FR2598621A1 - NOVEL ANTIGENIC FRACTION OBTAINED BY RELEASE INTO A CULTURE OF CHOLERIC VIBRIONS, PROCESS FOR PREPARING SUCH A FRACTION AND ITS APPLICATION TO THE PREPARATION OF AN ORAL CHOLERIC VACCINE - Google Patents
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Abstract
Description
Nouvelle fraction antigénique obtenue par libération dans un milieu de culture de vibrions cholériques, procédé de préparation d'une telle fraction et son application à la préparation d'un vaccin cholérique oral.New antigenic fraction obtained by release into a culture medium of cholera vibrios, process for the preparation of such a fraction and its application to the preparation of an oral cholera vaccine.
La présente invention a trait à une nouvelle fraction antigénique obtenue par libération dans un milieu de culture de vibrions cholériques pathogènes, et destinée à être utilisée dans la préparation d'un vaccin cholérique oral
Elle concerne également le procédé de préparation d'une telle fraction et le vaccin correspondant.The present invention relates to a new antigenic fraction obtained by release into a culture medium of pathogenic cholera vibrios, and intended for use in the preparation of an oral cholera vaccine
It also relates to the process for the preparation of such a fraction and the corresponding vaccine.
Le choléra est une maladie qui se caractérise par une diarrhée infectieuse aiguë due à l'entérotoxine du vibrion cholérique et par une déshydratation extrêmement rapide Cette naladie, qui sévit principalement dans les pays pauvres et plus particulièrement en Asie du Sud-Est, au
Bengladesh et dans toute l'Afrique, est souvent mortelle lorsqu'elle atteint des organismes mal nourris et affaiblis.Cholera is a disease which is characterized by an acute infectious diarrhea due to the enterotoxin of the cholera vibrio and by extremely rapid dehydration This illness, which prevails mainly in poor countries and more particularly in Southeast Asia,
Bangladesh and throughout Africa is often fatal when it reaches malnourished and weakened organisms.
Le développement des transports et des échanges interhumains ont facilité ces dernières années la diffusion des vibrions cholériques, créant des foyers secondaires et constituant une menace pour la santé de nombreux pays. The development of transport and human-to-human exchanges have facilitated the spread of cholera vibrios in recent years, creating secondary foci and constituting a threat to the health of many countries.
On a cherché, depuis, à mettre au point un vaccin qui puisse efficacement protéger contre le choléra et qui soit facile à administrer. Efforts have since been made to develop a vaccine which can effectively protect against cholera and which is easy to administer.
Pendant très longtemps, on a administré par voie parentérale des vaccins constitués de V. cholerae tués, sans avoir toutefois de certitude sur l'immunité que de tels vaccins pouvaient apporter. For a very long time, vaccines made up of killed V. cholerae have been administered parenterally, without, however, being certain of the immunity that such vaccines could provide.
Des résultats d'études menés au Bengladesh, à
Calcutta et aux Philippines et ayant porté sur plusieurs centaines de milliers de sujets ont clairement montré que ce type de vaccin, bien que provoquant une réponse sérologique importante, n'apportait pas une protection suffisante pour pouvoir modifier l'endémicité et l'épidémicité du choléra.Results of studies conducted in Bangladesh,
Calcutta and the Philippines and having covered several hundred thousand subjects have clearly shown that this type of vaccine, although provoking a significant serological response, does not provide sufficient protection to be able to modify the endemicity and epidemicity of cholera .
Plus tard, la toxine cholérique ayant été reconnue comme la seule responsable de la maladie, on a espéré pouvoir se protéger contre le choléra, de la même manière que contre la diphtérie ou le tétanos, en vaccinant au moyen d'une anatoxine administrée par voie parentérale. Later, the cholera toxin having been recognized as solely responsible for the disease, it was hoped to be able to protect oneself against cholera, in the same way as against diphtheria or tetanus, by vaccinating with an toxoid administered by route parenteral.
Ce type de vaccination, bien qu'apportant une certaine protection contre le choléra, a été abandonné par suite d'une mauvaise tolérance et d'une durée de protection trop courte.This type of vaccination, although providing some protection against cholera, was abandoned due to poor tolerance and too short a period of protection.
C'est à la lumière d'études épidémiologiques, mais surtout au vu des résultats obtenus sur volontaires recevant une dose d'épreuve de vibrions cholériques, qu'il est apparu que la maladie elle-même apportait une protection efficace et de longue durée. It was in the light of epidemiological studies, but especially in view of the results obtained on volunteers receiving a test dose of cholera vibrios, that it appeared that the disease itself provided effective and long-term protection.
Les recherches se sont alors orientées vers la mise au point de vaccins oraux tendant à reproduire la réponse immunitaire obtenue par la maladie, mais en évitant ses effets pathologiques. Ces effets étant strictement limités à la muqueuse de l'intestin grêle, c'est à ce niveau que l'on a cherché à provoquer une réponse immunitaire capable de s'opposer, soit au développement des vibrions1 soit à l'action de l'entérotoxine libérée. Research was then directed towards the development of oral vaccines tending to reproduce the immune response obtained by the disease, but avoiding its pathological effects. These effects being strictly limited to the mucosa of the small intestine, it is at this level that we have sought to provoke an immune response capable of opposing either the development of vibrios1 or the action of the enterotoxin released.
