FR2606515A1 - Procede pour l'isolement d'un nouvel agent viral et de l'antigene qui lui est associe, agent viral et antigene obtenus par ce procede et procede de detection dudit antigene a l'aide d'un reactif immunologique approprie - Google Patents
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Abstract
NOUVEL AGENT VIRAL PURIFIE IMPLIQUE DANS L'HEPATITE VIRALE NON-A NON-B, AUSSI BIEN EPIDEMIQUE QUE SPORADIQUE, DEFINI PAR LE PROFIL DE REPARTITION DE SON ACTIVITE ANTIGENIQUE, QUI COMPORTE AU MOINS UNE BANDE A UNE DENSITE DE 1,29-1,32 GCM ETOU AU MOINS UNE BANDE A UNE DENSITE DE 1,17-1,19 GCM, ET L'ANTIGENE ASSOCIE A CET AGENT VIRAL. PROCEDE D'ISOLEMENT DUDIT AGENT VIRAL ET DE L'ANTIGENE QUI LUI EST ASSOCIE. PROCEDE DE DETECTION D'ANTIGENE NON-A NON-B PRESENT DANS LES FECES DE PATIENTS ATTEINTS D'HEPATITE VIRALE NON-A NON-B.
Description
La présente invention est relative à l'isolement et à la caractérisation d'un agent viral impliqué dans l'h4pati- te non-A non-B tant épidémique que sporadique.
L'hépatite virale peut être causee par le virus de l'hépatite A (HAV), par le virus de l'hépatite B (HBV) et par un nombre inconnu de virus d'hépatite non-A non-B (NANB) non encore identifiés. Actuellement dans les pays développés dans lesquels la prophylaxie de 1'HBV est efficace, les NANB sont la cause la plus importante d'hépatite infectieuse conduisant à l'hospitalisation. Cette maladie est considérée comme impliquant au moins trois virus : deux sont transmis par le sang contaminé et les produits de sang contaminé; pour le troisième qui est à l'origine de l'hépatite NANB épidémique, l'inventeur a pu établir qu'il est également responsable de 50 à 60% des cas d'hépatites nécessitant une hospitalisation, rapportés dans les pays occidentaux et son mode de transmission est inconnu.Dans les pays en voie de développement, le
NANB semble également associé à des épidémies à grande échelle liées à un mode de transmission fécal-oral véhiculé par l'eau. Actuellement cinq cas d'épidémies de ce type ont été rapportés depuis 1980 : en Inde, en Sibérie, au Népal, en Algérie et récemment en Côte d'Ivoire. Dans tous ces cas, un taux de mortalité élevé a été observé parmi les femmes enceintes.
NANB semble également associé à des épidémies à grande échelle liées à un mode de transmission fécal-oral véhiculé par l'eau. Actuellement cinq cas d'épidémies de ce type ont été rapportés depuis 1980 : en Inde, en Sibérie, au Népal, en Algérie et récemment en Côte d'Ivoire. Dans tous ces cas, un taux de mortalité élevé a été observé parmi les femmes enceintes.
Nos connaissances actuelles concernant les virus qui sont à l'origine de l'hépatite NANB sont d'une imprécision décourageante et sont limitées à des données cliniques et épidémiologiques. Des agents filables ont nettement été isolés s par inoculation de sang ou de produits sanguins provenant de sujets souffrant d'hépatite NANB post-transfusionnelle à des chimpanzés et des produits sanguins infectieux sont disponibles. En ce qui concerne l'hépatite NANB épidémique, très peu d'infections expérimentales ont été réalisées l'infection s'est avérée transmissible aux ouistitis (Saguinus mystax), aux singes macaques (tiacecus cynomolgus) et à un volontaire humain et récemment à des singes verts africains (Cercopithecus aethops et Erythrocebus patas), mais aucune préparation infectieuse définie n'a été proposée.
En ce qui concerne l'hépatite post-transfusionnelle, en dépit de la pléthore de rapports sur des systèmes antigène-anticorps NANB, des modifications ultrastructurales et des particules analogues à des virus, tous potentiellement prometteurs, aucun système ou virus qui remplisse les crité- res sérologiques acceptés pour une association causale spécifique, n'a été identifié. En ce qui concerne l'hépatite épidémique, des particules analogues à des virus, de forme sphérique et de 27 nm de diamètre ont été visualisées dans de très rares fèces et la caractérisation immunologique a été médiocrement réalisée par agglutination au microscope électronique. La réplication virale n'a jamais été obtenue dans des cultures cellulaires pour quelque virus NANB que ce soit.
La Demande de Brevet français nO 86 05437 au nom de 1'INSTITUT PASTEUR, avec Monsieur PILLOT pour Inventeur, a pour objet un réactif propre à permettre la détection d'hépatites virales NANB épidémiques et un procédé de diagnostic mettant en oeuvre ce réactif; le réactif conforme à cette Demande de Brevet est constitué par des IgM anti-NANB isolées de sérums de singes infectés artificiellement par des extraits de fèces de patients connus pour être atteints d'hépatite NANB épidémique, lesquelles IgM anti-NANB sont avantageusement fixées sur des supports solides tels que, notamment, des plaques de PVC.
La poursuite de ses recherches à partir de l'invention objet de la Demande de Brevet précitée a permis à l'Inventeur d'atteindre les buts suivants 1') I1 a infecté des singes dont il a utilisé les anticorps
(Ac), ainsi que les Ac de convalescents humains, pour
développer un test ELISA pour la détection spécifique
d'antigènes (Ag) associés avl virus et la détection des Ac anti-viraux; 2o) L'Inventeur a réussi à répliquer le virus dans une lignée
continue de cellules hépatocytaires avec une bonne pro
duction de matériel antigénique;; 3g) Il est parvenu d visualiser des particules virales dans
des préparations purifiées d'échantillons de fèces et
dans des lignées d'hépatocytes infectées; 40) Il a pu établir l'implication du même agent causal dans
l'hépatite virale NANB aussi bien épidémique que sporadi
que.
(Ac), ainsi que les Ac de convalescents humains, pour
développer un test ELISA pour la détection spécifique
d'antigènes (Ag) associés avl virus et la détection des Ac anti-viraux; 2o) L'Inventeur a réussi à répliquer le virus dans une lignée
continue de cellules hépatocytaires avec une bonne pro
duction de matériel antigénique;; 3g) Il est parvenu d visualiser des particules virales dans
des préparations purifiées d'échantillons de fèces et
dans des lignées d'hépatocytes infectées; 40) Il a pu établir l'implication du même agent causal dans
l'hépatite virale NANB aussi bien épidémique que sporadi
que.
La présente invention s'est donné pour but l'identification et la caractérisation d'un nouvel agent viral, ainsi que d'un antigène NANB associé à ce nouvel agent viral et une méthode de diagnostic d'hépatite NANB aussi bien épidémique que sporadique, par détection de l'Ag associé au virus de NANB, en utilisant les anticorps qui font l'objet de la Demande de Brevet INSTITUT PASTEUR précitée ou par recherche des Ac du malade, en utilisant le virus ou ses fractions adsorbé sur un support adéquat.
La présente invention a pour objet un nouvel agent viral purifié impliqué dans l'hépatite virale NANB aussi bien épidémique que sporadique, caractérisé en ce qu'il présente un profil de répartition de son activité antigénique qui comporte au moins une bande à une densité de 1,29-1,32 g/cm3 et/ou au moins une bande à une densité de 1,17-1,19 g/cm3 qui est un produit dérivé de la première bande.
Selon un mode de réalisation de l'agent viral purifié impliqué dans l'hépatite NANB épidémique ou sporadique, celui-ci est isolé de fèces d patients atteints d'hépatite NB, par centrifugation et filtration à travers un filtre dont la porosité est de l'ordre de 0,22 pm.
Selon un autre mode de réalisation de l'agent viral impliqué dans l'hépatite NANB épidémique ou sporadique, celui-ci est obtenu à partir d'hépatocytes ou de lignées continues d'hépatocytes, inoculés par de l'extrait de fèces d'un malade atteint d'hépatite NANB ou par un extrait de foie d'un singe infecté.
