cter in vitro;
- la figure 7 est la photographie d'une autoradiographie après séparation sur gel SDS-PAGE montrant l'interaction in vitro entre la protéine C (ss-COP-Cter) marquée à la méthionine S35 et Nef immobilisée sur billes GST;
- la figure 8 est la photographie d'immunoempreintes (Western blot) après traitement
- en haut avec des anticorps anti B-COP,
- en bas avec des anticorps anti-Nef.- Figure 1 is the sequence of protein A [SEQ ID No. 2] and the cDNA sequence [SEQ ID No. 1] encoding this protein;
- Figure 2 is the sequence of protein B [SEQ ID No. 4] and the cDNA sequence [SEQ ID No. 3] encoding this protein;
- Figure 3 is the sequence of protein C [SEQ ID No. 6] and the cDNA sequence [SEQ ID No. 5] encoding this protein;
FIG. 4 is the comparison of the protein sequences of clone 26A (lower sequence) and of rat ss-COP (upper sequence);
- Figure 5 is a photograph of Petri dishes showing the growth of yeast cells cotransformed by plasmids containing SNF1 + SNF4; Nef + B-COP-Cter; 5-COP-Cter; Nef, SNF1 + B-COP-Cter or SNF4 on medium in the presence of histidine (His +) and on medium in the absence of histidine (His-)
- Figure 6 is a photograph of an immunoblot (Western blot) showing the interaction of the Nef protein with t3-COP-Cter in vitro;
- Figure 7 is a photograph of an autoradiography after separation on SDS-PAGE gel showing the in vitro interaction between protein C (ss-COP-Cter) labeled with methionine S35 and Nef immobilized on GST beads;
- Figure 8 is the photograph of immunoblotting (Western blot) after treatment
- above with anti-B-COP antibodies,
- below with anti-Nef antibodies.
Les cellules de levure utilisées dans les exemples ci-après sont des cellules de Sacharromvces cerevisiae. The yeast cells used in the examples below are cells from Sacharromvces cerevisiae.
EXEMPLE 1: criblage double hybride en levure / mise en évidence des séquences d'ADNc et des protéines de l'invention
Pour identifier les protéines cellulaires susceptibles d'interagir spécifiquement avec la protéine Nef de MIV 1, on a utilisé le système de double hybride en levure décrit par FIELDS et SONG (1989) (9). On a procédé à la fusion du cadre de lecture ouvert entier du gène HIV 1 LAI Nef avec le domaine de fixation de l'ADN Gal4 (Gal4 DB), dans le plasmide pGBT10 [CHARDIN et al.EXAMPLE 1: Double Hybrid Yeast Screening / Demonstration of the cDNA and Protein Sequences of the Invention
To identify the cellular proteins capable of interacting specifically with the Nef protein of MIV 1, the yeast double hybrid system described by FIELDS and SONG (1989) (9) was used. The entire open reading frame of the HIV 1 LAI Nef gene was fused with the DNA binding domain Gal4 (Gal4 DB), in the plasmid pGBT10 [CHARDIN et al.
(1993) (16)] et on a utilisé ce plasmide d'expression, désigné ci-après Nef hybride, comme cible pour le criblage en double hybride. On a co-transformé la souche de levure HF7, contenant deux gènes rapporteurs réagissant à Gal4, HIS3 et LacZ, à l'aide du plasmide d'expression Nef - hybride et avec une banque d'ADNc de cellules de Jurkat construite dans pGADî3î8 [ HANNON et al. (1993) (17)]; ce vecteur dirige l'expression de protéines hybrides en fusion avec le domaine activateur de la transcription de Gal4 (Gal4AD).(1993) (16)] and this expression plasmid, hereinafter referred to as hybrid Nef, was used as target for the screening in double hybrid. The yeast strain HF7, containing two reporter genes reacting to Gal4, HIS3 and LacZ, was co-transformed with the expression plasmid Nef - hybrid and with a Jurkat cell cDNA library constructed in pGAD138 [ HANNON et al. (1993) (17)]; this vector directs the expression of hybrid proteins in fusion with the activating domain of the transcription of Gal4 (Gal4AD).
La banque d'ADNc a été construite à partir de 5jg d'ARN poly A+ de cellules Jurkat (ATCC TIBI 152) en utilisant le kit Pharmacia (ref. : 27-9274-01) selon les recommandations du fournisseur, avec une amorce oligo dT/Notl et des adaptateurs EcoRI fournis dans le kit. Les ADNc ont été insérés dans le vecteur pGAD1318 entre les sites EcoRI et NotI. The cDNA library was constructed from 5 μg of poly A + RNA from Jurkat cells (ATCC TIBI 152) using the Pharmacia kit (ref.: 27-9274-01) according to the supplier's recommendations, with an oligo primer dT / Notl and EcoRI adapters supplied in the kit. The cDNAs were inserted into the vector pGAD1318 between the EcoRI and NotI sites.
