FR2543572A1

FR2543572A1 - Preparation of Pseudomonas syringae inoculum of low water activity and use in the biological control of Dutch elm disease

Info

Publication number: FR2543572A1
Application number: FR8305443A
Authority: FR
Inventors: Gerard Jung; Jacques Mugnier
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1983-04-01
Filing date: 1983-04-01
Publication date: 1984-10-05

Abstract

The present invention relates to a Pseudomonas syringae inoculum and to the process for producing it. The process is characterised in that the Pseudomonas syringae is encapsulated in a polymeric gel and in that the water activity is reduced below 0.3, and preferably below 0.1, and in that it is maintained at this value. The inoculum can be applied in particular to the treatment of Dutch elm disease.

Description

PREPARATIONS D'INOCULUM DE PSEUDOMONAS SYRINGE
A FAIBLE ACTIVITE DE L'EAU ET UTILISATION DANS
LA LUTTE BIOLOGIQUE CONTRE LA GRAPHIOSE DE L'ORNE
La présente invention concerne une préparation de Pseudomonas syringae. Elle concerne plus particulièrement une préparation de
Pseudomonas syringae à faible activité de l'eau présentant une longue viabilité et une résistance améliorée à la température.INOCULUM PREPARATIONS OF PSEUDOMONAS SYRINGE
LOW ACTIVITY OF WATER AND USE IN
THE BIOLOGICAL FIGHT AGAINST THE GRAPHIOSIS OF THE ORNE
The present invention relates to a preparation of Pseudomonas syringae. It relates more particularly to a preparation of
Pseudomonas syringae with low water activity with long viability and improved temperature resistance.

Cette préparation est utilisée notamment dans la lutte biologique contre la graphiose de l1 orme. This preparation is used in particular in the biological control against elm disease.

Cette maladie, qui a détruit plusieurs millions d'ormes depuis son apparition signalée en France en 1918, est imputable à un champignon Ceratocystis ulmi dont la forme imparfaite asexuée est connue sous le nom de Graphium ulmi ; ce champignon revêt au cours de son cycle plusieurs formes (mycelium, spores issues du bourgeonnement -du mycelium, conidiospores, ascospores) qui toutes sont infectieuses pour l'orme. This disease, which has destroyed several millions of elms since its appearance reported in France in 1918, is attributable to a fungus Ceratocystis ulmi whose imperfect asexual form is known under the name of Graphium ulmi; this fungus takes during its cycle several forms (mycelium, spores from the budding of the mycelium, conidiospores, ascospores) all of which are infectious for elm.

Le champignon au cours de sa croissance synthétise des toxines qui entrainent la mort du parenchyme ligneux. The fungus during its growth synthesizes toxins that cause the death of the woody parenchyma.

La contamination des arbres sains par les arbres malades se fait soit directement par contact des racines, soit par dispersion des spores par l'intermédiaire de coléoptères du genre Scoltus,
Aussi pour lutter contre cette maladie, divers moyens ont été essayés : abattage des arbres atteints, écorçage, application de fongicides, piges à phéromonas, sélection d'ormes résistants.The contamination of healthy trees by diseased trees is done either directly by contact with the roots, or by dispersing spores by means of beetles of the genus Scoltus,
Also to fight against this disease, various means have been tried: felling of the affected trees, debarking, application of fungicides, pheromonas pigs, selection of resistant elms.

On a aussi essayé de lutter contre le principal agent vecteur de cette maladie1 c'est-a-dire contre les coléoptères à l'aide d'insecticides chimiques ou biologiques. Ce traitement permet d'éviter la propagation de la maladie mais ne résoud en rien le probleme consistant à traiter les ormes malades. It has also been tried to control the main vector of this disease, that is to say against the beetles with chemical or biological insecticides. This treatment prevents the spread of the disease but does not solve the problem of treating sick elms.

Le traitement de cette maladie a été tenté grâce à l'injection dans le tronc de nombreux fongicides systémiques de la famille des benzimidazoles. Mais cette technique est essentiellement préventive et doit être répétée fréquemment. D'autre part, son coat est très élevé et sa mise en oeuvre délicate. Treatment of this disease has been attempted through the injection into the trunk of many systemic fungicides of the benzimidazole family. But this technique is essentially preventive and needs to be repeated frequently. On the other hand, its coat is very high and its delicate implementation.

I1 est aussi connu d'apres le brevet US 4 342 746 de traiter cette maladie par voie biologique par des bactéries capables de se développer dans la sève de l'orme et de'produire une substance fortement inhibitrice vis-à-vis de Ceratocystis ulmi. Cette méthode de traitement uniquement biologique a pour avantage d'éviter de nuire à l'environnement en utilisant comme microorganisme le Pseudo montas syringae qui n'est pas toxique ni pour l'homme, ni pour les végétaux. It is also known from US Pat. No. 4,342,746 to treat this disease biologically by bacteria capable of developing in the sap of the elm and of producing a substance which is highly inhibitory with respect to Ceratocystis ulmi. . This method of biological treatment has the advantage of avoiding harm to the environment by using as a microorganism Pseudo montas syringae which is not toxic to humans or plants.