Selon encore un autre mode de réalisation de l'agent viral impliqué dans l'hépatite NANB épidémique ou sporadique, ledit agent viral auquel est associé l'antigène spécifique, se présente sous la forme de particules virales sphériques de deux type principaux, à savoir des particules d'environ 75 nm de diamètre et des particules de l'ordre de 25 à 30 nm de diamétre, les premières étant majoritairement présentes dans les fractions d'un gradient de CsCl de densité variant entre 1,1 et 1,6 g/ml, dont la densité est comprise entre 1,29 et 1,32 g/cm3 et les fractions à 40-41,5% d'un gradient de saccharose de concentrations variant de 10 à 60% poids/volume et les secondes étant majoritairement présentes dans les fractions du gradient de CsCl de densité comprise entre 1,17 et 1,19 g/cm3 et les fractions à 26-28% dudit gradient de saccharose.
La présente invention a également pour objet un antigène associé au virus NANB défini plus haut, caractérisé en ce qu'il est obtenu par traitement d'un agent viral isolé de fèces de patients, cultivé sur des hépatocytes infectés par le virus de l'hépatite NANB, par des agents de dissociation physiques ou chimiques.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'antigène associé au virus NANB, susdit, ledit antigène est obtenu par traitement aux ultra-sons d'un agent viral isolé de lignées cellulaires continues d'hépatocytes infectés par le virus de l'hépatite N IB.
Selon un autre mode de réalisation de l'antigène associé au virus UM;B, son profil de répartition dans un gradient de CsCl se présente sous la forme d'une bande à une densité de 1,17-1,19 g/cm3 et/ou d'une bande de densité 1,29-1,32 et l'antigène est présent après ultra-centrifugation des fractions de CsCl dans un gradient de saccharose, dans la fraction à 26-288 du gradient de saccharose pour la première bande et dans la fraction à 40-41,5% du gradient de saccharose pour la seconde brande.
La présente invention a, de plus, pour objet un procédé d'isolement d'un agent viral impliqué dans l'hépatite virale NANB tant épidémique que sporadique, qui est caractérisé en ce que des fèces de patients atteints d'hépatite NANB sont soumises à un traitement de centrifugation, suivi d'un traitement de filtration à travers un élément filtrant dont la porosité est de l'ordre de 0,22 pm, pour extraire ledit agent viral des féces.
Selon un mode de mise en oeuvre du procédé d'isolement de l'agent viral susdit, le traitement de centrifugation est avantageusement constitué par une opération de centrifugation à 5000 - 8000 g environ pendant 10 minutes environ.
Selon un autre mode de mise en oeuvre du procédé d'isolement de l'agent viral susdit, préalablement aux opérations de centrifugation et de filtration susdites, l'extrait de fèces est soumis à un traitement par ultra-sons.
La présente invention a également pour objet un autre procédé d'obtention de l'agent viral susdit, qui est caractérisé en ce que des hépatocytes ou des lignées cellulaires continues d'hépatocytes sont inoculés par un extrait de fèces d'un patient atteint d'hépatite NANB ou par un extrait de foie d'un singe (de préférence Saimiri) inoculé par un extrait de fèces de patients souffrant d'hépatite NAlZB, et cultivés jusqu'à confluence de la culture, à partir de laquelle est réalisée une sous-culture, qui est centrifugée après plusieurs passages, pour recueillir l'agent viral recherché.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé, le culot de centrifugation est repris par un tampon approprié pour être soumis à un traitement par ultra-sons qui libère dans le surnageant, 1'Ag NANB.
La présente invention a en outre pour objet un procédé de détection d'antigène NANB présent dans les fèces de patients atteints d'hépatite virale NANB tant épidémique que sporadique, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre des immunoglobulines isolées de sérum de patients convalescents, ou de singes préalablement infectés par le virus de l'hépatite
NANB, qui sont incubées avec des extraits de fèces de mammifères présumés atteints d'hépatite virale NANB, pour former un immuncomplexe antigène-anticorps qui est révélé à l'aide d'un test de détection approprié de la présence de l'antigène
NANB dans lesdites fèces, tel qu'un test ELISA ou un test radioimmunologique, notamment.
NANB, qui sont incubées avec des extraits de fèces de mammifères présumés atteints d'hépatite virale NANB, pour former un immuncomplexe antigène-anticorps qui est révélé à l'aide d'un test de détection approprié de la présence de l'antigène
NANB dans lesdites fèces, tel qu'un test ELISA ou un test radioimmunologique, notamment.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de détection d'antigène NANB dans les fèces de patients atteints d'hépatite NANB, celui-ci est caractérisé en ce que des extraits de fèces de mammifères présumés infectés par le virus NANB, obtenus par centrifugation et filtration des fèces de ces mammifères, sont incubés avec une fraction d'IgM anti-NANB isolée de sérums de patients ou de singes infectés artificiellement par des extraits de fèces de patients humains connus pour être atteints d'hépatite NANB, laquelle fraction est fixée sur un support solide, puis avec une fraction d'IgG immune anti-virus NANB purifié selon l'invention, d'un mammifère, de la même espèce ou d'une espèce voisine, marquée avec un marqueur enzymatique tel que la B-galacto- sidase ou la peroxydase, la réaction étant développée à l'aide d'un substrat révélateur approprié tel que l'orthonitro phényl-ss-D-galactopyranoside ou 1 'orthophénylène-diamine, en tampon acide. Le marquage peut être fait également avec un élément fluorescent ou radioactif selon les méthodes connues de l'homme de l'Art.
Conformément à l'invention, des souches de l'agent viral conforme à l'invention, isolées comme décrit dans ce qui précède et ci-après, et caractérisées comme indiqué plus loin, ont été déposées auprès de la COLLECTION NATIONALE DE
CULTURE DE MICROORGANISMES tenue par 1'INSTITUT PASTEUR, en date du 30 Octobre 1986, à savoir
- une souche d'agent viral isolé de fèces d'un ma
lade atteint d'hépatite NANB sporadique, dite
"Souche Clamart", qui a été affectée du Numéro de
dépôt : I-617,
- une souche d'un agent viral isolé de fèces d'un
malade atteint d'hépatite NANB épidémique, dite
Souche ivoirienne", qui a été affectée du Numéro
de dépôt : I-616.
CULTURE DE MICROORGANISMES tenue par 1'INSTITUT PASTEUR, en date du 30 Octobre 1986, à savoir
- une souche d'agent viral isolé de fèces d'un ma
lade atteint d'hépatite NANB sporadique, dite
"Souche Clamart", qui a été affectée du Numéro de
dépôt : I-617,
- une souche d'un agent viral isolé de fèces d'un
malade atteint d'hépatite NANB épidémique, dite
Souche ivoirienne", qui a été affectée du Numéro
de dépôt : I-616.
Selon un mode de mise en oeuvre du procédé de détection des anticorps présents dans le sang du malade ou du convalescent ou dans des produits utilisés en transfusion sanguine ou dans des fractions dérivées de sang, ayant été en contact avec le virus agent causal de l'hépatite non A non B, tel que défini selon la présente invention, dont les souches 1-617 et I-616 et celles présentant une réaction immunologique croisée avec les deux souches de référence, le sérum du malade ou du patient convalescent est mis en contact avec la préparation virale purifiée (ou avec une fraction de celle-ci) telle que recueillie dans les conditions mentionnées ci-dessus, après centrifugation et isolement de la bande correspondant à une densité de 1,30.
Ladite préparation virale est fixée, par exemple, sur les parois d'une microplaque selon les techniques connues.
Le complexe Ag/Ac est révélé par une préparation d'anti-immunoglobulines humaines marquées par un marqueur adéquat, par exemple une enzyme.
Un système analogue peut être utilisé pour caractériser une activité anticorps dans les IgM d'un patient en vue d'un diagnostic sérologique très précoce de la maladie, en utilisant des anti-IgM humaines, ou mieux en captant les IgM d'un sérum en les faisant réagir avec le virus ou ses fractions et en caractérisant l'Ag fixé sur 1'IgM du malade.
La caractérisation de certains des antigènes qui entrent dans la composition de l'agent viral isolé conformément à la présente invention a été réalisée dans un premier temps sur la souche Clamart, en procédant comme décrit ciaprès.
