FR2561101A1

FR2561101A1 - PROCESS FOR THE PREPARATION OF LIPOSOMES AND LIPOSOMES THUS OBTAINED

Info

Publication number: FR2561101A1
Application number: FR8403842A
Authority: FR
Inventors: Francis Puisieux; Dominique Beau
Original assignee: Universite Paris Sud
Current assignee: Universite Paris Sud
Priority date: 1984-03-13
Filing date: 1984-03-13
Publication date: 1985-09-20
Also published as: FR2561101B1

Abstract

L'INVENTION A POUR OBJET UN PROCEDE DE PREPARATION DE LIPOSOMES CONSISTANT A FORMER DANS UNE PREMIERE ETAPE UNE EMULSION DE TYPE EH PAR DISPERSION D'UNE PREMIERE PHASE AQUEUSE DANS UN SOLVANT ORGANIQUE NON MISCIBLE A L'EAU EN PRESENCE DE MOLECULES COMPORTANT UNE FRACTION LIPOPHILE ET UNE FRACTION HYDROPHILE, CARACTERISE EN CE QUE, DANS UNE SECONDE ETAPE, ON ELIMINE LA MAJEURE PARTIE DU SOLVANT ORGANIQUE DE CETTE EMULSION PAR UNE METHODE DOUCE OBTENANT AINSI UNE EMULSION EH CONCENTREE PUIS, DANS UNE TROISIEME ETAPE, ON AJOUTE PROGRESSIVEMENT A CETTE EMULSION EH CONCENTREE SOUS AGITATION UNE SECONDE PHASE AQUEUSE CONTENANT DES MOLECULES COMPORTANT UNE FRACTION LIPOPHILE ET UNE FRACTION HYDROPHILE ET SIMULTANEMENT ON ELIMINE LE SOLVANT ORGANIQUE RESIDUEL PAR EVAPORATION.THE OBJECT OF THE INVENTION IS A PROCESS FOR THE PREPARATION OF LIPOSOMES CONSISTING OF FORMING IN A FIRST STAGE AN EMULSION OF EH TYPE BY DISPERSION OF A FIRST AQUEOUS PHASE IN AN ORGANIC SOLVENT NOT MISCIBLE TO WATER IN THE PRESENCE OF MOLECULES CONTAINING A LIPOPHILIC FRACTION AND A HYDROPHILIC FRACTION, CHARACTERIZED IN THAT, IN A SECOND STEP, THE MAJOR PART OF THE ORGANIC SOLVENT OF THIS EMULSION IS ELIMINATED BY A GENTLE METHOD SO OBTAINING A CONCENTRATED EH EMULSION THEN, IN A THIRD STEP, IS GRADUALLY ADDED TO THIS EMULSION CONCENTRATED WITH AGITATION A SECOND AQUEOUS PHASE CONTAINING MOLECULES CONTAINING A LIPOPHILIC FRACTION AND A HYDROPHILIC FRACTION AND SIMULTANEOUSLY THE RESIDUAL ORGANIC SOLVENT IS ELIMINATED BY EVAPORATION.

Description

La présente invention concerne un procédé dé préparation de liposomes. The present invention relates to a process for the preparation of liposomes.

Les liposomes sont de petites vésicules sphériques normalement dispersées dans une phase aqueuse et renfermant en leur sein au moins une autre phase aqueuse. Ces phases aqueuses sont séparées par une paroi qui est formée d'une double couche de molécules comportant une fraction lipophile et une fraction hydrophile, généralement des phospholipides. La frac- tion hydrophile de chaque molécule est orientée vers une phase aqueuse, tandis que la fraction lipophile est orientée vers l'intérieur de la paroi. Liposomes are small spherical vesicles normally dispersed in an aqueous phase and containing within them at least one other aqueous phase. These aqueous phases are separated by a wall which is formed of a double layer of molecules comprising a lipophilic fraction and a hydrophilic fraction, generally phospholipids. The hydrophilic fraction of each molecule is oriented towards an aqueous phase, while the lipophilic fraction is oriented towards the inside of the wall.

l'es liposomes peuvent être unilamellairesX c'est-à-dire ne comporter qu'une seule paroi à double couche de molécules à fractionslipophile et hydrophile, ou être plurilamellairs, c'est-à-dire comporter plusieurs parois concentriques isolant entre elles di f-- férentes phases aqueuses. the liposomes can be unilamellar X that is to say have only one single wall with a double layer of lipophilic and hydrophilic fractions, or be plurilamellairs, that is to say have several concentric walls isolating them di f-- different aqueous phases.

