FR2599844A1

FR2599844A1 - CONDUCTIVE SOLID PHASE FOR IMMUNOENZYMATIC ASSAY, PROCESS FOR PREPARING THE SAME AND USE THEREOF IN IMMUNOENZYMATIC ASSAY METHODS

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Publication number: FR2599844A1
Application number: FR8608267A
Authority: FR
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1986-06-09
Filing date: 1986-06-09
Publication date: 1987-12-11
Anticipated expiration: 2006-06-09
Also published as: EP0308414A1; WO1987007725A1; FR2599844B1

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UNE PHASE SOLIDE CONDUCTRICE POUR DOSAGES IMMUNOENZYMATIQUES, CARACTERISEE EN CE QUE, SUR UNE PARTIE AU MOINS DE SA SURFACE APPELEE A ETRE EN CONTACT AVEC LE MILIEU A DOSER, EST FIXE DIRECTEMENT, SANS INTERPOSITION D'UN SUPPORT INTERMEDIAIRE, UN ANTICORPS OU UN ANTIGENE ASSURANT LA RECONNAISSANCE SPECIFIQUE DE LA MOLECULE A DOSER. CETTE PHASE SOLIDE PEUT ETRE UTILISEE COMME ELECTRODE DANS DES PROCEDES DE DOSAGE IMMUNOENZYMATIQUE.THE INVENTION RELATES TO A SOLID CONDUCTIVE PHASE FOR IMMUNOENZYMATIC DOSAGES, CHARACTERIZED IN THAT, ON AT LEAST PART OF ITS SURFACE CALLING TO BE IN CONTACT WITH THE MEDIUM TO BE DETERMINED, IS FIXED DIRECTLY, WITHOUT INTERPOSITION OF AN INTERMEDIATE SUPPORT, AN ANTICORPS OR AN ANTIGEN ENSURING THE SPECIFIC RECOGNITION OF THE MOLECULE TO BE DOSE. THIS SOLID PHASE MAY BE USED AS AN ELECTRODE IN IMMUNOENZYMATIC ASSAY METHODS.

Description

Phase solide conductrice Dour dosage immunoenzvmatiaue, son Procédé de PréParation et son utilisation dans des procédés de dosaae immunoenzvmatique. Conducting solid phase for immunoenzymatic assay, its preparation method and its use in immunoenzyme dosing processes.

La présente invention concerne une phase solide conductrice pour dosage immunoenzymatique, son procédé de préparation et son utilisation dans des procédés de dosage immunoenzymatique. Elle concerne plus particulièrement la mise en oeuvre de dosages immunoenzymatiques en phase hétérogène utilisant comme phase solide la surface conductrice d'une électrode. The present invention relates to a solid conducting phase for enzyme immunoassay, its method of preparation and its use in immunoenzymatic assay methods. It relates more particularly to the implementation of immunoenzymatic assays in heterogeneous phase using as solid phase the conductive surface of an electrode.

On sait que le dosage de substances présentes en faible concentration dans les liquides biologiques industriels soulève un grand intérêt dans les milieux scientifiques, enraison des tres nombreuses applications de ces dosages dans divers domaines techniques. It is known that the dosage of substances present in low concentrations in industrial biological liquids is of great interest in the scientific community, in view of the many applications of these assays in various technical fields.

Les techniques récentes utilisent l'activité enzymatique comme moyen de marquage et d'amplification des molécules assurant les processus de reconnaissance moléculaire qui interviennent dans les procédés d'analyse irtununologique. Recent techniques utilize enzymatic activity as a means of labeling and amplifying molecules that provide the molecular recognition processes involved in the immunoassay methods.

On a ainsi envisagé de marquer des antigènes ou desanticorps avec des enzymes telles que la peroxydase ou la glucose oxydase, dont il est possible de doser facilement l'activité par spectrophotométrie.It has thus been envisaged to label antigens or antibodies with enzymes such as peroxidase or glucose oxidase, the activity of which can be readily assayed spectrophotometrically.

On distingue, dans ces techniques, les dosages en phase homogène et les dosages en phase hétérogène
- dans les dosages en phase homogène, l'activité enzymatique est fonction de la réaction anticorps-antigène et il n'est pas nécessaire de séparer la "fraction liée", c'est-à-dire l'immunoréactant (conjugué antigène-enzyme ou anticorps-enzyme), qui a réagi dans la réaction immunologique, de la "fraction libre", qui représente l'immuno- réactant qui n'a pas réagi t
- Dans les dosages en phase hétérogène, l'activité enzymatique n'est pas modifiée par la réaction antigène anticorps et une séparation de la fraction liée et de la fraction libre s'avère nécessaire.Homogeneous phase assays and heterogeneous phase assays are distinguished in these techniques.
in the homogeneous phase assays, the enzymatic activity is a function of the antibody-antigen reaction and it is not necessary to separate the "bound fraction", that is to say the immunoreactant (conjugated antigen-enzyme or antibody-enzyme), which reacted in the immunological reaction, of the "free fraction", which represents the unreacted immuno-
In the heterogeneous phase assays, the enzymatic activity is not modified by the antibody antigen reaction and a separation of the bound fraction and the free fraction is necessary.

C'est à ces dosages en phase hétérogène que s'intéresse la présente invention et l'on commencera par rappeler les principes de ces différents dosages, qu'il est usuel de classer en méthodes compétitives et non-compétitives. It is to these heterogeneous phase assays that the present invention is interested and we will begin by recalling the principles of these different assays, which is common to classify in competitive and non-competitive methods.

Dans les méthodes dites compétitives, le conjugué enzyme-ligand (antigène ou anticorps) est mélangé avec un échantillon du milieubiologique à doser (ou avec un échantillon d'un milieu standard) contenant le ligand libre, en vue d'entrer en compétition avec ce dernier pour se combiner à des antiligands fixés en quantité limitée sur un support solide. En variante (dosage par inhibition), le ligand peut être immobilisé sur un support et entrer en compétition avec le ligand à doser, lorsqu'ils sont mis simultanément en présence d'une quantité limitée d'antiligand en solution. In the so-called competitive methods, the enzyme-ligand conjugate (antigen or antibody) is mixed with a sample of the biological medium to be assayed (or with a sample of a standard medium) containing the free ligand, in order to compete with this last to combine with antiligands fixed in limited quantity on a solid support. Alternatively (inhibition assay), the ligand can be immobilized on a support and compete with the ligand to be assayed, when simultaneously placed in the presence of a limited amount of antiligand in solution.

Dans ces méthodes, l'activité enzymatique est inversement proportionnelle à la concentration en ligand à doser.In these methods, the enzymatic activity is inversely proportional to the concentration of ligand to be assayed.

Parmi les méthodes non compétitives, la méthode dite "sandwich" est la plus connue et elle s'applique au dosage de ligands ayant au moins deux sites antigéniques. Le ligand à doser est mis en contact avec un support solide sur lequel sont fixés des anticorps. Le ligand se combine avec les anticorps et, après lavage du support, on met celui-ci en contact avec un excès déterminé des mêmes anticorps marqués par une enzyme. Ceux-ci se fixent à leur tour sur les ligands, qui sont ainsi pris en sandwich entre les anticorps fixés sur le support et ceux marqués par l'enzyme, d'où le nom de la méthode. Dans ce cas, 11 activité enzymatique est directement proportionnelle à la concentration en ligand à doser. Among the non-competitive methods, the so-called "sandwich" method is the best known and it applies to the determination of ligands having at least two antigenic sites. The ligand to be assayed is contacted with a solid support to which antibodies are attached. The ligand combines with the antibodies and, after washing the carrier, it is brought into contact with a determined excess of the same enzyme-labeled antibodies. These in turn bind to the ligands, which are thus sandwiched between the antibodies fixed on the support and those labeled by the enzyme, hence the name of the method. In this case, enzymatic activity is directly proportional to the concentration of ligand to be assayed.

