FR2623509A1

FR2623509A1 - Proteine de 17 kd a action angiogenique, son procede d'isolement a partir de lait de mammiferes, compositions therapeutiques la contenant, procede de detection et/ou de dosage et reactifs immunologiques de detection et de dosage des angiogenines de mammiferes, de leurs homologues et de leurs fragments

Info

Publication number: FR2623509A1
Application number: FR8715984A
Authority: FR
Inventors: Genevieve Spik; Andre Tartar; Jean Montreuil
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille; Institut Pasteur
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille; Institut Pasteur
Priority date: 1987-11-19
Filing date: 1987-11-19
Publication date: 1989-05-26
Anticipated expiration: 2007-11-19
Also published as: EP0342219A1; WO1989004837A1; US5171845A; FR2623509B1; AU619830B2; AU3370189A

Abstract

La présente invention est relative à une nouvelle protéine d'environ 17 KD, à action angiogénique, à son procédé d'isolement à partir de lait de mammifères, à des compositions thérapeutiques la contenant, à un procédé de détection et/ou de dosage des angiogénines de mammifères, de leurs homologues et de leurs fragments. Ladite protéine, d'origine bovine présentant une séquence de 125 amino-acides, dont 81 sont communs avec l'angiogénine humaine et ayant un poids moléculaire d'environ 17 KD, est extraite de lait de mammifère. Application à la détection des angiogénines de mammifères.

Description

La présente invention est relative à une nouvelle

protéine d'environ 17 KD, à action angiogénique, à son procé-

dé d'isolement a partir de lait de mammifères, a des composi-

tions thérapeutiques la contenant, a un procédé de détection et/ou de dosage, ainsi qu'à des réactifs immunologiques de détection et/ou de dosage des angiogénines de mammifères, de

leurs homologues et de leurs fragments.

A la suite du travail de pionnier de J. FOLKMAN (cf. J. Exp. Med., 133, 275 (1971)), qui a démontré que la croissance d'une tumeur requiert une alimentation sanguine

importante, celle-ci étant réalisée par la croissance conti-

nue de nouveaux vaisseaux sanguins; il a suggéré que cette croissance résulte de la présence d'une substance diffusible qu'il a dénommée "Tumor angiogenesis factor" (TAF), plusieurs protéines qui stimulent l'angiogénèse ont été isolées

(FOLKMAN et al., Science, (1987), 235, 442). Parmi ces subs-

tances, l'angiogénine, protéine d'origine humaine, a été pu-

rifiée par l'Equipe de VALLEE, de même que le clonage de son gène. En 1985, FETT J.W. et al.,(Biochem, (1985), 24,

5480-5486) ont isolé l'angiogénine humaine a partir de cellu-

les intestinales humaines cancéreuses en culture. Les cellu-

les intestinales HT 29 sécrètent l'angiogénine humaine dans le milieu de culture. A partir de ces milieux de culture ne renfermant pas de sérum, 0, 5 mg/litre d'angiogénine humaine a été isolée. L'équipe de VALLEE a déterminé la concentration en angiogénine tout d'abord par la méthode de Bradford (Anal. Biochem., 1975, 72, 248-254 méthode par fixation de colorant, en utilisant la SAB comme standard), puis par la méthode décrite dans Biochem, 1986, 25, 3527, 3732, par SHAPIRO et A1.. La séquence en amino-acides a été également précisée par STRYDOM et Al. (BIOCHEMISTRY (1985), 24, p.

5486-5494).

L'angiogénine humaine est une protéine dont la mas-

se moléculaire est de 14 400 D. L'angiogénine isolée de cellules tumorales humaines

comprend une seule chaîne protéinique comprenant 123 amino-

-2- acides et dont la séquence est la suivante:

Gln-Asp-Asn-Ser-Arg-Tyr-Thr-His-Phe-Leu-Thr-Gln-

His-Thr-Asp1l5-Ala-Lys-Pro-Gln-Gly-Arg-Asp-Asp-Arg-

Tyr-Cys-Glu-Ser-Ile-Met30-Arg-Arg-Arg-Gly-Leu-Thr-

Ser-Pro-Cys-Lys-Arg-Ile-Asn-Thr-Phe45-Ile-His-Gly-

Asn-Lys-Arg-Ser-Ile-Lys-Ala-Ile-Cys-Glu-Asn-Lys60-

Asn-Gly-Asn-Pro-His-Arg-Glu-Asn-Leu-Arg-Ile-Ser-Lys

Ser-Ser75-Phe-Gln-Val-Thr-Thr-Cys-Lys-Leu-His-Gly-

Gly-Ser-Pro-Trp-Pro90-Pro-Cys-Gln-Tyr-Arg-Ala-Thr-

Ala-Gly-Phe-Arg-Asn-Val-Val-Vall05-Ala-Cys-Glu-Asn-

Gly-Leu-Pro-Val-His-Leu-Asp-Gln-Ser-Ile-Phe120-Arg-

Arg-Prol23-OH L'amino-acide C-terminal est la proline; trois

ponts disulfure lient les cystéines 26-81, 39-92 et 57-107.