Les vaccins destinés à assurer une neutralisation de la toxine cholérique sont constitués de sousunités B de cette même toxine (choléragénoide) ou encore de procholéragénoide obtenu par chauffage contrôlé de la toxine. Vaccines intended to neutralize cholera toxin are made up of B subunits of this same toxin (choleragenoid) or even procholeragenoid obtained by controlled heating of the toxin.
Ceux destinés à empêcher la colonisation de la muqueuse intestinale par le V. cholerae sont constitués de composants antigéniques de vibrions1 isolés ou en mélange, tels que flagelle, enzymes extracellulaires, adhésines, lipopolysaccharide, protéines de la membrane externe. Those intended to prevent colonization of the intestinal mucosa by V. cholerae consist of antigenic components of vibrios1 isolated or in mixture, such as flagellum, extracellular enzymes, adhesins, lipopolysaccharide, proteins of the outer membrane.
Le brevet français n' 73 03734 décrit un vaccin de ce type constitué d'une fraction antigénique obtenue après lyse d'un culot bactérien dans le but dlen libérer le matériel endocellulaire. French Patent No. 73 03734 describes a vaccine of this type consisting of an antigenic fraction obtained after lysis of a bacterial pellet in order to release the endocellular material.
Il a été également proposé des vaccins oraux visant à empêcher la colonisation de la muqueuse intestinale par le V. cholerae, qui sont constitués par des germes tués ou par des germes vivants préparés à partir de mutants, soit hypotoxigéniques (M13), soit produisant une toxine exempte de fragment A et obtenue par clonage après mutation (Texas
Star SR) ou par des techniques.de recombinaison génétique.Oral vaccines have also been proposed to prevent colonization of the intestinal mucosa by V. cholerae, which consist of killed germs or live germs prepared from mutants, either hypotoxigenic (M13) or producing fragment A-free toxin obtained by cloning after mutation (Texas
Star SR) or by techniques of genetic recombination.
Aucun de ces vaccins, toutefois, n' a réussi jusqu'ici à s'imposer, soit en raison de leur mauvaise tolérance, soit parce qu'ils ne confèrent pas une durée de protection suffisamment longue. None of these vaccines, however, has so far been successful, either because of their poor tolerance or because they do not provide a sufficiently long period of protection.
Enfin, des vaccins combinant des dérivés de la toxine cholérique avec des constituants membranaires ou des germes entiers tués sont actuellement en développement. Finally, vaccines combining derivatives of cholera toxin with membrane constituents or killed whole germs are currently in development.
te demandeur s'est attaché à mettre au point un vaccin cholérique qui soit administrable par voie orale, donc facile à mettre en oeuvre, et qui puisse conférer une protection de longue durée. The applicant has endeavored to develop a cholera vaccine which can be administered by the oral route, therefore easy to implement, and which can confer long-term protection.
Un objectif de l'invention est de proposer une nouvelle fraction antigénique obtenue par libération dans un milieu de culture de vibrions cholériques pathogènes et qui, lorsqu'elle est administrée par voie orale, est capable d'induire au niveau de l'intestin une réponse immunitaire locale s'opposant à la colonisation ultérieure par les V. cholerae vivants. An objective of the invention is to provide a new antigenic fraction obtained by release into a culture medium of pathogenic choleric vibrios and which, when administered orally, is capable of inducing a response in the intestine local immune system opposing subsequent colonization by live V. cholerae.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un procédé de préparation d'une telle fraction vaccinante. Another objective of the invention is to propose a process for the preparation of such a vaccinating fraction.
Un autre objectif encore de l'invention est de fournir un vaccin cholérique contenant comme principe actif ladite fraction. Yet another objective of the invention is to provide a cholera vaccine containing said fraction as an active ingredient.
Le procédé de préparation de la fraction antigénique conforme à l'invention est caractérisé en ce qu'il consiste
- à cultiver des vibrions cholériques, de préférence dans un milieu pauvre en éléments nutritifs et exempt de fer, dans des conditions qui favorisent la biosynthèse des antigènes de surface et la libération dans le milieu de culture d'un complexe antigénique particulaire de lipopolysaccharide de caractère lisse et de protéines de membrane externe ; et
- à soumettre le surnageant, après élimination des corps bactériens, par exemple par centrifugation, à une séparation dans laquelle on récupère les éléments possédant un poids moléculaire supérieur à une valeur d'au moins 100.000 environ.The process for preparing the antigenic fraction according to the invention is characterized in that it consists
- to cultivate cholera vibrios, preferably in a medium poor in nutritive elements and free of iron, under conditions which favor the biosynthesis of surface antigens and the release in the culture medium of a particulate antigenic complex of lipopolysaccharide of character smooth and outer membrane protein; and
- subjecting the supernatant, after elimination of the bacterial bodies, for example by centrifugation, to a separation in which the elements having a molecular weight greater than a value of at least about 100,000 are recovered.