Les liposomes ont des tailles très variables (de 25 à 10.000 nm). Les liposomes unilamellaires ont généralement une taille inférieure à 500 nm, tandis que les liposomes plurilamellaires peuvent avoir des tailles supérieures. The liposomes have very variable sizes (from 25 to 10,000 nm). Unilamellar liposomes are generally less than 500 nm in size, while plurilamellar liposomes can be larger.

Les liposomes se sont avérés être des véhicules très intéressants en biologie et en médecine.-. Liposomes have proven to be very interesting vehicles in biology and medicine.

Ils sont, en effet, capables de contenir diverses substances. C'est ainsi qu'ils peuvent contenir des substances hydrophiles dans la phase aqueuse interne, des substances lipophiles dans la paroi lipidique ou même des substances amphiphiles dont la partie hydrophile est dans la phase aqueuse interne ou externe et dont la partie lipophile est dans la paroi lipidique. They are, in fact, capable of containing various substances. Thus they can contain hydrophilic substances in the internal aqueous phase, lipophilic substances in the lipid wall or even amphiphilic substances whose hydrophilic part is in the internal or external aqueous phase and whose lipophilic part is in the lipid wall.

En outre, les liposomes présentent l'avantage de pouvoir être formés de molécules naturelles ou analogues à des molécules naturelles et métabolisables dans l'organisme. Ce sont, de ce fait, des véhicules biodégradables peu ou pas toxiques. In addition, liposomes have the advantage of being able to be formed from natural molecules or analogues to natural and metabolizable molecules in the body. They are therefore biodegradable vehicles with little or no toxicity.

Enfin, les liposomes, lors d'une administration chez l'homme ou l'animal par voie intraveineuse, présentent la particularité de se concentrer dans certains organes, notamment le foie et la rate. Finally, liposomes, when administered to humans or animals intravenously, have the distinction of concentrating in certain organs, in particular the liver and spleen.

Ils constituent donc des véhicules particulièrement intéressants pour amener au foie, à la rate ou à d'autres organes des principes actifs ou des agents de diagnostic (par exemple des produits opacifiants en vue de la visualisation de ces organes). They therefore constitute particularly advantageous vehicles for supplying the liver, spleen or other organs with active principles or diagnostic agents (for example opacifying products for the visualization of these organs).

Il est donc fortement souhaitable de disposer d'un procédé de préparation industriel de liposomes permettant d'encapsuler diverses substances. It is therefore highly desirable to have an industrial preparation process for liposomes making it possible to encapsulate various substances.

On connais déjà divers procédés de préparation de liposomes. On trouvera une étude des procédés classiques dans un article de F. Puisieux, Les Liposomes, classification et obtention l'abo. Pharma. Problèmes et Techniques 281, 899-904 (1978). Various methods of preparing liposomes are already known. One will find a study of the classic procedures in an article by F. Puisieux, The Liposomes, classification and obtaining the abo. Pharma. Problèmes et Techniques 281, 899-904 (1978).

Ces procédés classiques conduisent à des taux d'encapsulation qui ne dépassent guère 10 % et à des structures qui sont souvent hétérogènes. De tels procédés ne sont pas utilisables à l'échelle industrielle. These conventional methods lead to encapsulation rates which hardly exceed 10% and to structures which are often heterogeneous. Such methods cannot be used on an industrial scale.

Plus récemment, on a proposé plusieurs procédés qui comprennent la même première étape. Cette étape consiste à former une émulsion très fine de type eau dans l'huile par dispersion d'une phase aqueuse contenant une substance à encapsuler dans un solvant organique non miscible à l'eau en présence de phospholipides. Les vési- cules microscopiques obtenues à l'issue de la première étape qui ont été appelées "précurseurs de liposomes" comprennent une seule couche de phospholipides (couche monomoleculaire). More recently, several methods have been proposed which include the same first step. This step consists in forming a very fine water-in-oil emulsion by dispersing an aqueous phase containing a substance to be encapsulated in an organic solvent immiscible with water in the presence of phospholipids. The microscopic vesicles obtained at the end of the first stage which have been called "liposome precursors" comprise a single layer of phospholipids (monomolecular layer).

