FR2693207A1 - Souche de levure permettant la co-expression d'une activité mono-oxygénase de cytochrome P450 hétérologue et d'une NADPH-cytochrome P450-réductase endogène ou hétérologue et son utilisation à des fins de bioconversion. - Google Patents
Souche de levure permettant la co-expression d'une activité mono-oxygénase de cytochrome P450 hétérologue et d'une NADPH-cytochrome P450-réductase endogène ou hétérologue et son utilisation à des fins de bioconversion. Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne une souche de levure permettant la co-expression d'une activité mono-oxygénase de cytochrome P450 hétérologue et d'une NADPH-cytochrome P450-réductase endogène ou hétérologue, caractérisée en ce que l'un des gènes de la NADPH-cytochrome P450-réductase ou du cytochrome P450 est intégré dans le chromosome de ladite souche, et la souche est transformée par un vecteur portant une cassette d'expression de l'autre gène. L'invention concerne également l'utilisation à des fins de bioconversion de ladite souche de levure ainsi qu'une séquence d'ADNc codant pour le cytochrome P450 CA4H de topinambour Heliantus tuberosus.
Description
La présente invention concerne une souche de levure permettant la co-expression d'une activité mono-oxygénase de cytochrome P450 microsomal hétérologue et d'une NADPH-cytochrome P450-réductase endogène ou hétérologue.
La présente invention concerne également un procédé de coexpression chez une levure d'une activité mono-oxygénase de cytochrome
P450 microsomal hétérologue. et de la NADPH-cytochrome P450-réductase endogène ou hétérologue.
P450 microsomal hétérologue. et de la NADPH-cytochrome P450-réductase endogène ou hétérologue.
La présente invention concerne également l'utilisation à des fins de bioconversion d'une souche de levure selon l'invention.
Plus précisément, la présente invention concerne un procédé de bioconversion destiné à la monoxygénation spécifique, notamment à l'hydroxylation stéréospécifique, d'un composé substrat d'un cytochrome
P450.
P450.
La présente invention concerne enfin une séquence d'ADNc codant pour le cytochrome P450 catalysant l'hydroxylase du trans-cinnamate dans les tubercules de topinambour ou CA4H.
Les cytochromes P450 sont des protéines à activité mono-oxygénase qui constituent une des plus grandes superfamilles de gènes connue chez les eucaryotes supérieurs. Ils sont capables d'oxyder une très grande variété de substrats généralement hydrophobes en se servant de l'oxygène moléculaire dissous dans le cytoplasme, ainsi que des équivalents réducteurs fournis par la NADPH-cytochrome P450-réductase.
Ces réactions sont le plus souvent caractérisées par l'insertion d'un atome d'oxygène dans des liaisons C-H, C=C, N=N, soit par l'oxydation d'un hétéroatome ou encore dans des cas plus rares par une réduction de groupes nitro ou une déshalogénation (Guengerich et Macdonald, 1990,
FASEB J. 4, pp 2453-2459).
FASEB J. 4, pp 2453-2459).
Les cytochromes P450 sont des protéines membranaires associés le plus souvent au reticulum endoplasmique, quelques formes étant mitochondriales.
Leur intervention chez l'homme et les animaux dans les premières étapes de la métabolisation de substances xénobiotique telles que les médicaments ou des polluants, ainsi que leur implication dans des voies importantes du métabolisme endogène des stéroïdes membranaires et hormonaux, des acides biliaires, des phéromones, de la vitamine B, des acides gras, des prostaglandines ont fait des cytochromes P450 un objet d'un vif intérêt (Nebert et Gonzales, 1987, Ann. Rev. Biochem. 56, pp 945993).
Les intenses efforts de recherche se sont traduits par le développement d'un grand nombre d'outils biochimiques, immunologiques et génétiques qui ont permis l'isolement d'environ 200 séquences d'ADN (génomique ou ADNc) à ce jour.
Par rapport au nombre rapidement croissant des séquences connues de nombreuses isoformes de cytochromes P450 chez l'homme et chez les animaux, aucune séquence d'ADN d'un cytochrome P450 avec une fonction bien définie a été isolée. Bozak et al. (1990, PNAS, 90) ont bien reporté le clonage d'un ADNc végétal possédant toutes les caractéristiques conservées au sein des cytochromes P450 mais on n'a pas pu lui associer une fonction. Dans le cadre de la présente invention, est revendiquée la séquence d'ADNc d'un cytochrome P450 végétal, la ca4H, qui catalyse l'hydroxylation en position 4 du trans-cinnamate. Le produit ainsi formé est le trans-coumarate.
D'une manière générale, les progrès de la recherche dans le domaine des cytochromes P450 de plantes ont été retardés en raison de leur faible teneur dans les tissus végétaux et des grandes difficultés auxquelles on se heurte lors de leur purification. Néanmoins, on possède aujourd'hui de sérieuses évidences que les cytochromes P450 de plantes sont très similaires aux cytochromes P450 de mammifères concernant les types de réaction, les mécanismes de réaction et le cycle catalytique (Reichart et al., 1980, Plant Physiol. 66, pp 600-604). Les oxydations de substrats endogènes dans les plantes, catalysées par des ctytochromes
P450, comprennent des hydroxylations de composés aliphatiques et aromatiques, des époxydations, des déméthylations et des réarrangements intramoléculaires.Une quarantaine d'activités enzymatiques catalysées par des cytochromes P450 ont été caractérisées jusqu'à présent chez les végétaux. Elles sont impliquées dans les métabolismes des phénylpropanoïdes, des terpènes des lipides et participent aussi à la synthèse des phytoalexines, des anthocyanes, des tannins, des arômes, des hormones, des stérols membranaires, des alcaloïdes et des cutines et suberines. Compte tenu de leur participation à la synthèse de ce large nombre de métabolites végétaux dont certains présentent un grand intérêt industriel en tant qu'additifs alimentaires ou pigments naturels, le clonage et la surexpression coordonnée de cytochromes P450 dans un microorganisme adapté afin d'y effectuer des réactions de bioconversion est clairement digne d'intérêt.
P450, comprennent des hydroxylations de composés aliphatiques et aromatiques, des époxydations, des déméthylations et des réarrangements intramoléculaires.Une quarantaine d'activités enzymatiques catalysées par des cytochromes P450 ont été caractérisées jusqu'à présent chez les végétaux. Elles sont impliquées dans les métabolismes des phénylpropanoïdes, des terpènes des lipides et participent aussi à la synthèse des phytoalexines, des anthocyanes, des tannins, des arômes, des hormones, des stérols membranaires, des alcaloïdes et des cutines et suberines. Compte tenu de leur participation à la synthèse de ce large nombre de métabolites végétaux dont certains présentent un grand intérêt industriel en tant qu'additifs alimentaires ou pigments naturels, le clonage et la surexpression coordonnée de cytochromes P450 dans un microorganisme adapté afin d'y effectuer des réactions de bioconversion est clairement digne d'intérêt.
Il a été également reporté la déalkylation de substances xénobiotiques (Fonné et al., 1988, Plant Sci., 55, pp 9-20). On constate un net gain d'intérêt agronomique dans les cytochromes P450 de plantes puisqu'ils interviennent dans les premières étapes de la métabolisation de certains pesticides ou herbicides tels que le diclofop ou le chlortoluron (Zimmerlin et Durst, 1990, Phytochemistry, 29, pp 1729-1732, Fonne-Pfister et Kreuz, 1990, Phytochemistry 29, pp 2793-2797) ce qui leur confère une résistance sélective à ces produits. Leur maîtrise et la compréhension de leur fonction est donc de première importance pour l'industrie agronomique.
De part sa position clé dans le métabolisme secondaire de la plante, la cinnamate 4-hydroxylase à P450, qui est le point de départ commun à la synthèse d'un nombre très important de voies métaboliques, dont les produits finaux ont des rôles cruciaux soit comme support structural de la cellule (lignines, phénols de la paroi), soit comme support à la protection superficielle (subérines), soit comme substance de défense de la cellule végétale contre des agents pathogènes (flavonoïdes, isoflavonoïdes, stilbènes, acides phénoliques, tannins), soit comme filtrees de rayonnement UV. Outre ces fonctions vitales, un certain nombre de composés issus de ces voies métaboliques sont très recherchés dans l'industrie alimentaire soit comme arôme ou colorant naturels.Pour exemple, on peut citer la vanilline, dont la première étape de la biosynthèse dans la gousse de Vanilla planifolia est la transformation du trans-cinnamate en trans-coumarate. Le marché mondial de la vanilline est actuellement estimé à 5 000 tonnes/an.
La présente invention a pour objet une souche de levure permettant la co-expression d'une activité mono-oxygénase de cytochrome P450 hétérologue et d'une NADPH-cytochrome P450-réductase endogène ou hétérologue, caractérisée en ce que l'un des gènes de la
NADPH-cytochrome P450-réductase ou du cytochrome P450 est intégré dans le chromosome de ladite souche, et, la souche est transformée par un vecteur portant une cassette d'expression de l'autre gène.
NADPH-cytochrome P450-réductase ou du cytochrome P450 est intégré dans le chromosome de ladite souche, et, la souche est transformée par un vecteur portant une cassette d'expression de l'autre gène.
Ledit vecteur peut être un vecteur d'intégration ou non.
Lorsque ledit vecteur est un vecteur d'intégration dans le chromosome de la souche, les deux gènes se trouvent donc en fait intégrés dans le génome de la souche.
La présente invention a donc en particulier pour objet une souche de levure permettant la co-expression de l'activité mono-oxygénase de cytochrome P450 hétérologue et d'une NADPH-cytochrome P450-réductase endogène ou hétérologue, caractérisée en ce que le gène de la NADPHcytochrome P450-réductase est intégré dans le génome chromosomique de ladite souche et la souche est transformée par un vecteur portant une cassette d'expression du gène de cytochrome P450 hétérologue.
