FR2540121A1 - Procede de preparation d'un facteur stimulant des colonies et de kallikreine provenant de l'urine humaine - Google Patents
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Abstract
Procédé de séparation de facteur stimulant les colonies et de kallikréine provenant d'urine humaine sous forme pure, à partir d'une solution aqueuse de ceux-ci, telle qu'une solution concentrée en protéines urinaires. Il consiste à soumettre la solution, additionnée d'un stabilisant tel que l'octyl-phénoxypolyéthoxyéthanol ou le polyéthylène glycol ayant tous deux une masse moléculaire de 1000-10.000, à une filtration sur gel à hautes performances efficace dans la limite d'exclusion moléculaire, déterminée avec une protéine globulaire, de 10**5 -5 x 10**5 . (CF DESSIN DANS BOPI)
Description
1 2540121
Procédé de préparation d'un facteur stimulant
des colonies et de kallikréine provenant de l'urine humai-
ne. La présente invention concerne un procédé de préparation d'un facteur stimulant des colonies (désigné ci-après par CSF), et de kallikréine provenant de l'urine humaine. Elle concerne plus particulièrement un procédé de préparation simultanée de CSF exempt de kallikréine
et de kallikréine appropriée à l'utilisation pharmaceuti-
que en isolant le CSF et la kallikréine, qui sont des substances physiologiquement actives, à l'état purifié avec des taux de récupération élevés, à partir d'urine de sujets humains normaux ou d'une solution contenant du CSF et de la kallikrdine (désignée ci-après sous le nom
d'"urine humaine etc ").
Le CSF et la kallikréine sont des substances physiologiquement actives de masse moléculaire êlevée présentes dans l'urine humaine à l'état de traces Le CSF est une glycoprotéine qui agit sur les cellules souche de la granulopoièse de la moelle osseuse de la souris et de l'homme et stimule la prolifération et la différentiation de ces cellules pour former des monocytes macrophages et des granulocytes, lesquels appartiennent au groupe leucocytaire (Motoyoshi K et coll, Blood, 52 1012- 1020 ( 1978); Das S K et coll, Blood, 58, 630-641 ( 1981)) Il est également connu que le CSF stimule aussi
la production in vivo de CSF et que, lorsqu'il est admi-
nistré à un cancéreux souffrant d'une leucopénie grave
due à des traitements tels que l'administration de subs-
tances carcinostatiques ou l'irradiation par les rayons X, il favorise la récupération ou l'augmentation du nombre de leucocytes, dont le granulocyte est le constituant principal (Motoyoshi K et coll, Japanese Journal of
Medicine, 21, 187-191 ( 1982)).
De son côté, la kallikréine est une sorte d'enzy-
me protéolytique qui participe à la formation de la kini-
ne, laquelle est un peptide physiologiquement actif déri-
vant du kininogène présent dans le plasma des mammifères et dans le système de coagulation du sang La kinine
formée à partir de la kallikréine a des activités physio-
logiques telles que la vasodilatation des vaisseaux
sanguins périphériques et l'augmentation de la perméabi-
lité des vaisseaux sanguins; la kallikréine remplit une
lo fonction de régulation de ces activités A l'heure ac-
tuelle, des préparations pharmaceutiques de kallikréine extraite de pancréas d'animaux existent dans le commerce sous forme de médicament pour améliorer la circulation du sang etc La kallikréine provenant d'urine humaine
a un effet physiologique équivalant à ceux de ces kalli-
kréines d'origine animale et de plus, en raison de son origine humaine, la préparation de kallikréine à partir d'urine humaine a moins de chances de donner lieu à des effets secondaires causés par des protéines étrangères, ce qui permet une administration répétée, et elle est par suite supérieure comme médicament aux préparations
de kallikréine d'origine animale.
