FR2679034A1 - Determination de la malignite des cellules de tumeurs humaines ou animales, au moyen de lectines endogenes. - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation pour la détermination in vitro de présence de cellules malignes dans un échantillon biologique donné, de lectines endogènes intervenant dans les phénomènes d'adhésion et/ou reconnaissance cellulaire ayant une affinité indépendante du calcium pour un site impliquant des résidus mannose au niveau de ligands glycanniques, et présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL ou avec R1, ou des fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis-à-vis des ligands glycanniques.

Description

Détermination de la malignité des cellules de tumeurs humaines ou animales, au moyen de lectines endogènes
L'invention a pour objet la détermination de la malignité des cellules de tumeurs humaines ou animales, au moyen de lectines endogènes.

L'invention met en oeuvre les propriétés de certaines lectines endogènes, de se fixer à des ligands glycanniques, notamment des ligands riches en mannose présents au niveau des membranes de cellules, pour détecter la présence de cellules malignes dans des échantillons biologiques.

Selon les inventeurs, dans la cadre de la présente demande, la transformation maligne de cellules correspond de façon générale à une perte de l'inhibition de contact entre des cellules, résultant d'un trop grand nombre de signaux cellulaires générés par les contacts intercellulaires. Les cellules confrontées à une "surexpression" de signaux équivalents à un signal polysémique peuvent ne plus être en mesure d'interpréter ces signaux et se transformer en cellules malignes.

On connaissait la propriété des glycoconjugués de surface des cellules transformées (cellules tumorales), d'être modifiés par rapport à ceux des cellules normales, qu'il s'agisse des glycoprotéines, des glycolipides ou même des protéoglycannes.

De plus certains auteurs avaient envisagé que la présence de cellules tumorales pouvait être accompagnée de modifications de certaines lectines endogènes.

La nature des lectines en cause n'avait pas cependant été identifiée. En outre aucune relation n'avait été établie entre les modifications de lectines lors de la transformation maligne de cellules et les modifications des glycannes de surface observées dans des conditions comparables.

Les inventeurs ont défini un groupe de lectines spécifiques, capables d'interagir avec des groupements glycanniques modifiés lors de la transformation maligne des cellules et, ont été en mesure de formuler une hypothèse sur le processus de cette transformation. Les lectines qui ont fait l'objet des études ayant conduit à cette hypothèse, sont des lectines endogènes susceptibles d'avoir un rôle dans les phénomènes d'adhésion et/ou de reconnaissance intercellulaires et donc d'intervenir dans la génération de signaux au niveau de ces cellules. Elles appartiennent principalement à deux familles.

Les lectines endogènes intérressantes dans le cadre de l'invention sont capables de se lier avec une affinité spécifique et forte avec la partie glycannique de ligands glycoprotéiques riches en mannose, cette liaison générant des contacts intercellulaires, par l'intermédiaire des pontages réalisés entre les glycannes portés par des glycoprotéines membranaires et de telles lectines.

Les inventeurs ont remarqué que les modifications de glycoconjugués membranaires, lors de la transformation maligne de cellules, comprennent une augmentation notable du nombre des ligands affines de lectines endogènes définies dans le cadre de l'invention et le cas échéant une diversification (augmentation de la quantité de ligands) de ces ligands. Ils ont émis l'hypothèse selon laquelle cette augmentation du taux de ligands de certaines lectines endogènes favoriserait la multiplication des contacts intercellulaires et par conséquent la génération de signaux en surnombre non traités par la cellule, constatée dans les processus malins.

L'invention met à profit cette hypothèse pour proposer un test permettant la détection in vivo de cellules tumorales, à partir d'échantillons biologiques par exemple constitués par des tissus, des lignées cellulaires, des cellules isolées ou encore des coupes histologiques. Le test défini dans le cadre de l'invention consiste à mettre en évidence l'augmentation du nombre et de la quantité de ligands glycanniques de lectines endogènes affines pour ces ligands et le cas échéant à doser leur taux.

L'augmentation du nombre des ligands est définie par rapport à un ligand donné présent sur des cellules normales mais en nombre inférieur. On peut en outre constater une augmentation de la quantité de ligands au sens d'une plus grande variété de ces ligands en comparaison avec le profil de cellules normales.

Les lectines endogènes utilisées dans le cadre de la réalisation de ce test, sont des lectines particulières capables d'intervenir dans les phénomènes d'adhésion et/ou de reconnaissance intercellulaires, et susceptibles de se lier de façon spécifique et indépendante du calcium avec un site impliquant des résidus mannose, présent au niveau de la partie glycannique de glycoconjugués, en particulier de glycoprotéines membranaires ou solubles, habituellement présents en nombre réduit au niveau de cellules normales.

Ce groupe de lectines comporte principalement des lectines des deux familles suivantes.

La spécificité glycannique de ces deux familles de lectines et leurs différences par rapport à d'autres lectines endogènes décrites dans la littérature ont été cernées dans l'article de Marschall et coll., Biochimie 71 (1989) 645-653. Les résultats décrits dans cet article montrent également que les deux familles de lectines possèdent des spectres de spécificité glycannique partiellement superposables.

Une première famille de lectines propres à la réalisation du test de détection précédemment décrit, est celle qui comprend la lectine endogène à mannose désignée par l'abréviation CSL (Cerebellar Soluble
Lectine). La CSL a été isolée jusqu'à présent à partir de cellules de cervelet de rat et décrite dans l'article de Zanetta et al, 1987, J. Neurochem. 51: 1250-1257). On connaissait cette lectine endogène, pour ses propriétés au niveau de la myélinisation d'une part, et au niveau du guidage de contact de la migration des neurones immatures, d'autre part cette molécule a d'ailleurs été isolée à partir du cervelet de rat. On avait également mis en évidence le rôle de la lectine endogène CSL dans le domaine de la pathologie comme cible immunologique dans la sclérose en plaques.On avait également constaté que la CSL, bien qu'initialement isolée du cervelet, est largement répandue dans les tissus de mammifères. La CSL décrite dans la publication précitée comporte au moins trois formes de sous-unités de masses moléculaires relatives (Mr) voisines de 31 500, 33 000 et 45 000 kd. Cette molécule est soluble et polyvalente, et possède une spécificité glycannique très fine pour des glycannes riches en mannose. Sa constante de dissociation pour certains glycannes endogènes peut être estimée à au moins 10-8 M (Marschall et al, 1989, Biochimie 5: 10-20).

Les inventeurs se sont également intéressés à une autre famille de lectines endogènes comprenant en particulier la lectine désignée par R1 (Receptor 1) cette lectine a été décrite en 1985 (Dontenwill et al
Dave Brain Res. 17: 245-252). Cette lectine R1 avait selon la description donnée, une localisation spécifiquement neuronale dans le cervelet et était exprimée transitoirement à la surface de certaines cellules du système nerveux.Cette lectine était connue en outre pour ses propriétés de reconnaissance intercellulaire par le biais du contact entre R1, externalisé de façon transitoire, et de glycoprotéines présentes à la surface des axones. I1 a été montré que la lectine membranaire R1 n'était pas spécifique des neurones cérébelleux mais pouvait être présente dans d'autres zones du système nerveux central ou périphérique, ou encore dans d'autres cellules et notamment à la surface de cellules endothéliales, les macrophages et les muscles.

Les structures des lectines endogènes CSL et R1 sont donc différentes mais les inventeurs ont constaté qu'elles possèdent en commun leur spécificité vis à vis de groupements glycanniques de glycoconjugués membranaires.

A partir des études menées sur ces deux lectines particulières, les inventeurs ont défini une famille ou groupe de lectines utilisables pour la détection de cellules malignes, caractérisées en ce qu'il s'agit de lectines endogènes intervenant dans les phénomènes d'adhésion et/ou reconnaissance cellulaire ayant une affinité indépendante du calcium pour un site impliquant des résidus mannose et présent au niveau de ligands glycanniques et présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou en ce qu'il s'agit de fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention une parenté immunologique et/ou structurale d'une telle lectine existe également avec la lectine
R1.

La lectine est ainsi utilisée pour détecter voire mesurer l'augmentation du nombre et le cas échéant de la quantité de liaands glycanniques membranaires de ces cellules.