L'utilisation d'une phase solide dans un dosage immunoenzymatique est une technique relativement récente, qui présente l'avantage de permettre une séparation de la fraction libre sans avoir recours à des procédés physicochimiques qui compliquent les dosages. The use of a solid phase in an enzyme immunoassay is a relatively recent technique, which has the advantage of allowing separation of the free fraction without resorting to physicochemical methods that complicate the assays.

Toutes ces méthodes en phase hétérogène nécessitent la détection aunaie de l'activité enzymatique, qui est réalisée en général en phase homogène (par des méthodes spectrophotométriques, fluorimétriques ou par bioluminescence) ou pseudo-homogène (par un capteur enzymatique). All these heterogeneous phase methods require the encephalic detection of the enzymatic activity, which is generally carried out in a homogeneous phase (by spectrophotometric, fluorimetric or bioluminescent methods) or pseudo-homogeneous (by an enzymatic sensor).

Seule une méthode optique très complexe, l'éllipsométrie, permet de détecter directement sur la phase solide la présence, par exemple, de l'anticorps utilisé pour le dosage. Only a very complex optical method, ellipsometry, makes it possible to detect directly on the solid phase the presence, for example, of the antibody used for the assay.

Mais, cette méthode n'est pas envisageable pour des mesures de routine.But this method is not feasible for routine measurements.

La présente invention vise à utiliser la phase solide elle-même comme détecteur de la présence de l'enzyme, ce qui rend le processus totalement hétérogène et facilite sa mise en oeuvre. The present invention aims to use the solid phase itself as a detector of the presence of the enzyme, which makes the process completely heterogeneous and facilitates its implementation.

I1 a été en effet établi que, lorsqu'une enzyme qui produit une espèce électroactive se trouve immobilisée en situation de proximité moléculaire sur une surface conductrice, la cinétique électrochimique et la cinétique enzyma tiaue sont interdépendantes, ce qui permet de quantifier la présence de l'enzyme par le courant électrique de détection électrochimique de cette espèce électroactiveo
Selon l'invention,cet état de proximité moléculaire peut être obtenu par l'une quelconque des méthodes immunologiques précédemment décrites, l'anticorps étant immobilisé directement sur la surface conductrice.It has been established that, when an enzyme which produces an electroactive species is immobilized in a situation of molecular proximity on a conductive surface, the electrochemical kinetics and enzymatic kinetics are interdependent, which makes it possible to quantify the presence of enzyme by the electric current of electrochemical detection of this electroactive species
According to the invention, this state of molecular proximity can be obtained by any of the immunological methods described above, the antibody being immobilized directly on the conductive surface.

Une conséquence importante de l'utilisation de ce procédé de dosage, que l'on désignera par l'expression "électrocatalyse enzymatique", est que la quantité d'enzyme détectable dans cette situation est extrêmement faible, ce qui, dans son application à un dosage immunoenzymatique, en phase hétérogène1 conduit à une sensibilité supérieure à celle des moyens de détection antérieurs. An important consequence of using this assay method, which will be referred to as "enzymatic electrocatalysis", is that the amount of detectable enzyme in this situation is extremely low, which in its application to a enzyme immunoassay, heterogeneous phase leads to a higher sensitivity than the previous detection means.

A cet effet, l'invention a pour premier objet une phase solide conductrice pour dosages immunoenzymatiques, caractérisée en ce que, sur une partie au moins de sa surface appelée à être en contact avec le milieu à doser, est fixé directement, sans interposition d'un support intermédiaire, un anticorps ou un antigène spécifique de la molécule à doser. For this purpose, the invention firstly relates to a conductive solid phase for immunoenzymatic assays, characterized in that, on at least a portion of its surface which is intended to be in contact with the medium to be assayed, is fixed directly, without the interposition of an intermediate support, an antibody or an antigen specific for the molecule to be assayed.

Cette phase solide pourra être, par exemple, en carbone, en platine ou en or et pourra prendre n'importe quelle forme en fonction des contraintes d'introduction de l'échantillon à doser (électrode plane, poreuse ou à solution percolante). This solid phase may be, for example, carbon, platinum or gold and may take any form depending on the constraints of introduction of the sample to be assayed (flat electrode, porous or percolating solution).

Les anticorps ou les antigènes peuvent être fixés sur l'électrode par tout moyen connu dans la technique, par exemple par liaison covalenteou par adsorption physique, en formant une unique couche moléculaire. Antibodies or antigens may be attached to the electrode by any means known in the art, for example by covalent bonding or physical adsorption, forming a single molecular layer.

Dans le cas d'une fixation par liaison covalente, on fera subir à l'électrode un prétraitement comprenant, de façon connue en soi, une phase de création de sites réactifs à la surface de l'électrode par oxydation électro-chimique de celle-ci et une phase d'activation de ces sites par un agent de couplage approprié à la nature de l'électrode et à celle de l'anticorps ou de l'antigène à fixer, par exemple une activation par un carbodiimide dans le cas d'une électrode en carbone
Dans le cas d'une immobilisation des anticorps ou des antigènes sur l'électrode par adsorption physique, on procèdera également à un prétraitement électrochimique de la surface de l'électrode avant de la mettre en contact avec lesdits anticorps ou antigènes.In the case of covalent bonding, the electrode will undergo a pretreatment comprising, in a manner known per se, a phase of creation of reactive sites on the surface of the electrode by electrochemical oxidation thereof. and a phase of activation of these sites by a coupling agent appropriate to the nature of the electrode and that of the antibody or antigen to be fixed, for example activation by a carbodiimide in the case of a carbon electrode
In the case of immobilization of antibodies or antigens on the electrode by physical adsorption, electrochemical pretreatment of the surface of the electrode will also be carried out before bringing it into contact with said antibodies or antigens.

Dans chaque cas d'espèce, on peut optimiser la quantité d'anticorps ou d'antigène à mettre en contact avec l'électrode en vue d'obtenir, au plus, une monocouche à la surface de l'électrode. L'épaisseur de cette couche étant réduite, elle ne fera pas "écran" devant la phase solide lors de la détection électrochimique ultérieure du produit de catalyse enzymatique. In each case, one can optimize the amount of antibody or antigen to be contacted with the electrode to obtain, at most, a monolayer on the surface of the electrode. The thickness of this layer being reduced, it will not "screen" in front of the solid phase during the subsequent electrochemical detection of the enzyme catalysis product.

L'utilisation d'une telle phase solide comme électrode dans les dosages immunoenzymologiques constitue un autre objet de la présente invention. The use of such a solid phase as an electrode in immunoenzymological assays is another object of the present invention.