La séparation peut, de préférence, comporter une ultrafiltration à un seuil de coupure d'environ 10 000, suivie d'une diafiltration qui élimine tout le matériel provenant de lt culture et dont le poids moléculaire est inférieur à environ 100.000. The separation may preferably include an ultrafiltration at a cut-off threshold of approximately 10,000, followed by a diafiltration which removes all the material originating from the culture and whose molecular weight is less than approximately 100,000.
De préférence, on complète la libération du complexe antigénique par un traitement à la chaleur en présence d'un agent dissociant, tel que l'acide citrique. Preferably, the release of the antigenic complex is completed by heat treatment in the presence of a dissociating agent, such as citric acid.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré, dans une étape préliminaire, on prépare des inoculums en culture agitée et en milieu nutritif riche, à partir de souches de V. cholerae, de préférence de sérotypes Ogawa et
Inaba, choisies parmi les souches pathogènes de caractère lisse.According to a preferred embodiment, in a preliminary step, inocula are prepared in agitated culture and in a rich nutritive medium, from strains of V. cholerae, preferably of Ogawa serotypes and
Inaba, chosen from pathogenic strains of a smooth character.
On ensemence, ensuite, à l'aide de ces inoculums, un milieu pauvre en éléments nutritifs et exempt de fer. Un tel milieu peut être, par exemple, le milieu MSA qui présente, par litre, la composition suivante - Acide glutamique : 1,5 g
- Caséine lactique : 0,8 g
- Proline : 0,18 g
- NaCl 10 g
- KH2P04 : 0,45 g
- MgS04 : 0,1 g.Then inoculated with these inocula, a medium poor in nutrients and free of iron. Such a medium can be, for example, the MSA medium which has, per liter, the following composition - Glutamic acid: 1.5 g
- Lactic casein: 0.8 g
- Proline: 0.18 g
- NaCl 10 g
- KH2P04: 0.45 g
- MgS04: 0.1 g.
La culture est effectuée sous agitation pendant une durée comprise entre 6 et 24 heures et à une température comprise entre 30 et 35-C, le pH étant maintenu au-dessus de 7. En fin de culture, on ajoute un agent dissociant, tel qu'une solution d'acide citrique ou d'acide éthylène-diamine-tétraacétique. On abaisse le pH à environ 6, et on chauffe à une température comprise entre environ 40 et environ 60'C, la culture étant maintenue à cette température pendant environ 15 à 60 minutes. The culture is carried out with stirring for a period of between 6 and 24 hours and at a temperature between 30 and 35-C, the pH being maintained above 7. At the end of the culture, a dissociating agent is added, such as '' a solution of citric acid or ethylene-diamine-tetraacetic acid. The pH is lowered to about 6, and heated to a temperature between about 40 and about 60 ° C, the culture being maintained at this temperature for about 15 to 60 minutes.
Après refroidissement, on effectue une centrifugation ou une filtration de manière à éliminer les corps bactériens. Le surnageant est ensuite recueilli et filtré sur une membrane de porosité Or 45
Le filtrat est soumis à une ultrafiltration dans laquelle on ne retient que la fraction possédant un poids moléculaire supérieur à 100 000, qui est ensuite soumise à une diafiltration éliminant le matériel de poids moléculaire inférieur à 100 000.After cooling, centrifugation or filtration is carried out so as to eliminate the bacterial bodies. The supernatant is then collected and filtered through a membrane of porosity Or 45
The filtrate is subjected to an ultrafiltration in which only the fraction having a molecular weight greater than 100,000 is retained, which is then subjected to a diafiltration removing the material with a molecular weight less than 100,000.
La fraction recueillie est ensuite lyophilisée. Cette opération s'effectue, en général, en présence d'un adjuvant de lyophilisation tel que le mannitol. The collected fraction is then lyophilized. This operation is generally carried out in the presence of a lyophilization adjuvant such as mannitol.
La fraction lyophilisée constitue le principe actif du vaccin cholérique conforme à l'invention. The lyophilized fraction constitutes the active principle of the cholera vaccine in accordance with the invention.
Cette fraction antigénique est constituée par un complexe composé de lipopolysaccharide de caractère smooth et de protéines de membrane externe, se présentant sous forme particulaire. This antigenic fraction is constituted by a complex composed of lipopolysaccharide of smooth character and proteins of external membrane, occurring in particulate form.
La fraction antigénique lyophilisée constituant le principe actif du vaccin conforme à l'invention se caractérise par des propriétés biologiques tout à fait remarquables. The lyophilized antigenic fraction constituting the active principle of the vaccine according to the invention is characterized by quite remarkable biological properties.