Lorsque l'ADNc code pour une protéine qui interagit avec la protéine Nef, la souche rapportrice se développe en l'absence d'histidine et produit de la ss- galactosidase. Sur les quelques 106 doubles transformants criblés, on a sélectionné 148 clones positifs primaires en identifiant les colonies qui s'étaient développées en l'absence d'histidine. On a ensuite dosé l'activité ss-galactosidase de ces colonies et on a constaté que 28 des 148 colonies His+ exprimaient une activité ss- galactosidase. On a récupéré des plasmides de banque de chacun de ces clones et on les a utilisé pour retransformer la souche rapportrice en combinaison avec soit la protéine cible Nef soit une cible étrangère représentée par la protéine de levure
SNF4 [FIELDS & SONG 1989(9)]. Seuls trois plasmides de banques, les clones 3, 20 et 26A, ont conféré à HF7 la capacité de croître en l'absence d'histidine et de produire une activité ss-galactosidase en présence de la cible Nef et non avec un hybride formé entre le domaine de liaison de l'ADN Gal4 et SNF4 ou un Gal4 BD sans insert (voir figure 5). Les séquences d'ADNc de ces trois clones, déterminées par séquençage d'ADN sur séquenceur automatique Applied Biosystem, sont représentées sur les figures 1, 2 et 3. Alors que les clones 3 et 20 ne présentent aucune homologie avec les séquences existantes des banques de séquences, le clone 26A, comme représenté à la figure A, fait preuve d'une similarité frappante avec une des séquences figurant dans les bases de données existantes, la protéine ss -COP de rat [Duden et al., (1991) (11)]. En fait, le clone 26A code pour les 303 résidus amino-acides carboxy-terminaux de la protéine ss-COP humaine (protéine
C). Le niveau de conservation de séquence entre les deux protéines est extrémement élevé, supérieur à 95% ; sur ces 303 résidus, on ne note que 9 différences. En outre, on a découvert par la technique de Northen que la taille de l'ARNm de la ss-COP humaine (3,2 kb) (donnée non représentée), était très similaire à celle de la RNAm de la ss-COP du rat (3,4kb) [Duden et al., (1991) (11)j. When the cDNA codes for a protein that interacts with the Nef protein, the reporter strain grows in the absence of histidine and produces ss-galactosidase. Of the approximately 106 double transformants screened, 148 primary positive clones were selected by identifying colonies that had grown in the absence of histidine. The ss-galactosidase activity was then assayed for these colonies and it was found that 28 of the 148 His + colonies expressed ss-galactosidase activity. Bank plasmids from each of these clones were recovered and used to transform the reporter strain in combination with either the target protein Nef or a foreign target represented by the yeast protein
SNF4 [FIELDS & SONG 1989 (9)]. Only three library plasmids, clones 3, 20 and 26A, gave HF7 the ability to grow in the absence of histidine and to produce ss-galactosidase activity in the presence of the target Nef and not with a hybrid formed between the DNA binding domain Gal4 and SNF4 or a Gal4 BD without insert (see FIG. 5). The cDNA sequences of these three clones, determined by DNA sequencing on the Applied Biosystem automatic sequencer, are represented in FIGS. 1, 2 and 3. While clones 3 and 20 show no homology with the existing sequences of libraries of sequences, clone 26A, as shown in FIG. A, shows a striking similarity with one of the sequences appearing in existing databases, the rat ss -COP protein [Duden et al., (1991) ( 11)]. In fact, clone 26A codes for the 303 carboxy-terminal amino acid residues of the human ss-COP protein (protein
VS). The level of sequence conservation between the two proteins is extremely high, greater than 95%; of these 303 residues, only 9 differences are noted. Furthermore, it was discovered by the Northen technique that the size of the human ss-COP mRNA (3.2 kb) (data not shown) was very similar to that of the ss-COP mRNA of rat (3,4kb) [Duden et al., (1991) (11) j.