Afin de développer efficacement cette technique, il est nécessaire de pouvoir disposer de quantités importantes de Pseudomonas syringae. In order to effectively develop this technique, it is necessary to have large amounts of Pseudomonas syringae available.

Nais il est toujours difficile de stocker des organismes vivants sans avoir des pertes importantes. Le stockage des bactéries en milieu liquide est possible mais il doit être réalisé à une température maximale de 40 C et pendant des périodes relativement courtes en évitant toute contaminationétrangere ce qui pose de nombreux problèmes techniques et de lourdes contraintes technologiques. But it is always difficult to store living organisms without significant losses. The storage of bacteria in liquid medium is possible but it must be carried out at a maximum temperature of 40 C and for relatively short periods avoiding any foreign contamination which poses many technical problems and heavy technological constraints.

Vu l'importance écologique de ces préparations, de longues études ont permis de réaliser un inoculum de Pseudomonas syringae présentant une longue viabilité et une résistance améliorée à la température caractérisé par le fait que l'on inclut le Pseudomonas syringae dans un gel de polymère, que l'on abaisse l'activité de l'eau à une valeur inférieure à 0,3 et de préférence inférieure à 0,1 et qu'on la maintient à cette valeur. Considering the ecological importance of these preparations, long studies made it possible to carry out an inoculum of Pseudomonas syringae having a long viability and an improved resistance to the temperature characterized by the fact that one includes the Pseudomonas syringae in a gel of polymer, that the activity of the water is lowered to a value of less than 0.3 and preferably less than 0.1 and maintained at this value.

L'invention a également pour objet la préparation de ces inoculun ainsi que leur ueilisation en tant que fongicide biologique. The invention also relates to the preparation of these inoculum and their use as a biological fungicide.

Le moyen selon l'invention pour préparer ces inoculun consiste à inclure les bactéries dans un polymère auquel on fait subir un traitement de réticulation au moins partiel puis à modifier la disponibilité de l'eau de façon à bloquer son pouvoir calorique et de solvation. Cette disponibilité de l'eau exprimée en terme d'activité de l'eau permet lorsqu'elle atteint des valeurs extrêmement faibles de soustraire les bactéries aux actions néfastes des solutés présents dans le milieu de culture, des contaminants capables de se multiplier dans le milieu et au pouvoir de transmission calorique de l'eau. The means according to the invention for preparing these inoculants consists in including the bacteria in a polymer which is subjected to at least one crosslinking treatment and then modifying the availability of water so as to block its caloric and solvency. This availability of water expressed in terms of water activity makes it possible, when it reaches extremely low values, to remove bacteria from the harmful actions of the solutes present in the culture medium, contaminants capable of multiplying in the medium. and the power of caloric transmission of water.

Cette activité de l'eau minimum au-delà de laquelle les bactéries seront préservées est fonction des constituants du milieu de culture, du polymère dans lequel sont insérées les bactéries. This minimum water activity beyond which the bacteria will be preserved is a function of the constituents of the culture medium, the polymer in which the bacteria are inserted.

La valeur limite de l'activité de l'eau en-dessous de laquelle l'ensemble de ces facteurs présente une influence réduite est de 0,3 et de préférence de 0,1. The limit value of the water activity below which all these factors have a reduced influence is 0.3 and preferably 0.1.

Les valeurs de l'activité de l'eau sont déterminées par la méthode dite des solutions aqueuses saturées (MULTON, 1981, Techniques d'analyse et de contrôle dans les industries agro-alimentaires,
APRIA) ou par leur mesure directe à l'aide d'un hygromètre (Hygroscop) ROTRONIC BT, J. RICHARD et PEKLY.The values of water activity are determined by the so-called saturated aqueous solutions method (MULTON, 1981, Techniques of Analysis and Control in the Agro-Food Industries,
APRIA) or by direct measurement using a hygrometer (Hygroscop) ROTRONIC BT, J. RICHARD and PEKLY.

Les bactéries pouvant être mises en oeuvre selon la présente invention appartiennent aux souches de Pseudomonas syringae. The bacteria that can be used according to the present invention belong to Pseudomonas syringae strains.