Administrée à l'animal par voie orale, elle provoque
- l'apparition d'anticorps vibriocides dans le sérum,
- une protection contre l'infection expérimentale in vivo dans les anses intestinales ligaturées,
- une inhibition de l'adhérence des V. cholerae sur la muqueuse intestinale,
- une inhibition de la colonisation de l'intestin par le V. cholerae,
- une production intestinale d'immunoglobulines spécifiques.Administered to the animal orally, it causes
- the appearance of vibriocidal antibodies in the serum,
- protection against experimental infection in vivo in ligated intestinal loops,
- inhibition of the adhesion of V. cholerae to the intestinal mucosa,
- inhibition of colonization of the intestine by V. cholerae,
- intestinal production of specific immunoglobulins.
Administrée à la souris par voie parentérale, elle la protège contre l'infection mortelle par le V. Administered to the parenteral mouse, it protects it from fatal V. infection
cholerae.cholerae.
Le vaccin cholérique conforme à l'invention se présente, soit sous la forme de comprimés, soit encore sous la forme de microgranules. The cholera vaccine according to the invention is presented either in the form of tablets or else in the form of microgranules.
Les comprimés sont obtenus en mélangeant le lyophilisat avec un excipient de compression, et sont ensuite enrobés d'une pellicule gastrorésistante. The tablets are obtained by mixing the lyophilisate with a compression excipient, and are then coated with an enteric coating.
Dans le cas d'une présentation sous forme de microgranules, le lyophilisat est fixé sur la surface des microgranules par des techniques bien connues de l'homme de l'art. Ces microgranules sont ensuite recouverts d'une pellicule qui leur confère la gastrorésistance et distribués en gélules. In the case of presentation in the form of microgranules, the lyophilisate is fixed to the surface of the microgranules by techniques well known to those skilled in the art. These microgranules are then covered with a film which gives them gastroresistance and distributed in capsules.
Cette dernière forme de présentation permet, d'une part, la ïnservation de toutes les propriétés biolo iquc du principe actif et, d'autre part, l'administration du vaccin sous forme protégée aux très jeunes enfants. This latter form of presentation allows, on the one hand, the preservation of all the biological properties of the active principle and, on the other hand, the administration of the vaccine in protected form to very young children.
D'autres avantages et particularités de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, donnés à titre purement illustratif, et non limita- tif. Other advantages and particularities of the invention will appear on reading the examples which follow, given purely by way of illustration, and not by way of limitation.
Préparation du complexe lipopolysaccharide-protéines. Preparation of the lipopolysaccharide-protein complex.
On reprend une ampoule contenant sous forme congelée le V. cholerae, sérotype Ogawa, biotype eltor, par 2 à 3 ml de milieu VCM constitué, par litre, de
- Baeto-tryptone (Difco) : 10 g
- Extrait de levure : 1 g
- Glucose - 1 g
- NaCl : 5 g
- K2HP04 : 2 g - MgS04 0,1
le pH étant ajusté à 8,5 avec NaOH,
On ensemence au moyen de cette suspension un flacon de 5 litres contenant 3 litres de milieu VCM et on cultive pendant une nuit -sous agitation magnétique, à 20 22-C, à l'abri de la lumière et sous aération constituée par un bullage lent d air
Cette culture sert à inoculer un fermenteur de 50 litres contenant 32 litres de milieu VCM.La culture est menée pendant 6 heures à 33-34-C sous agitation suffisante pour obtenir un vortex important.A vial containing frozen V. cholerae, serotype Ogawa, biotype eltor, is taken up in frozen form, with 2 to 3 ml of VCM medium consisting, per liter, of
- Baeto-tryptone (Difco): 10 g
- Yeast extract: 1 g
- Glucose - 1 g
- NaCl: 5 g
- K2HP04: 2 g - MgS04 0.1
the pH being adjusted to 8.5 with NaOH,
A 5 liter flask containing 3 liters of VCM medium is inoculated with this suspension and cultured overnight, under magnetic stirring, at 20 ° C., protected from light and under aeration constituted by slow bubbling. air
This culture is used to inoculate a 50 liter fermenter containing 32 liters of VCM medium. The culture is carried out for 6 hours at 33-34-C with sufficient stirring to obtain a large vortex.
L'aération est apportée à raison de 35 l/h par balayage en surface. Le pH de la culture est maintenu au-dessus de 7,2 par apport de KOH 1 N. Aeration is provided at a rate of 35 l / h by surface sweeping. The pH of the culture is maintained above 7.2 by adding KOH 1 N.
La culture obtenue sert à inoculer un fermenteur de 1500 litres contenant 900 litres de milieu MSA constitué, par litre, de
- Acide glutamique : 1,5 g
- Caséine lactique : 0,8 g
- Proline : 0,18 g
- NaCl : 10 g
- KH2P04 : 0,45 g
- MgS04 : 0,1 g
- le pH.étant ajusté à 8,4 par KOH, et 100 litres de milieu VCM.The culture obtained is used to inoculate a 1500 liter fermenter containing 900 liters of MSA medium consisting, per liter, of
- Glutamic acid: 1.5 g
- Lactic casein: 0.8 g
- Proline: 0.18 g
- NaCl: 10 g
- KH2P04: 0.45 g
- MgS04: 0.1 g
- the pH. being adjusted to 8.4 by KOH, and 100 liters of VCM medium.