De plus, pour confirmer la spécificité de l'interaction de la protéine Nef avec la protéine C (B-COP), on a utilisé plusieurs produits d'assemblage différents de protéines hybrides fusionnés avec le domaine d'activation transcriptionnel de Gal4 ou de LexA, à savoir des protéines cellulaires telles que rabS, rab6 et des protéines de HIV 1 telles que pS5 Gag pr ou NCp7. Aucune de ces protéines hybrides n'a présentée d'aptitude à interagir avec Nef. De même, en utilisant un produit d'assemblage hybride formé avec le domaine cytoplasmique de CD4 aucune interaction directe entre Nef et CD4, ni entre ss-COP-Cter et CD4 n'a pu être détectée. In addition, to confirm the specificity of the interaction of the protein Nef with the protein C (B-COP), several different constructs of hybrid proteins were used, fused with the transcriptional activation domain of Gal4 or LexA. , namely cellular proteins such as rabS, rab6 and HIV 1 proteins such as pS5 Gag pr or NCp7. None of these hybrid proteins showed any ability to interact with Nef. Likewise, using a hybrid construct formed with the cytoplasmic domain of CD4, no direct interaction between Nef and CD4, nor between ss-COP-Cter and CD4 could be detected.
Dans les exemples ci-après, on a vérifié que l'interaction de l'une des protéines de l'invention, la protéine C (ou protéine ss-COP-Cter) avec la protéine
Nef existe in vitro et, ex vivo dans des cellules chroniquement infectées par le virus HIV 1.In the examples below, it has been verified that the interaction of one of the proteins of the invention, protein C (or protein ss-COP-Cter) with the protein
Nef exists in vitro and ex vivo in cells chronically infected with the HIV 1 virus.
EXEMPLE 2 : interaction in vitro entre la protéine Nef et la protéine ss-COP-Cter (protéine C)
Pour déterminer si l'interaction entre Nef et le fragment C-terminal de ss-
COP (B-COP Cter) était directe ou médiée par une protéine de levure non identifiée, on a étudié cette interaction in vitro, en utilisant les deux protéines exprimées par voie bactérienne en fusion avec la glutathion S-transférase (GST) [Smith et Johnson (1988) (18) et Bougeret et al.(1993) (19)]. Ces protéines de fusion ont été utilisées sous une forme immobilisée sur des billes de glutathion (billes GSH) ou clivés ensuite de la fraction de GST par la thrombine.EXAMPLE 2 In Vitro Interaction Between the Nef Protein and the ss-COP-Cter Protein (Protein C)
To determine if the interaction between Nef and the C-terminal fragment of ss-
COP (B-COP Cter) was direct or mediated by an unidentified yeast protein, this interaction was studied in vitro, using the two proteins expressed by the bacterial route in fusion with glutathione S-transferase (GST) [Smith and Johnson (1988) (18) and Bougeret et al. (1993) (19)]. These fusion proteins were used in a form immobilized on glutathione beads (GSH beads) or then cleaved from the GST fraction by thrombin.
a) Création de plasmides recombinants pGEX. expression et purification des protéines de fusion GST-Nef et GST-ss-COP-Cter
La séquence codante pour Nef (621 bp) a été récupérée par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) réalisée sur le génome entier de la souche HIV 1
LaI [Peden et al., (1991) (20)]. Les amorces oligo-nucléotidiques utilisées pour l'amplification de Nef sont les suivantes
amorce S'(BamHI)
CGGGATCCATGGGTGGCAAGTGTCAAAAAG (LAI8390-84 12),
amorce 3' (EcoRI) CCGGAATTCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCCG (LAI8988-9010). a) Creation of recombinant plasmids pGEX. expression and purification of the GST-Nef and GST-ss-COP-Cter fusion proteins
The coding sequence for Nef (621 bp) was recovered by polymerase chain reaction (PCR) carried out on the entire genome of the strain HIV 1
LaI [Peden et al., (1991) (20)]. The oligo-nucleotide primers used for the amplification of Nef are the following
primer S '(BamHI)
CGGGATCCATGGGTGGCAAGTGTCAAAAAG (LAI8390-84 12),
3 'primer (EcoRI) CCGGAATTCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCCG (LAI8988-9010).