On utilisera, de préférence, un gène de cytochrome P450 microsomal.
On entend ici par "microsomal" les fractions de membranes intracellulaires, notamment du réticulum endoplasmique, rugueux ou lisse, de l'appareil Golgi.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit vecteur n'est pas un vecteur d'intégration mais un vecteur réplicatif, notamment plasmidique.
Dans la présente demande de brevet, on entend par gène hétérologue" un gène provenant d'un organisme autre qu'une levure.
Dans un mode de réalisation particulier le cytochrome P450 microsomal hétérologue est d'origine végétale.
On cite plus particulièrement comme cytochrome P450 microsomal selon l'invention la protéine catalysant l'hydroxylase du transcinnamate, encore appelée protéine CA4H, notamment provenant des tubercules de topinambour Heliantus tuberosus.
De façon appropriée, ledit gène dudit cytochrome P450 est la séquence d'ADNc codant pour ledit cytochrome P450.
Ledit gène dudit cytochrome P450 peut être un gène hybride.
On entendu par gène hybride" un gène pouvant résulter de recombinaisons homologues entre deux gènes de cytochrome P450 d'origines différentes, notamment d'organismes différents, ou pouvant résulter de fusions de parties de gènes de cytochrome P450 d'origines différentes, notamment d'organismes différents.
En particulier on cite la séquence d'ADNc codant pour la CA4H telle que représentée à la figure 1.
Dans un mode de réalisation particulier, la NADPH-cytochrome P450réductase est la NADPH-cytochrome P450-réductase endogène de levure.
Dans un autre mode de réalisation ledit gène de la NADPHcytochrome P450-réductase consiste dans la séquence d'ADNc codant pour la NADPH-cytochrome P450-réductase.hétérologue.
Le clonage de gènes de NADPH-cytochrome P450-réductase hétérologues, en particulier de plantes, a été décrit dans la demande de brevet français n" 92 04491.
On peut citer en particulier, de façon appropriée, comme gène de
NADPH-cytochrome P450-réductase, les gènes d'origine végétale, notamment les gènes de NADPH-cytochrome P450-réductase d'Arabîdonsis thaliana ou de topinambour Heliantus tuberosus.
NADPH-cytochrome P450-réductase, les gènes d'origine végétale, notamment les gènes de NADPH-cytochrome P450-réductase d'Arabîdonsis thaliana ou de topinambour Heliantus tuberosus.
Les séquences d'ADNc codant pour ces gènes d'origine végétale ont été représentées dans la demande de brevet français n" 92 04491.
Dans un mode de réalisation particulier, lorsque le gène de NADPHcytochrome P450-réductase est hétérologue il est du même genre et de la même espèce que le cytochrome P450 hétérologue.
De manière à obtenir une intégration la plus stable possible, de préférence le gène de la NADPH-cytochrome P450-réductase est intégré dans le locus de la NADPH-cytochrome P450-réductase endogène.
Selon l'invention, la souche de levure peut être choisie notamment parmi les genres Saccharomvces. Hansenula, Kluvveromvces, Pichia et
Yarrowia.
Yarrowia.
On cite plus particulièrement les levures du genre Saccharomvces cerevisiae.
Avantageusement, pour permettre une bonne modulation et une régulation de l'expression du cytochrome P-450 dans ledit vecteur, le gène de cytochrome P450 est mis sous le contrôle d'un promoteur inductible.
Dans un mode de réalisation particulier, on a utilisé le vecteur pYEDP60 décrit ci-après.
Avantageusement également, on a remplacé le promoteur naturel de la NADPH-cytochrome P450-réductase, laquelle a été mise sous le contrôle d'un promoteur hétérologue inductible.
Avantageusement encore, le gène de NADPH-cytochrome P450réductase et le gène de cytochrome P450 sont placés sous le contrôle d'un même promoteur inductible, en particulier, le promoteur GA;L10 CYC 1 inductible en milieu galactose.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche est obtenue à partir de la souche PES 1-3-U déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le n" I-1187. Cette souche a été décrite dans la demande de brevet français n" 92 04491.
Cette souche exprime, lorsqu'elle est utilisée sur un milieu contenant du galactose, un niveau de NADPH-cytochrome P450-réductase qui est 20 à 30 fois supérieur au niveau présent dans la souche parentale comportant le promoteur naturel. A l'inverse, en l'absence de galactose, le niveau de réductase présent est extrèmement faible, en fait indétectable, c'est-à-dire au moins 100 fois inférieur au niveau présent dans la souche parentale.
Des niveaux d'expression intermédiaires entre ces deux extrêmes sont possibles en utilisant soit des durées d'induction par le galactose limitées (0 à 12 heures), soit des cultures en présence d'un mélange adapté de glucose et de galactose.
Dans l'exemple de réalisation détaillé qui va suivre ladite souche est la souche WRCA obtenue par transformation de la souche PES 1-3-U par le vecteur pCA4H/YeDP6 0.
De préférence, pour obtenir les taux d'expression maximum, la souche que co-exprime la DADPH-cytochrome P450-réductase est le cytochrome P450 dans un rapport molaire NADPH-cytochrome P450réductase/cytochrome P450 optimum entre 1/3 et 1/10, notamment 1/5.
La variation des taux d'expression respectifs peut être obtenue en variant le nombre de copies des gènes respectifs et/ou en employant des promoteurs différents et plus ou moins forts et/ou en décalant le temps d'induction des promoteurs respectifs.
Dans le but d'obtenir des grandes quantités d'une molécule d'intérêt industriel par un procédé de bioconversion, le choix du microorganisme le mieux adapté pour l'expression du complexe cytochrome P450/P450 réductase est primordial. A cet égard, selon la présente invention, la levure S. cereviae, recombinée dans l'optique de conférer au P450 hétérologue un environnement optimal pour l'expression efficace de son activité est particulièrement appropriée pour les raisons suivantes : 1) la levure S. cer. est un microorganisme unicellulaire eucaryotique contenant l'infrastructure cellulaire (le reticulum endoplasmique) nécessaire pour l'expression de cytochromes P450 microsomales, 2) S. cer.
étant le microorganisme eucaryotique le mieux étudié à ce jour, un grand nombre d'outils biochimiques et génétiques ont été mis au point, 3) S. cer.
a été montré comme un bon système d'expression pour un grand nombre de cytochromes P450 de mammifères, 4) de part de son temps de génération court pour une cellule eucaryotique et par sa faculté de pouvoir pousser à des hautes densités cellulaires dans des milieux peu complexes, S. cer. est un système modèle pour une approche industrielle de production de molécules d'intérêt par bioconversion.
Selon la présente invention, une attention particulière a été portée à la co-expression à un haut niveau de la CA4H et de la P450 réductase associée. La P450 réductase ayant un cycle catalytique plus rapide que les cytochromes P450, il est particulièrement important de respecter un rapport molaire essentiel au bon fonctionnement dans la levure. En effet, un rapport molaire réductase/P450 hétérologue trop bas conduit à une faible activité spécifique du fait du défaut en réductase. Un rapport molaire réductase/P450 hétérologue trop élevé conduit à la desctruction d'une fraction importante du P450 du fait du fort accroissement de cycles abortifs.C'est pourquoi, afin de respecter au mieux un rapport molaire optimal réductase/P450 on a utilisé, selon l'invention, une levure recombinante chez laquelle le promoteur naturel du gène endogène de la
P450 réductase a été remplacé par le promoteur inductible GAL10/CYC1.
P450 réductase a été remplacé par le promoteur inductible GAL10/CYC1.
Puisque la séquence de la C4AH sur plasmide est sous contrôle du même promoteur on peut raisonnablement admettre que le rapport molaire final est donné par le nombre de copies du plasmide par rapport au gène copie simple de la réductase.
Selon la présente invention, on a construit une souche recombinante de levure qui assure un niveau optimal pour l'expression du premier cytochrome P450 de plante à fonction connue. Plus précisément, pour un niveau d'expression comparable à celui trouvé dans la littérature de 100 picomoles par mg de protéines microsomales, l'activité spécifique est de l'ordre de 400 min-1, la valeur la plus élevée jamais mesurée pour un cytochrome P450 microsomal. Cette activité reste de surcroît stable dans le temps. En particulier, selon la présente invention on décrit donc une souche recombinante de levure qui sur les critères de productivité est tout à fait adaptée à la bioconversion du trans-cinnamate en tr-coumarate par la CA4H de topinambour.
La présente invention fournit donc également un procédé de coexpression chez une levure de l'activité mono-oxygénase de cytochrome
P450 microsomal hétérologue, caractérisé en ce qu'on cultive dans un milieu de culture approprié une souche selon l'invention.
P450 microsomal hétérologue, caractérisé en ce qu'on cultive dans un milieu de culture approprié une souche selon l'invention.
La présente invention a également pour objet l'utilisation à des fins de bioconversion d'une souche de levure selon l'invention.
La présente invention a, en particulier, pour objet un procédé de bioconversion destiné à la monoxydation spécifique d'un composé substrat d'un cytochrome P450, caractérisé en ce qu'on convertit un milieu contenant ledit composé ou un précurseur avec l'une des souches selon l'invention exprimant l'activité monoxygénase dudit cytochrome P450 et en ce qu'on récupère ledit composé substrat monoxygéné.
De préférence, on utilise comme milieu de conversion le milieu de culture de la souche. Néanmoins, il est possible de prévoir, lorsque la masse de levure initialement cultivée est suffisante, d'effectuer la conversion dans un milieu qui n'est pas un milieu de culture.
En général, le substrat est contenu dans le milieu, il rentre dans les cellules où il est convertit, puis est relargué dans le milieu. Toutefois, dans certains cas, le milieu peut contenir uniquement un précurseur du substrat, le substrat n'apparaissant qu'à l'intérieur après transformation du précurseur.