On cultive pendant IR. heures à une température de l'ordre de 33-34'C, le pH étant maintenu audessus de 7,2 par addition de KOH 1 N. L'oxygène dissous est maintenu à- 50 's de la saturation par apport d'air en profondeur, et agitation à 750 t/mn. Après ce laps de temps, on ajoute une solution d'acide citrique à 125 g/l jusqu'à ce que le pH de la culture soit abaissé à 6,0 et on élève la température de la culture à 55-C. On maintient cette température pendant 45 mn puy5 on refroidit la culture à environ 10'C. One cultivates during IR. hours at a temperature of the order of 33-34 ° C, the pH being maintained above 7.2 by addition of KOH 1 N. The dissolved oxygen is maintained at -50 's of saturation by supply of air in depth, and stirring at 750 rpm. After this time, a citric acid solution at 125 g / l is added until the pH of the culture is lowered to 6.0 and the temperature of the culture is raised to 55 ° C. This temperature is maintained for 45 min. Puy5 the culture is cooled to around 10 ° C.
On effectue ensuite immédiatement la centrifugation en continu et sous refroidissement. On recueille le surnageant et on filtre à + 4-C sur membrane de porosité 0,45r. The centrifugation is then immediately carried out continuously and under cooling. The supernatant is collected and filtered at + 4-C on a membrane with a porosity of 0.45 r.
L'ultrafiltration-concentration est effectuée sur membrane possédant un point de coupure PM 100 000. On élimine l'ultrafiltrat jusqu a ce que le volume de la préparation. atteigne 10 litres. On y ajoute un même volume de solution de NaCI à 8,5 g/l stérile et on poursuit l'ultrafiltration pour ramener le volume du rétentat à 10 litres. The ultrafiltration-concentration is carried out on a membrane having a cut-off point PM 100,000. The ultrafiltrate is removed until the volume of the preparation. reaches 10 liters. The same volume of sterile 8.5 g / l NaCl solution is added thereto and the ultrafiltration is continued to bring the volume of the retentate to 10 liters.
On répète 5 fois cette dernière opération et on ajuste le volume de préparation à 20 litres au moyen d'une solution de mannitol stérile et de concentration telle que la concentration finale en mannitol soit égale à 20 g/l. This last operation is repeated 5 times and the volume of preparation is adjusted to 20 liters using a sterile mannitol solution and of a concentration such that the final mannitol concentration is equal to 20 g / l.
La préparation est ensuite soumise à une lyophilisation en vrac de 48 heures comportant une dessiccation secondaire de 24 heures à 30'C. The preparation is then subjected to a freeze-drying in bulk for 48 hours comprising a secondary desiccation for 24 hours at 30 ° C.
On procède, de la même façon, avec le V. We proceed, in the same way, with the V.
cholerae, sérotype Inaba, biotype eltor, et on mélange les lyophilisats obtenus à partir des deux souches.cholerae, Inaba serotype, eltor biotype, and the lyophilisates obtained from the two strains are mixed.
La présentation du vaccin sous forme de microgranules gastrorésistants se fait par fixation du mélange de lyophilisats à la surface de microgranules neutres de 1 mm de diamètre et essentiellement constitués d'amidon, en utilisant les techniques connues de l'homme de l'art. The presentation of the vaccine in the form of gastroresistant microgranules is effected by fixing the mixture of lyophilisates to the surface of neutral microgranules 1 mm in diameter and essentially consisting of starch, using the techniques known to those skilled in the art.
Ces microgranules sont ensuite recouverts d'une enveloppe constituée d'acétophtalate de cellulose. These microgranules are then covered with an envelope made of cellulose acetophthalate.
Ils contiennent 50 mg de mélange de lyophilisats par gramme de microgranules termines
Caractérisation du complexe lipopolysaccharideprotéines.They contain 50 mg of lyophilisate mixture per gram of finished microgranules
Characterization of the lipopolysaccharideprotein complex.
Le complexe lipopolysaccharide-protéines libéré dans le milieu de culture se présente sous forme particulaire. The lipopolysaccharide-protein complex released into the culture medium is in particulate form.
Le caractère particulaire du complexe est mis en évidence par l'examen au microscope électronique. The particular nature of the complex is highlighted by examination with an electron microscope.
La préparation se présente sous forme de vésicules de diamètre compris entre 20 et 100 nm après coloration négative au phosphotungstate. The preparation is in the form of vesicles with a diameter between 20 and 100 nm after negative staining with phosphotungstate.
Association lipopolysaccharide-protéines. Lipopolysaccharide-protein association.
Cette association de composants peut être mise en évidence par le fait que ce complexe présente une vitesse de sédimentation et une densité différentes de celles de ses composants isolés. This association of components can be demonstrated by the fact that this complex has a sedimentation rate and a density different from that of its isolated components.