La formation d'une seconde couche de phospholipides dans une étape ultérieure conduit à l'obtention des li posqmes. The formation of a second layer of phospholipids in a subsequent step leads to the production of the liquids.

Dans certains procédés de ce type (S. Matsumotoet coll. J. of Colloid Interface Scie I vol. 62, 1, 149-157, (1977) et F. Szoka et colt. Proc Nat. Acad. Sci., vol. In certain processes of this type (S. Matsumotoet coll. J. of Colloid Interface Scie I vol. 62, 1, 149-157, (1977) and F. Szoka et al. Proc Nat. Acad. Sci., Vol.

75, 9, 4194-4198 (19781) la phase organique est totalement éliminée de l'émulsion par évaporation avant realisation de la structure liposomiale.75, 9, 4194-4198 (19781) the organic phase is completely eliminated from the emulsion by evaporation before the liposomal structure is produced.

Ce procédé qui est envisagé également dans l'une des variantes du procédé de préparation décrit dans le brevet FR 2 399 242 conduit à une destruction partielle des précurseurs de liposomes engendrant une très grande hétérogénéité dans la structure des liposomes et un rendement d'encapsulation faible. This process which is also envisaged in one of the variants of the preparation process described in patent FR 2 399 242 leads to a partial destruction of the liposome precursors generating a very great heterogeneity in the structure of the liposomes and a low encapsulation yield. .

Le brevet FR 2 399 242 propose toutefois un autre procédé qui est considéré comme préférable. Ce procédé consiste à émulsifier l'émulsion obtenue à la première étape et comprenant les précurseurs de liposomes,avec une phase aqueuse de dispersion en présence d'un excès de phospholipides, de façon à obtenir une émulsion H/E et à éliminer ensuite de cette émulsion le solvant organique par évaporation. Patent FR 2,399,242, however, proposes another method which is considered preferable. This process consists in emulsifying the emulsion obtained in the first step and comprising the liposome precursors, with an aqueous phase of dispersion in the presence of an excess of phospholipids, so as to obtain an O / W emulsion and then eliminating from this emulsion the organic solvent by evaporation.

S'il constitue un progrès par rapport aux procédés déjà connus, ce procédé ne permet pas d'obtenir une structure totalement homogène. De plus, il est difficilement transposable au niveau industriel. If it constitutes an improvement over the already known methods, this method does not make it possible to obtain a completely homogeneous structure. In addition, it is difficult to transpose to the industrial level.

La présente invention vise à remédier à ces divers inconvénients et à fournir un procédé de préparation des liposomes permettant d'obtenir des structures homogènes avec un rendement élevé, qui soit utilisable au niveau industriel. The present invention aims to remedy these various drawbacks and to provide a process for the preparation of liposomes making it possible to obtain homogeneous structures with a high yield, which can be used at the industrial level.

A cet effet, la présente invention a pour objet un procédé de préparation de liposomes consistant à former dans une première étape une émulsion de type E/H par dispersion d'une première phase aqueuse dans un solvant organique non miscible à l'eau en présence de molécules comportant une fraction lipophile et une fraction hydrophile, caractérisé en ce que, dans une seconde étape, on élimine la majeure partie du solvant organique de cette émulsion par une méthode douce,obtenant ainsi une émulsion È/H concentrée,puis, dans une troisième étape, on ajoute progressivement à cette émulsion E/H concentrée, sous agitation, une seconde phase aqueuse contenant des molécules comprenant une fraction lipophile et une fraction hydrophile et si- multanément on élimine le solvant organique résiduel par évaporation. To this end, the subject of the present invention is a process for the preparation of liposomes consisting in forming in a first step an emulsion of W / O type by dispersion of a first aqueous phase in an organic solvent immiscible with water in the presence of molecules comprising a lipophilic fraction and a hydrophilic fraction, characterized in that, in a second step, the major part of the organic solvent is removed from this emulsion by a gentle method, thus obtaining a concentrated W / O emulsion, then, in a third step, a second aqueous phase containing molecules comprising a lipophilic fraction and a hydrophilic fraction is gradually added to this concentrated W / O emulsion, with stirring, and the residual organic solvent is removed by evaporation.