Les essais et les résultats rapportés dans la présente invention ont porté sur une souche de Pseudomonas : Pseudomonas syringe
M 27 fournie par Ortho Chevron Chemical Company et déposée a la
Northern Utilization Research and Development Division sous le numéro NRRL B 12050 et à l'Institut Pasteur sous le numéro I 142.The tests and the results reported in the present invention related to a strain of Pseudomonas: Pseudomonas syringe
M 27 supplied by Ortho Chevron Chemical Company and filed at the
Northern Utilization Research and Development Division under number NRRL B 12050 and at the Institut Pasteur under number I 142.

Le milieu de culture de Pseudomonas syringae renferme au moins une source hydrocarbonée, des sels minéraux, une source azotée et éventuellement des facteurs de croissance. The Pseudomonas syringae culture medium contains at least one hydrocarbon source, mineral salts, a nitrogen source and optionally growth factors.

La source hydrocarbonée est choisie parmi les sucres tels que le mannitol, le galactose, le glycérol, le sorbitol, le saceharose, le glucose, le fructose > les alcools > les di ou polyosides et les polysaccharides et de préférence parmi le mannitol, le glucoses le glycérol et le saccharose
La source azotée peut etre d'origine minérale telle que nitrate d'ammonium, de potassium ou d'origine organique telle que notaitirnent lysine, arginîne, glycines glutamate oa extrait de levure.The hydrocarbon source is chosen from sugars such as mannitol, galactose, glycerol, sorbitol, saceharose, glucose, fructose>alcohols> di or polysaccharides and polysaccharides and preferably from mannitol, glucose glycerol and sucrose
The nitrogen source may be of mineral origin such as ammonium nitrate, potassium nitrate or organic acid such as lysine, arginine, glycines glutamate oa yeast extract.

Le milieu de culture préférentiel est le suivant
Extrait de levure Disco 1 gil
PO4HK2 0,5
MgS04 71120 0,2
NaCl 0,2
FeC13 0,004
Sucre (mannitol ou glucose ou 10
glycerol ou saccharose)
La concentration de la source hydrocarbonée dans le milieu de culture varie de 10 à 30 g/l, celle de la source azotée varie de 1 a 10 g/l.The preferred culture medium is as follows
Yeast Extract Disco 1 gil
PO4HK2 0.5
MgSO4 71120 0.2
NaCl 0.2
FeC13 0.004
Sugar (mannitol or glucose or 10
glycerol or sucrose)
The concentration of the hydrocarbon source in the culture medium varies from 10 to 30 g / l, that of the nitrogen source varies from 1 to 10 g / l.

L'inclusion des bactéries dans le polymère selon l'invention peut etre réalisée à partir de la culture liquide directement ou à partir d'un concentré de bactéries obtenu après centrifugation. The inclusion of the bacteria in the polymer according to the invention can be carried out from the liquid culture directly or from a bacterial concentrate obtained after centrifugation.

On fait subir au dit polymère un traitement de réticulation au moins partiel. Par traitement de réticulation au moins partiel, on entend un traitement susceptible de modifier la structure du polysaccharide tel que traitement thermique, traitement par un sel métallique ou par un autre polymère. The said polymer is subjected to at least partial crosslinking treatment. By at least partial crosslinking treatment is meant a treatment capable of modifying the structure of the polysaccharide such as heat treatment, treatment with a metal salt or with another polymer.

Le polymère dans lequel sont incluses les bactéries doit pour répondre aux projets de normes antipollution être biodégradable. The polymer in which the bacteria are included must be biodegradable in order to meet the draft anti-pollution standards.

Aussi, les polymères a base de polysaccharides sont utilisés de préférence aux autres polymères. Ils présentent l'avantage d'être rapidement biodégradables et de libérer ainsi facilement les bactéries
Les polysaccharides sont avantageusement d'origine bacterienne ou végétale.Also, polysaccharide-based polymers are used in preference to other polymers. They have the advantage of being rapidly biodegradable and thus easily freeing bacteria
The polysaccharides are advantageously of bacterial or plant origin.

Les polysaccharides d'origine bactérienne sont obtenus par fermentation d'un hydrate de carbone par un micro-organisme notamment du genre Xanthomonas ou Arthrobacter ou par des champignons appartenant par exemple au genre Sclérotium. The polysaccharides of bacterial origin are obtained by fermentation of a carbohydrate by a microorganism, in particular of the genus Xanthomonas or Arthrobacter, or by fungi belonging, for example, to the genus Sclerotium.

Les polysaccharides d'origine végétale peuvent avoir des provenances diverses telles que notamment algues (alginates, carraghénanes) exsudats de plantes (gomme karaya, adragante) et de graines (guar, caroube). Polysaccharides of plant origin can have various origins such as algae (alginates, carrageenans) exudates from plants (karaya gum, tragacanth) and seeds (guar, carob).