Une ultracentrifugation de 65 heures à 39.000 t/mn sur un gradient de saccharose 40-60 , effectuée sur la préparation obtenue comme il a été indiqué plus haut, montre que le complexe possède une densité de flottation de 1,21 alors que le lipopolysaccharide isolé à partir de la même préparation montre une densité de 1,19. 65-hour ultracentrifugation at 39,000 rpm on a 40-60 sucrose gradient, carried out on the preparation obtained as indicated above, shows that the complex has a flotation density of 1.21 while the isolated lipopolysaccharide from the same preparation shows a density of 1.19.
Les vitesses de sédimentation déterminées par ultracentrifugation en gradient de saccharose 5-15 % sont respectivement de 30 S pour le complexe de lipopolysaccharide-protéines conforme à l'invention et de 20 S pour le lipopolysaccharide extrait de ce complexe. The sedimentation rates determined by 5-15% sucrose gradient ultracentrifugation are respectively 30 S for the lipopolysaccharide-protein complex according to the invention and 20 S for the lipopolysaccharide extracted from this complex.
Cette association lipopolysaccharide-protéines peut être encore mise en évidence par le fait que la dose nécessaire à l'apparition d'un pouvoir vibriocide dans le sérum de lapins ayant reçu la préparation par voie orale est au moins 40 fois inférieure à celle du lipopolysaccharide extrait du V. cholerae. This lipopolysaccharide-protein association can be further demonstrated by the fact that the dose necessary for the appearance of vibriocidal power in the serum of rabbits having received the preparation by the oral route is at least 40 times lower than that of the extracted lipopolysaccharide. of V. cholerae.
Nature des constituants
lipopolysaccharide (LPS) du V. cholerae de ~caractère lisse.Nature of the constituents
lipopolysaccharide (LPS) of V. cholerae of ~ smooth character.
On extrait du complexe lipopolysaccharideprotéines obtenu comme on l'a indiqué plus haut, le lipopolysaccharide par la technique de Westphal et on soumet celui-ci à une électrophorèse en gel de polyacrylamide en milieu dissociant selon la méthode de Laemmli. Après oxydation par le periodate, les constituants sont révélés par une coloration au nitrate d'argent. Le profil électrophorétique obtenu est caractéristique du LPS de V. cholerae de caractère lisse. The lipopolysaccharide protein complex obtained as indicated above is extracted from the lipopolysaccharide by the Westphal technique and this is subjected to electrophoresis in polyacrylamide gel in dissociating medium according to the Laemmli method. After oxidation by periodate, the constituents are revealed by staining with silver nitrate. The electrophoretic profile obtained is characteristic of the LPS of V. cholerae of a smooth character.
On note que les préparations vaccinales contenant du LPS ne présentant pas le profil du caractère smooth ne possèdent pas les activités biologiques recherchées
protéines de membrane externe du V. cholerae.It is noted that the vaccine preparations containing LPS which do not exhibit the profile of the smooth character do not have the desired biological activities
outer membrane proteins of V. cholerae.
Ces protéines participent à la réponse immunitaire induite par le complexe lipopolysaccharideprotéines. These proteins participate in the immune response induced by the lipopolysaccharideprotein complex.
Ce rôle des proteines est mis en évidence par les faits suivants
- la dénaturation des protéines par chauffage, par exemple à une températule de l'ordre de 100-C pendant 30 minutes, détruit totalement les propriétés vaccinantes,
- administré par voie orale au lapin , le complexe lipopolysaccharide-protéines provoque la sécrétion intestinale d'immunoglobulines spécifiques des protéines entrant dans la composition du complexe.This role of proteins is highlighted by the following facts
- the denaturation of proteins by heating, for example at a temperature of the order of 100-C for 30 minutes, completely destroys the vaccinating properties,
- administered orally to rabbits, the lipopolysaccharide-protein complex causes the intestinal secretion of immunoglobulins specific for the proteins used in the composition of the complex.
La mise en evidence de ces immunoglogulines est effectuée par la technique d'"immunoblot" sur les protéines du complexe, après que celles-ci ont été séparées par électrophorèse en gel polyacrylamide mono- ou bidimensionnelle. The detection of these immunoglogulins is carried out by the "immunoblot" technique on the proteins of the complex, after these have been separated by electrophoresis in mono- or two-dimensional polyacrylamide gel.
On observe, enfin, que le pouvoir vibriocide des sérums de lapins vaccinés par voie orale n'est inhibé qu'en partie seulement lorsque ces sérums sont additionnés de r.ps extrait de V. cholerae, alors que ce pouvoir vibriocide est totalement inhibé par la présence du complexe. Finally, it is observed that the vibriocidal power of sera from rabbits vaccinated orally is only partially inhibited when these sera are supplemented with r.ps extract of V. cholerae, while this vibriocidal power is totally inhibited by the presence of the complex.
L'électrophorèse en gel de polyacrylamide en milieu dissociant des protéines du complexe vaccinant permet de mettre en évidence une série de polypeptides de poids moléculaires compris entre 28 000 et 70 000 daltons. Polyacrylamide gel electrophoresis in a medium dissociating proteins from the vaccine complex makes it possible to demonstrate a series of polypeptides with molecular weights between 28,000 and 70,000 daltons.