Les produits de la PCR ont été purifiés sur gel, soumis à une double digestion par BamMJ/EcoRI et clonés dans les sites BamHI-EcoRI du vecteur d'expression bactérien pGEX2T (Pharmacia), en phase avec le gène de la
Glutathion S-transférase (GST). Pour vérifier l'insertion et pour s'assurer que la
PCR n'avait pas introduit d'erreur dans la séquence, on a procédé au séquençage de l'ADN double brin à l'aide d'un kit Séquénase version 2.0 (commercialisé par
United States Biochemical) selon le protocole fournit par le fabricant. Après l'avoir isolé par criblage en double hybride, on a sous-cloné le clone 26A représentant les 303 résidus amino-acides C-terminaux de la ss-COP (ss-COP-Cter) humaine en tant que protéine de fusion en phase avec GST en utilisant le vecteur pGEX 4,3 (Pharmacia). ss-COP-Cter on a lavé les billes à trois reprises avec NaCl 1M et à deux reprises avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). On a estimé la quantité de protéine de fusion immobilisée sur les billes après électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécyl sulfate de sodium (SDS-PAGE) et coloration au bleu de
Coomassie, par comparaison des intensités des bandes avec celles de protéines étalons de concentration connue. On a identifié les protéines de fusion par immunoempreintes (Westem blot) à l'aide d'anticorps anti-Nef (FM11-BF7) [BRADY et al. (1993) (7)] et des anticorps anti-ss-COP (mAD) PEPPERKOK et al. (1993) (26). Pour préparer Nef sous une forme pure, on a traité GST-Nef immobilisée sur des billes GSH par de la thrombine [Smith & Johnson (18)
Bougeret et al. (19)] et on a ensuite élué les billes. La pureté de chaque fraction éluée a été vérifiée par SDS-PAGE.The PCR products were purified on a gel, subjected to a double digestion with BamMJ / EcoRI and cloned into the BamHI-EcoRI sites of the bacterial expression vector pGEX2T (Pharmacia), in phase with the gene of the
Glutathione S-transferase (GST). To check the insertion and to make sure that the
PCR had not introduced any error in the sequence, the double-stranded DNA was sequenced using a Sequenase version 2.0 kit (marketed by
United States Biochemical) according to the protocol provided by the manufacturer. After having been isolated by screening in double hybrid, clone 26A was subcloned representing the 303 C-terminal amino acid residues of human ss-COP (ss-COP-Cter) as a fusion protein in phase with GST using the vector pGEX 4.3 (Pharmacia). ss-COP-Cter the beads were washed three times with 1M NaCl and twice with phosphate buffered saline (PBS). The quantity of fusion protein immobilized on the beads was estimated after electrophoresis on polyacrylamide-sodium dodecyl sulfate gel (SDS-PAGE) and blue staining.
Coomassie, by comparison of the intensities of the bands with those of standard proteins of known concentration. The fusion proteins were identified by immunoblotting (Westem blot) using anti-Nef antibodies (FM11-BF7) [BRADY et al. (1993) (7)] and anti-ss-COP antibodies (mAD) PEPPERKOK et al. (1993) (26). To prepare Nef in pure form, GST-Nef immobilized on GSH beads was treated with thrombin [Smith & Johnson (18)
Bougeret et al. (19)] and the beads were then eluted. The purity of each eluted fraction was checked by SDS-PAGE.
b) Etude de la liaison in vitro de Nef à la protéine de fusion GST-ss-COP-
Cter immobilisée sur des billes de GSH
Pour étudier la liaison de ss-COP-Cter in vitro, la protéine ss-COP-Cter a été produite sous forme de GST-ss-COP-Cter comme décrit plus haut, puis immobilisée sous forme de GST-ss-COP-Cter sur des billes d'agarose-glutathion, et ensuite incubée avec 30,ut de protéine Nef purifiée pendant 30 minutes à 4-C, dans le tampon TENGN. Après lavages, les billes ont été traitées par SDS 1% à 95 pendant 1 minute, puis analysées par Western blot avec des anticorps anti-Nef (FM11-BF7). De manière réciproque, on a pu démontrer que la protéine ss-COP-
Cter traduite in vitro et marquée à la méthionine 35S se liait à la protéine Nef exprimée sous forme de GST-Nef et immobilisée sur des billes d'agaroseglutathion.b) Study of the In Vitro Binding of Nef to the GST-ss-COP- Fusion Protein
Cter immobilized on GSH beads
To study the binding of ss-COP-Cter in vitro, the ss-COP-Cter protein was produced in the form of GST-ss-COP-Cter as described above, then immobilized in the form of GST-ss-COP-Cter on agarose-glutathione beads, and then incubated with 30 μl of purified Nef protein for 30 minutes at 4-C in TENGN buffer. After washing, the beads were treated with 1% SDS at 95 for 1 minute, then analyzed by Western blot with anti-Nef antibodies (FM11-BF7). Conversely, it has been demonstrated that the protein ss-COP-
Cter translated in vitro and labeled with 35S methionine bound to the protein Nef expressed in the form of GST-Nef and immobilized on agaroseglutathione beads.
c) Svnthèse in vitro de ss-COP-Cter et liaison à GST-Nef immobilisée sur des billes GSH
On a préparé des transcrits T3 de ss-COP-Cter à partir d'un fragment amplifié par PCR sur le plasmide pGal4BD-ss-COP-Cter, selon la technique générale décrite par [GASPAR et al. (1991) (21)]. L'amorce oligonucléotide 5' comporte successivement une séquence promotrice T3 devant un Codon d'initiation ATG en phase avec la phase de lecture de ss-COP-Cter. L'amorce 3' est choisie après le Codon Stop.c) In vitro synthesis of ss-COP-Cter and binding to GST-Nef immobilized on GSH beads
T3 transcripts of ss-COP-Cter were prepared from a fragment amplified by PCR on the plasmid pGal4BD-ss-COP-Cter, according to the general technique described by [GASPAR et al. (1991) (21)]. The 5 'oligonucleotide primer successively comprises a T3 promoter sequence in front of an ATG initiation codon in phase with the reading phase of ss-COP-Cter. The 3 'primer is chosen after the Codon Stop.