La séquence de l'angiogénine humaine est homologue a 35% de celle de la ribonucléase humaine pancréatique, en particulier en ce qui concerne les amino-acides essentiels à l'activité ribonucléolytique (cf. BIOCHEMISTRY, (1985), 24,

5494-5499. KURACHI et Al.). L'activité de l'angiogénine hu-

maine est importante, puisque 50 ng, soit 3,5 picomoles, sont

capables d'entraîner une vascularisation de la cornée de la-

pin et 35 fentomoles sont capables d'induire la vascularisa-

tion de l'embryon de poulet.

Il est connu de préparer l'angiogénine humaine par clonage. Le clonage du gène codant pour l'angiogénine humaine

permet de préparer des quantités satisfaisantes par l'inter-

médiaire de systèmes d'expression adéquats. Néanmoins, de

telles méthodes sont coûteuses.

Il s'est avéré nécessaire de rechercher un composé

qui présenterait des propriétés similaires à celles de l'an-

giogénine humaine et dont le procédé d'obtention serait plus

simple et moins coûteux.

La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à une nouvelle protéine présentant des -3-

propriétés similaires à celles de l'angiogénine humaine, ob-

tenue par des moyens peu coûteux et-faciles à mettre en oeu-

vre, permettant des rendements quantitatifs élevés.

C'est aussi un but de l'invention de pourvoir à un nouveau procédé d'obtention de ladite protéine, ne présentant pas les inconvénients des procédés de l'Art antérieur; en effet, ce nouveau procédé permet d'obtenir d'importantes quantités de la protéine en question à un coQt très bas, ce

qui, dans le cadre de la fabrication industrielle de composi-

tions pharmaceutiques contenant cette protéine, présente des

avantages importants.

C'est encore un but de l'invention de pourvoir à

des compositions pharmaceutiques contenant ladite protéine.

C'est également un but de l'invention de pourvoir à

un agent de détection et de dosage des angiogénines de mammi-

fères, de leurs homologues, de leurs fragments, dans des

fluides biologiques.

C'est en outre un but de l'invention de pourvoir à un kit de détection et de dosage des protéines susdites dans

lesdits fluides.

La présente invention a pour objet une protéine, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence qui comporte amino-acides, et répond à la formule I ci-après:

(I) Alal-Gln-Asp-Asp-Tyr5-Arg-Tyr-Ile-His-Phe10-

Leu-Thr-Gln-His-Tyr15-Asp-Ala-Lys-Pro-Lys20-

Gly-Arg-Asn-Asp-Glu25-Tyr-Cys-Phe-Asn-Met30-

Met-Lys-Asn-Arg-Arg35-Leu-Thr-Arg-Pro-Cys40 Lys-Arg-Arg-Asn-Thr45-Phe-IleHis-Gly-Asn50

Lys-Asn-Arg-Ile-Lys55-Ala-Ile-Cys-Glu-Asp60-

Arg-Asn-Gly-Gln-Pro65-Tyr-Arg-Gly-Asp-Leu70-

Arg-Ile-Ser-Lys-Ser75-Glu-Phe-Gln-Ile-Thr80-

Ile-Cys-Lys-His-Lys85-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg90-

Pro-Pro-Cys-Arg-Tyr95-Gly-Ala-Thr-Glu-Asn100-

Phe-Arg-Val-Ile-Val105-Val-Gly-Cys-Glu-Asn110

Gly-Leu-Pro--Val-Hisll5-Phe-Asp-Glu-Ser-Phet20-

Ile-Thr-Pro-Arg-His125-OH, -4- en ce que 81 amino-acides de sa séquence sont communs avec l'angiogénine humaine, et en ce que son poids moléculaire est

d'environ 17 KD.

La masse moléculaire a été évaluée en comparant la vitesse de migration électrophorétique de ladite protéine bo- vine à celle des témoins suivants: la myoglobine (P.M.: 17 200), la myoglobine 1 + 2 (P.M.: 14 600) , la myoglobine A (P.M.: 8 240), la myoglobine 2 (P.M.: 6 380), la myoglobine

3 (P.M.: 2 560) (Pharmacia).