La mono-oxydation peut être, par exemple, une hydroxylation stéréospécifique, notamment lorsque le cytochrome P450 est la CA4H, auquel cas le composé substrat est le trans-cinnamate et on récupère le trans-coumarate .
Enfin, la présente invention a aussi pour objet une séquence d'ADNc codant pour le cytochrome P450 CA4H de topinambour Heliantus tuberosus., notamment la séquence d'ADNc telle que représentée à la figure 1 ou une séquence d'ADNc s'hybridant dans des conditions faiblement stringentes à 50"C et/ou présentant au moins 60 % d'homologie avec l'une des séquences précédemment décrites.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée du mode de réalisation qui va suivre, illustrée par les dessins annexés sur lesquels
- la figure 1 représente l > ADNc du gène de cytochrome P450 de topinambour Heliantus tuberosus CA4H,
- la figure 2 représente le schéma de clonage de la CA4H de topinambour dans le vecteur de lecure pYED P60,
- la figure 3 représente, schématisée, la souche de lecure WRCA surexprimant simultanément en milieu galactosé une CA4H exogène et la
NADPH-cytochrome P45Gréductase endogène (ci-après abrégé par "P450- réductase"),
- la figure 4 représente le spectre de différence d'absorption en présence de monoxyde de carbone d'une fraction microsomale de souche
WRCA,
- la figure 5 représente le spectre de perburbation de type I suite à l'ajout de l'acide trans-cinnamique aux microsomes à partir de la culture induite de la souche WRCA,
- la figure 6 représente un chromatogramme de détection du transcinnamate après conversion du trans-cinnamate par une culture de WRCA en milieu galactosé,
- la figure 7 représente la variation de l'amplitude d'absorption dans un spectre de perturbation de type I en fonction du trans-cinnamate ajouté en quantités croissantes à des microsomes oxydés issus d'une culture induite de la souche WRCA,
- la figure 8 représente l'efficacité de couplage entre la NADPH
P450-réductase de levure et la CA4H de topinambour dans les microsomes de la souche WRCA,
- la figure 9 montre une représentation selon Linweaver-Burte donnant l'inverse des activités CA4H mesurées en fonction de l'inverse de la concentration de trans-cinnamate ajouté permettant la détermination de la vitesse maximale de conversion de la CA4H dans les microsomes de levure ainsi que le Km,
- la figure 10 représente la cinétique de formation de p-coumarate sur des microsomes de WRCA,
- la figure 11 représente la cinétique de formation de p-coumarate à partir du trans-cinnamate sur cellules entières contenant la CA4H de topinambour.
- la figure 1 représente l > ADNc du gène de cytochrome P450 de topinambour Heliantus tuberosus CA4H,
- la figure 2 représente le schéma de clonage de la CA4H de topinambour dans le vecteur de lecure pYED P60,
- la figure 3 représente, schématisée, la souche de lecure WRCA surexprimant simultanément en milieu galactosé une CA4H exogène et la
NADPH-cytochrome P45Gréductase endogène (ci-après abrégé par "P450- réductase"),
- la figure 4 représente le spectre de différence d'absorption en présence de monoxyde de carbone d'une fraction microsomale de souche
WRCA,
- la figure 5 représente le spectre de perburbation de type I suite à l'ajout de l'acide trans-cinnamique aux microsomes à partir de la culture induite de la souche WRCA,
- la figure 6 représente un chromatogramme de détection du transcinnamate après conversion du trans-cinnamate par une culture de WRCA en milieu galactosé,
- la figure 7 représente la variation de l'amplitude d'absorption dans un spectre de perturbation de type I en fonction du trans-cinnamate ajouté en quantités croissantes à des microsomes oxydés issus d'une culture induite de la souche WRCA,
- la figure 8 représente l'efficacité de couplage entre la NADPH
P450-réductase de levure et la CA4H de topinambour dans les microsomes de la souche WRCA,
- la figure 9 montre une représentation selon Linweaver-Burte donnant l'inverse des activités CA4H mesurées en fonction de l'inverse de la concentration de trans-cinnamate ajouté permettant la détermination de la vitesse maximale de conversion de la CA4H dans les microsomes de levure ainsi que le Km,
- la figure 10 représente la cinétique de formation de p-coumarate sur des microsomes de WRCA,
- la figure 11 représente la cinétique de formation de p-coumarate à partir du trans-cinnamate sur cellules entières contenant la CA4H de topinambour.
PARTIE EXPERIMENTALE 1) Isolation de l'ADNc du Cytochrome P450 catalysant I'hydroxyîation du tr-cinnamate dans les tubercules de topinåmbour'('C 4H = cinnamate 4-h,ydroxylase.E.C.1.14.13.1).
La procédure de clonage de la CA4H met en oeuvre des méthodes classiques de la biologie moléculaire connues de l'homme de l'art. Le protocole de purification, ainsi que l'obtention d'un anticorps anti-CA4H spécifique à l'aide de la protéine purifiée, est décrit dans la littérature scientifique (Gabriac et al, Archives of
Biochemistry and Biophysics, 1991, Vol 288, pp 302-309) et n'est pas repris en détail ici. Brièvement, des tranches de tubercules de topinambour, incubés dans un milieu contenant du manganèse pour induire la synthèse de l'activité enzymatique de la CA4H, constitue le matériel de départ pour la préparation de la fraction microsomale. Il suit une première étape d'enrichissement en CA4H par une partition de phases en triton X-114, et deux étapes de chromatographie sur DEAE-Trisacryl et sur Hydroxylapatite.
Biochemistry and Biophysics, 1991, Vol 288, pp 302-309) et n'est pas repris en détail ici. Brièvement, des tranches de tubercules de topinambour, incubés dans un milieu contenant du manganèse pour induire la synthèse de l'activité enzymatique de la CA4H, constitue le matériel de départ pour la préparation de la fraction microsomale. Il suit une première étape d'enrichissement en CA4H par une partition de phases en triton X-114, et deux étapes de chromatographie sur DEAE-Trisacryl et sur Hydroxylapatite.
La protéine ainsi purifiée, qui montre un poids moléculaire apparent de 57KD en gel SDS-Acrylamide, a été utilisé pour la fabrication d'anticorps polyclonaux. Ces anticorps réaissent de manière sélective avec un polypeptide de 57 KD en Western blot et inhibent aussi fortement l'activité CA4H dans des microsomes de différentes es peces régétales. Leur utilisation pour cribler une banque d'ADNc de topinambour dans le phage lambda go11, obtenue à partir de tubercules induits pour la surexpression de la CADI, a permis d'isoler un fragment d'ADNc de 1130 bp présentant des séquences caractéristiques de cytochromes
P450 bactériens, fongiques ou animaux. Ce fragment a été ensuite utilisé comme sonde pour cribler une deuxième banque d'ADNc de topinambour dans le phage lambda gtiO construite par amorçage à l'oligodT. Ceci a permis dtiso- ler un clone de 1608 bp qui présente toutes les séquences caractéristiques d'un P450 et la séquence complète est montré en figure 1. Cet ADNc peut être identifié comme étant celui de la CA4H de topinambour pour des raisons suivantes : a) les pH isoélectriques de la protéine purifiée et celui calculé du polypeptide issu de l'ADNcr sont tous deux voisins de pH 9,0 b) l'anticorps anti
CA4H reconnalt dans la banque d'expression un polypeptide de fusion présentant des séquences caractéristiques de
P450 c) la partie 5' terminale du polypeptide déduit de l'ADNc isolé par criblage immunologique avec un anticorps spécifique anti-CA4H est totalement identique à la séquence N-terminale de la CA4H purifiée.
P450 bactériens, fongiques ou animaux. Ce fragment a été ensuite utilisé comme sonde pour cribler une deuxième banque d'ADNc de topinambour dans le phage lambda gtiO construite par amorçage à l'oligodT. Ceci a permis dtiso- ler un clone de 1608 bp qui présente toutes les séquences caractéristiques d'un P450 et la séquence complète est montré en figure 1. Cet ADNc peut être identifié comme étant celui de la CA4H de topinambour pour des raisons suivantes : a) les pH isoélectriques de la protéine purifiée et celui calculé du polypeptide issu de l'ADNcr sont tous deux voisins de pH 9,0 b) l'anticorps anti
CA4H reconnalt dans la banque d'expression un polypeptide de fusion présentant des séquences caractéristiques de
P450 c) la partie 5' terminale du polypeptide déduit de l'ADNc isolé par criblage immunologique avec un anticorps spécifique anti-CA4H est totalement identique à la séquence N-terminale de la CA4H purifiée.
Nous disposons donc de la première séquence nucléotidique codant pour un cytochrome P450 d'origine végétale de fonction connue, déterminée à ce jour.