La séquence des amorces utilisées est la suivante
amorce 5':
CGAATTAACCCTCACTAAAGAAGGATGGCCTCGTGCCGGAAATTATCC
amorce 3': ACGCGTCGACTAAGGGAAAGGCITAAATTATTGCTG . The sequence of the primers used is as follows
5 'primer:
CGAATTAACCCTCACTAAAGAAGGATGGCCTCGTGCCGGAAATTATCC
3 'primer: ACGCGTCGACTAAGGGAAAGGCITAAATTATTGCTG.
Après PCR, on a préparé le transcrit T3 de B-COP-Cter en utilisant de la T3
ARN polymérase et le kit de transcription de Stratagène (mCapmRNA Cappingkit) selon les instructions du fabricant. On a ensuite utilisé le transcrit T3 de ss-COP-
Cter pour traduction in vitro de 5-COP-Cter marquée au 35S à l'aide du kit de traduction in vitro de Stratagène selon les instructions du fabricant. On a utilisé de la ss-COP-Cter marquée au S35 dans les expériences de liaison à GSH-Nef ou
GST immobilisées sur des billes GSH dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus à propos de Nef et de GSH-ss-COP-Cter. After PCR, the T3 transcript of B-COP-Cter was prepared using T3
RNA polymerase and the Stratagene transcription kit (mCapmRNA Cappingkit) according to the manufacturer's instructions. We then used the T3 transcript of ss-COP-
Cter for in vitro translation of 5-COP-Cter labeled with 35S using the in vitro translation kit of Stratagene according to the manufacturer's instructions. S35-labeled ss-COP-Cter was used in the GSH-Nef binding experiments or
GST immobilized on GSH beads under the same conditions as those described above with respect to Nef and GSH-ss-COP-Cter.
Les résultats obtenus sont représentés sur les figures 6 et 7. The results obtained are shown in Figures 6 and 7.
Dans l'expérience représentée à la figure 6, on a d'abord chargé GST-ss-COP
Cter ou GST, utilisée comme témoin, sur des billes GSH, puis on a incubé avec de la protéine Nef purifiée, obtenue après clivage de GST-Nef par la thrombine.In the experiment shown in Figure 6, we first loaded GST-ss-COP
Cter or GST, used as a control, on GSH beads, then incubated with purified Nef protein, obtained after cleavage of GST-Nef by thrombin.
Après lavage, on a analysé la protéine Nef liée par SDS-PAGE par immunoempreinte avec des anticorps anti-Nef. On constate que la protéine Nef s'est liée spécifiquement à GST-ss-COP Cter (piste 3), mais non à GST (piste 2), ce qui confirme in vitro l'interaction détectée dans la levure à l'aide du système en double hybride. En outre, comme montré à la figure 7, ,B-COP Cter traduite in vitro et marquée par la 35S méthionine, comme indiqué ci-dessus, s'est liée sur la GST
Nef immobilisée sur les billes de glutathion (piste 1) mais non sur GST (piste 2), ce qui confirme de nouveau que les deux protéines interagissent directement in vitro.After washing, the Nef protein bound was analyzed by SDS-PAGE by immunoblotting with anti-Nef antibodies. We see that the protein Nef is specifically linked to GST-ss-COP Cter (lane 3), but not to GST (lane 2), which confirms in vitro the interaction detected in yeast using the system. in double hybrid. In addition, as shown in Figure 7, B-COP Cter translated in vitro and labeled with 35S methionine, as indicated above, bound on GST
Nave immobilized on the glutathione beads (lane 1) but not on GST (lane 2), which again confirms that the two proteins interact directly in vitro.