Les inventeurs ont constaté que les ligands glycanniques augmentent à la surface de cellules tumorales dans une proportion de 1 à 100 voire plus, par rapport à la quantité de ces ligands sur des cellules normales. Cette augmentation du taux de ligands glycanniques des lectines endogènes selon l'invention, varie légèrement en fonction des tumeurs mais ne peut pas être reliée au grade du cancer.

Une lectine endogène répondant à cette définition présente une parenté immunologique avec la CSL, et le cas échéant avec R1, dès lors qu'elle est reconnue par des anticorps dirigés contre la CSL ou des anticorps dirigés contre R1. A cet égard des anticorps susceptibles d'être utilisés pour déterminer si une lectine endogène peut être mise en oeuvre dans le cadre de l'invention sont les anticorps suivants
- les anticorps polyclonaux obtenus chez le lapin
contre les diverses sous-unités séparées de la CSL
ou leur ensemble;
- les anticorps contenus dans le liquide céphalo
rachidien ou le sang de patients atteints de
maladie démyélinisante dont la sclérose en plaques
et donnant des résultats positifs par le test
d'immunoréplique mis au point pour le diagnostic
de la sclérose en plaques (Zanetta et coll. Lancet
335 (1990) 1282-1284, Zanetta et coll.C.R. Acad.

Sci Paris, Série III 311 (1990) 327-331);
- les anticorps monoclonaux produits chez la souris
permettant de révéler les sous-unités 31 500 et
33 000 de la CSL ou la sous-unité 45 000;
- un anticorps polyclonal produit chez le lapin
contre la lectine purifiée Rl;
- les anticorps monoclonaux anti-R1 produits chez la
souris.

Ces anticorps sont obtenus selon les techniques classiques de production d'anticorps.

La CSL peut être caractérisée, par les éléments décrits dans la publication de Zanetta et al 1987 cidessus référencée et en particulier par le fait qu'elle est inhibée par le mannose, l'inhibition étant obtenue pour 37,5 mM, les autres monosaccharides n'ayant aucun effet inhibiteur sur cette lectine.

Parmi les ligands glycoprotéiques de la CSL, on citera les molécules suivantes
- la glycoprotéine 31 kDa (Kuchler et coll. Neuro
science 33 (1989) 111-124), la glycoprotéine
formée d'un doublet de Mr 31 et 28 000, exprimé
transitoirement à la surface des neurones;
- la glycoprotéine majeure du système nerveux
périphérique, la glycoprotéine PO (Kuchler et
coll., Cell. Molec. Biol. 35 (1989) 581-596);
- la "myelin-associated glycoprotein", MAG, glyco
protéine majeure de la myéline du système nerveux
(Kuchler et coll., Dev. Neurosci. 10 (1988) 199
212).

Dans le cas de la lectine R1, le mannose est inhibiteur à une dose de 75 mM et les autres monosaccharides ne sont pas inhibiteurs.

Notons également que la CSL et Rl ne sont pas inhibées par de faibles concentrations de lactose (absence d'inhibition jusqu'à 75.10-3M) et de glycosaminoglycannes (concentration inférieure ou égale à 250 ,ug/ml correspondant environ à 2,5.10-4M d'unités disacchariques). Ces résultats sont obtenus en effectuant les tests d'agglutination d'érythrocytes de rats selon la technique décrite par Marschal et al (Biochimie 71 (1989) 645-653).

L'invention a donc pour objet, l'utilisation pour la détermination in vitro de la présence de cellules malignes dans un échantillon biologique donné, de lectines endogènes intervenant dans les phénomènes d'adhésion et/ou reconnaissance intercellulaires ayant une affinité indépendante du calcium pour un site impliquant des résidus mannose au niveau de ligands glycanniques, cette lectine présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou des fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques.

Les cas échéant les lectines utilisées présentent également une parenté immunologique et/ou structurale avec R1.

Les ligands pour lesquels les inventeurs ont constaté une affinité des lectines de l'invention peuvent être des ligands membranaires ou des ligands solubles.

Une lectine endogène particulièrement avantageuse pour la réalisation de l'invention est la CSL sous forme purifiée et active ou encore des fragments de la
CSL ou la CSL modifiée dès lors que la parenté fonctionnelle avec la CSL s'agissant de l'affinité indépendante du calcium vis à vis des ligands glycanniques est conservée.

Une molécule de CSL peut être modifiée, notamment par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés de la molécule, la lectine résultant conservant toutefois sa capacité de se lier aux ligands glycanniques en particulier membranaires normalement reconnus par la CSL.

Un procédé pour la purification de la CSL est décrit dans les exemples qui figurent dans les pages suivantes et l'activité de la molécule est vérifiée par un test d'agglutination des globules rouges de rat préalablement fixés par la glutaraldéhyde. Ce test est également décrit dans les pages qui suivent.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la CSL utilisée est obtenue par expression dans un hâte cellulaire procaryote ou eucaryote. La molécule recombinante est caractérisée comme CSL par une capacité de fixation des glycannes identique à celle de la CSL obtenue par extraction, une reconnaissance par les anticorps anti-CSL définis cidessus. Elle peut présenter une glycosylation différente ou une absence de glycosylation en particulier la présence de N-glycannes sensibles à la
N-glycanne ou endo-N-acétyl-glucosaminidase F.

Selon un autre aspect de la réalisation de l'invention, la lectine utilisée pour la détection in vitro de la malignité de cellules dans un échantillon biologique, est la lectine R1, ou un fragment de R1 ou R1 modifiée dès lors que la parenté fonctionnelle avec R1 s'agissant de l'affinité indépendante du calcium vis à vis des ligands glycanniques membranaires est conservée.

La détection de la présence de cellules malignes dans un échantillon biologique in vitro, par la détermination d'une augmentation du nombre des ligands glycanniques et le cas échéant le dosage de ces ligands, peut être réalisée par différentes techniques.

Un avantage de l'invention résulte de la rapidité avec laquelle le test peut être effectué et de la sensibilité des résultats obtenus.

L'invention concerne donc l'utilisation d'une lectine ou d'un fragment de lectine répondant aux critères donnés ci-dessus, caractérisée en ce que cette lectine ou ce fragment de lectine est marqué, par exemple par un isotope radioactif (radioisotope), un marqueur fluorescent ou un marqueur d'amplification.

A titre d'exemple de marqueur radioactif, on peut citer l'iode et comme exemple de marqueur fluorescent on peut citer le fluorophore FITC.

Un système d'amplification adapté pour la réalisation de l'invention est par exemple le système dans lequel la lectine mise en oeuvre est marquée avec de la biotine, la révélation de la liaison entre la lectine biotinylée et le gli-canne d'un glycoconjugué membranaire étant réalisée par exemple à l'aide d'avidine couplée par exemple à la phosphatasealcaline. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux dès lors que la CSL biotinylée peut être conservée pendant plusieurs années sous forme congelée, sans perdre son activité.

D'autres systèmes de marquage peuvent être également utilisés et on aura notamment recours aux marqueurs de type enzymatique tels que la peroxydase, la ss glactosidase ou des systèmes d'amplification à trois constituants faisant appel à trois anticorps (du type ABC).

L'invention concerne également un kit pour la détermination in vitro dans un échantillon biologique donné, de la présence de cellules malignes, caractérisé en ce qu'il comprend une lectine endogène intervenant dans les réactions d'adhésion et/ou de reconnaissance intercellulaires ayant une affinité indépendante du calcium pour un site de ligands glycanniques impliquant des résidus mannose, cette lectine présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou des fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques, éventuellement marquée.

Les lectines mises en oeuvre dans ce kit peuvent aussi présenter une parenté immunologique et/ou structurale avec R1, selon un mode particulier de réalisation l'invention.

Dans un mode de réalisation préféré de ce kit, la lectine utilisée est la CSL, sous forme purifiée et active.

Dans un autre mode de réalisation de ce kit, la lectine mise en oeuvre est la lectine membranaire RI, sous forme purifiée et active.

Ce kit peut être utilisé sur différents types d'échantillons biologiques susceptibles de contenir des cellules tumorales : il peut être constitué par exemple par une biopsie, un extrait tissulaire, des cellules isolées, une coupe histologique ou encore une lignée cellulaire.