Dans la composition de ladite protéine 17 KD, dé-

terminée après hydrolyse acide totale, les amino-acides sui-

vants sont présents dans les proportions ci-après: Phé: 7, Leu: 4, Ile: 9, Met: 2, Val: 4, Pro: 7, Ser: 5, Thr: 6, Ala: 4, Tyr: 6, His: 6, Glu(Gln) : 10,

Asp(Asn): 16, Lys: 9, Arg: 15, Gly: 9, Cys: 6.

Conformément à l'invention, ladite protéine est obtenue par extraction de lait de mammifères, notamment de

vache ou par clonage ou par voie de synthèse.

La présente invention a également pour objet des peptides qui constituent des fragments de la protéine 17KD conforme à l'invention, elle couvre en particulier: - un peptide qui présente la séquence suivante en aminoacides:

Glu-Asp60-Arg-Asn-Gly-Gln-Pro65-Tyr-Arg-Gly-Asp-

Leu70-Arg-Ile-Ser dont 9 restes sur 15 s'alignent sur la séquence 58-72 de

l'angiogénine humaine.

- un peptide qui présente la séquence suivante en amino-acides: Phe-AspGlu-Ser-Phe120-Ile-Thr-Pro-Arg-His125 et qui correspond au fragment C terminal de la protéine 17 KD - un peptide présentant la séquence suivante en amino-acides: Glu-Asn110-Gly-Leu-Pro-Val-His115-Phe -5- qui s'aligne sur la séquence 108-115 de l'angiogénine humaine, dans laquelle séquence 7 restes sur 8 sont identiques;

- un peptide présentant la séquence en amino-

acides suivante: Ile-Val105-Val-Gly-Cys-Glu dont 4 restes sur 6 s'alignent sur la séquence 103-108 de l'angiogénine humaine; - un peptide présentant la séquence suivante en amino-acides: Arg-Tyr-Ile-His-Phe1OLeu-Thr-Gln-His-Tyr15-Asp-Ala-Lys dont 11 restes sur 13 s'alignent sur la séquence 5-17 de l'angiogénine humaine - un peptide présentant la séquence suivante en amino-acides:

Asn-Thr45-Phe-Ile-His-Gly-Asn50-Lys,-

qui se distingue par une homologie totale avec la séquence

43-50 de l'angiogénine humaine.

- un peptide qui présente la séquence en amino-acides suivante: Ile-Lys55Ala-Ile-Cys-Glu, qui se distingue également par une homologie totale avec la

séquence 53-58 de l'angiogénine humaine.

- un peptide qui présente la séquence suivante en amino-acides: Leu70-ArgIle-Ser-Lys-Ser75-Glu-Phe-Gln dont 8 restes sur 10 s'alignent sur la séquence 69-77 de

1'angiogénine humaine.

La présente invention a également pour objet un

procédé d'obtention de ladite protéine conforme à l'inven-

tion, caractérisé en ce que ladite protéine est extraite de

lait de mammifère, notamment de vache.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du pro-

cédé conforme à l'invention, l'extraction de ladite protéine

est réalisée par chromatographie par échange de cations, sui-

vie d'une élution par un éluant approprié.

6- Selon une disposition avantageuse de ce mode de

mise en oeuvre, l'éluant est un sel alcalin d'un acide orga-

nique faible, notamment de l'acétate de sodium.

Selon une autre disposition avantageuse, la frac-

tion éluée est soumise à une deuxième chromatographie par

échange de cations.

La protéine ainsi isolée est purifiée par chroma-

tographie sur une colonne de gel-filtration.

La protéine ainsi purifiée est obtenue avec un ren-

dement de l'ordre de 0,5 mg/litre de lait.

En variante a ce mode de mise en oeuvre, préalable-

ment à l'extraction, le lait d'origine bovine est soumis à

une délipidation.

Selon une disposition avantageuse, la délipidation

est réalisée par centrifugation.

Selon une modalité avantageuse de cette disposi-

tion, la centrifugation est réalisée à 4000 g pendant 30 mn

et a une température de 4 C.

La présente invention a encore pour objet une com-

position thérapeutique qui comprend comme composé actif, la protéine 17 KD et/ou des fragments ou des homologues de celle-ci, notamment pour le traitement de troubles requérant l'inhibition ou l'augmentation de la croissance des vaisseaux sanguins. La présente invention a également pour objet un

réactif immunologique de détection ou de dosage des angiogé-

nines de mammifères, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe qui comprend des anticorps anti-protéine 17 KD, des anticorps anti- peptide, notamment des anticorps contre l'un

des peptides définis ci-dessus, lesquels anticorps étant uti-

lisés seuls ou en mélange.