2)'clonage de la région codante de la CA4H de Topinambour dans le vecteur d'expression de levure pYEDP 60
La méthode de clonage schématisée en figure 2 fait appel à une étape d'amplification par PCR, qui par un choix judicieux des oligonucléotides servant d'amorces pour la PCR, résulte en l'amplification sélective de la région codante de la CA4H, débarrasse l'ADNc amplifié des bordures 5' et 3' non-codantes et introduit également des sites de restriction convenables pour la suite du sousclonage. Après un passage du fragment d'ADNc amplifié possédant des bouts francs dans pUC 19 digéré par SmaI, le plasmide pCA4H ainsi obtenu est ensuite digéré par des enzymes de restriction adéquats flanquant le fragment d'ADNc, qui ont été préalablement introduits par PCR.Le vecteur de levure pYEDPGO est ensuite digéré au niveau du site de multiclonage situé entre le promoteur GAL10/ CYCi et le terminateur PGK de façon à générer un vecteur linéaire comprenant des bouts compatibles avec le fragment d'ADNc contenant la région codante de la CA4H. Puis on procède à la recircularisation dans un milieu réaction nel comprenant le vecteur linéarisé, le fragment d'ADNc contenant la CA4H et de la ligase.Le vecteur recircularisé ainsi obtenu contient les séquences nécessaires à la propagation chez E. coli (origine de replication et Le gène bla conférant la résistance à l'ampicilline chez
E. coli), à la propagation chez S. cer (origine de replication chez S. cer et les gènes URA3 et ADE2 permettant de complémenter les auxotrophies de la souche hôte), ainsi que les signaux de régulation permettant l'induction de l'expression de I'ADNc codant pour la CA4H en milieu galactosé (figure 2). Toutes les méthodes utilisées afin de réaliser c clonage sont des méthodes standard et bien décrites dans des livres de référence (Sambrook, Fritsch and Maniais, 1989, Molecular Cloning, 2 éd., CSH Laboratory Press).La construction du vecteur de levure pYEDP 60 a été décrit dans la littérature (Urban, Cullin et Pompon, 1990, Biochimie, 72, pp 463-472).
La méthode de clonage schématisée en figure 2 fait appel à une étape d'amplification par PCR, qui par un choix judicieux des oligonucléotides servant d'amorces pour la PCR, résulte en l'amplification sélective de la région codante de la CA4H, débarrasse l'ADNc amplifié des bordures 5' et 3' non-codantes et introduit également des sites de restriction convenables pour la suite du sousclonage. Après un passage du fragment d'ADNc amplifié possédant des bouts francs dans pUC 19 digéré par SmaI, le plasmide pCA4H ainsi obtenu est ensuite digéré par des enzymes de restriction adéquats flanquant le fragment d'ADNc, qui ont été préalablement introduits par PCR.Le vecteur de levure pYEDPGO est ensuite digéré au niveau du site de multiclonage situé entre le promoteur GAL10/ CYCi et le terminateur PGK de façon à générer un vecteur linéaire comprenant des bouts compatibles avec le fragment d'ADNc contenant la région codante de la CA4H. Puis on procède à la recircularisation dans un milieu réaction nel comprenant le vecteur linéarisé, le fragment d'ADNc contenant la CA4H et de la ligase.Le vecteur recircularisé ainsi obtenu contient les séquences nécessaires à la propagation chez E. coli (origine de replication et Le gène bla conférant la résistance à l'ampicilline chez
E. coli), à la propagation chez S. cer (origine de replication chez S. cer et les gènes URA3 et ADE2 permettant de complémenter les auxotrophies de la souche hôte), ainsi que les signaux de régulation permettant l'induction de l'expression de I'ADNc codant pour la CA4H en milieu galactosé (figure 2). Toutes les méthodes utilisées afin de réaliser c clonage sont des méthodes standard et bien décrites dans des livres de référence (Sambrook, Fritsch and Maniais, 1989, Molecular Cloning, 2 éd., CSH Laboratory Press).La construction du vecteur de levure pYEDP 60 a été décrit dans la littérature (Urban, Cullin et Pompon, 1990, Biochimie, 72, pp 463-472).
3) Caractérisation de l'activité enzymatique de la CA4H chez S. cer.
3.1) Description de l'environnement génétique de la souche
WRCA
En figure 3 est schématisé la souche de levure
WRCA qui a été construite de façon à surexprimer simultanément en milieu galactose la CA4H exogène et la P450
Réductase endogène. La souche WRCA est obtenue par transformation de la souche PES 1-3U par le plasmide pCA4H/ YeDP6O décrit ci-dessus. La souche PES 1-3U, qui porte comme mutations connues Ura31 Ade2, Hisl, et Leu2, a été transformée selon une méthode standard au chlorure de li thium (Pompon, 1988, Eur. J. Biochem., 177, pp 285-293), suivie d'une sélection pour la restauration du phénotype videz qui est apporté en présence du plasmide.La souche
PES 1-3U, dont la description détaillée fait objet d'une demande de brevet en France nO 91 08884, a été déposée auprès de la Collection Nationale des Cultures et de
Microorganismes le 17 mars 1992, sous le numéro de dépit 1-1187. Cette souche haploïde (mating type alpha) est complètement isogénique à la souche de laboratoire
W303.1B, sauf la région promotrice précédant la phase codante de la P450 Réductase endogène, qui est modifiée par recombinaison homologue de façon à remplacer le promoteur naturel de la P450 Réductase par le promoteur inductible GAL10-CYC1.
WRCA
En figure 3 est schématisé la souche de levure
WRCA qui a été construite de façon à surexprimer simultanément en milieu galactose la CA4H exogène et la P450
Réductase endogène. La souche WRCA est obtenue par transformation de la souche PES 1-3U par le plasmide pCA4H/ YeDP6O décrit ci-dessus. La souche PES 1-3U, qui porte comme mutations connues Ura31 Ade2, Hisl, et Leu2, a été transformée selon une méthode standard au chlorure de li thium (Pompon, 1988, Eur. J. Biochem., 177, pp 285-293), suivie d'une sélection pour la restauration du phénotype videz qui est apporté en présence du plasmide.La souche
PES 1-3U, dont la description détaillée fait objet d'une demande de brevet en France nO 91 08884, a été déposée auprès de la Collection Nationale des Cultures et de
Microorganismes le 17 mars 1992, sous le numéro de dépit 1-1187. Cette souche haploïde (mating type alpha) est complètement isogénique à la souche de laboratoire
W303.1B, sauf la région promotrice précédant la phase codante de la P450 Réductase endogène, qui est modifiée par recombinaison homologue de façon à remplacer le promoteur naturel de la P450 Réductase par le promoteur inductible GAL10-CYC1.
3.2 Détermination de la concentration en Cytochrome
P450 dans la fraction microsomale de la souche WRCA
On réalise une préculture (150 ml) de la souche
WRCA en milieu SW5 à 280C sous agitation modérée (100 rpm) jusqu a une densité cellulaire de 3 OD, puis on ajoute 1 vol)vol de milieu YPGAL (induction de la CA4H et de la
P450 Réductase) et on continue la culture jusqu'à une densité cellulaire de 10 OD. On arrete la culture par centrifugation des cellules puis on procède à la préparation des microsomes selon un procédé standard impliquant la casse mécanique des cellules (Cullin et Pompon, 1988,
Gene, 65, pp 203-217).On obtient ainsi une solution homogène de microsomes de 2,8 ml, conservée à -800C sous forme d'aliquots de 100 microlitres, et qui sert de solution stock pour toutes les expériences décrites par la suite. Pour mesurer la concentration totale en protéines dans cette solution stock de microsomes on se sert de la méthode de Pierce avec la serumaîbumine comme standard.
P450 dans la fraction microsomale de la souche WRCA
On réalise une préculture (150 ml) de la souche
WRCA en milieu SW5 à 280C sous agitation modérée (100 rpm) jusqu a une densité cellulaire de 3 OD, puis on ajoute 1 vol)vol de milieu YPGAL (induction de la CA4H et de la
P450 Réductase) et on continue la culture jusqu'à une densité cellulaire de 10 OD. On arrete la culture par centrifugation des cellules puis on procède à la préparation des microsomes selon un procédé standard impliquant la casse mécanique des cellules (Cullin et Pompon, 1988,
Gene, 65, pp 203-217).On obtient ainsi une solution homogène de microsomes de 2,8 ml, conservée à -800C sous forme d'aliquots de 100 microlitres, et qui sert de solution stock pour toutes les expériences décrites par la suite. Pour mesurer la concentration totale en protéines dans cette solution stock de microsomes on se sert de la méthode de Pierce avec la serumaîbumine comme standard.
La concentration globale en Cytochrome P450 contenu dans ces microsomes est mesurée par spectrophotométrie différentielle selon la méthode décrite par Omura et Sato (1964, J. Biol. Chem. 239, pp 2379-2387) qui met en évidence la formation du pic caractéristique d'absorption autour de 450 nm du Cytochrome P450 réduit après fixation d'une molécule de monoxide de carbone sur l'atome fer du chromophore, par rapport à la forme réduite du cytochrome
P450 en absence de monoxide de carbone.Plus précisément, on répartit dans deux cuvettes spectrophotométriques des quantités égales de la solution stock de microsomes (environ 2 mg de protéines toales) diluée 10 fois dans un tampon composé de 50 mM Tris-Hcl pH 7,4 et 1 mM EDTA et à laquelle on a ajouté auparavant quelques graines de dithionite de sodium afin de réduire totalement les cytochromes P450 présents dans les microsomes et de consommer tout oxygène libre dissous dans la solution.Les deux cuvettes contenant des quantités égales de microsomes réduits servent à faire la ligne de base entre 400 et 500 nn. On fait ensuite barboter une dizaine de bulles de monoxide de carbone dans la cuvette d'essai, ce qui mène à la formation du pic d'absorption vers 450 nm dû à la fixation du monoxide de carbone à l'ion fer du groupe hème présent dans le cytochrome P450, par rapport aux microsomes réduits dans la cuve témoin. En se servant du coefficient d'absorption qui est de 91 mM 1.cl 1 pour les cytochromes P450 on peut déduire directement de l'amplitude du pic la concentration totale en cytochromes
P450 contenu dans les microsomes. Dans la figure 4 est montré le spectre de différence en présence de monoxide de carbone obtenu avec une solution de microsomes 10 fois diluée de la solution stock. A partir du spectre qui montre le pic caractéristique à 453,5 nm, nous avons déterminé la concentration globale dans les microsomes après induction est de 1,2 micromolaire. La culture de contrôle (PES 1-3U) ne montrant dans les mêmes conditions expérimentales et les mêmes conditions de sensibilité aucune trace détectable de cytochromes P450 nous pouvons conclure que le pic observé avec les microsomes de la culture induite de la souche WRCA doit provenir de l'expression de 1'ADNc de la CA4H sur le plasmide.