La réticulation peut se faire par exemple pour le cas des alginates par des sels-métalliques tels que de calcium. -
Selon un premier mode de mise en oeuvre de l'invention, on prépare un-milieu de culture que l'on ensemence avec la souche de
Pseudomonas syringae. Après quelques jours d'incubation, la culture totale ou les bactéries obtenues après centrifugation de la culture sont mélangées à un polymère ; après réticulation de ce polymère, le gel obtenu est déshydraté.The crosslinking can be done for example for the case of alginates with metal salts such as calcium. -
According to a first embodiment of the invention, a culture medium is prepared which is seeded with the strain of
Pseudomonas syringae. After a few days of incubation, the total culture or bacteria obtained after centrifugation of the culture are mixed with a polymer; after crosslinking of this polymer, the gel obtained is dehydrated.

La concentration en polymères dans la suspension à sécher se situe entre 1 et 2 %. The polymer concentration in the suspension to be dried is between 1 and 2%.

On peut ajouter à la suspension avant séchage des additifs tels que les constituants de la source hydrocarbonée précédemment cités ou tout autre produit inerte. L'ensemble gel, sel minéral, source hydrocarbonée et source azotée constitue entre 2 et 10 x en poids de la suspension à sécher. The additives such as the constituents of the hydrocarbon source mentioned above or any other inert product can be added to the suspension before drying. The whole gel, mineral salt, hydrocarbon source and nitrogen source is between 2 and 10 x by weight of the suspension to be dried.

L'étape de déshydratation consiste à diminuer l'activité de l'eau en-dessous de sa valeur critique c'est-à-dire en-dessous de 0,3 et de préférence en-dessous de 0,1. The dehydration step consists in reducing the activity of the water below its critical value, that is to say below 0.3 and preferably below 0.1.

L'étape de déshydratation peut se faire de diverses manières en une ou plusieurs étapes. Selon l'invention, un simple contact à l'air dans les conditions habituelles de température et d'humidité relative n'est pas suffisant. The dehydration step can be done in a variety of ways in one or more steps. According to the invention, a simple contact with air under the usual conditions of temperature and relative humidity is not sufficient.

Selon un premier mode de mise en oeuvre de l'étape de déshydre- tation, on fait appel a des techniques qui permettent d'obtenir une dessiccation plus poussée telles- que
- flux d'air chaud et sec, évidemment dans les conditions compatibles avec la survie du micro-organisme.According to a first embodiment of the dehydration step, techniques are used which make it possible to obtain a more thorough desiccation, such as
- hot and dry air flow, obviously in conditions compatible with the survival of the micro-organism.

- séchage à l'air complèté par une déshydratation de la poudre obtenue dans une enceinte hermétiquement close contenant une solution saturée en un composé présentant l'activité de l'eau requisse, évoluant vers l'équilibre avec l'inoculum. air drying complete with dehydration of the powder obtained in a hermetically sealed enclosure containing a saturated solution of a compound exhibiting the activity of the required water, evolving towards equilibrium with the inoculum.

Selon un deuxième mode de mise en oeuvre de l'étape de déshydratation, on peut faire appel à une technique de séchage par atomisation, qui, de manière inattendue conduit à des inoculum dans. According to a second embodiment of the dehydration step, it is possible to use a spray drying technique, which unexpectedly leads to inoculum in.

lesquels la survie du micro-organisme est préservée alors meme que les températures des gaz de traitement sont largement supérieures à celles que le micro-organisme peut subir.which survival of the microorganism is preserved even when the temperatures of the treatment gases are much higher than those that the microorganism can undergo.

Bien évidemment, on peut combiner plusieurs de ces techniques. Of course, many of these techniques can be combined.

Ainsi du point de vue économique, il est préférable d'adopter un système de séchage bi-étagé comme celui utilisé pour la déshydra- tation du lait. Ce système se compose d'un séchage par atomisation qui lorsqu'il est effectué avec une température convenable conduit à une activité de l'eau de l'ordre de 0,2 à 0,4 puis un séchage par lit fluidisé jusqu'a notamment une activité de l'eau inférieure à 0,1. L'utilisation d'un système bi-étagé permet d'augmenter le débit de la substance a sécher, par conséquent l'écart de température entre la sortie et l'entrée dans l'atomiseur. Thus, from an economic point of view, it is preferable to adopt a two-stage drying system such as that used for the dehydration of milk. This system consists of a spray drying which when done with a suitable temperature leads to a water activity of the order of 0.2 to 0.4 and then a fluidized bed drying up to including a water activity less than 0.1. The use of a two-stage system increases the flow rate of the substance to be dried, therefore the temperature difference between the output and the entry into the atomizer.