L'utilisation d'un extrait tissulaire pour rechercher la présence de cellules malignes, permet l'obtention d'un résultat quantitatif. L'utilisation de coupes histologiques permet d'effectuer une réaction immunocytochimique et conduit à l'obtention d'un résultat qualitatif qui peut être observé au microscope.

Le kit peut être appliqué dans tous les cas de tumeurs se produisant au niveau de tissus susceptibles de contenir de la CSL ou R1 et par exemple au niveau de tumeurs hépatiques (hépatomes), au niveau de neuroblastomes, de glioblastomes, de cancers du sein, de leucémies érythrocytaires, ou de cancers des ovaires.

Ces exemples ne sont toutefois pas limitatifs et le kit peut être mis en oeuvre pour la détection au niveau d'échantillons de tissus au niveau desquels on constate la présence de CSL ou d'une autre lectine répondant aux définitions données dans les pages précédentes.

Le kit peut également être mis en oeuvre pour détecter la présence de cellules tumorales circulantes et ce notamment en utilisant la CSL biotinylée ou fluorescente sur des culots ou lames de cellules circulantes.

Un kit convenant à la réalisation de l'invention peut aussi contenir plusieurs types de lectines, par exemple la CSL et R1, notamment lorsqu'il s'agit de déterminer l'augmentation de ligands membranaires au niveau de cellules circulantes dont l'origine tissulaire n'est pas connue.

Selon un mode de réalisation particulier du kit selon l'invention, la lectine utilisée peut également être marquée notamment par les marqueurs décrits plus haut de type radioactif, flurorescent ou amplificateur.

Les lectines du kit se présentent notamment sous forme de solution ou sous forme lyophilisée ou encore sous toutes formes adaptées à la conservation des protéines.

Un kit particulier comprend en outre un témoin négatif constitué par un échantillon de cellules normales dont le taux de ligands membranaires affines pour les lectines du kit est connu.

I1 peut contenir aussi des courbes étalons sous forme d'une gamme de concentration de matériel contenant une quantité connue de ligands caractérisés de la CSL, ces étalons doivent permettrent de définir un degré de malignité des cellules de l'échantillon.

Ces gammes permettent de préciser qu'un taux déterminé de ligands définis ci-dessus est corrélé avec un signal donné obtenu avec des lectines du kit après mise en contact avec cet échantillon.

L'invention vise aussi un procédé pour la détermination in vitro dans un échantillon biologique donné, de la présence de cellules malignes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
- mise en contact de l'échantillon biologique testé, avec une quantité déterminée de lectines endogènes, intervenant dans les réactions d'adhésion et/ou de reconnaissance intercellulaires, ayant une affinité indépendante du calcium pour un site impliquant des résidus mannose et présent au niveau de ligands glycanniques contenant des résidus mannose, cette lectine présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou des fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques, cette lectine étant en outre marquée, dans des conditions permettant la réaction de ladite lectine marquée avec des ligands glycanniques;
- élimination de la lectine n'ayant pas réagi avec les ligands;
- révélation de la presence de complexes du type lectine-ligand, caractéristiques de la malignité cellulaire;
- détermination de la quantité de ligands glycanniques ayant réagi.

La lectine mise en oeuvre dans le procédé peut en outre avoir une parenté immunologique et/ou structurale avec R1.

La détermination de la quantité de ligands ayant réagi avec les lectines peut être remplacée par la détermination de l'augmentation du nombre des ligands recherchés. I1 peut aussi s'agir d'une détermination qualitative.

Comme on l'a dit plus haut, ces ligands peuvent être membranaires ou solubles.

Selon un mode de réalisation avantageux, la lectine utilisée pour la réalisation du procédé est la
CSL purifiée, active.

Selon un autre mode de réalisation de ce procédé, la lectine endogène utilisée est la lectine Rl.

Le procédé peut être réalisé sur les diverses formes d'échantillons dont il est question dans les sages pr- e entes et en particulier à partir 'échantil;ons dont on a préalablement extrait les protéines. Cette technique est notamment utilisée lorsque l'échantillon est constitué par une tumeur ou par des cellules en culture.

La détermination de la présence d'une quantité de ligands d'une lectine endogène affine pour des glycannes tels que décrits ci-dessus, peut être réalisée à partir des protéines des échantillons déposés soit directement sur un support, par exemple selon une méthode analogue à l'immuno-dotting ou à la technique ELISA, soit après électrophorèse et électrotransfert (technique analogue à l'immunoblotting) sur les protéines de la tumeur préalablement séparées.

Une description détaillée de ces modes de réalisation est donnée dans les exemples.

Des supports utilisables pour déposer les protéines sont des filtres tels que les filtres de nitrocellulose, ou encore des plaques de type ELISA.

Pour la réalisation du procédé, les lectines utilisées sont marquées selon les techniques qui ont été décrites précédemment.

La mise en oeuvre du procédé de détection de l'invention au moyen d'une technique de dépôt des protéines de l'échantillon sur un support, permet la différenciation des tumeurs non homogènes, et en conséquence permet de déterminer dans quelle mesure une tumeur contient une partie de tissu sain, et donc le taux de malignité de la tumeur.

Le procédé de l'invention peut également faire appel à une étape de comparaison du résultat obtenu lors de l'étape de révélation de la présence de complexes de type lectine-ligand, caractéristiques de la malignité cellulaire, avec des étalons ou des gammes de standard, éventuellement pré-établies, et qui permettent de corréler le degré de malignité d'une cellule avec le taux de ligands glycanniques.

Ces gammes de standard ou témoin peuvent être obtenues à partir d'échantillons et notamment de cultures cellulaires dont on connait exactement la quantité de ligands glycanniques et par dilution progressive de ces échantillons. En conséquence les observations effectuées par mise en contact des lectines avec un échantillon dont on cherche à déterminer s'il contient des cellules malignes, peuvent être rapportées à un signal connu, obtenu pour un nombre de ligands glycanniques déterminé, mis en présence de lectines déterminées.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples et les figures qui suivent.

Figure 1 : contrôle électrophorétique (révélation argentique) des préparations de CSL biotinylée. Une partie aliquote des fractions obtenues après séparation sur une colonne d'Ultrogel AcA 202 des produits de biotinylation de la CSL a été déposée sur le gel. Le profil de la CSL trouvée dans des fractions du volume mort de la colonne est identique à celui de la préparation d'origine : il contient la même proportion des sous-unités 33 000 et 31 500 de la CSL et de ses produits de dégradation (bas poids moléculaire). Un profil identique est obtenu après révélation par l'avidine-phosphatase alcaline. Les nombres sur la droite indiquent la position des marqueurs de Mr.

Figure 2 profils électrophorétiques des protéines révélées par le CBB (A) et des ligands de la CSL révélés par la méthode CSL-biotinylée-Avidine-AKP (B) présents dans des cellules normales ou transformées d'origine hépatique. La quantité de protéines déposées est la même (15 ,ug) pour chacun des puits. Les échantillons sont les suivants 1) hépatocytes de souris 2) hépatome Al de souris 3) hépatocytes de rat 4) hépatome H56 de rat 5) hépatome HTC de rat
On notera la quantité importante de ligands de la CSL d s les lignées tumorales.

Figure 3 : analyse électrophorétique des ligands de la
CSL dans des cellules et tissus d'origine nerveuse normaux ou transformés.

A) coloration des protéines par le CBB
B) révélation par la CSL-biotinylée.

15 g de protéines ont été déposés dans chacun des puits. Le matériel déposé provient des tissus ou cellules suivants 1) cervelet de rat âgé de 14 jours 2) cervelet de rat adulte 3) neuroblastome NIE11S non différencié 4) neuroblastome NIE11S différencié par le dibutyryl
c-AMP 5) glioblastome C6 6) astrocytes 7) oligodendrocytes 8) cellules de Schwann de rat nouveau-né
On notera la quantité importante de ligands de la CSL dans les trois types de cellules tumorales
Figure 4 : analyse électrophorétique du profil des ligands de la CSL dans des cellules transformées d'origines diverses.

A) coloration des protéines par le CBB
B) révélation par la CSL biotinylée.

15 ,ug de protéines ont été déposés dans chacun des puits.