EXEMPLE 3: Co-immunoprécipitation de Nef et ss-COP à partir de lysat de cellules infectées chroniquement par HIV1 m B
15.106 cellules H9 (ATCC n HTB176H9) infectées chroniquement par un isolat de HIV 1 NDK [POPOVIC et al., (1984) (22)] ont été éventuellement traitées à la Bréfeldine A (BFA) à raison de 2g/ml, puis perméabilisées avec 0,8 Hg/ml de Streptolysine O (Murex) selon les conditions décrites par DONALDSON et al. (1991 (23).EXAMPLE 3 Co-immunoprecipitation of Nef and ss-COP from lysate of cells chronically infected with HIV1 m B
15,106 H9 cells (ATCC n HTB176H9) chronically infected with an HIV 1 NDK isolate [POPOVIC et al., (1984) (22)] were optionally treated with Brefeldine A (BFA) at a rate of 2 g / ml, then permeabilized with 0.8 Hg / ml of Streptolysin O (Murex) according to the conditions described by DONALDSON et al. (1991 (23).
Des anticorps anti-Nef HIV 1HXB3 [HAMMES et al. (1989) (24) ont ensuite été ajoutés au 1: 250 aux cellules perméabilisées. Les étapes ultérieures de l'immunoprécipitation ont été effectuées selon les enseignements de BENNETF et al. (1992) (25). Les immunoprécipités ont été analysés par immunoempreinte (Western blot) avec soit des anticorps anti--COP (mAD 1 : 1000) [PEPPER
KOK et al. (1993) (26)] soit avec des anticorps anti-Nef (AE6 1:100) [BRADY et al. (1993) (7)]. 15.106 cellules non infectées ont été traitées de la même manière à titre de contrôle.Anti-Nef HIV 1HXB3 antibodies [HAMMES et al. (1989) (24) were then added at 1: 250 to the permeabilized cells. The subsequent stages of immunoprecipitation were carried out according to the teachings of BENNETF et al. (1992) (25). The immunoprecipitates were analyzed by immunoblotting (Western blot) with either anti-COP antibodies (mAD 1: 1000) [PEPPER
KOK et al. (1993) (26)] or with anti-Nef antibodies (1: 100 AE6) [BRADY et al. (1993) (7)]. 15,106 uninfected cells were treated in the same way as a control.
Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 8 sur laquelle les différentes pistes sont explicitées ci-après
Piste 1: Lysat total de cellules H9(1,5.106 cellules) non infectées, contrôle du Western blot avec des anti-ss-COP, pour identifier la bande correspondant à ss-
COP.The results obtained are represented in FIG. 8 on which the different tracks are explained below
Lane 1: Total lysate of uninfected H9 cells (1.5 × 10 6 cells), control of the Western blot with anti-ss-COP, to identify the band corresponding to ss-
COP.
Pistes 2 à 5 : Immunoprécipités:
- de cellules H9 non infectées (piste 3)
- de cellules H9 non infectées, après addition de Nef recombinant, (rNef), préparé comme détaillé plus haut (piste 2)
- de cellules H9 chroniquement infectées par MIV 1 III B (piste 4)
- de cellules H9 chroniquement infectées par HIV 1 III B, après traitement à la Bréfeldin A (BFA) (piste 5).Tracks 2 to 5: Immunoprecipitates:
- uninfected H9 cells (lane 3)
- uninfected H9 cells, after addition of recombinant Nef, (rNef), prepared as detailed above (lane 2)
- H9 cells chronically infected with MIV 1 III B (lane 4)
- H9 cells chronically infected with HIV 1 III B, after treatment with Bréfeldin A (BFA) (lane 5).
Comme on peut le voir sur cette figure, quand les immunoprécipités des cellules infectées, obtenus avec des anticorps anti-Nef, sont analysés en Western blot avec des anticorps anti-ss-COP, une bande de 110 kD qui correspond à t3-
COP est détectée, et la protéine Nef est également détectée avec des anticorps anti-Nef (pistes 4 et 5). Dans des cellules non-infectées utilisées comme contrôle, le résultat est négatif. Mais la protéine Nef recombinante, ajoutée à un lysat de cellules non infectées, est également capable de co-précipiter avec ss-COP (piste 2). As can be seen in this figure, when the immunoprecipitates of the infected cells, obtained with anti-Nef antibodies, are analyzed in Western blot with anti-ss-COP antibodies, a 110 kD band which corresponds to t3-
COP is detected, and the Nef protein is also detected with anti-Nef antibodies (lanes 4 and 5). In uninfected cells used as a control, the result is negative. However, the recombinant Nef protein, added to a lysate of uninfected cells, is also capable of co-precipitating with ss-COP (lane 2).