Propriétés biologiques. Biological properties.
Les propriétés biologiques du principe actif ont été mises en évidence par une série d'expérimentations effectuées sur l'animal auquel a été administré soit le principe actif lui-même, soit le vaccin correspondant, et dont les résultats sont rapportés ci-dessous. The biological properties of the active ingredient have been demonstrated by a series of experiments carried out on the animal to which the active ingredient itself or the corresponding vaccine has been administered, the results of which are reported below.
A - Pour mettre en évidence les propriétés biologiques du principe actif, on a effectué ces essais
a) Administré par voie parentérale aux souris, il i e protège contre l'infection mortelle par le V.A - To demonstrate the biological properties of the active ingredient, these tests were carried out
a) Administered parenterally to mice, it protects against fatal infection with V.
chol erae. chol erae.
En appliquant les conditions recommandées par i 'OMS pour 1 < test de protection de la souris, on constate que le principe actif lyophilisé possede (par mg de PyQ- philisat) une activité supérieure de 2 à 10 fois celle de la référence. By applying the conditions recommended by WHO for the mouse protection test, it is found that the lyophilized active principle has (per mg of PyQphilisate) an activity 2 to 10 times greater than that of the reference.
/ b) Administré par voie sous-cutanee à des lapins, le principe actif induit une forte réponse en anticorps vibriocides. / b) Administered subcutaneously in rabbits, the active ingredient induces a strong vibriocidal antibody response.
On observe qu'après injection d'une quantité de principe actif équivalente au 1/20 de la dose humaine, les titres en anticorps vibriocides sont supérieurs à 50 000. Ces titres sont semblables à ceux obtenus par l'injection d'une dose humaine de vaccin composé de germes tués. It is observed that after injection of an amount of active principle equivalent to 1/20 of the human dose, the vibriocidal antibody titers are greater than 50,000. These titers are similar to those obtained by the injection of a human dose of vaccine made up of killed germs.
c) Administré par voie orale à des lapins, le principe actif sous forme de suspension (c'est-à-dire présenté sous forme non gastrorésistante) induit une apparition d'anticorps vibriocides dans le sérum de ces animaux. c) Administered orally to rabbits, the active principle in the form of a suspension (that is to say presented in non-gastroresistant form) induces the appearance of vibriocidal antibodies in the serum of these animals.
On administre par voie orale à des lapins des doses croissantes en deux prises espacées de 7 jours. Les titres en anticorps vibriocides des sérums recueillis 14 jours après la dernière administration montrent un effet dose linéaire. A titre de comparaison, l'administration de doses croissantes de LPS extrait de V. cholerae induit des anticorps vibriocides, mais à des doses 40 fois supérieures. Increasing doses are administered orally to rabbits in two divided doses 7 days apart. The vibriocidal antibody titers of the sera collected 14 days after the last administration show a linear dose effect. For comparison, the administration of increasing doses of LPS extracted from V. cholerae induces vibriocidal antibodies, but at doses 40 times higher.
B - Administré par voie orale à l'animal, le vaccin provoque
a) l'apparition d'anticorps vibriocides dans le sérum à des taux élevés.B - Administered orally to the animal, the vaccine causes
a) the appearance of vibriocidal antibodies in the serum at high levels.
Des lapins reçoivent 200 mg de microgranules a .J O et J 7. On a procédé au titrage des anticorps à J 21. Rabbits receive 200 mg of microgranules on day D and day 7. The antibody was titrated on day 21.
On obtient les titres suivants :
Ogawa Inaba
titre des sérums titre des sérums
lapin n0 avant apres avant après
immunisation inunisation
5316 < 40 30780 < 40 40960
6317 < 40 15360 (40 20480
6318 < z0 20480 < 40 20480
6319 < 40 20480 < 40 20480
6320 (40 20480 < 40 5180'
6321 < 40 81920 (40 20480
b) une protection contre l'infection expérimentale in vivo dans les anses intestinales ligaturées.The following titles are obtained:
Ogawa Inaba
title of sera title of sera
rabbit n0 before after before after
immunization inunization
5316 <40 30 780 <40 40 960
6317 <40 15360 (40 20480
6318 <z0 20480 <40 20480
6319 <40 20480 <40 20480
6320 (40 20480 <40 5180 '
6321 <40 81 920 (40 20 480)
b) protection against experimental infection in vivo in ligated intestinal loops.