1) IGROV1 2) MCF7 3) K562
On notera la quantité importante de ligands de la CSL et la similitude de leur profil.

Figure 5 : aspect en microscopie à contraste de phase des cultures de neuroblastome NIE11S non différencié
A) ou différencié par le dibutyryl-cAMP : B).

Les barres représentent 100 Sm. On notera la présence de prolongements en B).

Figure 6 : localisation de la CSL (A) et de ses ligands (B-D) dans les cultures du neuroblastome NIE11S non différencié (A-C) ou différencié par le dibutyryl c-AMP (D). Les barres représentent 10 ,um.

A) La CSL présente une localisation manifestement
intracellulaire (grosses flèches) mais se situe
également à la surface des cellules (petites
flèches).

B-D) Les ligands de la CSL révélés par la CSL
biotinylée, elle même révélée par l'avidine-HRP
sont localisés exclusivement à la surface des
corps cellulaires (B et C) et des prolongements
(D).

Figure 7 : analyse électrophorétique des ligands de la
CSL dans huit (1-8) tumeurs malignes des glandes mammaires humaines.

A) coloration des protéines par le CBB
B) révélation par la CSL biotinylée 15 ,ug de protéines ont été déposés dans chacun des puits. On notera, pour la plupart des tumeurs, la présence d'une quantité importante de ligands de la
CSL. I1 existe toutefois des variations entre elles.

C) témoin correpondant à la piste 7, incubé avec
1'avidine-phosphatase alcaline mais sans CSL
biotinylée.

Figure 8 : représentation schématique de l'hypothèse du signal non sens de la transformation maligne.

A) dans des cellules normales, le contact entre
cellules est assuré par la lectine CSL entre les
glycannes portés par un nombre limité de glycopro
téines (ici une seule). Ce contact génère un signal
intracellulaire (a) parfaitement interprété par la
cellule.

B) dans la cellule transformée, le même contact assure
par la CSL se réalise à travers de nombreuses
glycoprotéines différentes générant chacune un
signal intracellulaire différent (a) (b) (c) (d)
(e). La résultante de ces signaux équivaut à un
signal polysémique non interprété par la cellule
il équivaut à un signal "non-sens".

EXEMPLES
A) PURIFICATION DE LA CSL
Protocole d'extractions séquentielles : 20 ratons (entre 12 et 22 jours après la naissance) sont tués par décapitation et le cervelet est prélevé sur glace. Toutes les opérations sont réalisées alors à 4"C. Tous les tampons contiennent des inhibiteurs de protéases : 0,01% de l'ester méthylique de la p-tosylarginine et 0,1 mM de fluorure de phényl méthyl sulfonyle.

1) Les cervelets sont homogénéisés dans 300 ml de
tampon 10 mM Tris-HCl à pH 7,2, puis centrifugés (lh
X 200 000g).

2) Le culot est homogénéisé dans 10 ml d'eau et l'on
ajoute 90 ml d'un tampon 11 mM Tris-HCl à pH 7,2
contenant 0,44 M de NaCl. Après homogénéisation, la
suspension est centrifugée (lh X 200 000g).

3) Le culot est homogénéisé dans 10 ml d'eau et l'on
ajoute 90 ml d'un tampon 11 mM Tris-HCl à pH 7,2,
contenant 0,44 M de NaCl. Après homogénéisation, la
suspension est centrifugée (lh X 200 000g) (idem 2).

4) Le culot est homogénéisé dans 10 ml d'eau et l'on
ajoute 90 ml d'un tampon 11 mM tris-HCl à pH 7,2
contenant 0,44 M et 0,55 M de mannose. Après
homogénéisation, la suspension est centrifugée (2h X
200 000g). Cette fraction est appelée TNM1.

5) Le culot est homogénéisé dans 10 ml d'eau et l'on
ajoute 90 ml d'un tampon 11 mM Tris-HCl à pH 7,2
contenant 0,44 M de NaCl et 0,55 M de mannose. Après
homogénéisation, la suspension est centrifugée (2h X
200 000g). Cette fraction est appelée TNM2.

6) La fraction TNM obtenue en réunissant les fractions
TNM1 et TNM2 sert de départ pour la purification de
la CSL par immunoaffinité.

Protocole pour la purification de la CSL par immunoaffinité 1) - les anticorps polyclonaux obtenus chez le lapin
contre les diverses sous-unités séparées de la CSL
ou leur ensemble;
- les anticorps contenus dans le liquide céphalo
rachidien ou le sang de patients atteints de
maladie démyélinisante dont la sclérose en plaques
et donnant des résultats positifs par le test
d'immunoréplique mis au point pour le diagnostic
de la sclérose en plaques (Zanetta et coll. Lancet
335 (1990) 1282-1284, Zanetta et coll. C.R. Acad.

Sci Paris, Série III 311 (19g0) 327-331);
- les anticorps monoclonaux produits chez la souris
permettant de révéler les sous-unités 31 500 et
33 000 de la CSL ou la sous-unité 45 000 ayant
pour noms D36A, D36B, D36C, D36D;
Préparation des immunoglobulines : les fractions
d'immunoglobulines sont obtenues par précipitation
par le sulfate d'ammonium (250 mg/ml) à 4oC des
sérums ou plasmas contenant des anticorps anti-CSL,
suivie d'une centrifugation (lh X 100 000g). Les
culots d'immunoglobulines sont repris dans un volume
initial de tampon PBS (25 mM Phosphate de Na à pH
7,2 contenant 150 mM NaCl) puis dialysées plusieurs
fois sur une durée de 48 h contre de grands volumes
de PBS à 4"C et sous agitation.La source des immu
noglobulines peut être du sérum de lapin produisant
des anticorps anti-CSL ou des sérums ou plasmas de
patients atteints de sclérose en plaques ou d'autres
maladies dans lesquelles il existe des anticorps
anti-CSL en quantité importante.

2) Immobilisation des immunoglobulines : les immunoglo
bulines ainsi isolées sont immobilisées sur un
support (généralement de la Sepharose 4B activée par
le bromure de cyanogène) selon les protocoles
suggérés par le fabricant. Après réaction pendant
une nuit à 4"C, les sites d'activation résiduels
sont bloqués par réaction pendant 1h à 4"C avec une
solution 1M d'éthanolamine portée à pH 9,0 par de
l'acide chlorhydrique concentré. Le gel est alors
largement lavé avec du PBS, puis soumis à un cycle
d'immunoaffinité "à blanc" (comme ci-dessous, mais
sans protéines dans la fraction TNM).

3) Chromatographie d'immunoaffinité : la colonne (5 cm
de longueur et 1 cm de diamètre) est équilibrée dans
du tampon 2,5 mM Tris-HCl à pH 7,2 contenant 0,1 M
de NaCl. La fraction TNM est diluée 4 fois avec de
l'eau glacée et l'on ajoute les inhibiteurs de
protéase à la concentration habituelle. Cette
fraction est passée lentement sur la colonne (30 ml
par heure au maximum). Quand tout l'échantillon est
passé, la colonne est lavée avec le tampon
d'équilibration puis avec 25 ml de PBS trois fois
concentré. Pour cette élution, le matériel sortant
de la colonne est recueilli sur un collecteur de
fractions, en fractions d'environ 0,5 ml. La colonne
est alors lavée avec 25 ml de tampon Glycine-HCl 0,2
M à pH 7,2, puis neutralisée à l'aide d'un tampon
PBS 8 fois concentré.Après un dernier lavage avec
du PBS, le gel est récupéré et stocké à 4"C dans ce
tampon auquel on ajoute de l'azide de sodium
(concentration finale 1/1000). Selon l'affinité des
anticorps, la CSL peut se trouver soit dans l'éluat
3 X PBS, soit dans l'éluat pH 2,0.

4) Les fractions éluées par le PBS 3 fois concentré
sont gardées congélées à 80"C. Les fractions
contenant les protéines éluées par le tampon à pH
2,0 sont dyalisées plusieurs fois contre de grands
volumes de PBS à 4"C et sous agitation pendant une
période de 24h.