Les dessins schématiques annexés illustrent différentes variantes. Sur ces dessins
Les figures 1 à 4 illustrent la préparation d'une électrode électroenzymatique conforme à l'invention et son utilisation dans un procédé de dosage par une méthode non compétitive du type "sandwich",
Les figures 5 et 6 illustrent la préparation d'une électrode selon l'invention et son application dans une méthode compétitive ;;
Les figures 7 et 8 sont des schémas, respectivement, d'une cellule électrochimique et d'un système de dosage utilisables dans les procédés de dosage électroenzymatique conforme à l'invention
Les figures 9 et 10 représentent des courbes d'étalonnage utilisées respectivement dans les dosages des Exemples 1 et 2 t
La figure 11 est un schéma d'une cellule de dosage utilisée dans 1'Exemple 3 t
La figure 12 est une courbe d'étalonnage utilisée dans 1'Exemple 3.The attached schematic drawings illustrate different variants. On these drawings
FIGS. 1 to 4 illustrate the preparation of an electroenzymatic electrode according to the invention and its use in a method of assay by a non-competitive method of the "sandwich" type,
Figures 5 and 6 illustrate the preparation of an electrode according to the invention and its application in a competitive method;
FIGS. 7 and 8 are diagrams, respectively, of an electrochemical cell and of a dosing system that can be used in the electroenzymatic determination methods according to the invention
Figures 9 and 10 show calibration curves used respectively in the assays of Examples 1 and 2 t
Fig. 11 is a diagram of a dosing cell used in Example 3
Figure 12 is a calibration curve used in Example 3.

Comme on le voit sur la figure 1, l'électrode 1, après avoir subi un traitement propre à permettre l'immobilisation à sa surface d'anticorps 2, par liaison covalente ou par adsorption physique, est mise en contact avec une solution contenant ces anticorps. Ceux-ci, qui sont des anticorps spécifiques de l'antigène à doser, se fixent à la surface de l'électrode en formant une monocouche, qui recouvre totalement ou partiellement la surface traitée, suivant les conditions du traitement et le résultat souhaité. As seen in FIG. 1, the electrode 1, after having undergone a treatment suitable for allowing the immobilization on its surface of antibody 2, by covalent bonding or by physical adsorption, is brought into contact with a solution containing these antibody. These, which are antibodies specific for the antigen to be assayed, attach to the surface of the electrode forming a monolayer, which completely or partially covers the treated surface, depending on the conditions of the treatment and the desired result.

L'électrode modifiée résultante est ensuite mise en contact avec une solution de l'antigène 3 à doser (figure 2) qui vient se fixer sur les anticorps 2. Les conditions de la mise en contact sont telles que les anticorps ne soient pas saturés en antigènes et qu'une partie des sites anticorps demeure vacante. Le nombre des liaisons antigène-anticorps formées dépendra de la concentration en antigène de la solution à doser. The resulting modified electrode is then brought into contact with a solution of the antigen 3 to be assayed (FIG. 2) which binds to the antibodies 2. The conditions of the contacting are such that the antibodies are not saturated by antigens and some of the antibody sites remain vacant. The number of antigen-antibody bonds formed will depend on the antigen concentration of the solution to be assayed.

Le temps de mise en contact de la phase solide avec la solution d'antigène, ou phase d'incubation, est de l'ordre de quelques minutes, alors que, dans la plupart des méthodes de dosages immunoenzymatiques, les durées d'incubation sont de l'ordre de 1 heure. En effet, le procédé de l'invention étant beaucoup plus sensible.que les procédés usuels, pour les raisons indiquées ci-dessus, il n'est pas nécessaire de saturer tous les sites anticorps, ce qui permet de réduire de façon importante la durée de contact. The contact time of the solid phase with the antigen solution, or incubation phase, is of the order of a few minutes, whereas in most immunoenzymatic assay methods, the incubation times are of the order of 1 hour. Since the process of the invention is much more sensitive than the usual methods, for the reasons indicated above, it is not necessary to saturate all the antibody sites, which makes it possible to significantly reduce the duration of contact.

L'électrode est alors exposée au conjugué anticorpsenzyme 4, qui vient se fixer sélectivement sur les antigènes 3 (figure 3)e Les conditions de la mise en contact peuvent être telles que les conjugués 4 saturent tous les sites antigènes, mais ceci n'est pas une obligation, si l'on procède par comparaison avec un étalon interne réalisé dans les mêmes conditions. Le temps d'incubation peut donc être considérablement réduit par rapport aux techniques antérieures. The electrode is then exposed to the antibodyenzyme 4 conjugate, which selectively binds to the antigens 3 (FIG. 3). The conditions of the contacting can be such that the conjugates 4 saturate all the antigenic sites, but this is not the case. not an obligation, if one proceeds by comparison with an internal standard made under the same conditions. The incubation time can therefore be considerably reduced compared to prior techniques.

A l'issue de la phase illustrée par la figure 3, le conjugué antigène-enzyme 4 se trouve en situation d'électro- catalyse enzymatique à la surface de 1'électrode 1. Il suffit, en effet, d'introduire dans le milieu à doser une ou des substances 5 (ou "substrats") aptes à réagir avec l'enzyme du conjugué 4, comme on le voit sur la figure 4, pour détecter et doser à l'aide de l'électrode 1 le produit 6 de la réaction enzymatique. At the end of the phase illustrated in FIG. 3, the antigen-enzyme conjugate 4 is in a situation of enzymatic electrocatalysis on the surface of the electrode 1. It is sufficient, in fact, to introduce into the medium assaying one or more substances (or "substrates") capable of reacting with the conjugate enzyme 4, as shown in FIG. 4, for detecting and assaying with the aid of the electrode 1 the product 6 of the enzymatic reaction.

C'est ainsi qu'avec l'acétylcholinesterase utilisée avec un substrat artificiel du type acétylthiocholine la réaction catalysée est : acétylthiocholine

thiocholine + acétate
La thiocholine (R-SH) produite est électrochimiquement détectée si le potentiel de l'électrode est au moins à 0,7 V par rapport à une électrode de référence du type
Ag/Ag C1

Thus, with the acetylcholinesterase used with an artificial substrate of the acetylthiocholine type, the catalyzed reaction is: acetylthiocholine

thiocholine + acetate
The thiocholine (R-SH) produced is electrochemically detected if the potential of the electrode is at least 0.7 V relative to a reference electrode of the type
Ag / Ag C1

Il est possible, à partir du courant d'oxydation obtenu, de calculer le nombre de molécules enzymatiques en situation d'électrocatalyse enzymatique et de mesurer ainsi,avec l'aide d'un étalonnage interne, la concentration de l'antigène 3. It is possible, from the oxidation current obtained, to calculate the number of enzymatic molecules in enzymatic electrocatalysis situation and thus measure, with the help of an internal calibration, the concentration of the antigen 3.

Les figures 5 et 6 illustrent le même procédé de mise en condition d'électrocatalyse enzymatique pour un conjugué antigène-enzyme 7 utilisé dans une méthode par compétition. Figures 5 and 6 illustrate the same enzymatic electrocatalysis conditioning method for an antigen-enzyme conjugate 7 used in a competition method.

Dans cette utilisation, le conjugué enzyme-ligand 7 est mis en compétition avec le ligand libre 3 du milieu biologique à doser pour se combiner avec les anticorps 2 immobilisés en formant monocouche sur l'électrode 1, (figure 5). Comme précédemment, si l'on introduit alors dans le milieu à doser une ou des substances 5 (ou substrats) aptes à réagir avec l'enzyme E du conjugué 7, on peut, comme on le voit sur la figure 6, détecter et doser à l'aide de l'électro- de 1 le produit 6 de la réaction enzymatique. In this use, the enzyme-ligand conjugate 7 is in competition with the free ligand 3 of the biological medium to be assayed to combine with the immobilized antibodies 2 forming a monolayer on the electrode 1, (FIG. 5). As previously, if one or more substances (or substrates) capable of reacting with the enzyme E of the conjugate 7 are introduced into the medium to be assayed, it is possible, as seen in FIG. 6, to detect and assay with the aid of the electrolyte 1, the product 6 of the enzymatic reaction.