Le lit fluidisé utilisé pour terminer le séchage et atteindre une activité de l'eau inférieure a 0,3 et de préférence inférieure à 0,1 consomme 2 à 4 fois moins d'énergie pour l'élimination de la dernière fraction d'eau que l'atomisation. Globalement l'économie d'énergie réalisée par rapport à un atomiseur simple est de l'ordre de 20 X.
Pour maintenir l'activité de l'eau à une valeur optimale, on fait appel à un mode d'emballage étanche limitant les transferts d'eau entre l'atmosphère environnante et l'atmosphère interne des inoculun lors du stockage.The fluidized bed used to complete the drying and reach a water activity of less than 0.3 and preferably less than 0.1 consumes 2 to 4 times less energy for the removal of the last fraction of water than atomization. Overall energy savings achieved compared to a simple atomizer is of the order of 20 X.
To maintain the activity of the water at an optimum value, a sealed packaging mode is used which limits the transfer of water between the surrounding atmosphere and the internal atmosphere of the inoculum during storage.

Les inoculun se présentent sous forme de particules, à structure souple, facile à mettre en oeuvre, on peut utiliser avantageusement pour leur application la pulvérisation, la remise en suspension dans de l'eau ou dans une solution, puis l'injection dans la sève de l'orme. The inoculum are in the form of particles, flexible structure, easy to implement, can be advantageously used for their application spraying, resuspension in water or in a solution, and then injection into the sap elm.

Ces inoculun sont utilisés comme fongicides biologiques, ils sont notamment actifs contre Ceratocystis ulmi agent de la graphiose de l'orme. These inoculants are used as biological fungicides, they are particularly active against Ceratocystis ulmi agent of the elm's graphiose.

La présente invention sera plus aisément comprise à l'aide des exemples suivants, donnés à titre indicatif mais nullement limitatif. The present invention will be more easily understood using the following examples, given for information but not limiting.

Exemple 1
10) Culture de Pseudomonas syringae
La culture est développée durant trois jours sur gélose. Cette culture sert à ensemencer un erlenmeyer de 300 ml contenant un milieu de culture YEM de composition suivante
Extrait de levure Difco 1 g/l
P04HK2 0,5
MgS04, 7 H20 0,2
NaCl 0,2
FeCl3 0,004
Mannitol 10
Après trois jours d'incubation à 280 C, on ensemence un erlen meyer de 2 000 ml contenant le milieu YEM précédemment décrit. Après 24 heures, on ensemence un fermenteur de 75 litres contenant le même milieu. Après 24 heures d'incubation, le nombre de germes obtenu est de 3,2 109 germes/ml.Example 1
10) Culture of Pseudomonas syringae
The culture is developed for three days on agar. This culture is used to seed a 300 ml Erlenmeyer flask containing a YEM culture medium of the following composition
Difco yeast extract 1 g / l
P04HK2 0.5
MgSO4, 7 H20 0.2
NaCl 0.2
FeCl3 0.004
Mannitol 10
After three days of incubation at 280 ° C., a 2000 ml Erlenmeyer flask containing the YEM medium described above is inoculated. After 24 hours, a 75-liter fermenter containing the same medium is seeded. After 24 hours of incubation, the number of seeds obtained is 3.2 109 germs / ml.

20) préparation d ' un inoculum polymère xanthane-farine de
graines de caroube
On prépare deux solutions (les valeurs sont données pour la préparation de 300 g d'inoculum). 20) preparation of a xanthan polymer inoculum-flour of
carob seeds
Two solutions are prepared (the values are given for the preparation of 300 g of inoculum).

a) Solution de gomme xanthane : polysaccharide de type anionique de PM > 2.106 résultant de la fermentation d'hydrates de carbone par un micro-organisme de genre Xanthomonas que l'on désignera par produit 1. a) Xanthan gum solution: polysaccharide of anionic type of PM> 2.106 resulting from the fermentation of carbohydrates by a microorganism of Xanthomonas genus which will be designated by product 1.

On amène 100 ml d'eau distillée à 70-800 C, on ajoute 1,5 g du produit 1, on maintient cette température 20 à 30 minutes, sous agitation puis on le ramène entre 40 et 500 C. 100 ml of distilled water are brought to 70-800 ° C., 1.5 g of product 1 are added, this temperature is maintained for 30 minutes, with stirring and then brought back to between 40 and 500 ° C.

b) Solution de farine de graine de caroube = polysaccharide constitué d'unités - D - manno pyranosyl (liaisons 1 - 4) une sur quatre ou cinq étant substituée en G6 par un - D - galacto-pyranosyl PH = 3,1 105 que l'on désignera par la suite par produit 2. b) Locust bean meal solution = polysaccharide consisting of - D - manno pyranosyl units (1-4 linkages) one in four or five being substituted at G6 by - D - galacto - pyranosyl PH = 3.1. hereinafter referred to as product 2.

On procède de la même façon en remplaçant le produit 1 par 1,5 g de farine de graine de caroube. The procedure is the same, replacing the product 1 with 1.5 g of carob seed meal.