D'autre part, si l'on prépare des préparations pharmaceutiques en isolant du CSF et de la kallikréine de l'urine humaine, la contamination par une des deux substances de la préparation pharmaceutique de l'autre est indésirable du point de vue de la qualité et de la sécurité du médicament En particulier, lorsque le CSF
est utilisé comme agent thérapeutique pour la granulo-
cytopénie, il est efficace de l'administrer par voie intraveineuse, et par suite la contamination par de la kallikréine est absolument inadmissible Lorsque la kallikréine est administrée, môme en très faible quantité par voie intraveineuse, elle exerce une action hypotensive marquée en raison de son action vasodilatatrice
3 2540121
sur les vaisseaux sanguins périphériques; en conséquence, lorsqu'une grande quantité de kallikréine, qui dépend de la quantité de CSF administrée, est introduite dans la veine, elle peut causer un choc au malade par suite de la diminution rapide de la pression sanguine. Le CSF et la kallikréine provenant d'urine humaine sont tous deux des produits pharmaceutiques
extrêmement précieux, comme il a été indiqué ci-dessous.
En conséquence, il est très avantageux, pour obtenir des produits pharmaceutiques de haute sécurité et de faible prix, de les récupérer efficacement de l'urine
humaine etc et de les préparer dans un état com-
plètement séparé l'un de l'autre Cependant, on ne dis-
posait jusqu'à présent que de très peu d'informations en ce qui concerne un procédé permettant d'obtenir
efficacement les deux substances, le CSF et la kallikréi-
ne, séparément l'une de l'autre, à partir d'urine humai-
ne etc La raison en est que bien que le CSF et la
kallikréine n'aient pas toujours des actions physiologi-
ques et des origines identiques, ils ont des propriétés
étroitement similaires Par exemple, le CSF et la kalli-
kréine sont tous deux des protéines auxquelles est liée une chaîne de saccharide, et leurs points isoélectriques sont tous deux dans le domaine acide (p H 3,0-4,5), de sorte qu'il était difficile de les séparer sur la base de la différence de leurs propriétés électriques En outre, lorsqu'ils sont présents dans l'urine humaine,
ils ont des masses moléculaires extrêmement voisines-
l'une de l'autre, celle du CSF étant de 60 000-100 000
dalton et celle de la kallikréine de 50 000-80 000 dalton.
On a étudié précédemment des procédés de sépa-
ration et de purification du CSF ou de la kallikréine
à partir d'urine humaine, ainsi que dans d'autres subs-
tances physiologiquement actives, pour chaque substance
individuelle, et par suite ces procédés étaient inappli-
cables à une purification efficace et simultanée du CSF et de la kallikréine En conséquence, lorsque le CSF
était préparé sous une forme purifiée exempte de kalli-
kréine, le taux de récupération de la kallikréine était
très mauvais De même, lorsqu'on avait en vue l'isole-
ment de la kallikréine, la récupération du CSF était impossible Comme procédé d'obtention simultanée du CSF et de la kallikréine à partir de l'urine humaine sous une forme complètement séparée et purifiée avec un pourcentage élevé de récupération, la demanderesse
a déjà inventé un procédé pour utiliser la chromato-
graphie d'affinité et la chromatographie sur échangeurs d'ions et déposé une demande de brevet (demande de brevet Japonais Kokai N O 58 629/82; désigné ci-après
sous le nom de "procédé de la demande antérieure").
Le procédé de la demande antérieure ne peut
cependant pas être considéré comme idéal à tous égards.
Par exemple, bien que la chromatographie d'affinité présente d'excellentes caractéristiques de séparation, orbant d'affinité par quantité unitaire à traiter est élevé D'autre part, l'échangeur d'ions, bien que très avantageux économiquement, présente l'inconvénient de sa difficulté de mise en oeuvre et, en particulier dans le cas d'une élution par gradient de concentration visant à un fractionnement précis, il nécessite un traitement ménagé exigeant le plus grand
soin possible et une durée prolongée Un troisième pro-
cédé pour isoler le CSF et la kallikréine simultanément à l'état purifié est la chromatographie de filtration sur gel dans laquelle le fractionnement est réalisé sur la base de la différence de masse moléculaire Cependant, le gel tendre largement utilisé jusqu'à présent, qui est principalement constitué d'un polysaccharide ou de divers
plastiques, ne pourrait pas réaliser une séparation com-
plète du CSF et de la kallikréine en raison de la grande
proximité de leurs masses moléculaires.