Après la phase de détection illustrée par la figure 4 ou la figure 6, il peut être souhaitable, pour pouvoir réutiliser l'électrode, de la ramener à son état de départ, avant la fixation des anticorps. Dans ce cas, on procèdera à un décapage électrochimique dans des conditions analogues à celles du prétraitement de l'électrode mentionné ci-dessus, ce qui constitue un autre avantage du procédé de l'invention. After the detection phase illustrated in FIG. 4 or FIG. 6, it may be desirable, in order to be able to reuse the electrode, to return it to its starting state, before the antibodies are fixed. In this case, an electrochemical etching will be carried out under conditions similar to those of the pretreatment of the electrode mentioned above, which constitutes another advantage of the process of the invention.

Dans le cas d'une électrode en carbone vitreux, par exemple, il suffira de porter l'électrode à un potentiel d'environ 2 volts par rapport à une électrode de référence Ag/Ag Cl dans une solution oxydante, pendant quelques secondes.In the case of a glassy carbon electrode, for example, it will suffice to bring the electrode to a potential of about 2 volts relative to a reference electrode Ag / Ag Cl in an oxidizing solution, for a few seconds.

Il se peut aussi qu'après la phase de dosage, on veuille simplement réutiliser les anticorps fixés. Dans ce cas, les anticorps utilisés (par exemple monoclonaux) auront été sélectionnés pour qu'un rinçage,dans des conditions physicochimiques différentes de la mesure, assure la rupture des liaisons antigène-anticorps, sans dénaturation de l'anticorps immobilisé sur la phase solide. It may also be that after the assay phase, one simply wants to reuse the fixed antibodies. In this case, the antibodies used (for example monoclonal) have been selected so that a rinsing, under physicochemical conditions different from the measurement, ensures the breaking of the antigen-antibody bonds, without denaturation of the antibody immobilized on the solid phase. .

Naturellement,l'électrode modifiée conforme à l'invention peut être utilisée dans tous les procédés usuels de dosage immunoenzymatique en phase hétérogène, que ce soit les méthodes compétitives, sandwich ou par inhibition. Naturally, the modified electrode according to the invention can be used in all the usual immunoenzymatic assay methods in heterogeneous phase, whether it is the competitive methods, sandwich or inhibition.

Toute molécule permettant une reconnaissance immunolo gique (protéine, enzyme, hormone, haptène, etc.,,) est donc dosable par le procédé conforme a' 1'invention, moyennant l'utilisation d'un milieu et de conditions de dosage appropriées. Any molecule allowing immunological recognition (protein, enzyme, hormone, hapten, etc.) is therefore assayable by the process according to the invention, using a suitable medium and assay conditions.

On remarquera que, si la molécule à doser est une enzyme catalysant une réaction électrochimique détectable, le dosage est notablement simplifié et ne nécessite au'un anticorps de cette enzyme. C'est ce qui ressortira notamment de l'Exemple 4 qui sera décrit ci-après. It will be noted that, if the molecule to be assayed is an enzyme catalyzing a detectable electrochemical reaction, the assay is significantly simplified and does not require an antibody of this enzyme. This will emerge in particular from Example 4 which will be described below.

Pour la préparation des conjugués, l'enzyme utilisée est nécessairement une enzyme possédant comme substrat ou produit de la catalyse un couple redox électroactif. Ce couple redox, qui peut être physiologique ou artificiel, est choisi de telle sorte qu'il présente une bonne réactivité électrochimique sur l'électrode employée, afin d'obtenir une sensibilité optimale. For the preparation of the conjugates, the enzyme used is necessarily an enzyme having as substrate or product of catalysis an electroactive redox couple. This redox couple, which may be physiological or artificial, is chosen so that it has good electrochemical reactivity on the electrode used, in order to obtain optimum sensitivity.

Les enzymes correspondantes sont en général des oxydoréductases, mais peuvent être aussi des enzymes d'une autre classe, répondant à la condition précédente, par exemple des hydrolases. The corresponding enzymes are in general oxidoreductases, but can also be enzymes of another class, corresponding to the preceding condition, for example hydrolases.

Le tableau ci-après rassemble quelques enzymes utilisables pour la préparation des conjugués détectables par électrocatalyse enzymatique. The following table gathers some enzymes that can be used for the preparation of the conjugates detectable by enzymatic electrocatalysis.

TABLEAU

BOARD

<tb> :
<tb> ( <SEP> Enzymes <SEP> Réactions <SEP> catalysées <SEP> : <SEP> Molécules)
<tb> électro
<tb> actives
<tb> détectables
<tb> ( <SEP> s <SEP> s <SEP> ) <SEP>
<tb> Hydrolases
<tb> Ex. <SEP> Acétyl- <SEP> acétylthiocholine# <SEP> thiocholine <SEP> + <SEP> thiocholine
<tb> (choline <SEP> estérase: <SEP> acétate
<tb> ex. <SEP> Phosphata- <SEP> phényl <SEP> phosphate+H2O#acide <SEP> <SEP> phosphénol
<tb> se <SEP> alcaline <SEP> phorique <SEP> + <SEP> phénol
<tb> Oxydoréduct <SEP> ases <SEP> glucose
<tb> +cosubstrat#acide <SEP> <SEP> gluconique <SEP> cosubstrat
<tb> Ex.<SEP> : <SEP> glucose
<tb> +cosubstrat <SEP> réduit <SEP> réduit
<tb> <SEP> oxydase
<tb> <SEP> Le <SEP> cosubstrat <SEP> peut <SEP> être <SEP> O2 <SEP> ou <SEP> des <SEP> H2O2
<tb> <SEP> accepteurs <SEP> artificiels <SEP> comme <SEP> par
<tb> hydroquiexemple <SEP> la <SEP> benzoquinone
<tb> <SEP> none
<tb> (Ex.: <SEP> péroxydase:H202 <SEP> + <SEP> substrat <SEP> H20 <SEP> + <SEP> substrat <SEP> substrat
<tb> oxydé <SEP> : <SEP> oxydé
<tb> De <SEP> très <SEP> nombreux <SEP> substratspossibles, <SEP> ex.<SEP> 3.3'
<tb> ( <SEP> :par <SEP> exemple <SEP> orthométhoxy <SEP> phénol <SEP> sdiméthoxy <SEP> )
<tb> diphénoqui
<tb> :none <SEP> )
<tb>
La sensibilité globale des procédures de dosage dépend de trois facteurs :
- la sensibilité intrinsèque de la détection en phase solide
- le temps de contact entre l'échantillon à doser et la phase solide,
- la qualité du matériel immunologique utilisé.<tb>:
<tb>(<SEP> Enzymes <SEP> Catalyzed <SEP> Reactions <SEP>: <SEP> Molecules)
<tb> electro
<tb> active
<tb> detectable
<tb>(<SEP> s <SEP> s <SEP>) <SEP>
<tb> Hydrolases
<tb> Ex. <SEP> Acetyl- <SEP> acetylthiocholine # <SEP> thiocholine <SEP> + <SEP> thiocholine
<tb> (choline <SEP> esterase: <SEP> acetate
<tb> ex. <SEP> Phosphata- <SEP> phenyl <SEP> phosphate + H2O # acid <SEP><SEP> phosphenol
<tb> se <SEP> alkaline <SEP> phoric <SEP> + <SEP> phenol
<tb> Oxidoreductase <SEP> ases <SEP> glucose
<tb> + cosubstrate # acid <SEP><SEP> gluconic <SEP> cosubstrate
<tb> Ex. <SEP>: <SEP> glucose
<tb> + cosubstrate <SEP> reduces <SEP> reduces
<tb><SEP> oxidase
<tb><SEP> The <SEP> cosubstrate <SEP> may <SEP> be <SEP> O2 <SEP> or <SEP> of <SEP> H2O2
<tb><SEP> artificial <SEP> acceptors <SEP> as <SEP> by
<tb> hydroquexample <SEP> the <SEP> benzoquinone
<tb><SEP> none
<tb> (eg: <SEP> peroxidase: H202 <SEP> + <SEP> substrate <SEP> H20 <SEP> + <SEP> substrate <SEP> substrate
<tb> oxidized <SEP>: <SEP> oxidized
<tb> Of <SEP> very <SEP> many <SEP> substratespossibles, <SEP> eg <SEP> 3.3 '
<tb>(<SEP>: by <SEP> example <SEP> orthomethoxy <SEP> phenol <SEP> sdimethoxy <SEP>)
<tb> diphénoqui
<tb>: none <SEP>)
<Tb>
The overall sensitivity of the assay procedures depends on three factors:
- the intrinsic sensitivity of the solid phase detection
the contact time between the sample to be assayed and the solid phase,
- the quality of the immunological material used.