La souche Clamart a été isolée à partir de selles d'un patient atteint d'hépatite NANB sporadique.
Le surnageant desdites selles a été centrifugé en gradient de chlorure de césium dont la bande contenant l'antigène viral purifié comme défini plus haut a été recueillie et sa densité déterminée comme étant de 1,30.
Le contenu de cette bande, après réduction par du ss-mercaptoéthanol en solution à 58 (concentration finale) contenant du SDS - ou dodécylsulfate de sodium - à concentration finale 1%, a été déposé sur un gel d'acrylamide à 12,5% contenant 0,1% de SDS.
Après migration électrophorétique, la détection d'un certain nombre des protéines qui constituent l'antigène viral a été faite par Western blotting (immunoempreinte) en utilisant des IgG purifiées provenant d'un patient convalescent d'hépatite NANB.
La révélation du complexe protéines virales-IgG a été faite en utilisant des fragments d'immunoglobulines antiimmunoglobulines humaines totales connus sous la dénomination de Fab2', marqués par 1'125il
Une autoradiographie a été faite et a révélé la présence, dans les conditions expérimentales et en utilisant comme marqueur de poids moléculaire, en référence, ceux contenus dans le kit PHARMACIE standard, de 7 bandes correspondant à 7 antigènes reconnus par le sérum du convalescent.
Une autoradiographie a été faite et a révélé la présence, dans les conditions expérimentales et en utilisant comme marqueur de poids moléculaire, en référence, ceux contenus dans le kit PHARMACIE standard, de 7 bandes correspondant à 7 antigènes reconnus par le sérum du convalescent.
Les poids moléculaires de ces 7 antigènes, qui entrent dans la composition du virus isolé et purifié conformément à la présente invention, dans les conditions de préparation du virus telles que définies dans ce qui précède, sont les suivants
64 000 Daltons
57 000 Daltons
47 000 Daltons
39 000 Daltons
30 000 Daltons
25 000 Daltons
14 500 Daltons
La figure 1 annexée est une reproduction du Western blot correspondant aux 7 antigènes obtenus à partir du lysat viral du virus de l'hépatite NANB reconnus par les anticorps du patient convalescent précité.
64 000 Daltons
57 000 Daltons
47 000 Daltons
39 000 Daltons
30 000 Daltons
25 000 Daltons
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La figure 1 annexée est une reproduction du Western blot correspondant aux 7 antigènes obtenus à partir du lysat viral du virus de l'hépatite NANB reconnus par les anticorps du patient convalescent précité.
Les épitopes reconnus dans le test de diagnostic défini plus haut, sont portés par ces antigènes, qui peuvent à ce titre, être utilisés dans ledit test.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.
I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Au cours d'une première étape, deux singes Cercopithecus aethops et un singe Erythrocebus patas ont été inoculés par voie orale par 2 ml d'un mélange d'un extrait aqueux à 10% de fèces de patients ivoiriens présumés atteints d'hépatite NANB épidémique, collectées au cours des premiers jours ayant suivi l'apparition des symptômes. Le mélange avait été préalablement centrifugé et filtré à travers des filtres Millipore de 0,22 pm pour éliminer les bactéries et les parasites. Les échantillons de sérum et les échantillons de fèces de ces singes ont été collectés d'une part avant l'administration de l'extrait de fèces et d'autre part le vingt-septième jour après l'inoculation. Les fonctions hépatiques de ces singes n'ont pas été étudiées; ces animaux ne présentaient pas de manifestations cliniques évidentes.Un singe Saimiri a également été inoculé dans les mêmes conditions par 0,5 ml d'un extrait de fèces provenant d'un patient ivoirien différent de ceux utilisés pour les singes verts d'Afrique. Un second singe Saimiri qui avait été inoculé trois mois auparavant par une préparation fécale de virus d'hépatite A et séroconverti à a' l'aide d'anticorps IgEl anti-HAV au jour 29, a été inoculé par voie intraveineuse par 0,5 ml du même échantillon de fèces filtré. Les deux singes
Saimiri ont été saignés deux fois par semaine pour effectuer des examens biochimiques et sérologiques et leurs fèces ont été examinées quotidiennement. Les deux singes Saimiri sont morts au jour 28, sans avoir présenté de symptômes particuliers.Aucun des singes n'avait présenté de preuve biochimique convaincante d'un dysfonctionnement hépatique et l'examen histologique effectué post-mortem a montré une congestion du foie sans lésion du parenchyme. Les sérums de ces cinq singes ont été fractionnés dans du tampon Tris NaC1 0,1M, pH 8, sur du "Sephacryl S 300" et les fractions contenant des IgM et des IgG ont été collectées. Elles ont été utilisées en tant qu'anticorps récepteurs dans un test immunoenzymatique. L'IgM a été choisie pour sa capacité de capture élevée et pour empêcher les réactions faussement positives dues à un facteur rhumatoïde ou analogue au facteur rhumatoïde, qui a eté reconnu comme stimulant l'antigène NANB.
Saimiri ont été saignés deux fois par semaine pour effectuer des examens biochimiques et sérologiques et leurs fèces ont été examinées quotidiennement. Les deux singes Saimiri sont morts au jour 28, sans avoir présenté de symptômes particuliers.Aucun des singes n'avait présenté de preuve biochimique convaincante d'un dysfonctionnement hépatique et l'examen histologique effectué post-mortem a montré une congestion du foie sans lésion du parenchyme. Les sérums de ces cinq singes ont été fractionnés dans du tampon Tris NaC1 0,1M, pH 8, sur du "Sephacryl S 300" et les fractions contenant des IgM et des IgG ont été collectées. Elles ont été utilisées en tant qu'anticorps récepteurs dans un test immunoenzymatique. L'IgM a été choisie pour sa capacité de capture élevée et pour empêcher les réactions faussement positives dues à un facteur rhumatoïde ou analogue au facteur rhumatoïde, qui a eté reconnu comme stimulant l'antigène NANB.
En fait, on pourrait également utiliser l'IgG bien que son bruit de fond soit un peu plus élevé que celui de l'Igfl et sa spécificité déficiente pour certaines préparations.
Pour révéler la fixation d'antigène de fèces sur l'anticorps en phase solide, des IgG provenant de sérums de convalescents ont été fractionnées par chromatographie sur
DEAE-trisacryl, après précipitation par du (NH4)2SO4. Les IgG ont été conjuguées à la ss-galactosidase ou à la peroxydase.
DEAE-trisacryl, après précipitation par du (NH4)2SO4. Les IgG ont été conjuguées à la ss-galactosidase ou à la peroxydase.
Des IgG marquées ont été utilisées pour la détection de l'antigène : une préparation d'IgG provenant d'un-patient ivoirien convalescent d'une hépatite NANB épidémique; une préparation d'IgG prélevée chez un patient algérien guéri, au cours de l'épidémie de Medea en 1981-1982; enfin l'IgG d'un singe Cercopithèque inoculé expérimentalement. Les préparations d'IgG des trois origines ont donné des résultats équivalents. Pour chaque singe, on a utilisé de 1'IgM de préinoculation en phase solide comme témoin de spécificité d'IgM de post-inoculation. De l'IgG humaine marquée non-immune a été utilisée comme témoin de marquage d'Ag. Les fèces de singes inoculés ont été examinées pour établir la présence d'un
Ag présumé NANB dans le test ELISA. Une activité antigénique a été détectée dans les fèces des deux singes Saimiri (cf.
Ag présumé NANB dans le test ELISA. Une activité antigénique a été détectée dans les fèces des deux singes Saimiri (cf.
Tableau 1). L'application d'un traitement par ultra-sons a permis d'augmenter la quantité d'antigène détecté et a augmenté la sensibilité de la méthode. L'Ag est apparu des le quatrième jour après l'inoculation et a persisté jusqu'au treizième jour.
Le Tableau 1 montre l'Ag NANB détecté dans les fèces de singes infectés expérimentalement par des extraits de fèces provenant de patients atteints de NANBH épidémique.