La chromatographie liquide à hautes performances est une technique qui a été mise au point récemment à la suite des efforts consacrés à l'amélioration des divers types de chromatographie largement utilisés pour la séparation et l'identification de composés organiques. Sa caractéristique est de permettre, sous une pression
élevée et un débit élevé, un fractionnement chromato-
graphique extrêmement précis de divers composés en un temps court Dans le domaine de la filtration sur gel, en particulier, elle est parvenue à fournir un moyen
pour améliorer radicalement le fractionnement de subs-
tances de masse moléculaire élevée sur la base de leurs masses moléculaires, et s'est accompagnée de la mise au point d'un gel dur ayant une excellente résistance à la pression utilisable à la place du gel tendre de
la technique antérieure.
La demanderesse a constaté les excellentes caractéristiques de fractionnement de la filtration sur
gel dans la chromatographie liquide à hautes performan-
ces et effectué la purification simultanée du CSF et de la kallikréine provenant d'urine humaine en utilisant ce procédé Elle a trouvé que le CSF et la kallikréine pouvaient être séparés avec d'excellents résultats par
une chromatographie liquide à hautes performances utili-
sant un gel résistant à la pression constituée principa-
lement de gel de silice Mais les gels disponibles dans le commerce pour la chromatographie liquide à hautes performances présentent un phénomène d'adsorption non spécifique du CSF et de la kallikréine, et une partie
du CSF et de la kallikréine reste à la surface du gel.
Bien que l'adsorption non spécifique sur la surface du gel soit un phénomène généralement observé sur les gels du commerce, il est possible d'éviter le phénomène en
augmentant la force ionique du solvant chromatographique.
Mais l'augmentation de la force ionique a d'autre part
pour résultat que l'activité biologique (désignée ci-
après simplement par activité) du CSF devient instable
et que la quantité d'activité récupérée diminue.
La demanderesse a effectué des études poussées sur les conditions de filtration liquide à hautes per- formances sur gel permettant de séparer et de purifier
efficacement le CSF et la kallikréine empêchant l'ad-
sorption non spécifique sur le gel ainsi que la dimi-
nution de l'activité du CSF Ces études ont abouti à
la présente invention par la découverte que l'octylphé-
noxypolyéthoxyéthanol (désigné ci-après sous le nom
d'OPPE) ou le polyéthylène glycol, connu comme stabili-
sant de l'activité du CSF, convenaient à cet effet.
Le but de l'invention est de fournir un procédé de préparation simultanée du CSF et de la kallikréine à l'état complètement séparé l'un de l'autre avec des taux de récupération élevés à partir d'urine humaine etc Conformément à la présente invention, il est fourni un procédé de préparation d'un facteur stimulant des colonies et de kallikréine provenant d'une urine humaine, qui consiste à concentrer l'urine de sujets humains normaux ou une solution contenant du facteur stimulant les colonies et de la kallikréine provenant d'urine humaine en les protéines qui y sont contenues, à mettre en équilibre le liquide concentré obtenu avec une solution tampon contenant un stabilisant, à soumettre le liquide à une chromatographie par filtration sur gel à hautes performances en introduisant le liquide dans une colonne qui a été remplie d'un gel ayant une limite d'exclusion moléculaire déterminée avec une protéine globulaire, de 105-5 x 105 dalton et en équilibre avec cette solution tampon, pour fractionner les fractions du facteur stimulant les colonies et les fractions de
kallikréine, et à les recueillir toutes les deux.