Lorsque les deux solutions sont à 40-450 C, on ajoute sous agitation, à chacune d'elle, 50 ml de suspension de Pseudomonas syringae. On verse alors, en agitant vigoureusement le mélange culture + gomme xanthane dans le mélange culture + farine de graine de caroube. L'obtention d'un gel consistant est instantanée. When the two solutions are at 40 ° to 450 ° C., 50 ml of suspension of Pseudomonas syringae are added with stirring to each of them. The culture + xanthan gum mixture is then poured vigorously into the mixture of culture and carob seed flour. Obtaining a consistent gel is instantaneous.

30) Préparation d'un inoculum polymère alginate CaSO4
Deux étapes sont nécessaires
a) Préparation de la suspension de Pseudomonas svringae dans un alginate de viscosite comprise entre 150 10-3 et 1.000 10-3
Pa.s. On dissout dans 80 ml de suspension de bactéries Ig d'alginate.30) Preparation of a CaSO4 alginate polymer inoculum
Two steps are needed
a) Preparation of the suspension of Pseudomonas svringae in a viscosity alginate between 150 10-3 and 1000 10-3
Not. It is dissolved in 80 ml of suspension of alginate Ig bacteria.

Pour cela, on disperse la poudre en pluie fine sur la culture en 11 agitant continuellement jusq'à solubilisation complète de l'alginate. For this, the powder is dispersed in fine rain on the culture by stirring continuously until complete solubilization of the alginate.

b) Gélification de la suspension
On ajoute à la suspension de Pseudomonas syringae dans l'algi- nate 20 ml d'une solution de CaS042H20 à 6 g/l. La prise en masse du gel est instantanée.b) Gelation of the suspension
To the suspension of Pseudomonas syringae in alginate is added 20 ml of a solution of CaS042H2O at 6 g / l. The caking of the gel is instantaneous.

Le pH du milieu est ajusté à 6,8. The pH of the medium is adjusted to 6.8.

Comme dit précédemment, le séchage est un point important puisque les modes de séchage utilisés dans llart antérieur pour la survie des bactéries telles que de Pseudomonas syrinae conduisaient à la destruction des bactéries. As said before, drying is an important point since the drying methods used in the prior art for the survival of bacteria such as Pseudomonas syrinae led to the destruction of bacteria.

Dans les exemples suivants, on règle l'activité de l'eau au moyen de solutions satures dont les valeurs des activités de l'eau à une température de 250 C sont exposées dans le tableau 1;

In the following examples, the water activity is controlled by means of saturated solutions whose values of the water activities at a temperature of 250 ° C are set out in Table 1;

<tb> <SEP> a <SEP> = <SEP>
<tb> <SEP> w
<tb> : <SEP> SOLUTES <SEP> (solutions <SEP> saturées) <SEP> : <SEP> Activité <SEP> de <SEP> l'eau <SEP> à <SEP> 250C
<tb> : <SEP> Actigel <SEP> (composé <SEP> déshydratant) <SEP> : <SEP> 0,04
<tb> : <SEP> NaOH <SEP> : <SEP> 0,07 <SEP>
<tb> : <SEP> KC2H302 <SEP> - <SEP> 1,5 <SEP> R20 <SEP> 0,23
<tb> <SEP> CaC12 <SEP> - <SEP> 6H2O <SEP> 0,31
<tb> : <SEP> Ca(No3)2 <SEP> 41120 <SEP> 0,51
<tb> : <SEP> CuC12 <SEP> 0,69
<tb> : <SEP> NaCl <SEP> 0,75 <SEP>
<tb> :<SEP> KCl <SEP> : <SEP> 0,84
<tb>
Exemple 2
On place les gels d'alginate séchés contenant Pseudomonas- syringe dans des enceintes correspondant aux activités de lteau suivantes 0,04 - 0,07 - 0,23 - 0,31 - 0,51 - 0,75 - 0,34 pendant 90 jours à une température de 28 C.<tb><SEP> a <SEP> = <SEP>
<tb><SEP> w
<tb>: <SEP> SOLUTES <SEP> (saturated <SEP> solutions) <SEP>: <SEP><SEP> Activity <SEP> water <SEP> to <SEP> 250C
<tb>: <SEP> Actigel <SEP> (compound <SEP> desiccant) <SEP>: <SEP> 0.04
<tb>: <SEP> NaOH <SEP>: <SEP> 0.07 <SEP>
<tb>: <SEP> KC2H302 <SEP> - <SEP> 1.5 <SEP> R20 <SEP> 0.23
<tb><SEP> CaC12 <SEP> - <SEP> 6H2O <SEP> 0.31
<tb>: <SEP> Ca (No3) 2 <SEP> 41120 <SEP> 0.51
<tb>: <SEP> CuC12 <SEP> 0.69
<tb>: <SEP> NaCl <SEP> 0.75 <SEP>
<tb>: <SEP> KCl <SEP>: <SEP> 0.84
<Tb>
Example 2
The dried alginate gels containing Pseudomonas-syringe are placed in enclosures corresponding to the following water activities 0.04 - 0.07 - 0.23 - 0.31 - 0.51 - 0.75 - 0.34 for 90. days at a temperature of 28 C.