On immunise des lapins par une dose humaine de vaccin à J O et J 7. Environ 25 jours après, on ligature des anses intestinales dans lesquelles on injecte des doses croissantes de V. cholerae. 16 à 18 heures après, les volumes sécrétés sont mesurés. On observe une forte diminu tion des volumes sécrétés chez les animaux immunisés les les nombres de germes injectés nécessaires pour obtenir la sécrétion de 1 ml de liquide par cm d'intestin sont respectivement
animaux témoins 10
9
animaux immunisés 10
c) un effet anti-adhérence et un effet anticolonisation de l'intestin par le V. cholerae.Rabbits are immunized with a human dose of OJ and D 7 vaccine. About 25 days later, intestinal loops are ligated into which increasing doses of V. cholerae are injected. 16 to 18 hours later, the secreted volumes are measured. A strong decrease in the secreted volumes is observed in the immunized animals the numbers of germs injected necessary to obtain the secretion of 1 ml of liquid per cm of intestine are respectively
control animals 10
9
immune animals 10
c) an anti-adhesion effect and an anti-colonization effect of the intestine by V. cholerae.
On administre par voie orale à des lapins 200 mg de microgranules à J O et J 7 ; 5 jours après la dernière administration, on opère les animaux et on introduit 109 V. 200 mg of microgranules are administered orally to rabbits on D0 and D7; 5 days after the last administration, the animals are operated and 109 V are introduced.
cholerae vivants dans leur duodénum après avoir ligaturé l'intestin grêle au niveau du caecum. Après 2 à 3 heures de contact, on retire la ligature. 16 à 18 heures après, on dénombre les V. Cholerae dans l'iléon et le jéjunum. On obtient des résultats significativement différents chez les animaux immunisés et chez les animaux témoins.cholerae alive in their duodenum after ligating the small intestine to the level of the cecum. After 2 to 3 hours of contact, the ligation is removed. 16 to 18 hours later, there are V. Cholerae in the ileum and jejunum. Significantly different results are obtained in immunized animals and in control animals.
lapins aanbre de germes/g d'intestin
Ogawa Inaba
iléon jéjunum iléon jéjunum
témoins lo8 107 108 107
immunisés 103 102 105 103
d) production intestinale d'IgA spécifiques.rabbits with germ / g intestine
Ogawa Inaba
jejunum ileum jejunum ileum
witnesses lo8 107 108 107
immune 103 102 105 103
d) intestinal production of specific IgA.
On administre à des lapins 200 mg de microgranu]es aux jours J 0, J 7 et J 14. On procède ensuite au titrage des IgA spécifiques présentes dans le liquide intestinal et la muqueuse intestinale, par méthode ELISA. Rabbits are administered 200 mg of microgranules on days D 0, D 7 and D 14. The specific IgA present in the intestinal fluid and the intestinal mucosa are then titrated, by ELISA method.
On utilise le complexe antigénique comme phase solide. Seules les IgA spécifiques présentes dans l'échantillon prélevé se fixent sur cette phase solide et sont révélées au moyen d'anticorps de chèvre anti-IgA de lapin conjugués à la peroxydase. The antigenic complex is used as the solid phase. Only the specific IgA present in the sample taken bind to this solid phase and are revealed by means of goat anti-rabbit IgA antibodies conjugated with peroxidase.
Après révélation de la réaction enzymatique, on obtient les résultats suivants
lapins Extrait de muqueuse intestinale
dilution 1/20-D.O. mesurée b 425 nm
immunisés 1,80
témoins 0,1.After revealing the enzymatic reaction, the following results are obtained
rabbits intestinal mucosa extract
1/20-DO dilution measured b 425 nm
immune 1.80
witnesses 0.1.
Dosage
Les microgranule, contenant par exemple 50 mg ou plus de mélange de lyophilisats par g de microgranules, sont conditionnés en gélules gastrorésistantes contenant 200 mg de microgranules.Dosage
The microgranules, containing for example 50 mg or more of mixture of lyophilisates per g of microgranules, are packaged in gastro-resistant capsules containing 200 mg of microgranules.
A titre d'exesmple, la vaccination petit se faire par absorption d'une gélule à J 0, J 7 et J 14, avec un rappel par exemple entre six mois et un an. As an example, the small vaccination can be done by absorption of a capsule on D 0, D 7 and D 14, with a reminder for example between six months and a year.
Claims (18)
Priority Applications (3)
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| FR8606836A FR2598621B1 (en) | 1986-05-13 | 1986-05-13 | NOVEL ANTIGENIC FRACTION OBTAINED BY RELEASE INTO A CULTURE OF CHOLERIC VIBRIONS, PROCESS FOR PREPARING SUCH A FRACTION AND ITS APPLICATION TO THE PREPARATION OF AN ORAL CHOLERIC VACCINE |
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| FR2388049A2 (en) * | 1977-04-22 | 1978-11-17 | Anvar | Antigenic vaccine fraction prepn. - by autoclaving harvest brew, centrifuging and dialysing against distilled water |
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| FR2527445A1 (en) * | 1982-05-26 | 1983-12-02 | Centre Nat Rech Scient | MEDICINAL PRODUCTS CONTAINING AT LEAST ONE SEQUENCE OF THE CHOLERIC TOXIN B1 SUBUNIT |
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1986
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-
1987
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Patent Citations (1)
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| FR2388049A2 (en) * | 1977-04-22 | 1978-11-17 | Anvar | Antigenic vaccine fraction prepn. - by autoclaving harvest brew, centrifuging and dialysing against distilled water |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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