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SEQUENCE LISTING
SEQ ID No.1
GGA ATT CGG CAC GAG GGC CTT GGT CAA GGG AGG CAG GCG TAC AAA TCC ATT TGG AGA ATC
TGG AGG AAG TAC AAA ATC TTG AAA CTG AAG ATT CTA TTC TTC ATC AGT TAT TTA TGT CCG
ATT CCT
SEQ ID No.2 gly ile arg his glu gly leu gly gln gly arg gln ala tyr lys ser ile trp arg ile trp arg lys tyr lys ile leu lys leu lys ile leu phe phe ile ser tyr leu cys pro ile pro
SEQ ID No.3
GAG GGT CAG GTT CTG TGT ATG TCT CCG CGT CTT CCG CGA GCG GTG TGC AGG GCC TGC AGC
ATT GAA CTA GAT GTC GTC CCC GCA GGC CCC AGA AGA TGG GCA GGG CTG TGG CGA CCG CGG
CGA TCC CCC TGG GGA CCT CCG
SEQ ID No.4
glu gly gln val leu cys met ser pro arg leu pro arg ala val cys arg ala cys ser
ile glu leu asp val val pro ala gly pro arg arg trp ala gly leu trp arg pro arg
arg ser pro trp gly pro pro
SEQ ID No.5
AAA TTA TCC CAA AAG AAA GAA TCT GAA AAG AGG AAT GTG ACA GTA CAG CCT GAT GAC CCC
ATT TCC TTC ATG CAA CTA ACT GCT AAG AAT GAA ATG AAC TGC AAG GAA GAT CAG TTT CAG
CTG AGT TTA CTG GCA GCA ATG GGT AAC ACA CAG AGG AAA GAG GCA GCA GAT CCC CTA GCA
TCT AAA CTT AAC AAG GTC ACC CAA TTG ACA GGT TTC TCA GAT CCT GTA TAT GCA GAA GCT
TAC GTT CAT GTC AAC CAA TAT GAT ATT GTC CTG GAT GTA CTT GTT GTG AAC CAA ACC AGT
GAT ACT TTG CAG AAT TGC ACA TTA GAA CTA GCT ACA CTA GGG GAT CTG AAA CTT GTG GAA
AAG CCG TCT CCT TTG ACT CTT GCT CCT CAT GAC TTC GCA AAT ATT AAA GCT AAC GTC AAA
GTA GCA TCA ACA GAA AAT GGA ATA ATT TTT GGT AAT ATA GTT TAT GAT GTC TCT GGA GCA
GCA AGT GAC AGA AAT TGT GTG GTC CTC AGT GAT ATT CAC ATC GAA ATC ATG GAC TAT ATC
CAG CCT GCA ACT TGC ACT GAT GCA GAA TTC CGT CAG ATG TGG GCC GAA TTG GAA TGG GAA
AAC AAA GTG ACA GTT AAC ACC AAC ATG GTT GAT TTA AAT GAC TAC TTA CAG CAC ATA TTA
AAG TCA ACC AAT ATG AAA TGC CTG ACT CCA GAA AAG GCC CTT TCT GGT TAC TGT GGC TTT
ATG GCA GCC AAC CTT TAT GCT CGC TCC ATA TTT GGT GAA GAT GCA CTT GCA AAT GTC AGC
AGT GAG AAG CCA TTA CAC CAG GGA CCA GAT GCT GCT GTT ACC GTC CAT ATA AGA ATT CGT
GCA AAG AGC CAG GGA ATG GCC TTA AGT CTT GGA GAT AAA ATC AAC TTG TCA CAG AAG GAA
ACT AGT ATA
SEQ ID No.6 lys leu ser gln lys lys glu ser glu lys arg asn val thr val gln pro asp asp pro ile ser phe met gln leu thr ala lys asn glu met asn cys lys glu asp gln phe gln leu ser leu leu ala ala met gly asn thr gln arg lys glu ala ala asp pro leu ala ser lys leu asn lys val thr gln leu thr gly phe ser asp pro val tyr ala glu ala tyr val his val asn gln tyr asp ile val leu asp val leu val val asn gln thr ser asp thr leu gln asn cys thr leu glu leu ala thr leu gly asp leu lys leu val glu lys pro ser pro leu thr leu ala pro his asp phe ala asn ile lys ala asn val lys val ala ser thr glu asn gly ile iie phe gly asn ile val tyr asp val ser gly ala ala ser asp arg asn cys val val leu ser asp ile his ile glu ile met asp tyr ile gin pro ala thr cys thr asp ala glu phe arg gln met trp ala glu leu glu trp glu asn lys val thr val asn thr asn met val asp leu asn asp tyr leu gln his ile leu lys ser thr asn met lys cys leu thr pro glu lys ala leu ser gly tyr cys gly phe met ala ala asn leu tyr ala arg ser ile pne gly glu asp ala leu ala asn val ser ser glu lys pro leu his gln gly pro asp ala ala val thr val his ile arg ile arg ala lys ser gln gly met ala leu ser leu gly asp lys ile asn leu ser gln lys glu thr ser ile 12, 4923-4932 (1993) (8) AIKEN C., Konner, J., Landau, NR, Lenburg, ME and Trono, D. Cell 76,