Les figures 1 et 2 sont des graphes montrant
les diagrammes de fractionnement du CSF et de la kallikré-
ine par filtration sur gel conformément au procédé an-
térieur et par filtration sur gel à hautes performances conformément à la présente invention, respectivement. Dans les deux figures, on a porté en ordonnées du côté gauche l'activité du CSF et la densité optique à 280 nm; en ordonnées du côté droit l'activité de la kallikréine; et en abscisses le numéro de fraction Les symboles -, -0-, et -S représentent respectivement la densité
optique, l'activité du CSF et l'activité de la kallikré-
ine. L'urine humaine etc est ajustée à p H 6-8 avec une solution acide diluée ou une solution alcaline
et concentrée par un procédé approprié connu de concen-
tration des protéines tel que l'adsorption sur un adsor-
bant minéral tel que le gel de silice ou un échangeur d'ions, le relargage au moyen d'un sel neutre tel que
le sulfate d'ammonium, l'ultrafiltration et une combi-
naison de ceux-ci La teneur en protéine dans l'urine humaine concentrée etc obtenue est de préférence
de 2 à 10 % (P/v).
Les symboles "% (P/v)" ou "%(v/v)" utilisés
dans la description désignent respectivement la quantité
de matière en poids (g) ou en volume (ml) dans 100 ml du liquide.
Il est avantageux dans la pratique de l'inven-
tion d'utiliser certains procédés connus dans le stade de concentration ci-dessus, pour éliminer des quantités de substances contaminantes de masse moléculaire élevée aussi importantes que possible dans un intervalle non
préjudiciable à la récupération du CSF et de la kalli-
kréine. Le liquide ainsi concentré est mis en équilibre avec une solution tampon ayant une force ionique d'au moins 0,05 et inférieure à 0,5, de préférence-de 0,1-0,3 et un p H de 6,0-8,0, par exemple une solution tampon au phosphate de sodium On y ajoute ensuite de l'OPPE, par exemple du Triton X-100 (marque déposée de Rohm and Haas Co) ou du polyéthylène glycol ayant tous deux une masse moléculaire de 1000 à 10 000, comme stabili- sant à une concentration de 0,01-0,1 % (P/v) Puis on
soumet le liquide obtenu à une filtration sur gel à hau-
tes performances en injectant dans une colonne remplie
d'un gel pour chromatographie liquide à hautes perfor-
mances ayant une limite d'exclusion moléculaire, déter-
minée avec une protéine globulaire, de 10 5 x 105 dalton, tel que le TSKGel 3000 SW du commerce (marque déposée de la Toyo Soda Inc), le ZORBAX PSM-1000 (marque déposée de Dupont Inc), ou le Shim-pack HSG-40 (marque déposée de Shimazu Seisakusho Inc) et mis en équilibre avec la solution tampon mentionnée ci-dessus contenant la même quantité de stabilisant en faisant passer la solution à travers lui auparavant; et en faisant passer ce liquide mlc-2
à travers cette colonne sous un débit de 1 à 5 ml cm 2.
min 1 au moyen d'une pompe à haute pression La pression de la solution tampon traversant la colonne varie avec le rayon de la colonne, mais on préfère normalement une pression de 10 kg/cm 2 ( 1 M Pa) ou davantage pour un rayon
de 5 mm.
Par les modes opératoires ci-dessus, le CSF
est élué de la colonne sous la forme d'une fraction cons-
tituant un pic unique pour une masse moléculaire de 85 000 dalton, et la kallikréine est éluée sous la forme d'une fraction ayant un pic pour une masse moléculaire de
60 000 dalton, et ces fractions sont récupérées indivi-
duellement Le CSF et la kallikréine sont soumis respec-
tivement, si on le désire, à une dialyse et à un relargage,
ils sont mélangés à un sel d'ajustement du p H, à un adju-
vant de solubilisation ou à un excipient pharmaceutiquement acceptables, puis soumis à un traitement tel que la filtration sur membrane pour la stérilisation et à un enflaconnage ou à une lyophilisation aseptique pour
obtenir un produit pharmaceutique Le CSF et la kalli-
kréine séparés de la manière indiquée ci-dessus peuvent aussi être soumis individuellement à une purification
ultérieure par des procédés connus.
Le CSF et la kallikréine sont ainsi préparés simultanément. Les exemples non limitatifs suivants sont
donnés à titre d'illustration de l'invention.
Essai 1.