5) Test de préparation de CSL purifiée : une partie
aliquote des fractions obtenues est mélangée avec un
volume de mélange de solubilisation de Laemmli et
soumis à une électrophorèse en gel de polyacrylamide
à 13% d'acrylamide en présence de SDS. Le gel est
ensuite coloré par le bleu de Coomassie, puis par
une coloration argentique. La qualité des
préparations se juge par l'absence de bandes autres
que celles de PM 31 500, 33 000 et 45 000
caractéristiques de la CSL.

L'activité des préparations est testée par agglutination des globules rouges de rat préalablement fixés par la glutaraldéhyde. Ces globules sont préparés selon la méthode préconisée par SIMPSON et coll.

(Nature (1977), 266: 367-369). Des dilutions de 2 en 2 de la lectine dans du PBS sont placées dans les puits à fond rond de plaques d'agglutination, dans un volume de 100 ,ul. On ajoute 100 111 de la suspension de globules rouges et on laisse reposer pendant environ lh.

L'activité agglutinante maximale observée est de l'ordre de 01-0,2 ,ug/ml.

B) MARQUAGE DE LA CSL
La protéine ainsi purifiée, dont l'activité est vérifiée par sa capacité d'agglutiner des globules rouges de rat préalablement fixés par la glutaraldéhyde (Marschal et coll., Biochimie (1989), 71: 645-653) est marquée soit par un isotope radioactif (iode), soit par un fluorophore (FITC) soit par un système d'amplification (biotine, qui permet d'utiliser une révélation par l'avidine couplée par exemple à la phosphatase alcaline). Ce dernier mode de marquage et de révélation est particulièrement avantageux, la CSL biotinylée pouvant conserver son activité durant plusieurs années de congélation.

Protocole de biotinylation de la CSL
Toutes les opérations sont réalisées à 4"C. A 500 il d'une solution de CSL (environ 500 ,ug de protéine / ml de PBS) placés dans un tube Eppendorf de 1,5 ml, on rajoute 30 ,ul de soude 0,1 N afin de porter le pH à 9,25. On rajoute, lentement sous agitation, 10,ut d'une solution de N-hydroxy-succinimide ester de biotine (75 mM dans du diméthylformamide). On laisse ainsi agir pendant 1h à 4"C en agitant régulièrement. On ajoute alors 100 ,ul d'une solution 0,2 M de glycine afin de bloquer l'excès de réactif.On ajoute ensuite du
Triton-X-100 (concentration finale 0,1%) afin d'éviter la précipitation ultérieure de la CSL biotinylée sur la colonne de gel filtration. Cette dernière, préparée avant le début de l'expérience, est constituée d'Ultrogel AcA 202 (IBF) équilibrée dans du tampon PBS contenant 0,1% de Triton-X-100 et 1 mg/ml de BSA traitée par l'acide périodique (BSA-HIO4; Glass et coll., 1981). L'emploi de BSA-HIO4 à ce stade a pour but de saturer les sites du gel qui pourraient, par la suite, adsorber la CSL biotinylée et ainsi diminuer le rendement de cette étape. La colonne est ensuite longuement lavée dans du PBS contenant 0,1% de Triton
X-100 sans BSA-HIO4. L'échantillon est déposé sur la colonne (7 cm de longueur et 1 cm de diamètre) et élué dans ce tampon. On recueille des fractions de 1 ml environ.

Une partie aliquote de 20 ,ul de chacune des fractions recueillies est déposée dans les puits d'une plaque de microtitration ELISA et on le laisse sécher. On ajoute 100 ,ul de BSA-HI04 pendant 1h à température ordinaire.

Après quelques lavages avec du PBS, on ajoute 100 111 d'une solution diluée 1000 fois d'avidine couplée à la phosphatase alcaline. Après incubation pendant 1h à température ambiante, les puits sont lavés une dizaine de fois avec du PBS. Après quelques lavages à l'eau, on révèle par le substrat p-nitrophényl-phosphate de la phosphatase alcaline à 37oC pendant environ 5 min.

L'intensité de la coloration obtenue est mesurée dans un lecteur de plaques ELISA classique.

Ces préparations sont testées également par électrophorèse en milieu dénaturant (SDS) avec une coloration argentique. Une vérification de la biotinylation de toutes les chaines est réalisée après transfert sur filtre de nitrocellulose par révélation avec l'avidine marquée à la phosphatase alcaline (voir ci-dessous).

Enfin il est conseillé de vérifier l'activité de la CSL biotinylée en utilisant la technique d'hémagglutination (voir ci-dessus).

Afin de vérifier l'intégrité de la CSL biotinylée des parties aliquotes des préparations ont été soumises à des analyses électrophorétiques suivies de coloration par le CBB (Coomassie Brilliant Blue R) ou le nitrate d'argent ou, après transfert sur filtre de nitrocellulose, révélation par 1 'avidine-phosphatase alcaline. Dans tous les cas (CSL biotinylée active ou non), on a pu vérifier qu'il n'y avait pas de protéolyse de la CSL au cours du protocole de biotinylation, et que la biotinylation portait sur toutes les chaînes CSL.En effet, il n'y a pas de modifications substantielles du profil électrophorétique de la CSL avant et après biotinylation : on retrouve le même type de profil avec les mêmes bandes (deux majeures à 31 500 et 33 000 ainsi que des bandes mineures initialement présentes vers 15 000 et correspondant à une dégradation de la
CSL) dans les mêmes proportions, toutes étant biotinylées (figure 1).

C) UTILISATION DE LA CSL POUR LE DOSAGE DES LIGANDS DE
LA CSL
La détermination de quantité des ligands de la CSL peut se faire à partir des protéines des cellules tumorales ou des tumeurs, déposées soit directement en un point d'un support (analogue à l'immuno-dotting ou à llELISA), soit, après électrophorèse et électrotransfert (analogue à l'immunoblotting), sur les protéines de la tumeur préalablement séparées.

1 - Techniques de cultures cellulaires
Origine des lignées cellulaires
Des lignées tumorales d'origines tissulaires et d'espèces différentes ont été étudiées. I1 s'agit
- du clone C6 dérivant d'un glioblastome de rat
induit par la nitrosurée (Benda et coll., Science
161 (1968) 370-371),
- du clone HTC dérivant de lthépatome de Morris de
rat (Thompson et coll., Proc. Natl; Acad. Sci. USA
56 (1966) 296-303),
- du clone H56 dérivant d'un hépatome de rat
(Deschatrette et Weiss, Biochimie 56 (1974) 1603
1611),
du clone NIE115 dérivant d'un neuroblastome de
souris (Lampert et al, Proc. Natl. Acad. Sci.USA
73 (1976) 3165-3167),
- du clone Al dérivant d'un hépatome de souris
(Chott et al Anticancer Drugs Vol. 191 (1989) 245
252),
- du clone MCF7 (WT 101/22/26) dérivant d'un cancer
de sein humain (Soule et coll., J. Natl. Cancer
Inst. 51 (1973) 1409-1416),
- du clone K562 dérivant d'une leucémie
érythrocytaire humaine (Lozzio et Lozzio, Blood 45
(1975) 321-334),
- du clone IGROV1 dérivant d'un cancer des ovaires
humains (Bénard et coll., Cancer Res. 45 (1985)
4970-4979),
- astrocytes de rat (Pettmann et coll., Dev.

Neurosci. 4 (1981) 37-45),
oligodendrocytes (McCarthy et DeVellis, J. Cell
Biol. 85 (1980) 890-902).

Techniques de cultures cellulaires
Les cellules sont cultivées dans des boîtes en polystyrene en présence des milieux indiqués ci-après, auxquels on a ajouté les antibiotiques suivants pénicilline (100 U/ml) et streptomycine (1 mg/ml).

- pour le clone C6 milieu de Dulbecco modifié
selon Eagle (DMEM) complétés avec 10% de sérum de
veau foetal (SVF)
- pour le clone HTC : milieu DMEM + 10% SVF
- pour le clone H56 : milieu DMEM + 5% SVF
- pour le clone Al : mélange nutrionnel F-12 HAM +
10% SVF
- pour le clone NIE11S : milieu DMEM + 10% SVF
- pour le clone IGROVI : milieu RPMI-1640 (RPMI) +
10% SVF
- pour le clone MCF7 : RPMI + 10% SVF
Toutes les cultures sont maintenues à 37"C dans une atmosphère d'air contenant 5% de CO2. Les milieux de culture sont changés deux fois par semaine.