Avant stockage, le logarithme du nombre de germes par gramme est de 9,3. Before storage, the logarithm of the number of germs per gram is 9.3.

A la suite de cette période (90 jours) les bactéries sont dénombrées par la méthode des suspensions dilutions bien connue de l'homme de l'art. Les résultats obtenus (tableau 2) montrent que
Pseudomonas syringae présente une très bonne survie au cours du temps lorsqu'il est stocké à une activité de l'eau (a ) inférieure ou égale à 0,07 et une survie correcte lorsqu'il est stocké à une activité de l'eau inférieure à 0,3.

Following this period (90 days) the bacteria are counted by the dilution suspensions method well known to those skilled in the art. The results obtained (Table 2) show that
Pseudomonas syringae has a very good survival over time when stored at a water activity (a) less than or equal to 0.07 and a correct survival when stored at a lower water activity at 0.3.

<SEP> : <SEP> aw <SEP> : <SEP> 0,04 <SEP> 0,07 <SEP> 0,23 <SEP> 0,31 <SEP> 0,51 <SEP> 0,75 <SEP> 0,84
<tb> : <SEP> log <SEP> nb <SEP> g/g <SEP> : <SEP> 9,2 <SEP> 9,2 <SEP> 8,4 <SEP> 7,1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> ExPnple 3
On mesure l'activité de Pseudomonas syringae sur Ceratocystis ulmi responsable de la graphiose de l'orme.<SEP>: <SEP> aw <SEP>: <SEP> 0.04 <SEP> 0.07 <SEP> 0.23 <SEP> 0.31 <SEP> 0.51 <SEP> 0.75 <SEP > 0.84
<tb>: <SEP> log <SEP> nb <SEP> g / g <SEP>: <SEP> 9.2 <SEP> 9.2 <SEP> 8.4 <SEP> 7.1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> ExPnple 3
The activity of Pseudomonas syringae on Ceratocystis ulmi responsible for the elm disease is measured.

On mesure l'activité de suspensions de Pseudomonas syringae obtenues à partir d'une culture de Pseudomonas syringae incluse dans un gel d'alginate séchée et stockée 80 jours à une activité de l'eau de 0,07 puis remise en suspension à raison de 60 mg de poudre déshydratée pour 9 ml de tampon pH 7, par estimation de l'inhibition de la croissance de Ceratocystis ulmi en botte de Petri. The activity of suspensions of Pseudomonas syringae obtained from a Pseudomonas syringae culture included in a dried alginate gel and stored for 80 days at a water activity of 0.07 and resuspended at a rate of 60 mg of dehydrated powder per 9 ml of pH 7 buffer, by estimation of growth inhibition of Ceratocystis ulmi in Petri bunch.

Le pourcentage d'inhibition de la culture incluse atteint 90 .X par rapport à un témoin développé dans les memes conditions en absence de Pseudomonas syringae inclus. The percentage inhibition of the culture included reaches 90 .X compared to a control developed under the same conditions in the absence of Pseudomonas syringae included.

L'activité de Pseudomonas syringae sur Ceratocystis ulmi est parfaitement conservée après un stockage de 80 jours à une activité de l'eau de 0,07. The activity of Pseudomonas syringae on Ceratocystis ulmi is perfectly preserved after storage for 80 days at a water activity of 0.07.

Exemple 4
Influence de la source hydrocarbonée sur la survie de
Pseudomonas syringae
Des milieux de culture contenant des sources hydrocarbonées différentes ont été essayés. La suspension de Pseudomcnas syringae obtenue a été incluse dans un gel qui a été séché puis stocké pendant 122 jours à 280 C à une activité de l'eau de l'ordre de 0,07.Example 4
Influence of the hydrocarbon source on the survival of
Pseudomonas syringae
Culture media containing different hydrocarbon sources were tested. The resulting Pseudomenas syringae suspension was included in a gel which was dried and stored for 122 days at 280 ° C at a water activity of about 0.07.

Le nombre de bactéries survivantes a été déterminé par la technique des suspensions dilutions. The number of surviving bacteria was determined by the technique of suspensions dilutions.

Le milieu de culture assurant une survie optimale de
Pseudomonas syringae est le milieu YEN contenant comme source hydrocarbonée le mannitol.The culture medium ensuring optimal survival of
Pseudomonas syringae is the YEN medium containing mannitol as the hydrocarbon source.