Pour le premier facteur, la sensibilité de détection est liée à l'activité catalytique moléculaire de l'enzyme utilisée pour l'amplification (par exemple,environ 10 000 pour un conjugué obtenu-avec l'acétylcholinestérase de
Electricus Electrophorus > . Dans ce cas, l'électrocatalyse enzymatique est capable de détecter la présence d'un minimum de 1O 16 mole de conjugué par cm de surface réelle de la phase solide.For the first factor, the detection sensitivity is related to the molecular catalytic activity of the enzyme used for the amplification (for example, about 10,000 for a conjugate obtained with the acetylcholinesterase of
Electricus Electrophorus>. In this case, enzymatic electrocatalysis is capable of detecting the presence of a minimum of 10 16 moles of conjugate per cm of real surface area of the solid phase.

Cette exceptionnelle sensibilité s'explique par la proximité moléculaire entre site enzymatique et site électrochimique, ce qui réduit à quelques nanomètres la distance que doit parcourir le produit pour être détecté. This exceptional sensitivity is explained by the molecular proximity between enzymatic site and electrochemical site, which reduces to a few nanometers the distance the product must travel to be detected.

I1 est important de noter, à ce propos, que, contrairement à toute autre méthode de détection, la sensibilité de détection du conjugué est entièrement indépendante de la surface de la phase solide. La taille et la forme de l'électrode utilisée peut donc être adaptée à la quantité d'antigène que l'on souhaite doser. It is important to note, in this connection, that, unlike any other detection method, the detection sensitivity of the conjugate is entirely independent of the surface of the solid phase. The size and shape of the electrode used can therefore be adapted to the amount of antigen that it is desired to assay.

Ce point sera illustré dans les exemples proposés. This point will be illustrated in the proposed examples.

Pour ce qui est du temps de contact entre la phase solide et l'échantillon, ce temps de contact détermine un taux de capture" T, qui peut être inférieur à 1, si tous les antigènes n1 ont pas été captés , le taux de capture étant défini comme le rapport entre le nombre de molécules antigèniques capturées par la phase solide et leur nombre total dans l'échantillon. With regard to the contact time between the solid phase and the sample, this contact time determines a capture rate "T, which can be less than 1, if all the antigens n1 have not been captured, the capture rate being defined as the ratio between the number of antigenic molecules captured by the solid phase and their total number in the sample.

Le taux T est également sensible au rapport entre le volume de l'échantillon et la surface de la phase solide. The rate T is also sensitive to the ratio between the volume of the sample and the surface of the solid phase.

Une des caractéristiques de l'invention est que la détection est suffisamment sensible pour qu'il soit possible d'accepter des taux de capture faibles (par exemple T = 0,03 dans l'exemple 1 > . One of the characteristics of the invention is that the detection is sufficiently sensitive so that it is possible to accept low capture rates (for example T = 0.03 in Example 1).

Enfin, la sensibilité pratique du procédé de dosage est fonction, comme pour toute méthode immunologique,de la qualité des anticorps utilisés ainsi que des adsorptions non spécifiques parasites sur la phase solide. Les rinçages dans des tampons appropriés, connus de l'homme de l'art, limitent ces adsorptions non spécifiques. Mais on notera que le temps d'incubation très court permis par la procédure proposée réduit considérablement ces adsorptions non spécifiques. Finally, the practical sensitivity of the assay method is a function, as for any immunological method, of the quality of the antibodies used as well as non-specific adsorption parasites on the solid phase. Rinses in appropriate buffers, known to those skilled in the art, limit these non-specific adsorptions. But it should be noted that the very short incubation time allowed by the proposed procedure considerably reduces these non-specific adsorptions.

La sensibilité globale obtenue est finalement un paramètre modulable en fonction du problème analytique traité, Les exemples présentés ci-après illustrent des sensibilités effectives pouvant atteindre 2. -12 mole par litre ou 2,1o21 mole dans la prise d'essai. The overall sensitivity obtained is finally a parameter that can be modulated according to the analytical problem being treated. The examples presented below illustrate effective sensitivities of up to 2. -12 mol per liter or 2.1021 mol in the test sample.

Ceci marque un progrès appréciable par rapport aux méthodes usuelles, dont la sensibilité est en général de l'ordre de 10-10 mole par litre. This marks an appreciable progress compared to the usual methods, the sensitivity of which is in general of the order of 10-10 mol per liter.

Les exemples suivants illustrent diverses formes de mise en oeuvre de ltinvention. The following examples illustrate various embodiments of the invention.

EXEMPLE 1
Cet exemple illustre le dosage d'une immunoglobine G par la méthode "sandwich" sur une phase solide de surface moyenne (électrode plane de-carbone vitreux de surface d'environ 0,1 cm2).EXAMPLE 1
This example illustrates the assay of an immunoglobulin G by the "sandwich" method on a medium surface solid phase (surface electrode of glassy surface carbon of about 0.1 cm 2).

1) PréDaration des réactifs
L'anticorps anti lgG de lapin a été fourni par les laboratoires BYOSIS, de Compiègne (France). Il a été obtenu chez le mouton et puririé selon les procédures connues. Le conjugué glucose oxydase-anti lgG est préparé par la méthode au glutaraldéhyde d'AVRA4EAS et al (Immunochemistry, Pergamon press 6, 43-52 (1969). Après purification, le conjugué est enzymatiquement actif à 95 % et immunologiquement actif à 60 %.1) Preparation of reagents
Anti-rabbit IgG antibody was provided by BYOSIS Laboratories, Compiègne, France. It was obtained in sheep and puririé according to the known procedures. The glucose oxidase-anti IgG conjugate is prepared by the glutaraldehyde method of AVRA4EAS et al (Immunochemistry, Pergamon Press 6, 43-52 (1969).) After purification, the conjugate is enzymatically active at 95% and immunologically active at 60%. .

2) AsDareillaqe. 2) AsDareillaqe.

La mesure pourra, par exemple, être effectuée dans une cellule électrochimique 9 à circulation, du type illustré par la figure 7. The measurement may, for example, be carried out in a circulating electrochemical cell 9, of the type illustrated in FIG. 7.