La présente invention a également pour objet un

procédé de détection et de dosage des angiogénines de mammi-

fères dans des fluides biologiques, caractérisé en ce que

l'on fait réagir, dans des conditions appropriées, un anti-

7- corps anti-angiogénine, notamment un anticorps anti-protéine 17 KD ou un anticorps anti-peptide, conformes A l'invention

avec un fluide biologique supposé contenir ladite angiogéni-

ne, la lecture de la réaction étant effectuée par un moyen approprié, tel que notamment RIA, ELISA, Immunofluorescence. La présente invention a en outre pour objet un kit de détection et/ou de dosage, dans des fluides biologiques, d'angiogénine de mammifères et notamment de l'angiogénine humaine, caractérisé en ce qu'il comprend: - une quantité appropriée, éventuellement subdivisée en doses unitaires, d'anticorps antiangiogénine, en particulier d'anticorps anti-protéine 17 KD ou d'anticorps anti-peptide, notamment d'anticorps contre l'un des

peptides définis ci-dessus; -

- éventuellement une quantité appropriée de tampons,diluants,

réactifs, nécessaires A la mise en oeuvre de ladite détec-

tion et/ou dosage.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la

description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de pre-

paration de la protéine selon l'invention, ainsi qu'à un compte-rendu d'expérimentations effectuées: - pour démontrer l'homologie angiogénine humaine/

protéine 17 KD d'origine bovine, selon l'inven-

- tion; - pour démontrer l'homologie avec la ribonucléase; - pour démontrer l'activité sur l'angiogénèse de

ladite protéine 17 KD d'origine bovine.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exem-

ples et ce compte-rendu d'expérimentations sont donnés uni-

quement à titre d'illustration de l'objet de l'invention dont

ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE A: EXTRACTION DE LA PROTEINE 17 KD DU LAIT DE VACHE

litres de lait de vache sont délipidés par cen-

trifugation (4 000 xg - 30 mn - 4 C) et chromatographiés sur -8-

une colonne de SP-Sephadex C50 (10 x100 cm) (Pharmacia).

La colonne est lavée par 10 1 d'une solution d'acé-

tate de sodium 0,35 M pH 7, puis est éluée par 5 1 d'acétate

de sodium 1,5 M pH 8. La solution obtenue est diluée de ma-

nière à obtenir une concentration en acétate de sodium 0,2 M. Cette solution est chromatographiée sur une colonne de S-Sepharose Fast Flow (10 x 100 cm) (Pharmacia) préalablement équilibrée avec de l'acétate de sodium 0,22 M pH 6,5. Après

lavage de la colonne par la même solution d'acétate, l'élu-

tion de la protéine est réalisée par un litre d'une solution d'acétate de sodium 0,4 M. Cette solution est dessalée par chromatographie de

gel-filtration sur une colonne de Bio-gel P-30 (4 x 100 cm).

Après élution de la colonne à l'eau, la fraction ren-

fermant la protéine est chromatographiée sur une colonne de Phényl Superose HR5/5 (Pharmacia) par F.P.L.C. (Fast Protein Liquid Chromatography). L'élution est réalisée à l'aide d'un

gradient obtenu en mélangeant le tampon A: Phosphate de so-

dium 50 mM, sulfate d'ammonium 1,7 M pH 7, avec le tampon B: phosphate de sodium 50 mM pH 7 (temps O minute: 100 % TpA;

temps 15 minutes: 100 % TpA; temps 40 minutes: 0 % TpA).

La Figure 1 annexée représente le diagramme d'élu-

tion de la protéine 17 KD de la colonne de Phényl Superose,

avec en abscisse le temps en minutes, et en ordonnée les den-

sités optiques. Le pic 2 renferme la protéine 17 KD pure. Le

rendement est de 25 mg de protéine, soit 0,5 mg/l de lait dé-

lipidé. TESTS

EXEMPLE 1: HOMOLOGIE ANGIOGENINE HUMAINE/PROTEINE 17 KD

Les données dont nous disposons sur la protéine 17 KD font apparaître sa parenté avec l'angiogénine humaine; en effet, 81 amino-acides sont communs aux deux protéines

L'analyse en amino-acides, évaluée pour l'angio-

génine humaine et déterminée après hydrolyse acide totale pour la protéine 17 KD d'origine bovine (Tableau I ci-après) 9- montre que les deux protéines possèdent des compositions très proches.