Essai comparatif de chromatographie par filtration sur gel de l'invention avec celle du procédé antérieur. On soumet un liquide concentré provenant d'urine humaine préparé de la même manière que dans l'exemple 1 décrit ciaprès à une chromatographie par filtration sur gel en utilisant le Sephacryl S-300 (marque commerciale de Pharmacia Fine Chemicals Inc) du procédé antérieur et du TSK-Gel 3000 SW (marque déposée de Toyo Soda Inc) pour la chromatographie
liquide à hautes performances de l'invention pour compa-
rer les caractéristiques de séparation des deux procédés.
Dans la colonne de Sephacryl S-300 ( O 20 x 1200 mm), on injecte 1,4 ml de ce liquide concentré, et dans la colonne de TSK-Gel 3000 SW ( O 7,5 x 1200 mm), on injecte 0,2 ml du même liquide On effectue la chromatographie en faisant passer la même solution tampon que dans l'exemple 1 sous
un débit de 5 ml/cm 2/h dans la première colonne en utili-
sant une pompe péristaltique, et de 2,0 ml/cm 2/min dans la dernière colonne en utilisant une pompe de transport des liquides sous haute pression LC-3 A (fabriquée par Shimazu Seisakusho Inc) On recueille des fractions de ml chacune (dans la première) et de 2 ml chacune (dans la dernière) et on détermine les activités du CSF et de
la kallikréine par le procédé suivant.
L'activité du CSF est déterminée par le procédé de formation de colonies en utilisant la technique de culture sur gélose molle en monocouche, avec des cellules de moelle osseuse de souris C 57 BL/6 N Ainsi, chaque échantillon de fraction est dilué de manière appropriée avec de l'eau distillée contenant 2 % (v/v) de sérum de boeuf, et stérilisée par filtration (en utilisant un filtre à pores de 0,45 pm) On place chaque portion de 0,1 ml du filtrat dans trois boites de Pétri et on y ajoute 1 ml de milieu 5 A de Mc Coy contenant 0,3 % (P/v) de gélose, 20 % (v/v) de sérum de foetus de veau et lx 105 cellules de moelle osseuse de souris C 57 BL/6 N. Apres mélange intime, on fait incuber le mélange pendant 7 jours dans un incubateur à 37 C dans une atmosphère de
gaz carbonique à 7,5 % (v/v) complètement humidifiée.
Apres incubation, on compte le nombre de colonies formées
sous un microscope, le terme "colonie" désignant ici un agré-
gat cellulaire contenant plus de 50 cellules L'activité
du CSF est exprimée en nombre (unités) de colonies for-
mées Une "unité" désigne ici une colonie formée La pureté de l'échantillon de CSF obtenu est exprimée en activité spécifique, c'est-à- dire en nombre de colonies
formé pour 1 mg de l'échantillon de protéine.
L'activité de la kallikréine est déterminée par
un procédé enzymochimique en utilisant de la H-D-Val-
Leu-Arg-paranitroaniline (désignée ci-après par "peptide-
PNA"}, un substrat synthétique de la kallikréine Ainsi, on mélange 0,1 ml de l'échantillon avec 2 ml d'une solution de tampon tris-H Cl 0,2 M (p H 8,0), on le fait préincuber à 37 C pendant 5 minutes, puis on le mélange avec 0,2 ml de solution 0,2 m M du peptide-PNA, et on le laisse réagir à 37 C pendant 30 minutes On ajoute ensuite 0,2 ml d'une solution à 50 % (P/v) d'acide acétique au mélange réactionnel pour terminer la réaction, et on il 2540121 mesure la quantité de PNA libérée à une longueur d'onde
de 405 nm On utilise comme témoin un échantillon conte-
nant de l'aprotinine, un inhibiteur de kallikréine.
L'activité de la kallikréine est exprimée en quantité de PNA formée en l minute à 37 C Une"unité de PNA" signifie
1 pmole de PNA formée en 1 minute.
Les diagrammes de séparation dans le procédé antérieur et dans la chromatographie liquide à hautes
performances de l'invention sont donnés dans les figu-
res i et 2, respectivement.