-Dans la présente invention, on désigne par molécule comportant une fraction lipophile et une fraction hydrophile ou, plus simplement, molécule à fractions lipophile et hydrophile toute molécule capable de participer à la constitution de la paroi des liposomes. Ces molécules sont notamment des phospholipides, mais peuvent être également d'autres lipides, certaines protéines, des polymères, des anticorps (ou immunoglobulines), des stérols et même certains principes actifs qui peuvent ainsi participer à la constitution de la paroi des liposomes. In the present invention, the term “molecule comprising a lipophilic fraction and a hydrophilic fraction or, more simply, molecule with lipophilic and hydrophilic fractions” denotes any molecule capable of participating in the constitution of the wall of the liposomes. These molecules are in particular phospholipids, but can also be other lipids, certain proteins, polymers, antibodies (or immunoglobulins), sterols and even certain active principles which can thus participate in the constitution of the wall of the liposomes.

Comme exemples de phospholipides, on peut citer la phosphatidylcholine (lécithine) d'oeuf ou de soja, la phosphatidylsérine, le phosphatidylinositol, la dipaîmitoyîphosphatidyîchoîine, la dimyristorylphosphatidylcholine et la sphingomyéline. Comme autres lipides, on peut utiliser des lipoldes ioniques. Les lipoïdes ioniques peuvent être de type anionique, par exemple l'acide phosphatidique et le phosphate de dicétyle, ou de type cationique, par exemple la stéarylamine. On peut, en outre, avantageusement ajouter à ces lipides des stérols (tels que le cholestérol) ou le tocophérol, qui diminuent la porosité des liposomes. As examples of phospholipids, mention may be made of egg or soy phosphatidylcholine (lecithin), phosphatidylserine, phosphatidylinositol, dipaitmitoyphosphatidyichoine, dimyristorylphosphatidylcholine and sphingomyelin. As other lipids, ionic lipoldes can be used. The ionic lipoids can be of the anionic type, for example phosphatidic acid and diketyl phosphate, or of the cationic type, for example stearylamine. It is further advantageous to add sterols (such as cholesterol) or tocopherol to these lipids, which reduce the porosity of the liposomes.

On utilise de préférence des lécithines de soja ou d'oeuf, éventuellement en mélange avec du cholestérol.Soy or egg lecithins are preferably used, possibly mixed with cholesterol.

On peut, en outre, ajouter diverses substances qui permettent d'améliorer la migration vers les cellules cibles et notamment des immunoglobulines ou des anticorps monochlonaux. Les molécules à fractions lipophile et hydrophile sont genéralement utilisées dans la première étape à raison de 0,5 à 5 parties en poids pour 100 parties en poids de solvant organique.It is also possible to add various substances which make it possible to improve the migration towards the target cells and in particular immunoglobulins or monochlonal antibodies. The molecules with lipophilic and hydrophilic fractions are generally used in the first step in an amount of 0.5 to 5 parts by weight per 100 parts by weight of organic solvent.

Le solvant organique utilisé dans la présente invention peut être tout solvant organique pratiquement insoluble dans l'eau. On préfère toutefois le dichlorométhane en raison notamment de sa faible toxicité, de son caractere pratiquement inexplosif et ininElam- mable et de son point d'ébullition très bas. Comme exemples d'autres solvants, on peut citer l'éther diéthylique et le chloroforme. The organic solvent used in the present invention can be any organic solvent practically insoluble in water. Dichloromethane is preferred, however, mainly because of its low toxicity, its practically inexplosive and ineffective character and its very low boiling point. Examples of other solvents include diethyl ether and chloroform.

La phase aqueuse que l'on disperse représente avantageusement de 20 à 50 parties en poids pour 100 parties en poids de solvant organique, cette quantité pouvant varier avec la teneur en molécules à fractions lipophile et hydrophile. The aqueous phase which is dispersed advantageously represents from 20 to 50 parts by weight per 100 parts by weight of organic solvent, this quantity being able to vary with the content of molecules with lipophilic and hydrophilic fractions.

La dispersion de 1a première phase aqueuse dans le solvant organique peut être effectuée par agitation, notamment à l'aide d'ultrasons. Cette dispersion est toutefois effectuée de préférence sous l'action d'une turbine tournant à une vites-se relativement élevée. The dispersion of the first aqueous phase in the organic solvent can be carried out by stirring, in particular using ultrasound. However, this dispersion is preferably carried out under the action of a turbine rotating at a relatively high speed.