Exemple 5
Comparaison de l'efficacité de diverses souches de Pseudomonas syringae sur Ceratocystis ulmi.Example 5
Comparison of the efficacy of various strains of Pseudomonas syringae on Ceratocystis ulmi.

Les souches essayées ont été fournies par = Ortho Chevron Chemical-company - Institut National de la Recherche Agronomique
Collection Nationale de Bactéries Phytopathogènes (C.N.B.P.).

The strains tested were provided by = Ortho Chevron Chemical-company - National Institute of Agronomic Research
National Collection of Phytopathogenic Bacteria (CNBP).

: <SEP> Souches <SEP> de <SEP> : <SEP> Nb. <SEP> de <SEP> germes <SEP> : <SEP> Inhibition
<tb> : <SEP> Pseudomonas <SEP> syringae <SEP> : <SEP> par <SEP> ml <SEP> : <SEP> C. <SEP> Ulmi
<tb> <SEP> : <SEP> : <SEP> : <SEP> %
<tb> : <SEP> Chevron <SEP> M <SEP> 27 <SEP> : <SEP> <SEP> 2,5 <SEP> 109 <SEP> : <SEP> <SEP> 90
<tb> : <SEP> INRA <SEP> 62311 <SEP> : <SEP> 3,0 <SEP> 109 <SEP> : <SEP> O
<tb> : <SEP> INRA <SEP> 62224 <SEP> : <SEP> <SEP> 2,2 <SEP> 109 <SEP> : <SEP> O
<tb> : <SEP> INRA <SEP> 64611 <SEP> : <SEP> 1,0 <SEP> 109 <SEP> : <SEP> 60
<tb> : <SEP> INRA <SEP> 5911 <SEP> : <SEP> 3,4 <SEP> 109 <SEP> : <SEP> 0
<tb> : <SEP> CNBP <SEP> 1585 <SEP> : <SEP> 1,9 <SEP> 109 <SEP> : <SEP> 80
<tb> : <SEP><SEP> strains of <SEP>: <SEP> Num. <SEP> of <SEP> germs <SEP>: <SEP> Inhibition
<tb>: <SEP> Pseudomonas <SEP> syringae <SEP>: <SEP> by <SEP> ml <SEP>: <SEP> C. <SEP> Ulmi
<tb><SEP>:<SEP>:<SEP>:<SEP>%
<tb>: <SEP> Chevron <SEP> M <SEP> 27 <SEP>: <SEP><SEP> 2.5 <SEP> 109 <SEP>: <SEP><SEP> 90
<tb>: <SEP> INRA <SEP> 62311 <SEP>: <SEP> 3.0 <SEQ> 109 <SEP>: <SEP> O
<tb>: <SEP> INRA <SEP> 62224 <SEP>: <SEP><SEP> 2.2 <SEP> 109 <SEP>: <SEP> O
<tb>: <SEP> INRA <SEP> 64611 <SEP>: <SEP> 1.0 <SEP> 109 <SEP>: <SEP> 60
<tb>: <SEP> INRA <SEP> 5911 <SEP>: <SEP> 3,4 <SEP> 109 <SEP>: <SEP> 0
<tb>: <SEP> CNBP <SEP> 1585 <SEP>: <SEP> 1,9 <SEP> 109 <SEP>: <SEP> 80
<Tb>

Claims

A process for the preparation of Pseudomonas syringae inoculum, characterized in that the Pseudomonas syringae is included in a polymer gel and the activity of the water is lowered below 0.3 and preferably below 0.1 and keep it at this value.

2. Method according to claim 1, characterized in that the polymer is from the group of polysaccharides which is subjected to at least partial crosslinking.

3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that the polymer is crosslinked by one of the following treatment modes: thermal, using a metal salt, by means of another polymer.

4. Method according to claim 1 or 2, characterized in that the polymer is a heteropolymer based on gum, xanthan and locust bean flour.

5. Process according to claim 1 or 2, characterized in that the polymer is an alginate-based polymer.

6. Method according to claim 1, characterized in that the Pseudomonas culture medium contains a hydrocarbon source selected from sugars, alcohols, di or polysaccharides and polysaccharides.

7. Method according to claim 1, characterized in that the culture medium contains a mineral nitrogen source such as ammonium nitrate, potassium or organic such as lysine, arginine, glycine, glutamate and yeast extract.

8. Process according to claim 1, characterized in that the activity of the water is lowered by atomization.

9. A process according to claim B, characterized in that the activity of the water is lowered by spraying and passing over a fluidized bed.

10. Inoculum obtained by implementing the method according to one of claims I to 9, characterized in that it comprises

Pseudomonas syringae included in an at least partially crosslinked polymer gel.

11. Application of the inoculum according to any one of the preceding claims to the biological control against the elm graphiose.