P450 en absence de monoxide de carbone.Plus précisément, on répartit dans deux cuvettes spectrophotométriques des quantités égales de la solution stock de microsomes (environ 2 mg de protéines toales) diluée 10 fois dans un tampon composé de 50 mM Tris-Hcl pH 7,4 et 1 mM EDTA et à laquelle on a ajouté auparavant quelques graines de dithionite de sodium afin de réduire totalement les cytochromes P450 présents dans les microsomes et de consommer tout oxygène libre dissous dans la solution.Les deux cuvettes contenant des quantités égales de microsomes réduits servent à faire la ligne de base entre 400 et 500 nn. On fait ensuite barboter une dizaine de bulles de monoxide de carbone dans la cuvette d'essai, ce qui mène à la formation du pic d'absorption vers 450 nm dû à la fixation du monoxide de carbone à l'ion fer du groupe hème présent dans le cytochrome P450, par rapport aux microsomes réduits dans la cuve témoin. En se servant du coefficient d'absorption qui est de 91 mM 1.cl 1 pour les cytochromes P450 on peut déduire directement de l'amplitude du pic la concentration totale en cytochromes
P450 contenu dans les microsomes. Dans la figure 4 est montré le spectre de différence en présence de monoxide de carbone obtenu avec une solution de microsomes 10 fois diluée de la solution stock. A partir du spectre qui montre le pic caractéristique à 453,5 nm, nous avons déterminé la concentration globale dans les microsomes après induction est de 1,2 micromolaire. La culture de contrôle (PES 1-3U) ne montrant dans les mêmes conditions expérimentales et les mêmes conditions de sensibilité aucune trace détectable de cytochromes P450 nous pouvons conclure que le pic observé avec les microsomes de la culture induite de la souche WRCA doit provenir de l'expression de 1'ADNc de la CA4H sur le plasmide.
3.3 Obtention d'un spectre de perturbation de type I
suite à l'ajout de l'acide tr-cinnamique aux micro
somes obtenues à partir de la culture induite de la
souche WRCA
Une des propriétés les plus intéressantes des cytochromes P450 est la possibilité de pouvoir monitorer l'interaction de différentes molécules avec le site actif.
suite à l'ajout de l'acide tr-cinnamique aux micro
somes obtenues à partir de la culture induite de la
souche WRCA
Une des propriétés les plus intéressantes des cytochromes P450 est la possibilité de pouvoir monitorer l'interaction de différentes molécules avec le site actif.
En effet, la force du champ des ligands détermine des spectres typiques et bien codifiés (type I, II ou I inversé). Les spectres de type I, caractérisant généralement l'interaction d'un P450 avec son substrat spécifique, sont définis par la formation d'un pic négatif vers 420 na et d'un pic positif vers 390 nm suite à la fixation du substrat au cytochrome P450. Afin de fournir une preuve supplémentaire que le pic à 453,5 nm observé en figure 4 est bien dû à la présence de la CA4H de topinambour dans les microsomes de levure et que la protéines y est sous une forme active capable de fixer son substrat propre, il a été tenté d'obtenir un tel spectre par l'adjonction du tr-cinnamate aux microsomes.Plus précisément, on répartit des quantités égales de la solution stock de microsomes (culture induite de la souche WRCA) diluée 10 fois dans un tampon contenant 50 mM Tris-Hcl pH 7,4 et 1 EM EDTA dans deux cuvettes spectrophotométriques. En présence d'oxygène dissous dans le milieu, on peut raisonnablement supposer que les cytochromes P450 dans les microsomes sont sous leur forme oxydée, ayant fixé de -l'oxygène -sur le groupe hème. Une ligne de base est faite entre 370 et 490 nm avec les deux cuvettes identiques.
Puis on ajoute à la cuve d'essai du tr-cinnamate à une concentration de 100 micromolaire, et on réalise un spectre différentiel absorption (cytochrome P450 oxydé versus cytochrome P450 oxydé plus substrat spécifique) entre 370 et 490 nm. Dans la figure 5 est montré l'obtention d'un spectre de perturbation de type I caractéristique d'un P450 après fixation de son substrat, en utilisant la même solution stock de microsomes que sous 3.2 qui montre bien la formation d'un pic négatif impor tant à 418 nm et d'un pic positif à 390 nm après l'ajout du tr-cinnamate. Ce même type de spectre différentiel a été observé après l'ajout du tr-cinnamate à des microsomes de topinambour (Benveniste et Durst, 1974, C.R.
Acad. Sc. Paris 278D, pp 1487-1490). Ainsi le polypeptide issu de 1'ADNC de la CA4H de topinambour possède toutes, les caractéristiques spectrales d'un cytochrome P450 dans
Les microsomes de levure et est capable de fixer spécifiquement le tr-cinnamate comme substrat.
Les microsomes de levure et est capable de fixer spécifiquement le tr-cinnamate comme substrat.
3.4 Démonstration de la conversion du tr-cinnamate en
tr-coumarate par une culture de WRCA en milieu ga lactose
Il est indispensable de prouver que le spectre de perturbation observée suite à l'ajout du tr-cinnamate aux microsomes contenant la CA4H de topinambour est correlé à une activité catalytique de la CA4H qui résulte en la formation de tr-coumarate. Il est également très important de prouver que le tr-cinnamate ne rencontre pas de barrière de diffusion lors d'une culture de cellules en trières et que le coumarate formé sera accumulé dans le milieu de culture, en vue d'une application de bioconversion sur cellules entières à l'échelle industrielle.A cette fin l'expérience suivante a été réalisée : 0,5 ml d'une préculture de WRCA en milieu minimum ont été ajoutés à 2 ml de milieu YPGAL frais contenant 10 microM de tr cirixiamate, puis on incube à 270C sous agitation modérée.
tr-coumarate par une culture de WRCA en milieu ga lactose
Il est indispensable de prouver que le spectre de perturbation observée suite à l'ajout du tr-cinnamate aux microsomes contenant la CA4H de topinambour est correlé à une activité catalytique de la CA4H qui résulte en la formation de tr-coumarate. Il est également très important de prouver que le tr-cinnamate ne rencontre pas de barrière de diffusion lors d'une culture de cellules en trières et que le coumarate formé sera accumulé dans le milieu de culture, en vue d'une application de bioconversion sur cellules entières à l'échelle industrielle.A cette fin l'expérience suivante a été réalisée : 0,5 ml d'une préculture de WRCA en milieu minimum ont été ajoutés à 2 ml de milieu YPGAL frais contenant 10 microM de tr cirixiamate, puis on incube à 270C sous agitation modérée.
après 6 heures les cellules sont centrifugées et on prélève I ml du surnageant auguel on ajoute 1 ml d'une solution saturée en NaCl et 1 ml d'acétate d'éthyle. Après avoir mélangé rigoureusement Les deux phases sur vortex, on sépare les phases organique et aqueuse par centrifugation, et on prélève un aliquot de la phase organique (acétate d'éthyle). On évapore à l'air et on reprend dans une solution 10 % méthanol. 20 microlitres de l'échantillon sont séparés par HPLC sur colonne C18 en se servant d'un gradient linéaire.
COMPOSITION DU GRADIENT HPLC
TABLEAU 1
TEMPS DEBIT COMPOSITION
(min) (ml/min) A(%) B(%)
0.00 1.00 100 0
1.00 1.00 90 10
15.00 1.00 70 30
15.10 1.00 40 60
17.00 1.00 100 0
A = 0.01% TFA
B = Acetonitrile
Un étalonnage préalable avec du tr-cinnamate et du tr-coumarate commercial pur avait démontré que sous les conditions de chromatographie décrites les deux produits sont bien séparés. En effet le coumarate sort après 8 minutes environ, tandis que le tr-cinnamate sort après 11,5 min. En figure 6 est montré le chromatogramme de l'échantillon issu de l'expérience décrite ci-dessus. La longueur d'onde de détection choisie de 292 nm est un compromis où les deux substances absorbent bien. Il est clairement visible qu'il ne reste plus que des quantités négligeables et à peine détectables, alors qu'il apparat un seuL pic majeur à la position du tr-coumarate.Ainsi il est démontré que le polypeptide issu de I'ADNc végétal cloné est bien une enzyme à cytochrome P450 sur la base de ses propriétés spectrales et que son activité catalytique est l'hydroxylation du tr-cinnamate en position quatre pour former le tr-coumarate, sans apparition de produits secondaires. Le tr-cinnamate est apparemment accessible aux cytochromes P450 intracellulaires, tandis que le produit de transformation est retrouvé dans le surnageant, Ni substrat, ni le produit de la conversion sont apparemment toxique pour la levure.
TABLEAU 1
TEMPS DEBIT COMPOSITION
(min) (ml/min) A(%) B(%)
0.00 1.00 100 0
1.00 1.00 90 10
15.00 1.00 70 30
15.10 1.00 40 60
17.00 1.00 100 0
A = 0.01% TFA
B = Acetonitrile
Un étalonnage préalable avec du tr-cinnamate et du tr-coumarate commercial pur avait démontré que sous les conditions de chromatographie décrites les deux produits sont bien séparés. En effet le coumarate sort après 8 minutes environ, tandis que le tr-cinnamate sort après 11,5 min. En figure 6 est montré le chromatogramme de l'échantillon issu de l'expérience décrite ci-dessus. La longueur d'onde de détection choisie de 292 nm est un compromis où les deux substances absorbent bien. Il est clairement visible qu'il ne reste plus que des quantités négligeables et à peine détectables, alors qu'il apparat un seuL pic majeur à la position du tr-coumarate.Ainsi il est démontré que le polypeptide issu de I'ADNc végétal cloné est bien une enzyme à cytochrome P450 sur la base de ses propriétés spectrales et que son activité catalytique est l'hydroxylation du tr-cinnamate en position quatre pour former le tr-coumarate, sans apparition de produits secondaires. Le tr-cinnamate est apparemment accessible aux cytochromes P450 intracellulaires, tandis que le produit de transformation est retrouvé dans le surnageant, Ni substrat, ni le produit de la conversion sont apparemment toxique pour la levure.