Dans cette cellule, le liquide arrive par une canalisation 10, circule en lame mince délimitée par une pellicule 11 de matière plastique, par exemple de P T F E, et est évacué par une canalisation 12. La cellule comprend, par ailleurs, une électrode de travail 13, par exemple en carbone vitreux, une contre-électrode 14, par exemple du type
Ag/Ag C1, et une électrode de décapage 15, par exemple en carbone vitreux. Les électrodes sont gainées sur toute leur surface latérale par une matière isolante et ne sont en contact avec le liquide à doser que par leur face d'extrémité. Bien entendu, une telle cellule n'a qu'une valeur d'exemple et l'on pourrait utiliser tout autre système conçu par 1'homme de l'art. In this cell, the liquid arrives via a pipe 10, circulates in a thin section delimited by a film 11 of plastics material, for example of PTFE, and is discharged through a pipe 12. The cell furthermore comprises a working electrode 13 , for example glassy carbon, a counter-electrode 14, for example of the type
Ag / Ag C1, and a pickling electrode 15, for example glassy carbon. The electrodes are sheathed over their entire lateral surface by an insulating material and are in contact with the liquid to be dosed only by their end face. Of course, such a cell is only exemplary and any other system designed by those skilled in the art could be used.

La cellule 9 s'incorpore dans un système entièrement automatisé du type de celui de la figure 8, qui permet un étalonnage interne assurant la précision du dosage. The cell 9 is incorporated in a fully automated system of the type of that of Figure 8, which allows an internal calibration ensuring the accuracy of the assay.

La cellule électrochimique 9 est alimentée par la canalisation 10 à partir d'un circuit fluidique 16, lui-même alimenté en réactifs par le conduit 17, avec prise d'échantillon éventuelle par le conduit 18. Les électrodes 13, 14 et 15 sont connectées à un système d'alimentation électrique 19, qui sert en même temps d'interface électronique de contrôle et d'acquisition, couplée à un microordinateur 20. The electrochemical cell 9 is supplied by the pipe 10 from a fluid circuit 16, itself supplied with reagents via the pipe 17, with possible sampling by the conduit 18. The electrodes 13, 14 and 15 are connected. to a power supply system 19, which at the same time serves as an electronic control and acquisition interface, coupled to a microcomputer 20.

3) Dosage
On utilise, dans ce cas, le principe de la méthode "sandwich" décrite en référence aux figures 1 à 4. L'introduction et la circulation des réactifs est assurée par le circuit fluidique 16 de la manière suivante
L'électrode de travail est oxydée 5 secondes dans un mélange nitrochromique (10 % en poids de HN03 + 2% en poids de K2Cr2O7 + eau) par passage d'un courant de 5 mA. L'électrode 15 est utilisée comme cathode. Cette phase de décapage de l'électrode régénère la surface de la phase solide et facilite l'adsorption de l'anticorps.3) Dosage
In this case, the principle of the "sandwich" method described with reference to FIGS. 1 to 4 is used. The introduction and circulation of the reagents is ensured by the fluid circuit 16 in the following manner
The working electrode is oxidized for 5 seconds in a nitrochromic mixture (10% by weight of HNO 3 + 2% by weight of K 2 Cr 2 O 7 + water) by passing a current of 5 mA. The electrode 15 is used as a cathode. This pickling phase of the electrode regenerates the surface of the solid phase and facilitates the adsorption of the antibody.

Après rinçage au tampon (phosphate 0,01 M, pH 7,4RNaCl 0,15 M), une solution d'anticorps (300g/ml dans le même tampon) est mise en contact 5 minutes avec la phase solide. Un rinçage pendant 2 minutes au tampon bloquant (phosphate 0,01 M, pH 7,4 + gélatine 0,25 % + Tween 20,0,1% (monolaurate de polyoxyéthylènesorbitane commercialisé sous cette appelation et utilisé commetensio-atif ) + NaCl 0,15 M) permet d'éliminer l'anticorps én excès. After rinsing with the buffer (0.01M phosphate, pH 7.4NaCl 0.15M), an antibody solution (300g / ml in the same buffer) is contacted for 5 minutes with the solid phase. Rinse for 2 minutes with the blocking buffer (0.01 M phosphate, pH 7.4 + 0.25% gelatin + Tween 20.0.1% (polyoxyethylenesorbitane monolaurate marketed under this name and used as a commetensitive) + NaCl 0 , 15M) makes it possible to eliminate the excess antibody.

On introduit 0,2 cm3 de la solution contenant l'antigène 3 à doser avec un débit de 0,1 cm par minute. Cette phase est suivie par 2 minutes de rinçage au tampon bloquant. 0.2 cm3 of the solution containing the antigen 3 to be assayed with a flow rate of 0.1 cm per minute are introduced. This phase is followed by 2 minutes of rinsing with blocking buffer.

Le conjugué (100 g/cm3 dans le tampon bloquant) est introduit pendant 1 minute, puis rincé par une solution de benzoquinone (10 M dans du tampon acétate 0,1 M,pH 5,6 +
NaCl 0,15 M).The conjugate (100 g / cm 3 in the blocking buffer) is introduced for 1 minute, then rinsed with a solution of benzoquinone (10 M in 0.1 M acetate buffer, pH 5.6 +
0.15 M NaCl).

Le courant de l'électrode, portée à 350 mV par rapport à l'électrode 14, est alors échantillonné pendant 1 minute par le système d'acquisition de données 19 et 20. The current of the electrode, raised to 350 mV with respect to the electrode 14, is then sampled for 1 minute by the data acquisition system 19 and 20.

L'introduction de glucose 0,2 M dans la même solution provoque un saut de courant , dû à la détection de l'hydroquinone enzymatiquement formée. Ce saut de courant, pratiquement instantané, est directement proportionnel à la quantité de conjugué en position d'électrocatalyse enzymatique. I1 est relié par une courbe d'étalonnage (figure 9) à la concentration en IgG dans l'échantillon.The introduction of 0.2 M glucose in the same solution causes a current jump, due to the detection of enzymatically formed hydroquinone. This current jump, which is practically instantaneous, is directly proportional to the quantity of conjugate in the enzymatic electrocatalysis position. It is connected by a calibration curve (Figure 9) to the IgG concentration in the sample.

Le taux de capture calculé est ici de l'ordre de 0,03 et la sensibilité de l'ordre de 2.1O11 mole/l en antigène, soit 4.10 mole d'antigène dans la prise d'essai. Le cycle de mesure peut alors recommencer par le décapage de la phase solide. L'ensemble du cycle dure ici 20 minutes y compris l'adsorption de l'anticorps sur la phase solide. The calculated capture rate is here of the order of 0.03 and the sensitivity of the order of 2.1011 mol / l antigen, or 4.10 mol of antigen in the sample. The measurement cycle can then begin again by stripping the solid phase. The entire cycle lasts 20 minutes including the adsorption of the antibody on the solid phase.

EXEMPLE 2
Cet exemple concerne le dosage d'un stéroïde, le 17ss oestradiol,par une méthode dite "compétitive ",sur une phase solide de surface moyenne (électrode plane de carbone vitreux de 0,1 cm de surface).EXAMPLE 2
This example relates to the determination of a steroid, 17ss estradiol, by a so-called "competitive" method, on a medium-surface solid phase (glassy surface carbon electrode 0.1 cm in area).

1) Réactifs
L'anticorps de lapin anti-oestradiol a été obtenu d'un laboratoire spécialisé. Le conjugué oestradiol-acétylcholi nestérase a été préparé selon la méthode de ERLANGER et al (Methods in immunology and immunochemistry, Academic Press, vol 1 144, (1967). 1) Reagents
The anti-estradiol rabbit antibody was obtained from a specialized laboratory. The estradiol-acetylcholinesterase conjugate was prepared according to the method of ERLANGER et al (Methods in Immunology and Immunochemistry, Academic Press, vol. 1 144, (1967).