Les figures l et 2 sont des graphes montrant
les diagrammes de fractionnement du CSF et de la kalli-
kréine par le procédé antérieur et par le procédé de l'invention, respectivement Dans les deux figures, on a porté en ordonnées du côté gauche l'activité du CSF et la densité optique à 280 nm; en ordonnées du côté droit, l'activité de la kallikréine; et en abscisses le numéro de la fraction Les symboles -, -0-, et -6 représentent la densité optique, l'activité du CSF et l'activité de
la kallikréine, respectivement.
Dans la chromatographie de filtration sur gel utilisant le Sephacryl S300 conformément au procédé
antérieur, le CSF et la kallikréine n'étaient pas com-
plètement séparés l'un de l'autre, et le taux de récupé-
ration de fraction CSF exempte de kallikréine était inférieur à 30 % Au contraire, dans la chromatographie liquide à hautes performances conforme au procédé de l'invention, le CSF et la kallikréine sont séparés presque complètement l'un de l'autre, et le taux de récupération du CSF exempt de kallikréine est de 90 % ou davantage; la contamination par la kallikréine est ainsi pratiquement nulle Les résultats de la détermination du pourcentage de récupération du CSF et de la kallikréine ainsi que la quantité de kallikréine contaminante dans le CSF dans
les deux procédés ci-dessus sont indiqués dans le tableau l.
TABLEAU 1 Taux de récupération du CSF et de la
kallikréine par le procédé antérieur et le.
procédé de l'invention.
Note: x Ceci signifie que la quantité est inférieure à la
limite de détection du procédé utilisé.
Essai 2.
Comparaison des taux de récupération dans diverses conditions de force ionique de la solution tampon
et de concentration en stabilisant.
Pour étudier le phénomène d'adsorption du CSF et de la kallikréine sur le support de filtration sur gel pour la chromatographie liquide à hautes performances ainsï que les effets de la force ionique de la solution
tampon et de la concentration du stabilisant, la chroma-
tographie liquide à hautes performances a été effectuée dans diverses conditions, et les activités du CSF et de la kallikréine ont été déterminées de la môme manière
que dans l'essai 1 pour comparer les taux de récupéra-
tion. L'urine humaine concentrée utilisée dans l'essai
a été préparée de la même manière que dans l'exemple 1.
Fraction CSF Taux de Taux de Quantité de récupération réciration kallikrnine onta de la (%) rcinante (unitn PNA) kallikrcine I Sephacryl
S-300 26,5 0,0019 38
Procédé de l'invention 92,5 x 0,0001M 90 La chromatographie liquide à hautes performances a été effectuée en utilisant une colonne de TSK-Gel 3000 SW ( O 7,5 x 1200 mm) et une pompe LC-3 A à la température
ambiante et avec un débit de 1 ml/min.
Le stabilisant utilisé a été le polyéthylène glycol (fabriqué par Sigma Co; masse moléculaire
moyenne: 6000 dalton), et les solutions tampons uti-
lisées contenaient du phosphate de sodium 0,01 M 0,5 M
et avaient un p H de 7,0 (force ionique: environ 0,02 -
1,14) Les résultats d'essai sont donnés dans les tableaux 2 et 3 Lorsque la chromatographie a été effectuée en
utilisant des solutions tampons à diverses concentra-
tions ne contenant pas de stabilisant, le taux de récu-
pération était faible avec toutes les solutions tampons à diverses concentrations En particulier lorsque la force ionique était faible, le taux de récupération du CSF et celui de la kallikréine étaient tous les deux faibles. Tableau 2 Taux de récupération M du CSF et de la kallikréine en fonction de la concentration de la solution tampon ne contenant pas de stabilisant. Note: * pourcentage de récupération par rapport à l'activité
du liquide concentré avant traitement.