3.5 Détermination de la constante d'affinité de la CA4H
pour le tr-cinnamate dans les microsomes de levure
L'amplitude totale observée entre le maximum positif à 370 nm et le pic négatif à 418 nm dans un spectre de perturbation de type I, varie en fonction du substrat spécifique ajouté lorsque le substrat est en concentration limitant par rapport aux cytochromes P450 capables de fixer ce substrat présents dans les microsomes.Si l'on reporte les valeurs inverses des amplitudes d'absorption mesurées dans un spectre de perturbation de type I en fonction de la valeur inverse des concentrations croissantes de substrat ajouté (représentation de Lineweaver
Burk), on obtient une droite et la constante d'affinité du cytochrome P450 considéré pour son substrat spécifique peut être calcule directement à partir du point d'intersection de la droite avec l'axe X. En figure 7 est montrée une représentation de Lineweaver-Burk en reportant la variation de l'amplitude d'absorption dans un spectre de type I en fonction du tr-cinnamate ajouté en quantités croissantes à des microsomes oxydés issus d'une culture induite de la souche WRCA.Les conditions expérimentales étant identiques à celles décrites sous 3.3 à l'exception des concentrations en tr-cinnamate utilisées allant de 0,2, 1,0, 3,0, 10,0 à 30,0 microM, elles ne seront pas reprises ici. La constante d'affinité de la CA4H de topinambour dans les microsomes de levure en présence de la
P450 Réductase endogène de Levure ainsi mesurée est de 2,2 microM, ce qui est en excellente concordance avec les valeurs obtenues avec des microsomes de topinambour qui varient entre 1 et 10 microM selon les préparations (F.
pour le tr-cinnamate dans les microsomes de levure
L'amplitude totale observée entre le maximum positif à 370 nm et le pic négatif à 418 nm dans un spectre de perturbation de type I, varie en fonction du substrat spécifique ajouté lorsque le substrat est en concentration limitant par rapport aux cytochromes P450 capables de fixer ce substrat présents dans les microsomes.Si l'on reporte les valeurs inverses des amplitudes d'absorption mesurées dans un spectre de perturbation de type I en fonction de la valeur inverse des concentrations croissantes de substrat ajouté (représentation de Lineweaver
Burk), on obtient une droite et la constante d'affinité du cytochrome P450 considéré pour son substrat spécifique peut être calcule directement à partir du point d'intersection de la droite avec l'axe X. En figure 7 est montrée une représentation de Lineweaver-Burk en reportant la variation de l'amplitude d'absorption dans un spectre de type I en fonction du tr-cinnamate ajouté en quantités croissantes à des microsomes oxydés issus d'une culture induite de la souche WRCA.Les conditions expérimentales étant identiques à celles décrites sous 3.3 à l'exception des concentrations en tr-cinnamate utilisées allant de 0,2, 1,0, 3,0, 10,0 à 30,0 microM, elles ne seront pas reprises ici. La constante d'affinité de la CA4H de topinambour dans les microsomes de levure en présence de la
P450 Réductase endogène de Levure ainsi mesurée est de 2,2 microM, ce qui est en excellente concordance avec les valeurs obtenues avec des microsomes de topinambour qui varient entre 1 et 10 microM selon les préparations (F.
Durst, communication personnelle). Il est donc évident que la levure S. cer. fournit l'environnement similaire à celui de la plante pour l'expression efficace de la CA4H.
'3.'6 Détermination de l'efficacité de couplage entre la
P450 Réductase de levure et la CA4H de topinambour
dans les microsomes de la souche WRCA
Les cytochromes P450 ne sont pas autosuffisants pour effectuer l'hydroxylation de leurs substrats. Le complexe enzymatique actif est constitué de deux composants, le cytochrome P450 et la P450 Réductase, qui assure la channe de transport des électrons nécessaires à l'hydroxylation du NADPH vers le Cytochrome P450. En cas de couplage parfait (illustré en figure 8) on observera donc la consommation d'une molécule de NADPH par molécule de produit formé. Aucun cytochrome P450 végétal n'ayant jamais été exprimé chez la levure, il est primordial de s'assurer que la levure fournit l'environnement réducteur adéquat à l'activité enzymatique de la CA4H de topinambour.
P450 Réductase de levure et la CA4H de topinambour
dans les microsomes de la souche WRCA
Les cytochromes P450 ne sont pas autosuffisants pour effectuer l'hydroxylation de leurs substrats. Le complexe enzymatique actif est constitué de deux composants, le cytochrome P450 et la P450 Réductase, qui assure la channe de transport des électrons nécessaires à l'hydroxylation du NADPH vers le Cytochrome P450. En cas de couplage parfait (illustré en figure 8) on observera donc la consommation d'une molécule de NADPH par molécule de produit formé. Aucun cytochrome P450 végétal n'ayant jamais été exprimé chez la levure, il est primordial de s'assurer que la levure fournit l'environnement réducteur adéquat à l'activité enzymatique de la CA4H de topinambour.
Dans ce but l'expérience suivante a été réalisée : un mélange réactionnel constitué de 6 nM de CA4H (dilution 1 pour 200 de la solution stock de microsomes) dans un tampon phosphate 50 mM pH 7,4 et de NADPH réduit 0,1 mglml est réparti à parts égales dans deux cuvettes spectrophotométriques. La quantité de NADPH réduit dans les deux cuves étant identique, l'absorption différentielle initiale mesurée à 350 nm est zéro. Puis on ajoute à la cuvette d'essai du tr-cinnamate à la concentration finale de 10 microM. En cas de couplage parfait on doit enregistrer à 350 nm une diminution d'absorption correspondant à la consommation dlune quantité équivalente de NADPH.
En figure 8 est montré l'enregistrement de cette expérience. L'ajout de 10 moles de tr-cinnamate résulte en une diminution de l'absorption initiale dans la cuve d'essai de 0,06 OD.
En se servant du coefficient molaire du NADPH réduit (6200 M 1 cm 1) il est facile de convertir la variation d'absorption en moles NADPH oxydés. En effet, après l'ajout de 10 nmoles de tr-cinnamate 9,7 nmoles de NADPH ont été oxydés, ce qui résulte en un facteur de couplage de 1,03. il est donc évident que la P450 Réductase de la levure est capable de parfaitement assurer la chaîne de transport des électrons vers la CA4H de topinambour afin de le faire fonctionner.
3.7 Détermination de la vitesse maximale de conversion
de la CA4H dans les microsomes de levure ainsi que
le Rm
La vitesse maximale de conversion du cytochrome
P450 végétal mesurée dans les microsomes de levure est une valeur très importante pour apprécier si S. Cer est un outil industriel intéressant pour y réaliser des bioconversions à l'aide de cytochromes P450, la vitesse de la réaction enzymatique étant un des critères principaux.
de la CA4H dans les microsomes de levure ainsi que
le Rm
La vitesse maximale de conversion du cytochrome
P450 végétal mesurée dans les microsomes de levure est une valeur très importante pour apprécier si S. Cer est un outil industriel intéressant pour y réaliser des bioconversions à l'aide de cytochromes P450, la vitesse de la réaction enzymatique étant un des critères principaux.
Ceci d'autant plus que les cytochromes P450 de mammifères sont connus pour être des enzymes dites"lentes". Dans la même expérience on déterminera également la constante de Michaelis, qui donne la concentration en substrat nécessaire pour que la CA4H fonctionne à 50 % de sa vitesse maximale. Sous 3.6 il a été démontré que l'efficacité de couplage entre la P450 Réductase de levure et la CA4H exprimé par la relation de NADPH consommé pour substrat converti est très voisin de 1. De ce fait il est possible de suivre l'activité de la CA4H en fonction de la concentration du tr-cinnamate ajouté par la vitesse de consommation du NADPH.En effet, le NADPH réduit absorbe fortement à une longueur d'onde de 340 nm (coefficient d'absorption molaire = 6200) et la pente de la variation de l'absorption dans le temps est directement proportionnelle à la vitesse de la transformation du tr-cinnamate en coumarate par la CA4H. Néanmoins afin d'éviter des interférences avec le coumarate formé qui absorbe faiblement à 340 nm, les mesures seront effectuées à 350 nm, une longueur d'onde ou seul le NADPH réduit montre une forte absorption.