En pratique, pour réaliser la dispersion, on dissout les molécules à fractions lipophile et hydrophile dans le solvant organique, on soumet la solution organique à une agitation et on ajoute progressivement la première phase aqueuse. Il se forme une émulsion
E/H comprenant des précurseurs de liposomes.In practice, to carry out the dispersion, the molecules with lipophilic and hydrophilic fractions are dissolved in the organic solvent, the organic solution is subjected to stirring and the first aqueous phase is gradually added. An emulsion is formed
W / O comprising liposome precursors.

Cette émulsion est ensuite concentrée par éli mination de la majeure partie du solvant organique. This emulsion is then concentrated by removing most of the organic solvent.

Cette élimination du solvant organique doit être ef secouée par des méthodes douces, c'estçà-dire des méthodes ne détruisant pas la structure des précurseurs de liposomes.This elimination of the organic solvent must be shaken by gentle methods, that is to say methods which do not destroy the structure of the liposome precursors.

En pratique, il suffit de laisser décanter l'émulsion E/H. Une émulsion E/H concentrée se sépare au bout de quelques heures. On peut accélérer la décantation par centrifugation à faible vitesse. In practice, it suffices to allow the W / O emulsion to settle. A concentrated W / O emulsion separates after a few hours. Decantation can be accelerated by centrifugation at low speed.

L'émulsion concentrée ainsi obtenue est ensuite soumise simultanément à deux opérations
- d'une part, on ajoute progressivement à l'émulsion sous agitation une seconde phase aqueuse contenant des molécules à fractions lipophile et hydrophile,
- d'autre part, on soumet l'ensemble à une évaporation du solvant organique pour éliminer le solvant résiduel.The concentrated emulsion thus obtained is then subjected simultaneously to two operations
on the one hand, a second aqueous phase containing molecules with lipophilic and hydrophilic fractions is gradually added to the emulsion with stirring,
- On the other hand, the assembly is subjected to evaporation of the organic solvent to remove the residual solvent.

Les molécules à fractions lipophile et hydrophile destinées à former la paroi des liposomes, peuvent être presentes dans la seconde phase aqueuse sous forme de dispersion très fine, mais sont de préférence sous forme de solution ou de pseudo solution. The molecules with lipophilic and hydrophilic fractions intended to form the wall of the liposomes, may be present in the second aqueous phase in the form of a very fine dispersion, but are preferably in the form of solution or of pseudo solution.

Compte tenu du fait que ces molécules sont relativement peu solubles dans l'eau, on utilise de préférence des phases aqueuses qui contiennent ces molécules à une concentration voisine de la saturation, de façon à obtenir des compositions ayant des teneurs relativement élevées en liposomes. Pour augmenter la solubilité de ces molécules dans la phase aqueuse1 on peut ajouter à la phase aqueuse des adjuvants favorisant la dissolution, par exemple du glycérol ou de 1' alcool éthylique. Given the fact that these molecules are relatively poorly soluble in water, aqueous phases are preferably used which contain these molecules at a concentration close to saturation, so as to obtain compositions having relatively high contents of liposomes. To increase the solubility of these molecules in the aqueous phase, it is possible to add to the aqueous phase adjuvants promoting dissolution, for example glycerol or ethyl alcohol.

La quantité de cette seconde phase aqueuse peut être ajustée de façon à ajouter la quantité de molécules à fractions lipophile et hydrophile juste nécessaire pour obtenir une structure unilamellaire. The amount of this second aqueous phase can be adjusted so as to add the amount of lipophilic and hydrophilic fraction molecules just necessary to obtain a unilamellar structure.

Ceci peut être contrôlé notamment au microscope électronique.This can be checked in particular with the electron microscope.

L'évaporation du solvant résiduel peut etre obtenue notamment par passage au sein du mélange d'un gaz neutre tel que i'azote, à une température voisine de la température d'ébullition du solvant, cette opération pouvant être effectuée 'notamment sous un vide partiel. Evaporation of the residual solvent can be obtained in particular by passing through the mixture of a neutral gas such as nitrogen, at a temperature close to the boiling point of the solvent, this operation being able to be carried out in particular under a vacuum. partial.

En pratique, on dispose-l'émulsion concentrée dans un réacteur qui est muni d'un agitateur et qui est chauffé légèrement, on introduit progressivement la phase aqueuse, tout en faisant passer un gaz neutre chauffé et on maintient le réacteur sous un vide partiel. In practice, the concentrated emulsion is placed in a reactor which is provided with an agitator and which is slightly heated, the aqueous phase is gradually introduced, while passing a heated neutral gas and the reactor is maintained under a partial vacuum. .