TABLEAU I

ANALYSE COMPAREE DES AMINO-ACIDES DE

L'ANGIOGENINE HUMAINE ET DE LA PROTEINE

17 KD D'ORIGINE BOVINE

HU BO

Phe 5 7 Leu 6 4 Ile 7 9 Met 1 2 Val 5 4 Pro 8 7 Ser 9 5 Thr 8 6 Ala 5 4 Tyr 3 6 His 6 6 Glu(Gln) 10 10 Asp(Asn) 14 16 Lys 7 9 Cys 6 6

Trp 1 -

Arg 14 15 Gly 8 9 Total*: 116 119 * sans Cys et Trp

La comparaison des séquences de l'angiogénine hu-

maine et de la protéine 17 KD d'origine bovin qui figure au Tableau II ciaprès, montre une homologie supérieure à

60 %. La plupart des différences sont le résultat de rempla-

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cements conservatifs.

Les 6 restes cystéines sont en même position, cequi indique une structure tertiaire similaire à celle de l'angiogénine humaine, un seul espacement est nécessaire dans la région C-terminale pour l'alignement; seulement les zones

N et C terminales sont responsables de la différence de tail-

le entre les deux protéines (la protéine 17 KD a deux amino-

acides de plus que l'angiogénine humaine).

Cependant, à la différence de l'angiogénine humai-

ne, qui a, en position N-terminale, un acide pyroglutamique,

la protéine 17 KD d'origine bovine a une alanine supplémen-

taire en position N-terminale.

Cette différence s'explique par la présence d'un peptide signal de 24 (ou 22) amino-acides (FETT J. et al. Biochem., (1985), 24, 5480), révélé par le séquençage des cDNA codant pour l'angiogénine humaine; la suppression de ce peptide se produit lors du traitement par la peptidase signal, qui clive entre l'alanine et la glutamine dans:

Pro-Pro-Thr-Leu-Ala-1-Glu+l-Asp-Asn..., dans l'an-

giogénine humaine, alors que la présence de l'alanine N-ter-

minale, en ce qui concerne la protéine 17 KD d'origine bovi-

ne, est due au déplacement de la liaison clivée par la pepti-

dase signal, laissant ainsi une alanine supplémentaire en po-

sition N-terminale, évitant la modification en acide pyroglu-

tamique observée dans l'angiogénine humaine.

La séquence de la protéine 17KD telle qu'elle figu-

re au Tableau II, ci-après, a été déterminée par les techni-

ques classiques de séquençage des protéines.

o NO

TABLEAU II

SEQUENCES COMPAREES PROTEINE 17 KD/ANGIOGENINE

Proteltie l J GD ",.0 ditp ltj Ar) q lie tl h I u. ah Ctn th, tgyrà* ib hsn% pré) PheIr8q nszr'd)t Angio,pjnine h'umaLine1, n l'iln Oséht Phet iP, Ih r tiln Hhrl#tuplof |lh.9 h lu Oet tIlm,# Pkgre nL_9.#, 4% 50% 60 6'* 74Ji Protéine17KD fi ro rtIgbag Z T rie il,ely g-Ttn tlhsn Arg rit dl 0.1. / hdv Ang ^ og nine huTma lnelleu Vh, J. ri I. hi.s fiitq 11.[tr lr Pn Il lle til h Hsn t Jlhr $eA|sIe tif Hl ie.ll L yJsn GhiJ#sn, iIL.t&lu #in, _I Protéine 17 KD i"rg lie %-r' b1ill 'l Golu.]le lp. lie "e' lle[CyiH Iyr, N-$ H lGj Clg ['Ger tber'%rgi l p,o Pro ód-r'b7l CI'Yó #sli|w,;4 l ll nlo i Arigiogdlil ne humaine' flrj" lie *er ttS '4r'fbe 1nJU olllrtwilCs (liqs &diO #JItGhi Glu Set|Pro topipreo Pro cs Gin LuJdr l!igif A* rAi. l|wh, #,JJ#tn Uliel Protdtine 17 KD WIIlC's cu nr' Cly ' reu" ro- Uel t Gi..lPhWr-Glur-Flerlïlhr Prorl mis

An-lioj-ininrF humaine imlcul Gl. an ty leu Pro Ul, tl!lieu..S. Phll nLg r.

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EXEMPLE 2 - HOMOLOGIE AVEC LA RNAse: R. SHAPIRO et al. (Biochem, (1986), 25, 3527-3532) ont montré que, en pratique, tous les restes de la séquence du site actif de la RNAse bovine sont conservés dans l'angiogénine humaine.