Plus précisément, on réalise un mélange réactionnel, constitué d'une dilution 200 fois (concentration finale ea CA4H est de 6 nM) de la solution stock de microsomes dans un tampon phosphate 50 mM à pH 7,4 et du NADPH réduit en excès à 0,1 mg/ml. Ce mélange est réparti à parties égales dans deux cuvettes spectrophotométriques, on ajoute des concentrations croissantes de tr-cinnamate au temps zéro, puis on suit par spectrophotométrie différentielle la diminution de l'absorption initiale à 350 nm dans le temps dans la cuve d'essai par rapport à la cuve témoin. On a effectué les enregistrements de cette expérieace pour des concentrations en tr-cinnamate de 0, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4, 12,6 et 25 microM.A partir des pentes obtenues, il est donc possible de les convertir directement en activité CA4H et de réaliser une représentation selon Lineweaver-Burk en reportant l'inverse des activités CA4H mesurées en fonction de l'interne de la concentration de tr-cinnamate ajoutée au milieu réactionnel. Le point d'intersection de la droite ainsi obtenue (figure 9 avec l'axe Y donnent la valeur de la vitesse maximum de conversion de la CA4H, tandis que le point d'intersection avec l'axe X donne la valeur du Km.La vitesse maximale in vitro de 400 +/- 50 min 1 est la plus grande obtenue à ce jour pour un P450 eucaryotique ce qui montre bien que dans un contexte génétique où il est possible de surexprimer simultanément la P450 Réductase de levure et la CA4K,
S. cer. fournit le meilleur environnement connu actuellement afin de faire fonctionner de façon très efficace un cytochrome P450 végétal. Sur la base des activités mesurées in vitro, la souche WRCA est un excellent candidat pour réaliser la bioconversion du tr-cinnamate en coumarate par la CA4H à l'échelle industrielle.Dans ce sens la valeur très basse du Km de 1,2 microM acquiert toute son importance, puisque de faibles concentrations intra ceLLulaires en tr-cinnamate de l'ordre micromolaire suffisent pour faire tourner la CA4H à plein régime.
S. cer. fournit le meilleur environnement connu actuellement afin de faire fonctionner de façon très efficace un cytochrome P450 végétal. Sur la base des activités mesurées in vitro, la souche WRCA est un excellent candidat pour réaliser la bioconversion du tr-cinnamate en coumarate par la CA4H à l'échelle industrielle.Dans ce sens la valeur très basse du Km de 1,2 microM acquiert toute son importance, puisque de faibles concentrations intra ceLLulaires en tr-cinnamate de l'ordre micromolaire suffisent pour faire tourner la CA4H à plein régime.
3.'8 Mesure directe de la vitesse maximale de conversion
de la CA4H sur des microsomes de WRCA
La mesure de la consommation de NADPH est certainement très appropriée au niveau expérimental, mais ne constitue qu'une preuve indirecte de l'activité enzymatique de la CA4H. Il reste donc très important de valider les résultats ainsi obtenus sous 3.7 par des mesures d'activité réelle, c'est-à-dire les valeurs comparables pour la vitesse maximale de conversion de la CA4H doivent être retrouvées lorsqu'on suit l'activité enzymatique par la mesure de la quantité de tr-coumarate formé.A cette fin l'expérience suivante a été réalisée : un mélange réactionnel de 1 ml contenant 50 mM tampon phosphate pE 7,4, 50 microM tr-cinnamate, 0,1 mg/ml NADPH et 12 pmoles de CA4H (dilution 1 pour 1000 de la solution stock de microsomes) est préparé sur la glace. Les microsomes sont ajoutés en dernier lieu, puis la réaction est démarré en plaçant le milieu réactionnel complet à 370C.
de la CA4H sur des microsomes de WRCA
La mesure de la consommation de NADPH est certainement très appropriée au niveau expérimental, mais ne constitue qu'une preuve indirecte de l'activité enzymatique de la CA4H. Il reste donc très important de valider les résultats ainsi obtenus sous 3.7 par des mesures d'activité réelle, c'est-à-dire les valeurs comparables pour la vitesse maximale de conversion de la CA4H doivent être retrouvées lorsqu'on suit l'activité enzymatique par la mesure de la quantité de tr-coumarate formé.A cette fin l'expérience suivante a été réalisée : un mélange réactionnel de 1 ml contenant 50 mM tampon phosphate pE 7,4, 50 microM tr-cinnamate, 0,1 mg/ml NADPH et 12 pmoles de CA4H (dilution 1 pour 1000 de la solution stock de microsomes) est préparé sur la glace. Les microsomes sont ajoutés en dernier lieu, puis la réaction est démarré en plaçant le milieu réactionnel complet à 370C.
La réaction est arrêtée aux temps indiqués au tableau 2, par prélèvement d'un échantillon de 50 microlitres auquel on ajoute 2,5 microlitres de l'acide trifluoroacétique, puis on sépare par HPLC dans les conditions décrites cidessus. La figure 10 montre la cinétique de la formation du coumarate en se servant des valeurs du tableau i. En effet dans une initiale de 6 minutes où le substrat est en excès, la formation de tr-coumarate est linéaire dans le temps et décline rapidement ensuite pour atteindre le plateau après 15 minutes seulement. Ceci se traduit par un rapide déclin de la vitesse maximale quand le substrat commence à devenir limitant.Il est très important à noter que la valeur de la vitesse maximale de conversion de la
CA4H est de 350 min-l lorsque le substrat est en excès, une valeur qui est en parfaite concordance avec les valeurs trouvées par test indirect, ce qui renforce les commentaires faits sous 3.7.
CA4H est de 350 min-l lorsque le substrat est en excès, une valeur qui est en parfaite concordance avec les valeurs trouvées par test indirect, ce qui renforce les commentaires faits sous 3.7.
TABLEAU 2
<tb> incubation <SEP> (min.) <SEP> tr-coumarate <SEP> Activité <SEP> spécifique
<tb> <SEP> (n <SEP> moles) <SEP> <SEP> (min~1) <SEP>
<tb> ;
<tb> <SEP> 3 <SEP> 0
<tb> <SEP> 3 <SEP> 13 <SEP> 350
<tb> <SEP> 6 <SEP> 25 <SEP> 350
<tb> <SEP> 10 <SEP> 32 <SEP> 265
<tb> <SEP> 15 <SEP> 41 <SEP> 221
<tb> <SEP> 15'50 <SEP> 46 <SEP> n.d
<tb> <SEP> 25 <SEP> 44 <SEP> n.d
<tb> '4. -Procédé'de bioconversion mettant en oeuvre une souche
de'levure surexprimant la P450 Réductase endogène
ainsi qu'un cytochrome P450 végétal. Exemplification
par la production de tr-coumarate à partir du tr
'cinnamate sur cellules entières contenant la CA4H
de topinambour.
<tb> <SEP> (n <SEP> moles) <SEP> <SEP> (min~1) <SEP>
<tb> ;
<tb> <SEP> 3 <SEP> 0
<tb> <SEP> 3 <SEP> 13 <SEP> 350
<tb> <SEP> 6 <SEP> 25 <SEP> 350
<tb> <SEP> 10 <SEP> 32 <SEP> 265
<tb> <SEP> 15 <SEP> 41 <SEP> 221
<tb> <SEP> 15'50 <SEP> 46 <SEP> n.d
<tb> <SEP> 25 <SEP> 44 <SEP> n.d
<tb> '4. -Procédé'de bioconversion mettant en oeuvre une souche
de'levure surexprimant la P450 Réductase endogène
ainsi qu'un cytochrome P450 végétal. Exemplification
par la production de tr-coumarate à partir du tr
'cinnamate sur cellules entières contenant la CA4H
de topinambour.
Une culture de 200 ml dans un erlenmeyer de 1 L de la souche WRCA est incubée à 270C sous agitation vigoureuse (200 rpm) dans un milieu YPGAL jusqu'à 5 DO (phase stationnaire de saturation). A ce moment on ajoute du cinnamate à une concentration finale de 100 microM, puis on continue l'incubation. On prélève des échantillons de 100 microlitres au moment de l'ajout du tr-cinnamate et puis 1, 10, 30, et 100 minutes après l'ajout. Puis on procède à 11 extraction selon les méthodes décrites sous 3.3, et on analyse les échantillons par chromatographie
HPLC (voir 3.3). La longueur d'onde d'analyse est volontairement choisie à 314 nm, une longueur d'onde où l'absorption du tr-coumarate est presque maximale tandis que
Le tr-cinnamate n'absorbe que très peu.L'amplitude des pics d'absorption n'est par conséquence pas identique pour une même concentration de tr-cinnamate et du tr-coumarate. Le but de cette expérience étant de quantifier l'évolution de la quantité de tr-coumarate trouvée dans le milieu de culture en fonction du temps, une échelle de concentrations connues de tr-coumarate a été utilisée pour la calibration, permettant de traduire l'amplitude du pic de coumarate en concentration ou en nombre de molécules de tr-coumarate formé. La superposition de 4 chromatogrammes a été réalisée sur les 4 échantillons préle ves aux temps indiqués ci-dessus. il est évident que très vite après l'ajout du tr-cinnamate, on peut déceler des quantités importantes dans le milieu de culture sans apparition de produits secondaires.Vu la valeur de la constante d'affinité de la CA4H pour le tr-cinnamate qui est de l'ordre micromolaire, il est clair que au moins 95 % du substrat initialement présent dans la culture seront transformés en tr-coumarate avant que la concentration devienne limitante. lie fait de retrouver des quantités importantes de tr-coumarate rapidement dans le milieu de culture laisse supposer que le tr-cinnamate diffuse suffisamment vite dans la cellule pour que la CA4H puisse fonctionner à plein régime, et aussi que le produit formé n'est pas retenu ou métabolisé dans la levure mais excrété dans le milieu.Ceci rend faisable la récupération puis la purification du produit lors d'une bioconversion à l'échelle industrielle, mais explique aussi l'apparente inocuité du coumarate pour la cellule. il est en effet peu probable d'obtenir en grande quantité un produit par bioconversion s'il est accumulé à l'intérieur de la cellule.