Concentration du phospha Taux de récupiç Taux de rcupé-
te de sodium (M) ration du CSF ration de la (%) kallikréine (%)
0,01 20,6 59,8
0,05 38,3 60,8
0,1 42,9 84,6
0,2 40,3 81,3
0,3 39,5 80,5
0,4 29,6 79,4
0,5 28,8 81,8
L'examen comparatif des taux de récupération
du CSF obtenus en utilisant une solution tampon au phos-
phate de sodium 0,1 M (force ionique 0,20) contenant du polyéthylene glycol ou du Triton X-100 aux diverses concentrations indiquées dans le tableau 3 ci-dessous
a révélé que le taux de récupération du CSF était nota-
blement amélioré en utilisant du polyethylène glycol ou du Triton X-100 à une concentration de 0,01 à 0,1 % comme stabilisant Le stabilisant est de préférence utilisé à une concentration plus faible Comme le montre le tableau 3, une concentration de 0,01 % (P/v) du
stabilisant donne des résultats presque satisfaisants.
Comme une concentration en stabilisant plus élevée
que celle nécessaire donnait lieu à une séparation in-
complète entre le CSF et la kallikréine et augmentait
la viscosité de l'échantillon, les concentrations supé-
rieures à 0,1 % (P/v) n'ont pas été préférées.
Tableau 3 Taux de récupération du CSF en utilisant
des solutions tampons à diverses concentra-
tions en stabilisant.
Taux de récupération du CSF (%) Concentration en stabilisant Polyethylène glycol Triton x-100 (%) (P/v)
0 40,3 40,3
0,005 72,6 68,2
0,01 88,4 90,6
0,05 92,4 91,8
0,1 94,5 93,4
0,5 -L -N
Note:
séparation incomplète entre CSF et kallikréine.
2540121
Bien que les résultats du tableau 3 aient été obtenus'avec une solution tampon au phosphate de sodium 0,2 M (p H 7), même lorsque la force ionique de la solution tampon était régulée par addition d'un sel neutre tel que le chlorure de sodium, une amélioration analogue du taux de récupération a été observée lorsque le stabilisant était présent Les résultats sont donnés dans le tableau 4, qui compare les taux de récupération
du CSF et de la kallikréine obtenus avec diverses solu-
tions tampons en présence de 0,01 % de polyéthylene glycol. Tableau 4 Taux de récupération du CSF et de la
kallikréine avec diverses solutions tampon.
Le p H de la solution tampon utilisée en chroma-
tographie n'affecte pas en lui-même les caractéristiques de séparation pour le CSF et la kallikréine Mais s'il est dans le domaine alcalin et si l'on utilise un gel principalement constitué de gel de silice, il se produit une dissolution du gel; s'il est dans le domaine acide, il peut se produire une corrosion de l'appareillage, par exemple de la colonne En conséquence, le p H le
plus favorable est dans le domaine voisin de la neutra-
lité, p H 6,0-8,0.
Exemple 1.
On ajuste environ 201 d'urine humaine à p H 7,0
avec une solution de Na OH 10 N, on la fait passer à tra-
vers une colonne de gel de silice ( O 4,0 x 50 cm) pour
adsorber le constituant protéinique qu'elle contient.
* Soltio Taux de récupération Taux de récupération Solution tam du CSF (%) de la kallikréine (%
Na Cl 0,1 M + phospha-
te de sodium 0,02 M (p H 7,0) 90,8 92,4 Cl 0,2 M + tris-HC 1 l 01 M (p H 7,0) 91,2 92,8 On élue ensuite la colonne avec 500 ml d'ammoniaque à % On neutralise l'éluat avec H 2504, 1 N, puis on centrifuge à 10 000 tours/min pendant 30 minutes pour éliminer les insolubles On mélange ensuite l'éluat obtenu avec du sulfate d'ammonium à 70 % de la satura- tion pour former un précipité, et on centrifuge à 4 C et
10.000 G pendant 30 minutes pour recueillir le précipité. On dissout le précipité ainsi obtenu dans 100 ml d'une solution tampon au
phosphate 0,02 M (p H 7,0), et on le dilue encore dix fois avec la même solution tampon On ajoute à la solution obtenue 40 g d'une DEAE-cellulose qui a été mise en équilibre au préalable avec cette solution tampon, et on mélange les deux à 4 C pendant 1 heure Après mélange, on recueille la DEAE-cellulose
par filtration, on la lave soigneusement avec une solu-
tion tampon au phosphate 0,02 M (p H 7,0) et avec cette solution tampon (p H 7,0) contenant du Na Cl 0,1 M, puis on élue avec 500 ml de solution tampon au phosphate 0,02 M (p H 7,0) contenant du Na Cl 0,4 M On filtre l'éluat à travers un filtre de verre, puis on le concentre au moyen d'une membrane d'ultrafiltration (HC-1, fabriquée par Asahi Kasei Inc) et en même temps on le met en équilibre avec une solution tampon au phosphate 0, 1 M (p H 7,0),
ce qui donne de l'urine humaine concentrée.