De plus, l'observation qu'un inhibiteur de la ri-

bonucléase humaine supprime à la fois l'activité angiogénique et ribonucléolytique de l'angiogénine humaine, confirme que

l'homologie angiogénine/RNAse est fonctionnellement signifi-

cative.

Les résultats suivants confirment ces observa-

tions (Tableau III, ci-après): - la prot6ine 17 KD d'origine bovine partage une homologie

similaire avec la RNAse bovine (39 % des restes étant iden-

tiques), à celle de l'angiogénine humaine pour la RNAse hu-

maine (34 % des restes étant identiques).

- mise à part la mutation Arg/Ile en position 43 et deux substitutions conservatives (Asp-69 pour Asn-68 et Phe 116 pour Leu-115), tous les restes qui sont connus pour être impliqués dans l'activité ribonucléolytique sont preserves, tant dans l'angiogénine humaine que dans la protéine 17 KD d'origine bovine, indiquant une forte pression sélective

pour le maintien de cette homologie fonctionnelle significa-

tive (Tableau III).

La substitution de la Leu-115 de l'angiogénine

humaine par la Phe-116 de la protéine 17 KD d'origine bovi-

ne est d'un intérêt particulier: il a été montré, par exemple, que dans la RNAse, le remplacement de Phe par Leu

faisait chuter l'activité d'un facteur 10. Ainsi, la pré-

sence de Phe-116 dans la protéine 17 KD, sous réserve que

l'activité RNAse soit directement impliquée dans son ac-

tivité biologique, pourrait être une indication d'une

activité supérieure à celle de l'angiogènine humaine.

- basée sur son homologie avec la ribonucléase A pancréa-

tique: la structure tridimensionnelle de l'angiogénine

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humaine a été évaluée lorsque les sites, sur lesquels les mutations ont porté, sont rapportés sur cette structure;

en ce cas, on peut observer que, à l'exception de la muta-

tion Arg/Ile en position 43, toutes les substitutions qui surviennent dans la structure spatiale de la protéine, im-

pliquées dans son activité ribonucléolytique, sont des sub-

stitutions conservatives.

/ / / / o

TABLEAU III

O HOMOLOGIES ANGIOGENINE HUMAINE/PROTEINE 17 KD ET

*RNases BOVINE/HUMAINE

K E T A A A KF P R M D S T S A A S S S N Y NQM V K S

A, D Y i Y -1 H F L 'o Q P Y D A K ' N D I-:YCI F N M M K N AIro.t',itie Humane KN S R Y T F Q 1' TD A K P(! > RD '.LY (FS.MkR aiscôulne Humaine XS RNar'f,. 1,,,maineK EsKK _iMDsD s sP s s s s TNMR

N N ILT K1KPN TF V H GSV. A D V O A V C S OV A

k rot#i.rtol 17 KD flR T R P C K VR N T F 1H G N K N D TK AI 1 GK N}< N G Q IeNans- 1%maisieRN MTQ F CKP VT H P LVD V Q N V C ? QYK V *1 C KN GTQ NCy TYDTMCTDI- T CE K Y RN.E";4} Ita)ville 4 _ r-. e L ms_ SKY7 Nf' Irtilsw I' Kn P YMRG _ ATS tC S EF C2 T I C K Fi K jC G S; S R P L) C IA ne Humaine THE N L S s T C K' G SW P l C RNa-,pHIumaine CK G G C KNS HI DLR N SY iN Asnili,,,,:l,ni iluma] inre IRIGII TI IP -C K N T Q G N C Y S M H A V E T N GI R Y N.,.s, -, BoVn LcD. R AS KVlI'TC.,li I I lNase Ilvrl J A N K Hl 11ACGN VP HF P'r-)te".in,. 17 KDCTEN VIV C -(-V F ISMT II Aqiie(1',,ii," Ilumain Y A Gr RIN VlV V[A C E - N G -i P V HE1DQS-LjF RQ N.,.,..,,,,,,,,,,, m ' J- ER 'à S P K H s. Y v.A v,i- ALJV E: D S

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EXEMPLE 3 - PROPRIETES BIOLOGIQUES DE LA PROTEINE 17 KD

D'ORIGINE BOVINE.