HPLC (voir 3.3). La longueur d'onde d'analyse est volontairement choisie à 314 nm, une longueur d'onde où l'absorption du tr-coumarate est presque maximale tandis que
Le tr-cinnamate n'absorbe que très peu.L'amplitude des pics d'absorption n'est par conséquence pas identique pour une même concentration de tr-cinnamate et du tr-coumarate. Le but de cette expérience étant de quantifier l'évolution de la quantité de tr-coumarate trouvée dans le milieu de culture en fonction du temps, une échelle de concentrations connues de tr-coumarate a été utilisée pour la calibration, permettant de traduire l'amplitude du pic de coumarate en concentration ou en nombre de molécules de tr-coumarate formé. La superposition de 4 chromatogrammes a été réalisée sur les 4 échantillons préle ves aux temps indiqués ci-dessus. il est évident que très vite après l'ajout du tr-cinnamate, on peut déceler des quantités importantes dans le milieu de culture sans apparition de produits secondaires.Vu la valeur de la constante d'affinité de la CA4H pour le tr-cinnamate qui est de l'ordre micromolaire, il est clair que au moins 95 % du substrat initialement présent dans la culture seront transformés en tr-coumarate avant que la concentration devienne limitante. lie fait de retrouver des quantités importantes de tr-coumarate rapidement dans le milieu de culture laisse supposer que le tr-cinnamate diffuse suffisamment vite dans la cellule pour que la CA4H puisse fonctionner à plein régime, et aussi que le produit formé n'est pas retenu ou métabolisé dans la levure mais excrété dans le milieu.Ceci rend faisable la récupération puis la purification du produit lors d'une bioconversion à l'échelle industrielle, mais explique aussi l'apparente inocuité du coumarate pour la cellule. il est en effet peu probable d'obtenir en grande quantité un produit par bioconversion s'il est accumulé à l'intérieur de la cellule.
Sur Labase des pics observés en figure il la productivité calculée est de 10 micromoles de coumarate formés/minute.
litre de culture. En figure 11 est montrée une cinétique qui reporte le nombre de tr-coumarate formée par cellule de levures (calculé à partir des chromatogrammes) en fonction du temps. il est clair que ce processus de bioconversion est tout-à-fait stable dans le temps. Ceci est un critère essentiel pour l'application de la souche WRCA pour un procédé industriel d'obtention de tr-coumarate par bioconversion. En extrapolant cette frappante stabilité de la CA4H de topinambour dans la levure par rapport à d'autres cytochromes P450 de mammifères la productivité citée ci-dessus sera d'environ 10 grammes de coumarate formé par jour et par litre de culture dans des conditions de laboratoire. Ces valeurs peuvent raisonnablement être améliorées d'un facteur 5 lors d'un procédé de fermentation industriel.
Claims (33)
1) Souche de levure permettant la co-expression d'une activité mono-oxygénase de cytochrome P450 hétérologue et d'une NADPHcytochrome P450-réductase endogène ou hétérologue, caractérisée en ce que l'un des gènes de la NADPH-cytochrome P450-réductase ou du cytochrome P450 est intégré dans le chromosome de ladite souche, et, la souche est transformée par un vecteur portant une cassette d'expression de l'autre gène.
2) Souche de levure selon la revendication 1 permettant la coexpression d'une activité mono-oxygénase de cytochrome P450 hétérologue et d'une NADPH-cytochrome P450-réductase endogène ou hétérologue, caractérisée en ce que le gène de la NADPH-cytochrome P450réductase est intégré dans le génome chromosomique de ladite souche et la souche est transformée par un vecteur portant une cassette d'expression du gène de cytochrome P450 microsomal hétérologue.
3) Souche selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit vecteur est un vecteur d'intégration ou un vecteur réplicatif.
4) Souche selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit vecteur est un vecteur réplicatif.
5) Souche selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le cytochrome P450 microsomal hétérologue est d'origine végétale.
6) Souche selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le cytochrome P450 microsomal hétérologue est la protéine CA4H de topinambour Heliantus tuberosus.
7) Souche selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit cytochrome P450 est la protéine CA4H de topinambour Heliantus tuberosus.
8) Souche selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit gène dudit cytochrome P450 est un gène hybride.
9) Souche selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la NADPH-cytochrome P450-réductase est la NADPH-cytochrome P450réductase endogène de levure.
10) Souche selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que ledit gène de la NADPH-cytochrome P450-réductase consiste dans la séquence d'ADNc codant pour la NADPH-cytochrome P450-réductase hétérologue.
11) Souche selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ledit gène de la NADPH-cytochrome P450-réductase est celui d'une
NADPH-cytochrome P450-réductase d'origine végétale.
12) Souche selon la revendication 11, caractérisée en ce que la
NADPH-cytochrome P450-réductase est une NADPH-cytochrome P450réductase d'Arabidopsis thaliana..
13) Souche selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que la NADPH-cytochrome P450-réductase est une NADPH-cytochrome
P450-réductase de topinambour Heliantus tuberosus.
14) Souche selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que le gène de la NADPH-cytochrome P450-réductase est intégré dans le locus de la NADPH-cytochrome P450-réductase endogène.
15) Souche de levure selon l'une des revendications 1 à 14, caracérisée en ce que la levure est choisie parmi les genres
Saccharomyces Hansenula, Kluvveromvces. Pichia, et Yarrowia.
16) Souche selon la revendication 15, caractérisée en ce que la levure est du genre Saccharomvces cerevisiae.
17) Souche l'une des revendications 1 à 16, caractérisée en ce que dans ledit vecteur d'expression le gène de cytochrome P450 est mis sous le contrôle d'un promoteur inductible.
18) Souche selon la revendication 17, caractérisée en ce que ledit vecteur est le vecteur pYEDP60.
19) Souche selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisée en ce que le gène de NADPH-cytochrome P450-réductase est placé sous le contrôle d'un promoteur hétérologue inductible.
20) Souche selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisée en ce que le gène de NADPH-cytochrome P450-réductase et le gène de cytochrome P450 sont placés sous le contrôle d'un même promoteur inductible.
21) Souche selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisée en ce que ledit promoteur inductible est le promoteur GAL10/CYC1.
22) Souche selon l'une des revendications 1 à 21, caractérisée en ce que ladite souche est obtenue à partir de la souche PES 1-3-U déposée à la
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le n" I1187.
23) Souche selon l'une des revendications 1 à 22, caractérisée en ce que ladite souche est la souche WRCA obtenue par transformation de la souche PES 1-3-U par le vecteur pCA4H/YeDP60.
24) Souche de levure selon l'une des revendications 1 à 23, caractérisée en ce qu'elle permet la co-expression de la NADPHcytochrome P450-réductase et du cytochrome P450 dans un rapport molaire NADPH-cytochrome P450-réductase/cytochrome P450 optimum qui est entre 1/3 et 1/10.
25) Procédé de co-expression chez une levure de l'activité monooxygénase de cytochrome P450 microsomal hétérologue et de NADPHcytochrome P450 endogène ou hétérologue, caractérisé en ce qu'on cultive dans un milieu de culture approprié une souche selon l'une des revendications 1 à 24.
26) Utilisation à des fins de bioconversion d'une souche de levure selon l'une des revendications 1 à 24.
27) Procédé de bioconversion destiné à la monoxydation spécifique d'un composé substrat d'un cytochrome P450, caractérisé en ce qu'on convertit un milieu contenant ledit composé ou un précurseur avec l'une des souches selon l"une des revendications 1 à 24, exprimant l'activité monoxygénase dudit cytochrome P450 et en ce qu'on récupère ledit composé substrat monoxygéné.
28) Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que ledit milieu est un milieu de culture.
29) Procédé de bioconversion selon l'une des revendications 27 ou 28, caractérisé en ce que la monoxygénation est une hydroxylation stéréospécifique.
30) Procédé selon la revendication 29, caractérisé en ce que le cytochrome P450 est la CA4H, le composé substrat est le trans-cinnamate, et on récupère le trans-coumarate.
31) Séquence d'ADNc codant pour le cytochrome P450 CA4H de topinambour Heliantus tuberosus.
32) Séquence d'ADNc selon la revendication 30 telle que représentée à la figure 1.
33) Séquence d'ADNc s'hybridant dans des conditions faiblement stringentes à 50"C et/ou présentant au moins 60 % d'homologie avec l'une des séquences selon la revendication 31 ou 32.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR929208254A FR2693207B1 (fr) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | Souche de levure permettant la co-expression d'une activité mono-oxygénase de cytochrome P450 hétérologue et d'une NADPH-cytochrome P450-réductase endogène ou hétérologue et son utilisation à des fins de bioconversion. |
| PCT/FR1993/000676 WO1994001564A1 (fr) | 1992-07-03 | 1993-07-02 | Souche de levure permettant la co-expression d'une activite mono-oxygenase de cytochrome p450 de plante et d'une nadph-cytochrome p450-reductase endogene ou heterologue et son utilisation a des fins de bioconversion |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| FR929208254A FR2693207B1 (fr) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | Souche de levure permettant la co-expression d'une activité mono-oxygénase de cytochrome P450 hétérologue et d'une NADPH-cytochrome P450-réductase endogène ou hétérologue et son utilisation à des fins de bioconversion. |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2693207A1 true FR2693207A1 (fr) | 1994-01-07 |
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| FR929208254A Expired - Lifetime FR2693207B1 (fr) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | Souche de levure permettant la co-expression d'une activité mono-oxygénase de cytochrome P450 hétérologue et d'une NADPH-cytochrome P450-réductase endogène ou hétérologue et son utilisation à des fins de bioconversion. |
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| WO (1) | WO1994001564A1 (fr) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2768748A1 (fr) * | 1997-09-24 | 1999-03-26 | Rhone Poulenc Agrochimie | Recodage de sequences d'adn permettant leur expression dans les levures et levures transformees obtenues |
| EP0911404A3 (fr) * | 1997-09-24 | 2000-08-30 | Aventis Cropscience S.A. | Recodage de sequences d ADN permettant leur expression dans les levures et levures transformees obtenues |
| US6787337B1 (en) | 1997-09-24 | 2004-09-07 | Aventis Cropscience S.A. | Recording of DNA sequences to enable them to be expressed in yeasts, and the transformed yeasts obtained |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2693207B1 (fr) | 1994-09-30 |
| WO1994001564A1 (fr) | 1994-01-20 |
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