Il est ainsi possible d'obtenir des liposomes dispersés dans une phase aqueuse, qui se caractérisent par une structure unilamellaire et une taille de particules très homogène. It is thus possible to obtain liposomes dispersed in an aqueous phase, which are characterized by a unilamellar structure and a very homogeneous particle size.

Ces caractéristiques sont liées à la nature déterminante des deux dernières étapes du procédé. En effet, dans la deuxième étape (élimination de la majeure partie du solvant) les techniques utilisées permettent d'éviter la destruction des précurseurs de liposomes et, dans la troisième étape, il est possible d'ajouter juste la quantité nécessaire de molécules à fractions lipophile et hydrophile pour obtenir une structure unilamellaire. De plus, le départ d'une faible quantité de solvant par évaporation a alors beaucoup moins d'effets destructifs au niveau de la paroi des liposomes que dans le cas du procédé du brevent FR. 2 399 242. These characteristics are linked to the determining nature of the last two stages of the process. Indeed, in the second step (elimination of most of the solvent) the techniques used make it possible to avoid the destruction of the liposome precursors and, in the third step, it is possible to add just the necessary quantity of molecules with fractions lipophilic and hydrophilic to obtain a unilamellar structure. In addition, the departure of a small amount of solvent by evaporation then has much less destructive effects at the level of the liposome wall than in the case of the brevent FR process. 2,399,242.

En outre, contrairement au procédé décrit dans le brevet FR. 2 399 242, le procédé selon l'invention est aisément réalisable à l'échelle industrielle. En effet, l'élimination du solvant organique par évaporation ne concerne plus dans le procédé selon l'invention qu'une fraction mineure de ce solvant et non pas la totalité de ce solvant. Il en résulte en outre une dépense plus faible en énergie. In addition, unlike the process described in the FR patent. 2,399,242, the method according to the invention can easily be carried out on an industrial scale. In fact, the elimination of the organic solvent by evaporation only concerns in the process according to the invention a minor fraction of this solvent and not all of this solvent. This also results in lower energy expenditure.

De plus, les rendements d'encapsulation sont élevés (ils peuvent être supérieurs à 70 %, ce qui permet d'éviter toute opération de recyclage des substances à encapsuler. In addition, the encapsulation yields are high (they can be greater than 70%, which makes it possible to avoid any operation of recycling the substances to be encapsulated.

Il est à noter également que le procédé selon l'invention permet d'encapsuler des produits sensibles à la chaleur, puisque les températures peuvent être modérées. It should also be noted that the method according to the invention makes it possible to encapsulate products sensitive to heat, since the temperatures can be moderate.

Grâce au procédé selon la présente invention, on peut encapsuler un grand nombre de substances. Ces substances peuvent être hydrophiles, lipophiles ou amphiphiles. Les substances hydrophiles'ou amphiphiles peuvent être ajoutées à la première phase aqueuse avant dispersion dans la phase organique et sont encapsulées à l'intérieur des liposomes. Les substances lipophiles ou amphiphiles peuvent être ajoutées à la phase organique, pour être encapsulées à l'intérieur des parois ou à leur périphérie après l'élimination du solvant organique. Thanks to the process according to the present invention, a large number of substances can be encapsulated. These substances can be hydrophilic, lipophilic or amphiphilic. The hydrophilic or amphiphilic substances can be added to the first aqueous phase before dispersion in the organic phase and are encapsulated inside the liposomes. Lipophilic or amphiphilic substances can be added to the organic phase, to be encapsulated inside the walls or at their periphery after the elimination of the organic solvent.

Ces substances peuvent être notamment des médicaments et des agents de diagnostic, notamment des produits opacifiants,ou des produits cosmétiques,de nature hydrophile ou lipophile. These substances can in particular be drugs and diagnostic agents, in particular opacifying products, or cosmetic products, of hydrophilic or lipophilic nature.

Comme exemples de médicaments, on peut citer des enzymes, des substances antitumorales, l'insuline, des agents chélatants, des stéroides. Examples of medicaments that may be mentioned are enzymes, anti-tumor substances, insulin, chelating agents, steroids.

Comme exemples de produits opacifiants hydrophiles, on peut citer les sels pharmaceutiquement acceptables des acides iotalamique, ioxitalamique et ioxaglique. As examples of hydrophilic opacifying products, mention may be made of the pharmaceutically acceptable salts of iotalamic, ioxitalamic and ioxaglic acids.