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SEQUENCE LISTING
SEQ ID No.1
GGA ATT CGG CAC GAG GGC CTT GGT CAA GGG AGG CAG GCG TAC AAA TCC ATT TGG AGA ATC
TGG AGG AAG TAC AAA ATC TTG AAA CTG AAG ATT CTA TTC TTC ATC AGT TAT TTA TGT CCG
ATT CCT
SEQ ID No.2 gly ile arg his glu gly leu gly gln gly arg gln ala tyr lys ser ile trp clay ile trp arg lys tyr lys ile leu lys leu lys ile leu phe phe ile ser tyr leu cys pro ile pro
SEQ ID No.3
GAG GGT CAG GTT CTG TGT ATG TCT CCG CGT CTT CCG CGA GCG GTG TGC AGG GCC TGC AGC
ATT GAA CTA GAT GTC GTC CCC GCA GGC CCC AGA AGA TGG GCA GGG CTG TGG CGA CCG CGG
CGA TCC CCC TGG GGA CCT CCG
SEQ ID No.4
glu gly gln val leu cys met ser pro arg leu pro arg ala val cys arg ala cys ser
ile glu leu asp val val pro ala gly pro arg arg trp ala gly leu trp arg pro arg
arg ser pro trp gly pro pro
SEQ ID No.5
AAA TTA TCC CAA AAG AAA GAA TCT GAA AAG AGG AAT GTG ACA GTA CAG CCT GAT GAC CCC
ATT TCC TTC ATG CAA CTA ACT GCT AAG AAT GAA ATG AAC TGC AAG GAA GAT CAG TTT CAG
CTG AGT TTA CTG GCA GCA ATG GGT AAC ACA CAG AGG AAA GAG GCA GCA GAT CCC CTA GCA
TCT AAA CTT AAC AAG GTC ACC CAA TTG ACA GGT TTC TCA GAT CCT GTA TAT GCA GAA GCT
TAC GTT CAT GTC AAC CAA TAT GAT ATT GTC CTG GAT GTA CTT GTT GTG AAC CAA ACC AGT
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GCA AGT GAC AGA AAT TGT GTG GTC CTC AGT GAT ATT CAC ATC GAA ATC ATG GAC TAT ATC
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ATG GCA GCC AAC CTT TAT GCT CGC TCC ATA TTT GGT GAA GAT GCA CTT GCA AAT GTC AGC
AGT GAG AAG CCA TTA CAC CAG GGA CCA GAT GCT GCT GTT ACC GTC CAT ATA AGA ATT CGT
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ACT AGT ATA
SEQ ID No.6 lys leu ser gln lys lys glu ser glu lys arg asn val thr val gln pro asp asp pro ile ser phe met gln leu thr ala lys asn glu met asn cys lys glu asp gln phe gln leu ser leu leu ala ala met gly asn thr gln arg lys glu ala ala asp pro leu ala ser lys leu asn lys val thr gln leu thr gly phe ser asp pro val tyr ala glu ala tyr val his val asn gln tyr asp ile val leu asp val leu val val asn gln thr ser asp thr leu gln asn cys thr leu glu leu ala thr leu gly asp leu lys leu val glu lys pro ser pro leu thr leu ala pro his asp phe ala asn ile lys ala asn val lys val ala ser thr glu asn gly ile iie phe gly asn ile val tyr asp val ser gly ala ala ser asp arg asn cys val val leu ser asp ile his ile glu ile met asp tyr ile gin pro ala thr cys thr asp ala glu phe arg gln met trp ala glu leu glu trp glu asn lys val thr val asn thr asn met val asp leu asn asp tyr leu gln his ile leu lys ser thr asn met lys cys leu thr pro glu lys ala leu ser gly tyr cys gly phe met ala ala asn leu tyr ala arg ser ile pne gly glu asp ala leu ala asn val ser ser glu lys pro leu his gln gly pro asp ala ala val thr val his ile arg ile arg ala lys ser gln gly met ala leu ser leu gly asp lys ile asn leu ser gln lys glu thr ser ile
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|---|---|---|---|
| FR9406206A FR2720068A1 (en) | 1994-05-20 | 1994-05-20 | Proteins capable of interacting with HIV-1 Nef protein |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9406206A FR2720068A1 (en) | 1994-05-20 | 1994-05-20 | Proteins capable of interacting with HIV-1 Nef protein |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Country Status (1)
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