- Test de la membrane chorio-allantoïque de l'oeuf de la poule: Ce test d'activité biologique a été décrit par FETT et al.(Biochem, (1985), 24, 5480-5486). Ce test consiste à apprécier le développement de vaisseaux sanguins au niveau de la membrane chorio-allantoique de l'embryon de Poulet après application de quantités croissantes de protéine 17 KD d'origine bovine de l'ordre de 10 ng à 1 ig. Sur 80 oeufs fécondés qui ont été expérimentés en présence de la protéine 17 KD, il a été observé un développement de nouveaux vaisseaux sanguins dans 62 oeufs pour une quantité d'angiogénine de 50 ng. Ces résultats démontrent que la protéine 17 KD selon l'invention possède un effet sur

l'organogenèse et la croissance des vaisseaux sanguins.

Les oeufs fécondés sont placés dans une couveuse

à 38 C en atmosphère à 70 % d'humidité.

Après 3 jours, une fenêtre est ouverte dans la

coquille et est fermée par une membrane perméable aux gaz.

Au 5ème jour, un disque d'une membrane imbibée de la solution de protéine 17 KD est implanté sur la membrane chorio-allantoique. Le développement des vaisseaux sanguins qui convergent vers le disque imbibé d'angiogénine est suivi à la

loupe binoculaire au 8ème, 9ème et 10ème jours.

La protéine 17 KD d'origine bovine conforme à l'invention peut être utilisée sous une forme pharmaceutiquement acceptable pour le traitement des troubles requérant l'inhibition ou l'augmentation de la croissance des

vaisseaux sanguins chez l'Homme.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon explicite; elle en embrasse au contraire toutes les

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variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la

présente invention.

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Claims

REVENDICATIONS 1') Protéine, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence qui comporte 125 amino-acides, et répond à la formule I ci-après: Ala1-GlnAsp-Asp-Tyr5-Arg-Tyr-Ile-His-Phe1O- Leu-Thr-Gln-His-Tyr15-Asp-Ala-Lys-Pro-Lys20- Gly-Arg-Asn-Asp-Glu25-Tyr-Cys-Phe-Asn-Met30- Met-Lys-Asn-Arg-Arg35-Leu-Thr-Arg-Pro-Cys40 (I) Lys-Arg-Arg-Asn-Asn-Thr45Phe-Ile-His-Gly-Asn50 Lys-Asn-Arg-Ile-Lys55-Ala-Ile-Cys-Glu-Asp60- Arg-Asn-Gly-GIu-Pro65-Tyr-Arg-Gly-Asp-Leu70- Arg-Ile-Ser-Lys-Ser75-Glu-Phe-Gln-Ile-Thr80- Ile-Cys-Lys-His-Lys85-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg90- Pro-Pro-Cys-Arg-Tyr95-Gly-Ala-Thr-Glu-Asn100- Phe-Arg-Val-Ile-Val105-Val-Gly-Cys-Glu-Asn1 0 Gly-Leu-Pro-Val-His115-Phe-Asp-Glu-Ser-Phe120- Ile-Thr-Pro-Arg-His125-OH, en ce que 81 amino-acides de sa séquence sont communs avec l'angiogénine humaine et en ce que son poids moléculaire est d'environ 17 KD.

2 ) Protéine selon la revendication 1, caractérisée

en ce qu'elle est obtenue par extraction de lait de mammifè-

res, notamment de vache.
3 ) Protéine selon-la revendication 1, caractérisée

en ce qu'elle est obtenue par clonage.

4') Protéine selon la revendication 1, caractérisée

en ce qu'elle est obtenue par voie de synthèse.

) Peptide, caractérisé en ce qu'il constitue un

fragment de la protéine selon l'une quelconque des revendica-

tions 1 à 4 et en ce qu'il présente la séquence suivante en amino-acides:

Glu-Asp6 0-Arg-Asn-Gly-Gln-Pro-Tyr-Arg-Gly-Asp-

Leu70-Arg-Ile-Ser dont 9 restes sur 15 s'alignent sur la séquence 58-72 de

l'angiogénine humaine.

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6 ) Peptide, caractérisé en ce qu'il constitue le fragment C-terminal de la protéine selon l'une quelconque des

revendications 1 à 4 et en ce qu'il présente la séquence en

amino-acides suivante: Phe-Asp-Glu-Ser-Phe120-Ile-Thr-Pro-Arg-His125 7>) Peptide, caractérisé en ce qu'il constitue un

fragment de la protéine selon l'une quelconque des revendica-

tions 1 à 4 et en ce qu'il présente la séquence suivante en amino-acides: Glu-Asn110-Gly-Leu-Pro-Val-His1l5-Phe dont 7 restes sur 8 s'alignent sur la séquence 108-115 de

l'angiogénine humaine.
8 ) Peptide, caractérisé en ce qu'il constitue un

fragment de la protéine selon lune quelconque des revendica-

tions 1 à 4 et en ce qu'il présente la séquence en amino-

acides suivante: Ile-Val105-Val-Gly-Cys-Glu dont 4 restes sur 6 s'alignent sur la séquence 103-108 de

l'angiogénine humaine.
9 ) Peptide, caractérisé en ce qu'il constitue un

fragment de la protéine selon l'une quelconque des revendica-

tions 1 à 4 et en ce qu'il présente la séquence suivante en amino-acides: Arg-Tyr-Ile-His-Phe10-Leu-Thr-Gln-His-Tyr15-Asp-Ala-Lys dont 11 restes sur 13 s'alignent sur la séquence 5-17de

l'angiogénine humaine.