2) Anpareillave
On utilise le même appareillage que dans 1'Exemple 1.2) Anpareillave
The same apparatus as in Example 1 is used.

3) Dosage
On utilise le principe de la méthode par compétition de l'antigène vis-à-vis de l'antigène marqué pour la phase solide , décrite en référence aux figures 5 et 6.3) Dosage
The principle of the antigen competitive method against the labeled antigen for the solid phase is described with reference to FIGS. 5 and 6.

L'introduction et la circulation des réactifs est assurée automatiquement par le circuit fluidique 16 selon la chronologie suivante t
Les phases de décapage puis d'adsorption de l'anticorps anti-oestradiol sont identiques aux deux premières phases de l'Exemple 1.The introduction and circulation of the reagents is ensured automatically by the fluidic circuit 16 according to the following chronology t
The stripping and adsorption phases of the anti-estradiol antibody are identical to the first two phases of Example 1.

Pendant la phase de compétition, une solution de conjugue antigène-enzyme de concentration appropriée est introduite aveclasolution à doser. Le débit de ce mélange 3 échantillon/conjugué est de 0,1 cm /min et cette phase dure 3 minutes. During the competition phase, a solution of antigen-enzyme conjugate of appropriate concentration is introduced with the solution to be assayed. The flow rate of this sample / conjugate mixture is 0.1 cm / min and this phase lasts 3 minutes.

Après un rinçage d'une minute au tampon phosphate (0,01 M pH 7,5 + NaCl 0,15 M), la solution d'acétylthio. After rinsing for one minute with phosphate buffer (0.01 M pH 7.5 + 0.15 M NaCl), the acetylthio solution.

choline (5.10 M dans le même tampon) est introduite.choline (5.10 M in the same buffer) is introduced.

Le saut de courant mesuré par l'électrode 13 préala blement portée à + 700 mV par rapport à l'électrode 14 correspond à l'oxydation de la thiocholine produitepar le conjugué en position d'électrocatalyse enzymatique. The current jump measured by the electrode 13 previously increased to + 700 mV relative to the electrode 14 corresponds to the oxidation of the thiocholine produced by the conjugate in the position of enzymatic electrocatalysis.

Dans ce cas, le courant mesuré est inversement proportionnel à la concentration en antigène dans l'échantillon à doser. La figure 10 représente une courbe d'étalonnage. In this case, the measured current is inversely proportional to the concentration of antigen in the sample to be assayed. Figure 10 shows a calibration curve.

EXEMPLE 3
Cet exemple concerne le dosage d'une immunoglobine
G par la méthode "sandwich", à l'aide d'une phase solide de grande surface (électrode en feutre de carbone de surface réelle 50 cm2)
1) Réactifs
Les anticorps - ont la même provenance que ceux de l'Exemple 1. Le conjugué est ici obtenu par couplage de l'acétylcholinestérase de Electricus electrophorus sur l'anticorps par la méthode au carbodiimide décrite par
Goodfriend T.L. et al., Science 1964, 144, 1344 - 46.EXAMPLE 3
This example concerns the determination of an immunoglobulin
G by the sandwich method, using a large surface solid phase (real surface carbon fiber electrode 50 cm 2)
1) Reagents
The antibodies have the same origin as those of Example 1. The conjugate is here obtained by coupling the acetylcholinesterase of Electricus electrophorus to the antibody by the carbodiimide method described by
Goodfriend TL et al., Science 1964, 144, 1344-46.

2) A > nareillaqe
L'appareillage utilisé est représente schématiquement sur la figure 11. La phase solide est un cylindre 22 de feutre de carbone (par exemple, celui portant la référence
RVC 2000 commercialisé par la Société Le Carbone Lorraine) de 7 mm de long sur 5 mn de diamètre, correspondant à une surface réelle de fibre de carbone de l'ordre de 50 cm2.2) A> nareillaqe
The apparatus used is diagrammatically in FIG. 11. The solid phase is a cylinder 22 of carbon felt (for example, the one bearing the reference
RVC 2000 marketed by the company Carbone Lorraine) 7 mm long and 5 minutes in diameter, corresponding to a real surface of carbon fiber of the order of 50 cm 2.

Le contact électrique avec cette électrode de travail est assuré par l'électrode annulaire 23 en platine. La solution, introduite par 24, percole au travers de l'électrode 22 et est évacuée par la sortie 25.The electrical contact with this working electrode is provided by the annular electrode 23 in platinum. The solution, introduced by 24, percolates through the electrode 22 and is discharged through the outlet 25.

L'électrode de référence 26 et la électrode de décapage 27 sont identiques à celles de la figure 7. Ce microréacteur électrochimique 21 s'incorpore à la place de la cellule électrochimique dans le système automatisé décrit dans la figure 8. The reference electrode 26 and the pickling electrode 27 are identical to those of FIG. 7. This electrochemical microreactor 21 is incorporated in place of the electrochemical cell in the automated system described in FIG. 8.

Ce micro réacteur est particulièrement efficace pour les solutions très diluées qui nécessitent un taux de capture élevé. Il permet également de réduire encore les temps de contact entre solutions et phase solide du fait de l'important rapport surface/volume obtenu. This micro reactor is particularly effective for very dilute solutions that require a high capture rate. It also makes it possible to further reduce the contact time between solutions and solid phase due to the large surface / volume ratio obtained.

3) Dosaae
Dans son principe, le processus de dosage est identique à celui de l'exemple 1, avec les différences suivantes
- le temps d'adsorption de l'anticorps est réduit à 2 minutes ;
- l'échantillon à doser (volume 10 cm3) est introduit avec un débit de 5 cm3/minute ;
- le potentiel de l'électrode 22 pendant la phase de mesure est à + 700 mV par rapport à l'électrode 26 t le saut de courant est obtenu par introduction du substrat de l'enzyme, ici l'acétylthiocholine 510 M M dans un tampon phosphate 0,01 M,pH 7,5/NaC1 0,15 M.3) Dosaae
In principle, the assay process is identical to that of Example 1, with the following differences
the adsorption time of the antibody is reduced to 2 minutes;
the sample to be assayed (volume 10 cm 3) is introduced with a flow rate of 5 cm 3 / minute;
the potential of the electrode 22 during the measurement phase is at + 700 mV with respect to the electrode 26, the current jump is obtained by introducing the substrate of the enzyme, here the 510 MM acetylthiocholine into a buffer 0.01 M phosphate pH 7.5 / NaCl 0.15 M.

La procédure de décapage de la phase solide est différente à cause de sa grande surface. Dans ce cas, l'alimentation 18 impose un courant alternatif à la fréquence du secteur d'environ - 3V d'amplitude entre l'électrode de travail 22 et l'électrode 270
Cette phase, réalisée en présence du mélange nitrochromique (10 % HN03 + K2Cr207 2 %), dure 5 secondes. Elle est suivie d'une phase de rinçage au tampon phosphate 0,01
M,pH 7,4 > . The stripping procedure of the solid phase is different because of its large surface area. In this case, the power supply 18 imposes an alternating current at the mains frequency of approximately -3V amplitude between the working electrode 22 and the electrode 270
This phase, carried out in the presence of the nitrochromic mixture (10% HNO 3 + K 2 Cr 2 O 7), lasts 5 seconds. It is followed by a phase of rinsing with 0.01 phosphate buffer
M, pH 7.4>.