Comme exemple de produit opacifiant lipophile, on peut citer le monoiodostéarate d'éthyle. As an example of a lipophilic opacifying product, mention may be made of ethyl monoiodostearate.

En outre, on peut fixer sur la paroi des liposomes, par adsorption ou tout autre type de liaison, diverses substances et notamment des principes actifs ou des produits favorisant la migration des liposomes jusqu'à la cible visée. In addition, various substances can be attached to the wall of the liposomes, by adsorption or any other type of bond, in particular active principles or products promoting the migration of the liposomes to the targeted target.

Par le procédé selon la présente invention, on obtient une dispersion de liposomes dans une phase aqueuse. Dans les applications thérapeutiques, ou de diagnostic, cette composition peut être administrée par voie orale, parentérale ou locale. By the method according to the present invention, a dispersion of liposomes is obtained in an aqueous phase. In therapeutic or diagnostic applications, this composition can be administered by oral, parenteral or local route.

Les exemples suivants illustrent la présente invention. The following examples illustrate the present invention.

EXEMPLE 1
On soumet à l'action d'un appareil à turbine
Ultra Turrax T45 (tournant à 4000 t/mn) une phase organique comprenant 100 ml de dichlorométhane contenant en solution 3 g de lécithine de soja et 1 g de cholestérol, refroidie entre 5 et 10"C. Au cours de la première minute d'agitation, on introduit progressivement 32 ml d'eau à titre de première phase aqueuse. La durée totale d'agitation est de 4 minutes.EXAMPLE 1
We submit to the action of a turbine device
Ultra Turrax T45 (rotating at 4000 rpm) an organic phase comprising 100 ml of dichloromethane containing in solution 3 g of soya lecithin and 1 g of cholesterol, cooled between 5 and 10 "C. During the first minute of stirring, 32 ml of water are gradually introduced as the first aqueous phase, the total stirring time being 4 minutes.

L'émulsion E/H ainsi obtenue est versée dans une ampoule à décanter. Deux phases se séparent : une phase surnageante de couleur blanche et une phase organique. The W / O emulsion thus obtained is poured into a separatory funnel. Two phases separate: a supernatant phase of white color and an organic phase.

La phase surnageante a la consistance d'un gel. The supernatant phase has the consistency of a gel.

Elle est constituée par une émulsion E/H (sens déterminé par la méthode des colorants) comprenant des précurseurs de liposomes de taille homogène.It consists of a W / O emulsion (meaning determined by the dye method) comprising precursors of liposomes of uniform size.

Au bout de 24 heures, la décantation est pratiquement terminée et on élimine la phase organique. After 24 hours, the settling is almost complete and the organic phase is eliminated.

On introduit 20 ml de gel dans un reacteur en verre muni d'une arrivée d'azote au sein du gel, d'une arrivée de solution agueusie au fond du réacteur, d'une agitation mécanique de type turbine centrifuge (Microvortex) et d'un orifice permettant d'assurer un vide partiel. Le réacteur est maintenu dans un bainmarie thermostaté à 420C. 20 ml of gel are introduced into a glass reactor fitted with a nitrogen inlet in the gel, a stirred solution inlet at the bottom of the reactor, mechanical agitation of the centrifugal turbine type (Microvortex) and d '' an orifice to ensure a partial vacuum. The reactor is maintained in a water bath thermostatically controlled at 420C.

De l'azote à 40"C est envoyé à travers le réacteur et évacué par l'orifice relié au dispositif de vide. h'agitation est mise en route à 140 t/mn
On prépare une seconde phase aqueuse par dissolution de 2 g de lécithine de soja dans un litre d'eau contenant 0,5 g de glycérol et filtration à travers une membrane à ouverture de 0,22 ssm. On introduit dans le réacteur progressivement en 30 mn 400 ml de cette seconde phase aqueuse.Nitrogen at 40 "C is sent through the reactor and evacuated through the orifice connected to the vacuum device. Agitation is started at 140 rpm
A second aqueous phase is prepared by dissolving 2 g of soya lecithin in a liter of water containing 0.5 g of glycerol and filtration through a membrane with an opening of 0.22 ssm. 400 ml of this second aqueous phase are gradually introduced into the reactor over 30 min.

L'agitation est poursuivie encore 5 minutes. Agitation is continued for another 5 minutes.