La détection a été réalisée comme suit, en mettant en oeuvre la technique ELISA : des immunoplaques NUNC ont été revêtues de 100 pl de 50 pg/ml de fraction d'IgM, échantil lonlëes 27 jours après inoculation, dans une solution physiologique de tampon phosphate (PBS) pendant une heure à 37"C et une nuit à 4iC. Après plusieurs lavages, les plaques ont été recouvertes de 200 pl de PBS contenant 1% de sérum-albumine bovine et 0,1% de Tween 20, pendant trois heures à 370C.
Après lavage, 100 p1 des extraits de fèces (1/10 V/V) filtrés sur un élément de porosité 0,22 um sont incubés sur les IgM du revêtement, à 370C pendant une heure, puis une nuit à 4"C.
Après plusieurs lavages, 100 p1 d'IgGde singe immun marquée à la peroxydase à 5 mcg/ml dans 1 % de BSA + 0,1 % de Tween 20 dans du tampon Tris sodique, pH 7,6 (TNB) contenant 0,1 % de NaN3, ont été utilisés pour la détection de l'Ag. Au bout d'une heure d'incubation à 37iC et plusieurs lavages1 la réaction a été développée à l'aide de 100 ul d'orthophénylène-diamine dans 0,005 M de tampon citrique pH 5,6, avec 1 pl/ml H202. Les résultats obtenus sont exprimés par le rapport entre l'échantillon étudié et la moyenne de cinq échantillons négatifs (P/N). Le bruit de fond des échantillons négatifs a été de l'ordre de 0,04-0,06 en densité optique (DO) à 492 nm.Il est plus élevé si le NaN3 a été omis, mais, dans ce cas, des quantités de réactifs plus faibles doivent être mises en réaction. Les échantillons dont le rapport P/N > 2,1, ont été considérés comme positifs. Les fèces (1/10 poids/poids) qui ont été examinées étaient de deux types : celles ayant subi un traitement aux ultra-sons et celles n'ayant pas subi un tel traitement; le traitement aux ultra-sons appliqué est de trois minutes à 4 C, avec une intensité de sortie de 4 avec l'appareil de BRENSON pour des volumes de 2 à 3 ml avant centrifugation et filtration à travers un élément de porosité de 0,22 pm. Les résultats positifs sont soulignés dans le Tableau 1. Les fèces d'un singe
Saimiri ayant requ de l'extrait de fèces d'un patient atteint d'une maladie du foie non-infectieuse ont servi de témoin et ont constamment donné des résultats négatifs.
Saimiri ayant requ de l'extrait de fèces d'un patient atteint d'une maladie du foie non-infectieuse ont servi de témoin et ont constamment donné des résultats négatifs.
TABLEAU 1
<tb> <SEP> P/N <SEP> sans <SEP> traitement <SEP> P/N <SEP> avec <SEP> traitement <SEP>
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> jours <SEP> par <SEP> ultra-scns <SEP> par <SEP> ultra-sons
<tb> après <SEP> inoculation
<tb> <SEP> Singe <SEP> N- <SEP> 1 <SEP> Singe <SEP> N <SEP> 2 <SEP> Singe <SEP> N0 <SEP> 1 <SEP> Singe <SEP> N0 <SEP> 2
<tb> <SEP> (inoculation <SEP> (inoculation <SEP>
<tb> <SEP> par <SEP> voie <SEP> par <SEP> voie
<tb> <SEP> intraveineuse) <SEP> orale)
<tb> <SEP> O <SEP> 0 <SEP> 1,15 <SEP> 1,14 <SEP> 1,18 <SEP> 1 <SEP> 1,07
<tb> <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> <SEP> 2,47 <SEP> 1,60 <SEP> 5,10 <SEP> 0,79
<tb> <SEP> 7 <SEP> 6,48 <SEP> 3,28 <SEP> 8,78 <SEP> 5,52
<tb> <SEP> 9 <SEP> 3,64 <SEP> 2,24 <SEP> 4,72 <SEP> 5,82
<tb> <SEP> 11 <SEP> 1,12 <SEP> 1,40 <SEP> 1,95 <SEP> 5,20
<tb> <SEP> 13 <SEP> 1,30 <SEP> 1,46 <SEP> 2,40 <SEP> 0,80
<tb> <SEP> 15 <SEP> 1,51 <SEP> 1,68 <SEP> 0,93 <SEP> 0,90
<tb> <SEP> 19 <SEP> 1,53 <SEP> 1,51 <SEP> 1,20 <SEP> 0,80
<tb>
Une deuxième étape a consisté à étudier des fèces de patients atteints d'une hépatite NANB aigüe présumée, aussi bien sous sa forme épidémique (patients ivoiriens) que sous sa forme sporadique (patients français).Le diagnostic de l'hépatite NANB a été établi conformément aux critères immunologiques classiques des trois types d'infections par des virus d'hépatite (A,B, delta) : présence ou absence d'IgM et d'IgG anti-HAV pour l'infection par le virus A; HBsAg, anti-HBc et IgM anti-HBc, anti-HBs, pour l'infection par HBV; les Ag delta et anti-delta pour l'infection par HDV, le cas échéant. Pour les patients ivoiriens, les marqueurs de la fièvre jaune ont été recherchés. On a également recherché chez tous ces patients l'infection par le cytomégalovirus par immunocapture d'anticorps IgM et l'infection par le virus d'Epstein-Barr, par détection d'IgM anti-VCA dans les taches immunofluorescentes. L'Ag associé à la NANB a été détecté aussi bien dans les cas épidémiques que dans les cas sporadiques (cf.Tableau 2). I1 n'a pas été détecté d'Ag dans 90 extraits témoins de patients européens présentant d'autres troubles gastro-intestinaux. Dans la plupart des cas, ces résultats ont été confirmés plusieurs fois avec différentes IgM ou IgG en phase solide et avec différentes IgG marquées. Les mêmes échantillons positifs ont été étudiés avec 1'IgM préimmune recouvrant une plaque et il n'a pas été détecté d'antigène. I1 en résulte que l'Ag détecté parait étroitement lié au virus NANB.
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> jours <SEP> par <SEP> ultra-scns <SEP> par <SEP> ultra-sons
<tb> après <SEP> inoculation
<tb> <SEP> Singe <SEP> N- <SEP> 1 <SEP> Singe <SEP> N <SEP> 2 <SEP> Singe <SEP> N0 <SEP> 1 <SEP> Singe <SEP> N0 <SEP> 2
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<tb> <SEP> par <SEP> voie <SEP> par <SEP> voie
<tb> <SEP> intraveineuse) <SEP> orale)
<tb> <SEP> O <SEP> 0 <SEP> 1,15 <SEP> 1,14 <SEP> 1,18 <SEP> 1 <SEP> 1,07
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Une deuxième étape a consisté à étudier des fèces de patients atteints d'une hépatite NANB aigüe présumée, aussi bien sous sa forme épidémique (patients ivoiriens) que sous sa forme sporadique (patients français).Le diagnostic de l'hépatite NANB a été établi conformément aux critères immunologiques classiques des trois types d'infections par des virus d'hépatite (A,B, delta) : présence ou absence d'IgM et d'IgG anti-HAV pour l'infection par le virus A; HBsAg, anti-HBc et IgM anti-HBc, anti-HBs, pour l'infection par HBV; les Ag delta et anti-delta pour l'infection par HDV, le cas échéant. Pour les patients ivoiriens, les marqueurs de la fièvre jaune ont été recherchés. On a également recherché chez tous ces patients l'infection par le cytomégalovirus par immunocapture d'anticorps IgM et l'infection par le virus d'Epstein-Barr, par détection d'IgM anti-VCA dans les taches immunofluorescentes. L'Ag associé à la NANB a été détecté aussi bien dans les cas épidémiques que dans les cas sporadiques (cf.Tableau 2). I1 n'a pas été détecté d'Ag dans 90 extraits témoins de patients européens présentant d'autres troubles gastro-intestinaux. Dans la plupart des cas, ces résultats ont été confirmés plusieurs fois avec différentes IgM ou IgG en phase solide et avec différentes IgG marquées. Les mêmes échantillons positifs ont été étudiés avec 1'IgM préimmune recouvrant une plaque et il n'a pas été détecté d'antigène. I1 en résulte que l'Ag détecté parait étroitement lié au virus NANB.