Repiquage des cultures
Pour la plupart des cultures en phase solide, à l'exception des neuroblastomes de souris, on rince les boîtes de culture avec du milieu frais. On détache ensuite mécaniquement les cellules à l'aide d'un "policeman" et on les dissocie par plusieurs passages à travers une aiguille de 0,8 mm de diamètre et de 4 cm de longueur. La suspension cellulaire ainsi obtenue à partir d'une culture sur support solide, ainsi que celles obtenues à partir des cultures en milieu liquide, sont centrifugées (5 - 10 min x 400 g). On élimine alors le surnageant et on resuspend le culot dans un volume convenable de milieu de culture que l'on répartit dans plusieurs boîtes.

Pour le repiquage des neuroblastomes, on procède par trypsinisation des cellules on aspire le milieu de culture, puis on met les cellules en contact avec une solution contenant 0,25% de trypsine pendant 2 à 3 min.

On ajoute ensuite du milieu de culture frais qui neutralise l'action de la trypsine et l'on détache les cellules en agitant doucement la bote par des mouvements de rotation. Les cellules alors en suspension sont dissociées par passage à travers une seringue de 0,8 mm de diamètre. La suspension cellulaire est alors reprise dans un volume convenable de milieu et répartie dans plusieurs boîtes.

Conservation des lignées cellulaires
Lorsqu'elles arrivent à confluence, les cultures en phase solide sont lavées avec du milieu frais, alors que les cultures en suspension sont centrifugées (5 10 min x 400 g). Les cellules sont alors mises en suspension dans du milieu frais de façon à obtenir une concentration cellulaire d'environ 5 x 106 cellules par ml en présence de 10% de sérum de veau foétal et 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO). La suspension cellulaire ainsi obtenue est conservée dans l'azote liquide.

2 - Méthodes d'extraction des protéines des cultures
de cellules ou de tumeurs:
Pour les tumeurs, on ajoute au tissu du SDS 1% dans l'eau de façon à avoir une concentration de l'ordre de 2mg/ml en protéines (les protéines représentent environ 10% du poids frais d'un tissu). Pour les cultures de cellules, il est nécessaire d'effectuer deux lavages avec du PBS avant de dissoudre le matériel dans le SDS 1%.

Pour les tumeurs du sein, conservées dans l'azote liquide, le tissu est d'abord dissocié manuellement à sec, immédiatement après l'avoir retiré de l'azote liquide, dans un homogénéisateur de Potter conique en verre muni d'un piston de téflon. Le tissu dissocié est alors homogénéisé mécaniquement dans une solution de
SDS à 1% de çon à obtenir une concentration protéique finale d'environ 2 mg/ml. Les extraits protéiques ainsi obtenus sont conservés à -20 C.

La concentration protéique exacte des homogénats est déterminée selon le protocole préconisé par Lowry et coll (1951, J. Biol. Chem. 193: 265-275). Avant électrophorèse, les extraits sont dilués dans le mélange de dissociation de Laemmli (Laemmli, 1970,
Nature 227: 680-685) de façon à obtenir une concentration protéique de 1 mg/ml et chauffés pendant 5 min à 90"C.

3) - Techniques électrophorétiques
Les électrophorèses en présence de SDS sur gel de polyacrylamide sont réalisées dans le système tampon de
Laemmli (Nature (1970), 227: 680-685). Habituellement, des gels à 13% d'acrylamide (0,75 mm d'épaisseur) sont utilisés, ils permettent une bonne résolution des protéines de bas poids moléculaires et de poids moléculaires moyens, protéines parmi lesquelles se trouvent les ligands majeurs de la CSL). Les protéines sont colorées avec du Bleu de Coomassie Brilliant R (CBB). La quantité déposée sur les gels est de 15 Ag environ pour les colorations protéiques, de 1 à 5 pg pour les révélations des ligands de la CSL.Les protéines des gels sont alors transférées sur filtres de nitrocellulose (pore de 0,22 ou 0,45 ,um de diamètre) dans le sytème de tampon développé par Towbin et coll.

(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979), 76: 4350-4354) avec la différence que du SDS (0,04%) est ajouté au tampon afin de faciliter le transfert de protéines hautement hydrophobes. Les blots sont rincés plusieurs fois à l'eau distillée, puis séchés entre des feuilles de papier filtre et conservés ainsi jusqu'à leur utilisation.

4 - Dépôt des échantillons en dots
Les protéines dissoutes dans le SDS 1% à la concentration de lmg/ml sont déposées à l'aide d'une microseringue sur le filtre de nitrocellulose. On dépose des volumes de 0,1-0,25-0,5-0,75 et 1,ul de matériel et de témoins correspondants et l'on sèche sous courant d'air. La plaque est alors rincée plusieurs fois à l'eau distillée et séchée entre des feuilles de papier filtre jusqu'à leur utilisation.

5 - Technique pseudo-ELISA
L'échantillon dissous dans du SDS 1% à la concentration de lmg/ml est dilué 10 fois dans du PBS. Une partie aliquote de 10,lu1 est déposée dans un puits d'une plaque
ELISA et laissée à sécher dans une étuve ventilée portée à 37"C. Le puits est alors lavé rapidement avec 5 fois 100 ,ul de PBS, puis 200 ,lLl de BSA-HIO4 sont ajoutés et laissés pendant 1h à température ordinaire.

Après trois lavages rapides par du PBS et une fois par de l'eau, les plaques sont retournées et laissées à sécher. Elles peuvent être gardées à l'abri de la poussière jusqu'à leur utilisation.

6 - Révélation
A partir de ce matériel fixé sur le support, on détecte les glycoprotéines ligands de la lectine CSL. Cette détection peut être réalisée de différentes façons suivant la nature du procédé permettant la détection de la CSL fixée sur ses ligands. I1 peut s'agir de CSL marquée par un radio-élément (iode en particulier), le marquage étant révélé par autoradiographie ou techniques plus récentes. I1 peut s'agir de la CSL rendue fluorescente ou de la CSL marquée de façon covalente par tout autre fluorophore visualisé en lumière ultra-violette. I1 peut s'agir d'un système amplificateur comprenant, par exemple, la CSL-biotinylée, révélée par un système du type avidine-phosphatase alcaline (ou avidine couplée à tout autre moyen classique de détection). Cette dernière technique, de la CSL biotinylée associée à une révélation par l'avidine, elle-même couplée à la phosphatase alcaline, constitue un système efficace et très sensible mais qui n'exclut pas les autres méthodes de détection des protéines.

Protocole de révélation des ligands de la CSL par la méthode CSL-biotinylée/Avidine-phosphatase alcaline sur filtre de nitrocellulose
Les filtres de nitrocellulose sont mouillés dans du PBS puis incubés pendant 1h à température ordinaire dans de la BSA-HIO4 à 3t dans du PBS. On ajoute alors la CSL biotinylée (lng/ml) et l'on laisse réagir pendant 4h avec agitation. On lave avec du PBS pendant 2h toutes les 10 minutes. On incube pendant environ 30 min avec de la BSA-HIO4 à 3% dans du PBS puis on ajoute une solution diluée 1/1500 d'avidine-phosphatase alcaline.

On laisse incuber pendant la nuit à 4"C sous agitation, puis on lave comme ci-dessus. On rince finalement avec du TBS pendant 5 min avant la révélation. On révèle par le réactif NBT-BCIP de la phosphatase alcaline (Leary et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 40454049). Après un rapide rinçage à l'eau distillée, les filtres de nitrocellulose sont séchés avec du papier filtre.

Protocole de révélation des ligands de la CSL par la méthode CSL-biotinylée/Avidine-phosphatase alcaline en technique pseudo-ELISA
Les puits des plaques de microtitration sont mouillés dans du PBS puis incubés pendant 1h à température ordinaire dans de la BSA-HIO4 à 3% dans du PBS. On ajoute alors la CSL biotinylée (lng/ml) et l'on laisse réagir pendant 4h avec agitation. On lave avec du PBS pendant 2h toutes les 10 minutes environ. On incube pendant environ 30 min avec de la BSA-HI04 à 3% dans du
PBS puis de nouveau pendant 2h toutes les 10 minutes avec du PBS. On incube ensuite pendant 30 min avec de la BSA-HIO4 à 3% dans du PBS puis on ajoute une solution diluée 1/1500 d'avidine-phosphatase alcaline.