L'ensemble du cycle de mesure dure 15 minutes et un exemple de courbe de calibration est donné sur la figure 12. La sensibilité est de l'ordre de 2.10 mole/1 avec un taux de capture compris entre 0,5 et 0,90 On remarquera que, Si une moins bonne sensibilité est désirée, il suffit de réduire le volume de l'échantillon. The entire measurement cycle lasts 15 minutes and an example of a calibration curve is given in FIG. 12. The sensitivity is of the order of 2.10 mol / l with a catch rate of between 0.5 and 0.90. It will be noted that, if a lower sensitivity is desired, it is sufficient to reduce the volume of the sample.

EXEMPLE 4
Cet exemple concerne la détection et la localisation d'une protéine in vivo à l'aide d'une microélectrode (fibre de carbone de diamètre 10 m).EXAMPLE 4
This example relates to the detection and localization of a protein in vivo using a microelectrode (carbon fiber diameter 10 m).

Dans cet exemple, la phase solide est utilisée pour détecter la présence d'acétylcholinestérase libre localisée à la périphérie d'une cellule nerveuse dans la moelle épinière du rat. L'anticorps anti-acétylcholinestérase est immobilisé sur la fibre de carbone, qui est introduite sous contrôle microscopique dans les tissus, selon les méthodes habituelles à l'électrophysiologie. In this example, the solid phase is used to detect the presence of free acetylcholinesterase located at the periphery of a nerve cell in the rat spinal cord. The anti-acetylcholinesterase antibody is immobilized on the carbon fiber, which is introduced under microscopic control into the tissues, according to the usual methods of electrophysiology.

1) Réactifs
L'anticorps monoclonal anti-acétylcholinestérase adapté à cette mesure n'est pas commercialisé et a été fourni par un laboratoire de recherches universitaire spécialisé.1) Reagents
The anti-acetylcholinesterase monoclonal antibody suitable for this measure is not commercially available and has been provided by a specialized university research laboratory.

2) ADareillaqe
On utilise ici une méthode manuelle.2) ADAREilla
Here we use a manual method.

La microélectrode utilisée (par exemple celle portant la référence MFC1 commercialisée par SOLEA-TACUSSEL) est sectionnée de telle sorte que la longueur utile de la fibre
soit d'environ 50 m. Compte tenu du diamètre (10 pin),
ceci correspond à une surface externe de la fibre de
l'ordre de 1,6.10 5 cm2
Pendant la phase de contact avec l'échantillon,
l'électrode est montée sur un stand de micromanipulation.The microelectrode used (for example that bearing the reference MFC1 marketed by SOLEA-TACUSSEL) is sectioned so that the useful length of the fiber
about 50 m. Given the diameter (10 pin),
this corresponds to an outer surface of the fiber of
the order of 1.6 × 10 5 cm 2
During the contact phase with the sample,
the electrode is mounted on a micromanipulation stand.

Pendant la phase de mesure de l'activité enzymatique, l'électrode est placée comme électrode de travail dans un montage électrochimique classique à trois électrodes. Le courant est mesuré à l'aide d'un picoampéromètre, à cause des faibles courants débités. During the measurement phase of the enzymatic activity, the electrode is placed as a working electrode in a conventional electrochemical assembly with three electrodes. The current is measured using a picoammeter, because of the low currents.

3) Dosage
La micro-électrode est prétraitée par passage de 10 A pendant 5 secondes dans le mélange nitrochromique de l'Exemple 1. Après rinçage au tampon phosphate
(0.01 M, pH 7,4), l'anticorps anti-acétylcholinestérase est adsorbé par simple trempage de la fibre dans une solution à 10 pg/cm3 dans le même tampon.3) Dosage
The microelectrode is pretreated by passing 10 A for 5 seconds in the nitrochromic mixture of Example 1. After rinsing with phosphate buffer
(0.01 M, pH 7.4), the anti-acetylcholinesterase antibody is adsorbed by simply soaking the fiber in a 10 μg / cm3 solution in the same buffer.

Après rinçage au tampon bloquant de 1'Exemple 1, l'électrode est fixée sur un micromanipulateur et la pointe de la fibre de carbone est enfoncée dans la préparation pendant 2 minutes. La localisation s'effectue sous microscope. After rinsing with the blocking buffer of Example 1, the electrode is attached to a micromanipulator and the tip of the carbon fiber is pressed into the preparation for 2 minutes. The location is done under a microscope.

La détection de l'acétylcholinestérase ainsi "prélevée"par les anticorps fixés sur l'électrode peut ensuite être effectuée, en différé, dans la cellule électrochimique. Les courants mesurés sont de l'ordre de 10 à 100 pico A, en fonction de la quantité d'enzyme à détecter et des temps de contact in vivo. La sensibilité, exprimée ici en quantité d'enzyme et non en concentration, est de l'ordre de 2,1O21 mole d'acétylcholinestérase. The detection of the acetylcholinesterase thus "taken" by the antibodies fixed on the electrode can then be carried out, laterally, in the electrochemical cell. The measured currents are of the order of 10 to 100 pico A, depending on the amount of enzyme to be detected and the contact times in vivo. The sensitivity, expressed here in amount of enzyme and not in concentration, is of the order of 2.1021 mole of acetylcholinesterase.

La méthode est semi quantitative, à condition de standardiser les temps de contact avec des témoins.The method is semi-quantitative, provided standardizing the contact time with controls.

On remarquera que la méthode peut être utilisée in vitro selon les mêmes principes, dans le cas de volumes d'échantillons très faibles (par exemple de volume inférieur à 1 1). Ceci prouve la très grande sensibilité de la méthode de détection0 It will be noted that the method can be used in vitro according to the same principles, in the case of very small sample volumes (for example of volume less than 1 1). This proves the very high sensitivity of the detection method

Claims

1.- conductive solid phase for immunoenzymatic assays, characterized in that, on at least part of its surface, which is intended to be in contact with the medium to be assayed, an antibody or an intermediate is fixed directly without the interposition of an intermediate support; antigen providing specific recognition of the molecule to be assayed.

2.- solid phase according to claim 1, characterized in that the antibody or antigen is attached to its surface in a single monomolecular layer.

3. Solid phase according to one of claims 1 and 2 characterized in that it consists of or comprises carbon, platinum or gold.

4. Solid phase according to one of claims 1 to 3, characterized in that the antibody or the dosage antigen is fixed on the electrode by covalent bond with certain sites thereof.

5. Modified solid phase according to one of claims 1 to 3, characterized in that the antibody or the dosage antigen is attached to the electrode by physical adsorption.

6. A process for the preparation of a solid phase according to claim 4, characterized in that, in a manner known per se, reactive sites are shown by electrochemical oxidation on the surface of said electrode, in that the said sites are activated with a coupling agent appropriate to the nature of the electrode and that of the antibody or antigen to be fixed, and in that the electrode thus pretreated is brought into contact with said antigens or antibodies.

7. A process for the preparation of a solid phase according to claim 5, characterized in that an electrochemical oxidation of the surface of the electrode is carried out and in that the surface thus treated is brought into contact with said antigens or antibodies.

8. The use of a solid phase according to one of claims 1 to 5 as electrodes in an enzyme immunoassay method involving an enzyme which has a substrate whose product is electroactive on said solid phase.

9.- Use according to claim 8, characterized in that, in end-dosing, the electrode is subjected to electrochemical pickling by action of a direct or alternating current, for the purpose of separating the antibodies and / or antigens that are in solidarity.

10. Use according to claim 8, characterized in that at the end of the assay, the immunoreactant is separated from the antigen or antibody attached to the electrode without separating said antigen or said antibody from the electrode, by rinsing the electrode with a liquid whose conditions of pH and / or polarity are different from those of the dosing medium.