Le Tableau 2 ci-après illustre la détection d'Ag
NANB dans -les fèces de patients atteints d'hépatite- NAfJB épidémique (de Côte d'Ivoire) et sporadique (de France). 90 fèces de patients suspectés d'infections gastro-intestinales ont été utilisées comme témoins. Tous les échantillons présu- més NANB et 17 des 90 témoins ont été soumis à un traitement par ultra-sons. De l'anticorps (Ac) humain marqué à la peroxydase ou la B-galactosidase, a été utilisé comme traceur d'Ag.
NANB dans -les fèces de patients atteints d'hépatite- NAfJB épidémique (de Côte d'Ivoire) et sporadique (de France). 90 fèces de patients suspectés d'infections gastro-intestinales ont été utilisées comme témoins. Tous les échantillons présu- més NANB et 17 des 90 témoins ont été soumis à un traitement par ultra-sons. De l'anticorps (Ac) humain marqué à la peroxydase ou la B-galactosidase, a été utilisé comme traceur d'Ag.
TABLEAU 2
<tb> I <SEP> I <SEP> Echantillons <SEP> de <SEP> I <SEP> Echantillons <SEP> de <SEP> I <SEP> Témoins
<tb> <SEP> I <SEP> I <SEP> fèces <SEP> de <SEP> Côte <SEP> I <SEP> fèces <SEP> de <SEP> France: <SEP> I <SEP> de
<tb> d'Ivoire <SEP> :<SEP> cas <SEP> I <SEP> cas <SEP> sporadiques <SEP> I <SEP> France
<tb> <SEP> t <SEP> épidémiues <SEP> t <SEP> I <SEP> t <SEP>
<tb> <SEP> I <SEP> I
<tb> IAg <SEP> NANB <SEP> <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP>
<tb> Ipositif <SEP> I <SEP> 17 <SEP> 1 <SEP> 7 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> I
<tb> <SEP> I <SEP> I
<tb> IAg <SEP> NANB <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP>
<tb> négatif <SEP> 1 <SEP> 44 <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> 90 <SEP> 1
<tb>
Pour vérifier que l'Ag détecté est effectivement étroitement lié au virus NANB, au cours d'une troisième étape, des lignées cellulaires continues d'origine hépatocytique, PLC/PRF 5 et HEP G2, et des cellules normales humaines fibroblastiques MRC 5, ont été inoculées dans du milieu de DULBECCO contenant 10 % de sérum de veau foetal, par un extrait de fèces d'un malade atteint d'hépatite NANB. Après confluence de la culture, une sousculture a été réalisée après addition d'EDTA-trypsine.
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Pour vérifier que l'Ag détecté est effectivement étroitement lié au virus NANB, au cours d'une troisième étape, des lignées cellulaires continues d'origine hépatocytique, PLC/PRF 5 et HEP G2, et des cellules normales humaines fibroblastiques MRC 5, ont été inoculées dans du milieu de DULBECCO contenant 10 % de sérum de veau foetal, par un extrait de fèces d'un malade atteint d'hépatite NANB. Après confluence de la culture, une sousculture a été réalisée après addition d'EDTA-trypsine.
Dans certains cas, des substances toxiques présentes dans les fèces provoquent la mort des cellules précocement lors de la première semaine, tandis que d'autres fèces non toxiques pour les lignées cellulaires, induisent la mort des cellules après plusieurs passages. Cet effet léthal spécifique a été observé uniquement avec la lignée cellulaire PLC/PRF 5 mais ne l'a pas été avec la lignée cellulaire HEP G2 et les cellules MRC 5. Après traitement des cellules aux ultra-sons et filtration sur porosité 0,22 Pm, de 1'Ag NANB a été détecté dans le surnageant de PLC/PRF 5 infectées mais pas dans le surnageant des
HEP G2 infectées dans les mêmes conditions.
HEP G2 infectées dans les mêmes conditions.
Pour des extraits de foie de singes inoculés, on n'a pas observé de toxicité cellulaire après inoculation et les cellules PLC/PRF 5 ont présenté une positivité antigénique de la même manière que dans le cas d'échan tillons de fèces (cf Tableau 3).
Le Tableau 3 illustre la détection d'Ag NANB dans la lignée cellulaire d'hépatome inoculée par un extrait de fèces d'un patient ivoirien souffrant d'hépatite NANB épidémique et par un extrait de foie d'un singe Saimiri infecté (N 1).
L'extrait de foie a été préparé dans du PBS (10 % poids/poids) et homogénéisé à l'aide de 1Ultra- turax". Après centrifugation, le culot a été remis en suspension dans 4 fois son volume de TNB et soumis à un traitement aux ultra-sons en présence de 0,005 mg/ml de chlorure de phénylméthylsulfonide (PMSF).
Un extrait de foie d'un singe Saimiri inoculé par un extrait de fèces de patients souffrant d'une maladie de foie non-infectieuse a servi de témoin.
Après trois passages, les cultures cellulaires inoculées ont été centrifugées. Le culot a été repris dans du TNB et après addition de PRSF, les cellules ont été soumises à un traitement aux ultra-sons. Les chiffres indiquent le rapport P/N.
TABLEAU 3
<tb> <SEP> Cellules <SEP> ino- <SEP> Cellules <SEP> ino- <SEP> Cellules <SEP> ino- <SEP> Cellules
<tb> <SEP> Lignée <SEP> culées <SEP> par <SEP> de <SEP> culées <SEP> par <SEP> de <SEP> culées <SEP> par <SEP> de <SEP> non
<tb> <SEP> cellulaire <SEP> 1' <SEP> extrait <SEP> de <SEP> 1'extrait <SEP> de <SEP> 1' <SEP> extrait <SEP> de <SEP> ino
<tb> <SEP> d'hépatite <SEP> fèces <SEP> de <SEP> pa- <SEP> foie <SEP> de <SEP> singe <SEP> foie <SEP> de <SEP> singe <SEP> culées
<tb> <SEP> tient <SEP> ivoirien <SEP> Saimiri <SEP> infecté <SEP> Saimiri <SEP> témoin
<tb> <SEP> PIC/PRF <SEP> 5 <SEP> 8,19 <SEP> * <SEP> 4,39 <SEP> 2 <SEP> 1,01
<tb> HEP <SEP> HEP <SEP> G2 <SEP> 1,62 <SEP> 1,14 <SEP> 2 <SEP> 1,07
<tb> * après dilution à 1/100 P/N : 6,29.
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<tb> HEP <SEP> HEP <SEP> G2 <SEP> 1,62 <SEP> 1,14 <SEP> 2 <SEP> 1,07
<tb> * après dilution à 1/100 P/N : 6,29.
I1 semble ressortir de essais préliminaires de marquage par immunofluorescence qu'une cellule sur 50 environ, seulement, soit infectée, dans les conditions expérimentales.
Une quatrième étape a eu pour objet de purifier l'antigène associé au virus, provenant d'échantillons de fèces de différentes origines. Trois profils de répartition d'antigène ont été observés et sont représentés à la figure 2 annexée qui montre que dans des échantillons fraichement utilisés, l'activité antigénique apparait sous la forme d'une bande à une densité de 1,29-1,32 g/cm3.
Certains des échantillons de fèces conservés à +40C pendant quelques mois, ou des échantillons frais ayant subi un traitement par ultrasons, n'ont présenté d'activité antigénique qu'à une densité de 1,17-1,19 g/cm3, tandis que d'autres présentaient une activité aux deux densités.
La figure 2 représente la répartition de l'antigène dans le gradient de CsCl après ultracentrifugation isopycnique, obtenue en procédant comme suit
3 ml d'échantillons de fèces (10 % dans RPMI) ont été fractionnés après filtration à travers un élément filtrant de 0,22 Wm de porosité, dans un gradient de CsCl de densité comprise entre 1,1 et 1,6 g/ml. La centrifugation isopycnique (48 heures) à 78000 g a été effectuée dans des tubes de 12 ml (1,2,3,2, 0,5, 0,5 ml de CsCl de densité 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 1,5 et 1,6 respectivement). 0,6 ml de fractions ont été collectés et testés pour déterminer la présence d'antigène NANB après deux dilutions.