Lorsque l'agitation est arrêtée, le courant d'azote est coupé et le vide est supprimé.When the stirring is stopped, the nitrogen flow is cut off and the vacuum is removed.

On obtient une dispersion fine de liposomes d'un volume final d'environ 420 ml. A fine dispersion of liposomes is obtained, with a final volume of approximately 420 ml.

L'étude de la granulométrie des liposomes obtenus, au Nanosizer, indique que leur taille moyenne est de 230 nm et que la dispersion est de 3. The study of the particle size of the liposomes obtained, with the Nanosizer, indicates that their average size is 230 nm and that the dispersion is 3.

L'examen au microscope électronique à transmission confirme l'homogénéité de la taille des liposomes et montre en outre qu'ils sont unilamellaires. Examination with a transmission electron microscope confirms the homogeneity of the size of the liposomes and also shows that they are unilamellar.

EXEMPLE 2
On opère comme à l'exemple 1, mais on utilise comme première phase aqueuse 32 ml d'une solution aqueuse de ioxitalamate de sodium et de méglumine à 38 % d'iode.EXAMPLE 2
The procedure is as in Example 1, but 32 ml of an aqueous solution of sodium ioxitalamate and meglumine containing 38% of iodine are used as the first aqueous phase.

On obtient une dispersion de liposomes ayant une taille moyenne de 237 nm avec une dispersion de 4. A dispersion of liposomes having an average size of 237 nm is obtained with a dispersion of 4.

La mesure de la taille des particules au bout de trois mois donne une valeur de 236 nm avec une dispersion de 4, ce qui montre la stabilité des liposomes ainsi obtenus au cours du temps. The measurement of the particle size after three months gives a value of 236 nm with a dispersion of 4, which shows the stability of the liposomes thus obtained over time.

EXEMPLE 3
On opère comme à l'exemple 1, mais on effectue la préparation de l'émulsion E/H en utilisant à la place de l'appareil à turbine un appareil à ultrasons (Branson). On introduit l'eau pendant la première minute et l'on soumet le mélange pendant encore une minute à l'action des ultrasons.EXAMPLE 3
The procedure is as in Example 1, but the W / O emulsion is prepared by using an ultrasonic device (Branson) in place of the turbine device. Water is introduced during the first minute and the mixture is subjected for another minute to the action of ultrasound.

On poursuit le traitement comme décrit à l'exemple 1. On obtient des résultats analogues. The treatment is continued as described in Example 1. Similar results are obtained.

Claims

1. A process for the preparation of liposomes consisting in forming in a first step a W / O type emulsion by dispersion of a first aqueous phase in an organic solvent immiscible with water in the presence of molecules comprising a lipophilic fraction and a fraction hydrophilic, characterized in that, in a second step, most of the organic solvent is removed from this emulsion by a gentle method thus obtaining a concentrated W / O emulsion then, in a third step, this emulsion E / is gradually added H concentrated under aigtation a second aqueous phase containing molecules comprising a lipophilic fraction and a hydrophilic fraction and simultaneously removing the residual organic solvent by evaporation.

2. Method according to claim 1, characterized in that the organic solvent is dichloromethane.

3. Method according to claim 1 or claim 2, characterized in that the first aqueous phase represents from 20 to 50 parts by weight per 100 parts by weight of organic solvent.

4. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the elimination of most of the organic solvent is carried out by decantation.

5. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the elimination of most of the organic solvent is carried out by centrifugation.

6. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the molecules comprising a lipophilic fraction and a hydrophilic fraction are present in the second aqueous phase at a concentration close to saturation.

7. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the quantity of the second aqueous phase is adjusted so as to add the quantity of molecules comprising a lipophilic fraction and a hydrophilic fraction just necessary to obtain a unilamellar structure .

8. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the residual organic solvent is evaporated under partial vacuum by bubbling a neutral gas at a temperature close to the boiling temperature of the organic solvent.

9. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that, in the first step, the first aqueous phase is gradually added to a solution of the molecules comprising a lipophilic fraction and a hydrophilic fraction in the organic solvent with stirring.

10. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the organic solvent contains from 0.5 to 5 parts by weight of molecules comprising a lipophilic fraction and a hydrophilic fraction per 190 parts by weight of organic solvent.

11. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the first aqueous phase contains a hydrophilic opacifying product.

12. Liposomes obtained by a process according to any one of claims 1 to 9.