On laisse incuber pendant la nuit à 4"C sous agitation, puis on lave comme ci-dessus. On rince finalement avec du TBS pendant 5 min avant la révélation. On révèle par le réactif p-nitrophényl-phosphatase de la phosphatase alcaline à 37"C. La coloration dans les puits des plaques de microtitration est mesurée à l'aide du lecteur automatique de plaques ELISA.

7 - Détection histologique des ligands de la CSL I1 est possible de mettre en évidence les ligands de la
CSL sur des coupes histologiques de tissus tumoraux ou sur des préparations de cellules tumorales en utilisant la CSL marquée. Ce marquage de la CSL peut être réalisé avec un fluorophore convenable (FITC, TRITC, etc), soit à un composé coloré (or colloïdal par exemple), soit à l'aide d'une méthode indirecte, utilisant par exemple biotinylation suivie d'une détection de la biotine par l'avidine marquée (par la phosphatase alcaline ou la peroxydase par exemple). Etant donné que les constituants révélés par la CSL sont essentiellement de nature glycoprotéique, le traitement des préparations par des solvants organiques ne modifie en rien la réaction.De même, les ligands révélés étant de nature glucidique, ils ne sont pas modifiés par les fixateurs de nature aldéhydique généralement utilisés pour fixer cellules ou tissus. Par contre, il est très fortement déconseillé d'utiliser des traitements oxydants (periodate) ou acides, susceptibles, eux, de détruire les glycannes reconnus. On peut donc utiliser cette technique sur tous les types de coupes de tissus classiques (paraffine, cryostat, vibratome) sur tissus fixés ou non par les aldéhydes (paraformaldéhyde et glutaraldéhyde).

Protocole préconisé pour la mise en évidence des ligands de la CSL par les techniques histochimiques
Les cellules sont d'abord fixées pendant 1h à 4oC avec une solution contenant 4% de paraformaldéhyde et 0,1% de glutaraldéhyde dans du tampon PBS. Les cellules sont ensuite incubées avec une solution de CSL biotinylée à une concentration d'environ 1,ug/ml pendant 4h à température ambiante. Après 2h de lavages dans du PBS, les cellules sont incubées avec l'avidine couplée à la peeoxydase de Raifort (avidine-HRP) à la dilution de 1/100 dans du PBS pendant une nuit à 4"C. Après plusieurs lavages dans du PBS l'activité peroxydasique est révélée par la méthode à la 3,3'-diaminobenzidine (DAB) (Graham et Karnovsky, 1966 J.Histochem. Cytochem.

14 291-302) et les coupes sont observées à l'aide d'un microscope optique Orthoplan Leitz.

Comme variante on pourra employer la CSL préalablement rendue fluorescente selon la technique classique (FITC/Célite), suivie d'une étape de gel filtration identique à celle utilisée pour purifier la CSL biotinylée. Elle possède l'avantage d'être une méthode directe donc plus rapide. Par contre elle nécessite une observation au microscope à fluorescence.

D) RESULTATS CONCERNANT LA DETECTION DES LIGANDS DE LA
CSL DANS LES CELLULES OU TISSUS TUMORAUX 1- Les ligands de la CSL dans les cellules normales et
transformées origine hépatique
Hépatomes et hépatocytes de souris
Comme le montre la figure 2, il existe des variations qualitatives importantes entre les profils protéiques des cellules tumorales (Al) et les hépatocytes de souris cultivés pendant 3 jours. Mais cette différence est bien moins prononcée que celle qui existe pour les ligands de la CSL. En effet, dans les hépatocytes de souris (figure 2, ligne 1), on distingue une bande majeure de masse moléculaire relative (Mr) voisine de 100 000 et une plus faible de basse Mr 19 900 (ligne 2). D'autres ligands sont également présents mais en quantité infimes. Dans les cellules Al le nombre et la quantité de ligands sont considérablement plus élevés.

Les ligands majeurs révélés ont des Mr très variées avec trois groupes majeurs : un groupe de masse Mr (inférieure à 20 000),un groupe de Mr voisine de 30 000 et un groupe de Mr supérieure à 50 000. On pourra noter que le ligand de la CSL dans les hépatocytes de souris n'est pas augmenté de façon proportionnelle dans llhépatome Al puisqu'à ce niveau de Mr, on ne retrouve que des constituants mineurs.

Hépatomes et hépatocytes de rats
Pour les hépatocytes de rat (figure 2, lignes 3-5), le profil des ligands de la CSL est plus complexe que celui observé pour les hépatocytes de souris, puisque l'on distingue 5 constituants, de Mr respectives 100 000, 52 300, un triplet vers 33 000, 31 000 et 20 000.

Dans leux deux hépatomes examinés, la situation est notablement plus complexe. D'une part la quantité de ces ligands est considérablement augmentée, et, d'autre part, le nombre de ligands majeurs de la CSL est très élevé. Comme pour les hépatomes Al de souris, on distingue trois groupes de ligands intenses, mais on retrouve également pour HTC (figure 2, ligne 5) des bandes importantes situées entre ces zones. H56 (figure 2, ligne 4), par contre, possède un profil tout à fait voisin de celui de 1'hépatome murin Al.

2- Les ligands de la CSL dans les cellules normales et
transformées origine nerveuse
Cellules d'origine neuronale
Cellules du neuroblastome différencié ou non
Comme le montre la figure 3 (lignes 3-4), les cellules de neuroblastome NIE11S non différenciées ou différenciées par le dibutyryl-cAMP, possèdent une quantité et un nombre considérables de ligands de la
CSL. Cette situation est très différente de celle que l'on peut trouver pour des neurones. A cet égard, il est très difficile d'obtenir un bon témoin neuronal du neuroblastome NIE11S et c'est la raison pour laquelle il a été comparé à un tissu particulièrement riche en matériel neuronal, le cervelet de rat.Bien que les ligands de la CSL soient présents en grande quantité dans cet organe au 14ème jour postnatal, on constate que pratiquement 5 ligands majeurs connus pour avoir une origine neuronale sont détectés (figure 3, ligne 1). La situation dans le neuroblastome est donc considérablement modifiée par rapport aux profils observés in vivo dans le système nerveux central. On remarquera que le fait que le clone NIE11S soit différencié sous les effets du dibutyryl-cAMP, ne modifie en rien la complexité du profil des ligands de la CSL. On peut constater (figure 3, lignes 3-4) que cette différenciation s'accompagne d'une légère augmentation de la quantité des ligands de la CSL.

Localisation de la CSL et de ses ligands dans une
cellule tumorale : le neuroblastome NIE11S I1 était important, au terme de ces études montrant une augmentation considérable des ligands de la CSL dans des cellules tumorales, de savoir si ces ligands étaient présents à l'intérieur ou à la surface des cellules et si la CSL elle même était présente à la surface cellulaire. Ce type d'étude a été conduit pour ce qui concerne la CSL, sur les cellules dlhépatomes et sur les cellules ovariennes de hamster (CHO).Une démonstration directe de la présence extracellulaire des ligands de la CSL est possible en utilisant d'une part la CSL biotinylée détectée par l'avidine couplée à la peroxydase pour les ligands, et d'autre part, les anticorps anti-CSL et la technique immunocytochimique indirecte pour la CSL elle-même.

Cette étude a été réalisée sur le neuroblastome NIE11S qui présentait un intérêt tout particulier dans la mesure où l'on peut facilement le faire se différencier et donc étudier la CSL et ses ligands dans deux situations ou les cellules sont morphologiquement différentes (figure 5). Comme le montre la figure 6A, la CSL est présente dans les cellules de neuroblastome à la fois à l'intérieur et à l'extérieur des cellules.

Cette localisation est observée tant dans les cellules NIE11S non différenciées que dans celles qui l'ont été.

Dans ce dernier cas, une réactivité notable est associée à des prolongements neuritiques et en particulier aux régions ayant l'aspect des cônes de croissance. Les arguments pour affirmer cette dualité de localisation intra et extra cellulaire proviennent de l'observation du liseré entourant la cellule (traduisant le marquage de la membrane) et de l'aspect irrégulier, en granulation notamment (traduisant la présence d'antigène dans des vésicules intracellulaires, localisation assez caractéristique de la CSL (Zanetta et coll., 1987, J. Neurochem. 49: 12501257).