3 ml d'échantillons de fèces (10 % dans RPMI) ont été fractionnés après filtration à travers un élément filtrant de 0,22 Wm de porosité, dans un gradient de CsCl de densité comprise entre 1,1 et 1,6 g/ml. La centrifugation isopycnique (48 heures) à 78000 g a été effectuée dans des tubes de 12 ml (1,2,3,2, 0,5, 0,5 ml de CsCl de densité 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 1,5 et 1,6 respectivement). 0,6 ml de fractions ont été collectés et testés pour déterminer la présence d'antigène NANB après deux dilutions.
Dans la figure 2
A désigne les fèces fraiches
B et C des fèces conservées ou traitées aux
ultra-sons.
A désigne les fèces fraiches
B et C des fèces conservées ou traitées aux
ultra-sons.
Du matériel antigénique à faible densité apparaissant dans ces conditions est supposé résulter d'un effet de décomposition par des enzymes contenues dans les fèces ou par un traitement physique. Les fractions de CsCl à antigénicité positive ont été soumises à une ultracentrifugation dans un gradient de saccharose variant de 10 à 60 % poids/volume et les fractions réactives ont été étudiées à l'ultramicroscope. L'antigène NANB a été trouvé à 40-41,5 t de saccharose et de façon prédominante à 26-28 % de saccharose.Sept préparations obtenues à partir de 9 échantillons à antigénicité NANB positive, comportaient des particules virales : une provenant d'un singe Saimiri inoculé (le second singe n'a pas été examiné), deux provenant de deux des trois patients atteints d'hépati- te NANB épidémique aigüe- (Côte d'Ivoire), quatre provenant de quatre des cinq patients atteints d'hépatite NANB sporadique (France). Deux types de particules virales sphériques ont été observés : des particules de grandes dimensions, de l'ordre de 75 nm de diamètre, qui présentent une structure à double membrane, et des particules de dimensions plus petites, homogènes, de 25 à 30 nm de diamètre environ, sans aucune structure interne définie.
Une structure tubulaire de 15 nm de diamètre (ou de largeur) et dont la longueur peut atteindre 1 ssm, plus où moins fixée aux particules, a été observée et est représentée à la figure 3 annexée. Certaines images donnent l'impression que des tubules partent de l'enveloppe des particules virales de grandes dimensions. Les particules les plus caractéristiques ont été observées dans des échantillons frais n'ayant pas subi de traitement par ultra-sons.Des particules sphériques de grandes dimensions o n t pu être observées pour la plupart dans des fractions de densité comprise entre 1,29 et 1,32 g/cm3 et dans la fraction de 40-41,5 % de saccharose du gradient de saccharose, tandis qu'on n'a pu observer que des particules de dimensions moindres dans les fractions de CsCl présentant une densité comprise entre 1,17 et 1,19 g/cm3 et dans la fraction du gradient de saccharose à 26-28 % de saccharose. I1 n'a pas encore pu être établi si les particules les plus petites et de densité plus basse représentent une forme de libération du virus de départ.
Six échantillons de fèces à antigénicité négative ont également été étudiés simultanément de la même manière pour servir de témoins. On n'a trouvé dans aucune de ces préparations une structure ayant l'aspect de particules.
Une dernière étape a permis de mettre en évidence que la détection d'Ag NANB dans les fèces démontre que le virus NANB épidémique est fréquemment impliqué dans l'hépatite NANB sporadique. De l'Ag NANB associé au virus a été détecté dans sept échantillons de fèces parmi 17 patients examinés atteints d'hépatite NANB sporadique aigu, (cf figure 3). Des examens sérologiques ont confirmé ces résultats : parmi huit patients dont on disposait des sérums, sept d'entre eux présentaient un sérum avec 1 'anticorps anti-NANB.
La figure 3 illustre la caractérisation de particules virales au microscope électronique dans les fèces de singes infectés par NANB et de patients atteints d'hépatite NANB.
Après ultracentrifugation isopycnique comme décrit en relation avec la figure 2, les fractions positives ont été mélangées, puis dialysées contre du TNB, puis elles ont été soumises à une ultracentrifugation zonale dans un gradient de saccharose (10-60 % poids/poids) à 78000 g pendant 5 heures. Les fractions positives ont été mélangées , dialysées, concentrées et examinées au microscope électronique. Une goutte de préparation virale a été étalée sur une grille de 200 mesh revêtue de carbone et après absorption sur papier-filtre, une goutte de 2 % d'acétate d'uranyle dans de l'eau distillée a été ajoutée.
Au bout de deux minutes, la grille a été essuyée avec du papier-filtre et étudiée au microscope JEM 100 C x II.
Les figures 4 et 5 annexées représentent des coupes vues au microscope électronique après coloration par l'acétate d'uranyle de cellules PLC/PRF 5 inoculées avec un extrait de selles d'un patient souffrant d'hépatite non A non B chez lequel l'Ag a été détecté dans ses selles selon les techniques décrites plus haut.
Les particules virales sont retrouvées dans
le noyau et le cytoplasme sous forme de "réseaux cris
tallins" ; le diamètre de la particule est très constant
74 à 75 nm. La figure 4 est une vue à grossissement X16000
et la fissure 5 une vue à qrossissemPnt 54000.
le noyau et le cytoplasme sous forme de "réseaux cris
tallins" ; le diamètre de la particule est très constant
74 à 75 nm. La figure 4 est une vue à grossissement X16000
et la fissure 5 une vue à qrossissemPnt 54000.
Comme les épidémies d'hépatite NANB sont hati- tuellement observées dans les pays en voie de développement, il a paru intéressant d'examiner si les mêmes virus jouent, dans ces pays, un rôle dans les cas sporadiques. C'est pourquoi 28 sérums de patients marocains souffrant d'hépatite NANB aigüe sporadique ont été examinés pour déterminer s'ils contiennent des anticorps vis-àvis du virus NANB épidémique. 68 % des patients se sont avérés présenter des anticorps anti-virus NANB épidémique tandis que les mêmes anticorps n'ont été détectés que dans 10 % de sérums de donneurs de sang, dans le même pays.
Le Tableau 4 ci-après illustre la détection d'anticorps spécifiques vis-à-vis de l'antigène NANB dans des sérums de patients souffrant d'hépatite NANB sporadique.
La présence d'anticorps a été démontrée par inhibition de la réaction dans les conditions décrites dans le Tableau 1 ci-dessus. La réaction a été réalisée en incubant 50 1 d'un extrait de référence provenant de fèces de singe infecté, pendant une heure à 370C et une nuit à 40C, avec 50 F1 du sérum à examiner. Toutes les autres étapes de la réaction ont été réalisées de la même maniere que pour la détection de l'Ag. Le rapport P/N de cet antigène de référence était de l'ordre de 6-8. 24 sérums humains normaux non dilués ont été testés dans une réaction d'inhibition contre l'Ag de référence comparativement au PBS aucun d'entre eux n'a exercé d'action inhibitrice. Ultérieurement, 50 1 d'un mélange de ces sérums ont servi à établir la positivité à 100 % de la réaction.Les échantillons testés ont été considérés comme positifs lorsque l'inhibition était supérieure à 50 %.
* L'Ag NANB a été détecté dans les fèces de cinq patients souffrant d'hépatite NANB aigüe ; on n'a pas trouvé d'anticorps dans l'une d'entre elles. Chez deux autres patients, la maladie aigüe datait respectivement de 9 et de 3 mois et il n'a plus pu être détecté d'Ag dans les fèces. Le dernier des cinq patients avait présenté dans le passé une hépatite NANB avec de l'anticorps décelable qui a disparu au bout de 3 ans.
TABLEAU 4
<tb> Source <SEP> de <SEP> I <SEP> Donneurs <SEP> I <SEP> Personnel <SEP> I <SEP> Patients <SEP> I <SEP> Hépatite <SEP> t
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<tb>
Comme le montre le Tableau 4 ci-dessus, l'hémodialyse ou un travail de laboratoire impliquant la manipulation de sang humain ne parait pas augmenter le risque d'infection par le virus NANB. Le fait que l'on utilise des Ac préparés à partir de singes infectés par un virus
NANB épidémique, pour la détection d'Ag liés à un virus
NANB sporadique, montre qu'il s'agit du même virus.