) Peptide, caractérisé en ce qu'il constitue un

fragment de la protéine selon l'une quelconque des revendi-

cations 1 à 4 et en ce qu'il présente la séquence suivante en aminoacides: Asn-Thr45-Phe-Ile-His-Gly-Asn50-Lys, qui se distingue par une homologie totale avec la séquence

43-50 de l'angiogénine humaine.
11 ) Peptide, caractérisé en ce qu'il constitue un

fragment de la protéine selon l'une quelconque des revendi-

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cations 1 à 4 et en ce qu'il présente la séquence suivante en aminoacides: Ile-Lys55-Ala-Ile-Cys-Glu, qui se distingue également par une homologie totale avec la séquence 53-58 de l'angiogénine humaine. 12 ) Peptide, caractérisé en ce qu'il constitue un

fragment de la protéine selon l'une quelconque des revendi-

cations 1 à 4 et en ce qu'il présente la séquence suivante en aminoacides: Leu70-Arg-Ile-Ser-Lys-Ser75-Glu-Phe-Gln dont 8 restes sur 10 s'alignent sur la séquence 69-77 de

l'angiogénine humaine.
13 ) Procédé d'obtention de la protéine selon l'une

quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que

ladite protéine est extraite de lait de mammifère, notamment

de vache.
14 ) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'extraction est réalisée par chromatographie par

échange de cations, suivie d'une élution par un éluant appro-

prié.

) Procédé selon l'une quelconque des revendica-

tions 13 et 14, caractérisé en ce que l'éluant est un sel al-

calin d'un acide organique faible, notamment de l'acétate de

sodium. -
16 ) Procédé selon l'une quelconque des revendica-

tions 13 à 15, caractérisé en ce que la fraction éluée est

soumise à une deuxième chromatographie par échange de ca-

tions, suivie d'une deuxième élution par un éluant approprié.

17e) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'éluant est un sel alcalin d'un acide organique

faible, notamment de l'acétate de sodium.
18 ) Procédé selon l'une quelconque des revendica-

tions 13 à 17, caractérisé en ce que le produit obtenu est

purifié par chromatographie sur colonne de gel-filtration.
19 ) Procédé selon la revendication 13, caractérisé

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en ce que le lait est préalablement délipidé par centrifuga-

tion. ) Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend comme composé actif, la protéine 17 KD selon

l'une quelconque des revendications 1 à 4 et/ou des fragments

ou des homologues de celle-ci.
21 ) Réactif immunologique de détection ou de dosage des angiogénines de mammifères, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe qui comprend des anticorps contre la

protéine 17 KD selon l'une quelconque des revendications 1 à

4, des anticorps anti-peptide, notamment des anticorps contre

l'un des peptides selon l'une quelconque des revendications 5

à 12, lesquels anticorps sont utilisés seuls ou en mélange.
220) Procédé de détection et de dosage des angiogé-

nines de mammifères dans des fluides biologiques, caractérisé en ce que l'on fait réagir, dans des conditions appropriées,

un anticorps anti-angiogénine, notamment un anticorps anti-

protéine 17 KD ou un anticorps anti-peptide, selon la reven-

dication 21, avec un fluide biologique supposé contenir ladi-

te angiogénine, la lecture de la réaction étant effectuée par

un moyen approprié, tel que notamment test RIA, ELISA, d'im-

munofluorescence. 23e) Kit, ou coffret, ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi, pour la détection et/ou le dosage, dans des fluides biologiques, d'angiogénines de mammifère et notamment de l'angiogénine humaine, caractérisé en ce qu'il comprend: - une quantité appropriée, éventuellement subdivisée en doses

unitaires, d'anticorps anti-angiogénine, notamment d'anti-

corps anti-protéine 17 KD ou d'anticorps anti-peptides

selon la revendication 21.

- éventuellement une quantité appropriée de tampons, di-

luants, réactifs, nécessaires à la mise en oeuvre de

ladite détection et/ou dosage.