Pour ce qui concerne les ligands de la CSL (figure 6,
B-D), le marquage est exclusivement de surface en microscopie optique, ce point ayart été vérifié en microscopie électronique.

Cellules d'origine gliale
Comme le montre la figure 3 (lignes 6-8), les astrocytes, les oligodendrocytes et les cellules de
Schwann immatures possèdent respectivement un nombre limité de ligands de la CSL. Un nombre de ligands de basse Mr (une bande majeure à 21 000 pour les astrocytes et les oligodendrocytes, un triplet vers 21 000 pour les cellules de Schwann), un groupe de Mr intermédiaire entre 30 000 et 50 000 (une bande majeure à 38 000 pour les cellules de Schwann) et un groupe de haute Mr (comprenant la MAG). Par contre, pour le glioblastome C6, le profil des ligands de la CSL est extrèmement complexe et leur quantité est très élevée (figure 3, ligne 5).

3- Les ligands de la CSL dans les autres cellules
tumorales
Nous avons étudié également des cellules tumorales d'origines diverses notamment d'origine humaine. Les résultats concernant ces cellules sont regroupés dans la figure 4. On notera dans ces cellules la quantité importante des ligands de la CSL et leur hétérogénéité.

On pourra constater que les résultats obtenus sur le neuroblastome NIE11S et le glioblastome C6 présentent une extrème similitude de profils, du moins pour ce qui concerne les ligands majeurs de la CSL.

Les ligands de la CSL dans les tumeurs mammaires humaines
Pour compléter les études précédentes réalisées sur des cellules tumorales cultivées in vivo, une vingtaine de tumeurs humaines malignes du sein ont été étudiées.

I1 apparaît que la plupart d'entre elles présentent des niveaux importants de ligands de la CSL (figure 7).

D'après l'intensité des marquages obtenus, on peut considérer que le taux de ces ligands est plus faible que dans les autres cellules tumorales examinées.

Néanmoins, il est très nettement supérieur à celui que l'on peut obtenir à partir d'un tissu adulte sain (foie, cerveau par exemple). Selon les tumeurs, il existe des variations qualitatives notables des profils. Ces différences ne sont pas en relation avec ce que les cancérologues définissent comme le "grade" de la tumeur.

E) TECHNIQUE DE CLONAGE DE LA CSL
La technique de clonage de la CSL a consisté en un criblage par divers anticorps anti-CSL des produits exprimés par les clones d'une banque cDNA dans ZAP2.

Cette banque de cDNA a été fabriquée à partir de mRNA de cervelet de rat de 14 jours. Les anticorps anti-CSL utilisés pour le criblage de la banque sont
- un anticorps polyclonal dirigé contre la CSL
totale (mélange des sous-unités sous-unités 45,33
et 31,5 kDa)
- un anticorps contre la sous-unité 45 kDa purifiée
- un anticorps entre la sous-unité 33 kDa purifiée
- un anticorps contre la sous-unité 31,5 kDa
purifiée
- un anticorps monoclonal anti-CSL
- une préparation d'immunoglobuline de patient
atteint de sclérose en plaques.

Les anticorps sont préparés selon les techniques classiques, par immunisation d'un animal avec la CSL ou avec une sous-unité de la CSL décrite plus haut. Les anticorps polyclonaux peuvent être récupérés à partir du sérum de l'animal immunisé. Pour produire les anticorps monoclonaux, des cellules spléniques de l'animal immunisé avec la CSL ou une sous-unité sont fusionnées avec des cellules de myélome pour former des hybridomes. Ces hybridomes sont clonés et sélectionnés pour leur capacité à reconnaître spécifiquement la CSL ou au moins l'une de ses sous-unités.

Ces anticorps utilisés pour le criblage de la banque permettent de sélectionner les séquences spécifiques de la CSL.

Claims (23)

REVENDICATIONS

1. Utilisation pour la détermination in vitro de présence de cellules malignes dans un échantillon biologique donné, de lectines endogènes intervenant dans les phénomènes d'adhésion et/ou reconnaissance intercellulaires ayant une affinité spécifique indépendante du calcium, pour un site impliquant des résidus mannose au niveau de ligands glycanniques, cette lectine présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou des fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques.

2. Utilisation d'une lectine endogène selon la revendication 1, caractérisée en ce que cette lectine est la CSL sous forme purifiée et active ou en ce qu'il s'agit de fragments de la CSL ou de la CSL modifiée dès lors que la parenté fonctionnelle avec la CSL s'agissant de l'affinité indépendante du calcium vis à vis de ligands glycanniques est conservee.

3. Utilisation d'une lectine endogène selon la revendication 1, caractérisée en ce que cette lectine est R1, ou un fragment de R1 ou R1 modifiée dès lors que la parenté fonctionnelle avec R1 s'agissant de l'affinité indépendante du calcium vis à vis de ligands glycanniques est conservée.

4. Utilisation d'une lectine ou d'un fragment de lectine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que cette lectine ou ce fragment de lectine est marqué par exemple par un isotope radioactif, un marqueur fluorescent ou un marqueur d'amplification.

5. Kit pour la détermination in vitro dans un échantillon biologique donné, de la présence de cellules malignes, caractérisé en ce qu'il comprend une lectine endogène intervenant dans les réactions d'adhésion et/ou de reconnaissance intercellulaires ayant une affinité indépendante du calcium pour un site impliquant des résidus mannose au niveau de ligands glycanniques, cette lectine présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou des fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques, éventuellement marquée.

6. Kit selon la revendication 1, caractérisé en ce que la lectine est la CSL sous forme purifiée et active.

7. Kit selon la revendication 1, caractérisé en ce que la lectine est la lectine membranaire R1 sous forme purifiée et active.

8. Kit selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que l'échantillon biologique susceptible de contenir des cellules tumorales, est constitué par un extrait tissulaire, des cellules isolées, une coupe histologique de tissu ou une lignée cellulaire.

9. Kit selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que la lectine est marquée par un marqueur radioactif, par exemple l'iode.

10. Kit selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que la lectine est marquée par un marqueur fluorescent, par exemple le fluorophore.

11. Kit selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que la lectine est marquée par un système d'amplification, par exemple la biotine.

12. Procédé pour la détermination in vitro dans un échantillon biologique donné, de la présence de cellules malignes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes

- mise en intact de l'échantillon biologique testé, avec une quantité déterminée de lectines endogènes intervenant dans les phénomènes d'adhésion et/ou de reconnaissance intercellulaires, ayant une affinité indépendante du calcium pour un site impliquant des résidus mannose au niveau de ligands glycanniques, cette lectine présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou des fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques, cette lectine étant en outre marquée, dans des conditions permettant la réaction de ladite lectine marquée avec des ligands glycanniques;;

- élimination de la lectine n'ayant pas réagi avec les ligands;

- révélation de la présence de complexes du type lectine-ligand, caractéristiques de la malignité cellulaire;

- détermination de la quantité de ligands glycanniques ayant réagi.

13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la lectine endogène est la CSL purifiée, active.

14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la lectine endogène est R1.

15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que l'échantillon biologique testé est constitué par des cellules tumorales, un extrait tumoral, le cas échéant préparé sous la forme d'une coupe histologique.

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que les cellules tumorales ou l'extrait de tumeur sont solubilisés.

17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que l'échantillon biologique testé est préalablement fractionné par électrophorèse et transféré par électrotransfert.

18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est traité afin de dissoudre les protéines.

19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce que l'échantillon contenant les protéines dissoutes est déposé sur un filtre, par exemple un filtre de nitrocellulose.

20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16, caractérisé en que l'échantillon contenant les protéines dissoutes, est déposé sur une plaque de type ELISA.

21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 20, caractérisé en ce que les lectines sont marquées par un radioisotope, par exemple l'iode.

22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 20, caractérisé en ce que les lectines sont marquées par un marqueur fluorescent, par exemple le fluorophore.

23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 20, caractérisé en ce que les lectines sont marquées par un marqueur d'amplification tel que la biotine.