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Comme le montre le Tableau 4 ci-dessus, l'hémodialyse ou un travail de laboratoire impliquant la manipulation de sang humain ne parait pas augmenter le risque d'infection par le virus NANB. Le fait que l'on utilise des Ac préparés à partir de singes infectés par un virus
NANB épidémique, pour la détection d'Ag liés à un virus
NANB sporadique, montre qu'il s'agit du même virus.
Les différentes étapes de l'étude qui viennent d'être décrites ont permis de caractériser un nouvel agent viral impliqué dans l'hépatite NANB. Cet agent viral semble être responsable aussi bien de la forme épidémique que de la forme sporadique de l'hépatite NANB.
I1 est différent du virus HAV
1) Une infection par le virus NANB épidémique
a été observée chez un singe et chez des
patients présentant une immunité anti-HAV
2) Les marqueurs usuels de l'infection aigüe
(IgM anti-HAV) n'ont pas été détectés
3) Ce virus induit une réponse immune spécifique
et les anticorps -n'ont pas réagi avec une
préparation virale de HAV ; des sérums de
patients convalescents d'hépatite A ont donné
des résultats négatifs dans le test de détection
d'anticorps antivirus NANB épidémique.
1) Une infection par le virus NANB épidémique
a été observée chez un singe et chez des
patients présentant une immunité anti-HAV
2) Les marqueurs usuels de l'infection aigüe
(IgM anti-HAV) n'ont pas été détectés
3) Ce virus induit une réponse immune spécifique
et les anticorps -n'ont pas réagi avec une
préparation virale de HAV ; des sérums de
patients convalescents d'hépatite A ont donné
des résultats négatifs dans le test de détection
d'anticorps antivirus NANB épidémique.
Le virus NANB épidémique est également distinct du HBV et par voie de conséquence du HDV
1) La maladie a évolué chez certains patients
présentant des anticorps anti-HBsAg et est
également apparue chez un patient européen
vacciné présentant une forte immunité anti
HBV
2) I1 n'a généralement pas été détecté de HBsAg
et HBeAg ; s'il préexiste des marqueurs
de HBV à l'hépatite NANB (chez certains
patients ivoiriens), il n'apparaît pas d'IgM
anti HBc
3) Des IgM de singes infectés par du virus NANB
épidémique et utilisées pour la détection
d'antigène viral, ne réagissent ni avec le
HBV ou avec des préparations purifiées de
HBsAg, ni avec des sérums de patients répli
quant activement le HBV ; des anticorps antiHBS
n'interfèrent pas dans le test de détection
d'antigène anti-virus NANB épidémique.
1) La maladie a évolué chez certains patients
présentant des anticorps anti-HBsAg et est
également apparue chez un patient européen
vacciné présentant une forte immunité anti
HBV
2) I1 n'a généralement pas été détecté de HBsAg
et HBeAg ; s'il préexiste des marqueurs
de HBV à l'hépatite NANB (chez certains
patients ivoiriens), il n'apparaît pas d'IgM
anti HBc
3) Des IgM de singes infectés par du virus NANB
épidémique et utilisées pour la détection
d'antigène viral, ne réagissent ni avec le
HBV ou avec des préparations purifiées de
HBsAg, ni avec des sérums de patients répli
quant activement le HBV ; des anticorps antiHBS
n'interfèrent pas dans le test de détection
d'antigène anti-virus NANB épidémique.
Le nouveau virus purifié caractérisé comme décrit dans ce qui précède semble pouvoir être isolé de sources largement réparties. En plus des cas décrits plus haut, l'antigène associé au virus a également été trouvé chez un patient sénégalais et des anticorps ont été trouvés dans le sérum d'un patient convalescent d'une épidémie ayant sévi en Algérie. L'agent NANB épidémique est considéré comme étant un virus véhiculé par l'eau. Néanmoins son rôle dans l'hépatite sporadique, en particulier dans un pays bénéficiant de bonnes conditions d'hygiène, n'exclut pas d'autres voies de transmission, et notamment la voie sanguine.
Au demeurant, l'implication du virus NANB épidémique dans des cas d'hépatite NANB sporadique, devrait entraîner une reconsidération du qualificatif "épidémique
Conformément à la présente invention, l'utili sation du virus ou de son lysat ou d'une fraction de ce lysat peut être envisagée pour la préparation d'anticorps monoclonaux et le lysat viral ou les fractions de celuici ou les protéines purifiées à partir de ce virus, du lysat ou de ses fractions, peuvent être utilisés pour la recherche d'anticorps dans le sérum des patients par mise en oeuvre de tests classiques de type RIA, ELISA ou Western blot (immunoempreinte).
Conformément à la présente invention, l'utili sation du virus ou de son lysat ou d'une fraction de ce lysat peut être envisagée pour la préparation d'anticorps monoclonaux et le lysat viral ou les fractions de celuici ou les protéines purifiées à partir de ce virus, du lysat ou de ses fractions, peuvent être utilisés pour la recherche d'anticorps dans le sérum des patients par mise en oeuvre de tests classiques de type RIA, ELISA ou Western blot (immunoempreinte).
Claims (3)
1. > Nouvel agent viral purifié impliqué dans l'h- patite virale NANB, caractérisé en ce qu'il présente un profil de répartition de son activité antigénique qui comporte au moins une bande & une densité de 1,29-1,32 g/cm3 et/ou au moins une bande & une densité de 1,17-1,19 g/cm3.
2 & Nouvel agent viral purifié selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par un agent viral purifié impliqué dans l'hépatite virale aussi bien épidémique que sporadique.
3*) Agent viral selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est isolé de fèces de patients atteints d'hépatite NANB, par centrifugation et filtration à travers un filtre dont la porosité est de l'ordre de 0,22 um.
4p) Agent viral selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'hépatocytes ou à partir de lignées cellulaires continues d'hépatocytes, inoculés par de l'extrait de fèces d'un malade atteint d'hépatite NANB ou par un extrait de foie d'un singe infecté.
5 ) Agent viral selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit agent viral auquel est associé un antigène spécifique, se présente sous la forme de particules virales sphériques de deux types principaux, à savoir des particules de l'ordre de 75 nm de diamètre et des particules de l'ordre de 25 à 30 nm de diamètre, les première res étant majoritairement présentes dans les fractions d'un gradient de chlorure de césium de densité variant entre 1,1 et 1,6 g/ml, dont la densité est comprise entre 1,29 et 1,32 g/cm3 et les fractions à 40-41,5% d'un gradient de saccharose de concentration variant de 10 à 60% poids/volume et les secondes étant majoritairement présentes dans les fractions du gradient de CsCl de densité comprise entre 1,17 et 1,19 g/cm3 et les fractions à 26-28% dudit gradient de saccharose.
69) Antigène associé a l'agent viral selon l'une quelconque des revendications 1 d 5, caractérisé en ce qu'il est obtenu par traitement d'un agent viral isolé de fèces de patients, cultivé sur des hépatocytes infectés, par des agents de dissociation physique ou chimiques.
7*) Antigène selon la revendication -6, caractérisé en ce qu'il est obtenu par traitement aux ultra-sons d'un agent viral isolé de lignées cellulaires continues d'hépatocytes infectés.
8|) Antigène selon la revendication 5 ou la revendication 7, caractérisé en ce que son profil de répartition dans un gradient de CsC1 se présente sous la forme d'une bande à une densité de 1,17-1,19 g/cm3 et/ou d'une bande de densité 1,29-1,32, et en ce que l'antigène est présent après après ultracentrifugation des fractions de CsCl dans un gradient de saccharose, dans la fraction à 26-28% du gradient de saccharose pour la première bande et dans la fraction à 40-41,5% du gradient de saccharose pour la seconde bande.
9*) Procédé d'isolement d'un agent viral impliqué dans l'hépatite virale NANB, caractérisé en ce que des fèces de patients atteints d'hépatite NANB sont soumises à un traitement de centrifugation, suivi d'un traitement de filtration à travers un élément filtrant dont la porosité est de l'ordre de 0,22 um, pour extraire ledit agent viral des fèces.
100 > Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le traitement de centrifugation est avantageusement constitué par une opération de centrifugation à 5000 - 8000 g.
Il.) Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que préalablement aux opérations de centrifugation et de filtration susdites, l'extrait de fèces est soumis à un traitement de dissociation physique, notamment par ultra-sons ou à un traitement de dissociation chimique.
12*) Procédé d'obtention d'un agent viral impliqué dans l'hépatite virale NANB, caractérisé en ce que des hépatocytes ou des lignées cellulaires continues d'hépato- cytes, sont inoculés par un extrait de fèces d'un patient atteint d'hépatite NANB ou par un extrait de foie d'un singe (de préférence Saimiri) inoculé par un extrait de fèces de patients souffrant d'hépatite NANB, et cultivés jusqu'à confluence de la culture, à partir de laquelle est réalisée une sous-culture, qui est centrifugée après plusieurs passages, pour recueillir l'agent viral recherché.
13g) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre pour l'obtention d'un agent viral impliqué dans l'hépatite virale NANB tant épidémique que sporadique.
14i) Procédé selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisé en ce que le culot de centrifugation est repris par un tampon approprié pour être soumis à un traitement de dissociation physique ou chimique qui libère dans le surnageant, de 1'Ag NANB.
15') Procédé de détection d'antigène NANB présent dans les fèces de patients atteints d'hépatite virale NANB, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un anticorps anti-NANB constitué par des immunoglobulines isolées du sérum de patients convalescents ou de singes préalablement infectés par le virus de l'hépatite NANB, qui sont incubées avec des extraits de fèces de mammifères présumés atteints d'hépatite virale NANB, pour former un immuncomplexe antigène-anticorps qui est révélé à l'aide d'un test de détection approprié de la présence de l'antigène NANB dans lesdites fèces, tel que le RIA ou 1'ELISA, notamment, pour la réalisation d'un test de détection de la présence de l'antigène NANB.
16)Procédé de détection selon la revendication 15, caractérisé en ce que des extraits de fèces de patients présumés infectés par le virus NANB, obtenus par centrifugation et filtration des fèces de ces patients, sont incubés avec des immunoglobulines provenant d'un mammifère artificiellement infecté par le virus d'hépatite NANB, pour former un immuncomplexe antigène-anticorps qui est révélé par des tests de détection appropriés tels que le RIA ou 1'ELISA, notamment.
17g) Procédé de détection selon la revendication 16, caractérisé entre que des extraits de fèces de mammifères présumés infectés par le virus NANB1 obtenus par centrifugation et filtration des fèces de ces mammifères, sont incubés avec un anticorps anti-NANB constitué par des fractions d'IgM isolées de sérums de singes infectés artificiellement par des extraits de fèces de patients humains connus pour être atteints d'hépatite NANB, fixées sur un support solide, puis avec une fraction d'IgG immune anti-virus NANB d'un mammifère de la même espèce ou d'une espèce voisine, marquée avec un marqueur fluorescent, radioactif ou enzymatique.
180) Procédé de détection selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite fraction d'IgG immune est marquée à la B-galactosidase ou à la peroxydase, la réaction étant développée à l'aide d'un substrat révélateur approprié tel que l'orthonitrophényl-B-D-galactopyranoside ou l'orthophénylènediamine en tampon acide.
19) Procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisé en ce qu'il est appliqué à la détection des anticorps dans le sang de malades ou dans des produits dérivés du sang.
20|) Procédé de détection selon la revendication 19, caractérisé en ce que la détection desdits anticorps a lieu par mise en contact de sérum de malade ou d'un patient convalescent avec la préparation virale purifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou avec une fraction de cette dernière, après centrifugation et isolement de la bande correspondant à une densité de 1,29-1,32, de préférence préalablement fixée sur les parois d'une microplaque, et révéla tion du complexe Ag/Ac par une préparation d'anti-immunoglobulines humaines marquées par un marqueur approprié.
IgM d'un patient permettant un diagnostic très précoce de la maladie, en captant les IgM d'un sérum de malade, en les faisant réagir avec la préparation virale purifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou avec une fraction de cette dernière, et en caractérisant l'Ag fixé sur l'IgM du malade à l'aide d'immunoglobulines anti-immunoglobulines humaines ou de fragments de celles-ci, marqués par un marqueur approprié.
21) Procédé de détection selon la revendication 19, caractérisé en ce que la détection desdits anticorps a lieu par caractérisation d'une activité anticorps dans les
Clamart", déposée le 30 Octobre 1986 sous le n I-617 auprès de la COLLECTION NATIONALE DE CULTURE DE MICROORGANIS > iES.
220) Souche d'un agent viral purifié, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, isolé des fèces d'un malade atteint d'hépatite virale NANB sporadique, dite "Souche
ORGANISMES.
23 ) Souche d'un agent viral purifié, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, isolé des fèces d'un malade atteint d'hépatite virale NANB épidémique, dite "Souche ivoirienne", déposée le 30 Octobre 1986 sous le n I-616 auprès de la COLLECTION NATIONALE DE CULTURE DE MICRO
NANB provenant des fèces d'un malade atteint d'hépatite virale NANB épidémique, sur des cellules hépatocytes.
24) Souche d'un agent viral purifié, dite "Souche ivoirienne", selon la revendication 23, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une culture du virus de l'hépatite
25) Souche d'agent viral selon la revendication 24, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une culture du virus de l'hépatite non A non B provenant des fèces d'un malade atteint d'hépatite virale NANB épidémique, sur une lignée cellulaire continue d'hépatocytes, en particulier sur la lignée continue dthépatocytes PLC/PRF 5 connue sous le nom de "lignée d'Alexander".
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|---|---|---|---|
| FR8615625A FR2606515B1 (fr) | 1986-11-07 | 1986-11-07 | Procede pour l'isolement d'un nouvel agent viral et de l'antigene qui lui est associe, agent viral et antigene obtenus par ce procede et procede de detection dudit antigene a l'aide d'un reactif immunologique approprie |
| ZA878303A ZA878303B (en) | 1986-11-07 | 1987-11-05 | A process for isolating and characterizing a new viral agent and its associated antigen,the antigen and viral agent obtained by this process,and detection procedures for non a,non b hepatitis using suitable immunological reagents |
| NZ23540287A NZ235402A (en) | 1986-11-07 | 1987-11-05 | Detection of non-a, non-b hepatitis, reagents and kits |
| NZ222465A NZ222465A (en) | 1986-11-07 | 1987-11-05 | Nanb (non a, non b hepatitis viral) antigen |
| ES87402519T ES2054696T3 (es) | 1986-11-07 | 1987-11-06 | Agente viral de la hepatitis nanb, antigen y reactivo inmunologico. |
| JP62506994A JP2602517B2 (ja) | 1986-11-07 | 1987-11-06 | 非ａ非ｂ型肝炎由来の新規ウイルス因子及びそれに結合した抗原の単離方法、この方法で得られたウイルス因子及び抗原、この抗原の検出方法並びに非ａ非ｂ型ウイルス性肝炎検出用免疫試薬、その製造法及び用途 |
| AT87402519T ATE86120T1 (de) | 1986-11-07 | 1987-11-06 | Hepatitis nanb-viraler stoff, antigen und immunologisches reagenz. |
| AU82734/87A AU611402B2 (en) | 1986-11-07 | 1987-11-06 | Viral agent for nanb hepatitis, antigen and immunologic reagent |
| PCT/FR1987/000441 WO1988003410A1 (fr) | 1986-11-07 | 1987-11-06 | Agent viral de l'hepatite nanb, antigene et reactif immunologique |
| DE8787402519T DE3784484T2 (de) | 1986-11-07 | 1987-11-06 | Hepatitis nanb-viraler stoff, antigen und immunologisches reagenz. |
| EP87402519A EP0277437B1 (fr) | 1986-11-07 | 1987-11-06 | Agent viral de l'hépatite NANB, antigène et réactif immunologique |
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