A 20 ml du liquide concentré ainsi obtenu (concentration en protéine 4,2 % (P/v)), on ajoute du polyethylène glycol 6 000 (fabriqué par Sigma Co) à une concentration de 0,01 % (P/v) et on filtre le mélange
à travers un filtre à pores de 0,4 pm.
On injecte l'urine humaine concentrée obtenue ( 0,2 ml) dans une colonne ( O 7,5 x 1200 mm) remplie de TSK-Gel 3000 SW et mise en équilibre au préalable avec une solution tampon au phosphate 0,1 M (p H 7,0) contenant 0,01 % (P/v) de polyéthylène glycol, et on la soumet à une chromatographie liquide à hautes performances en faisant passer la solution tampon ci-dessus à travers la colonne sous un débit de 1,0 ml/min avec une pompe
à haute pression, pour séparer le CSF et la kallikréine.
On recueille 10 ml de chacune des fractions CSF et kalli-
kréine, on les désalinise par dialyse puis on les lyo- philise aseptiquement, ce qui donne environ 1 mg de
CSF et environ 2,4 mg de kallikréine Le taux de récu-
pération, exprimé en activité de CSF obtenue, est d'en-
viron 94 % par rapport à la matière de départ (urine humaine), l'activité spécifique du CSF obtenue est portée à 4 x 105 unités/mg, et aucune contamination par la kallikréine n'y est observée Par ailleurs, le taux de récupération obtenu exprimé en activité de kallikréine est d'environ 78 % et l'activité spécifique est de 0,325
unités de PNA/mg de protéine.
Exemple 2.
On met en équilibre 20 litres d'urine de
sujets humains normaux avec une solution tampon au phos-
phate 0,02 M (p H 7,4) en utilisant une membrane d'ultra-
filtration (HIOPIO, fabriquée par l'Amicon Corp) et on y ajoute 40 g de DEAE-cellulose préalablement mise en équilibre avec la solution tampon cidessus Après
mélange à 4 C pendant 1 heure, on recueille la DEAE-cellu-
lose par filtration On lave soigneusement la DEAE-cellu-
lose avec cette solution tampon, puis on l'élue avec 1 1 de solution tampon au phosphate 0,02 M (p H 7,4) contenant du Na Cl 0,4 M pour obtenir un liquide concentré de l'urine humaine On soumet le liquide concentré obtenu à une concentration supplémentaire au moyen d'une membrane d'ultrafiltration, on le dialyse contre une solution de tampon au phosphate 0,1 M (p H 7,0) contenant 0,01 % (P/v) de Triton X-100, on l'injecte dans une colonne de TSK-Gel 3000 SW mise en équilibre au préalable avec cette solution tampon, puis on le traite de la même manière que dans l'exemple 1, et l'on obtient environ 0,9 mg de CSF et
18 2540121
environ 2,5 mg de kallikréine Les taux de récupération obtenus, exprimés en activité de CSF et de kallikréine,
sont de 92 et 94 %, respectivement.
Effets de l'invention.
Les effets pouvant être obtenus par le procédé de l'invention sont les suivants: ( 1) les taux de récupération du CSF et de la kallikréine sont respectivement d'environ 3,5 et d'environ 2,5 fois
celui obtenu dans le procédé antérieur.
( 2) Le CSF et la kallikréine peuvent être préparés simultan&ment. ( 3) Le CSF obtenu n'est pratiquement pas contaminé par
la kallikréine.
( 4) Le CSF et la kallikréine peuvent être préparés en un
temps beaucoup plus court qu'avec le procédé antérieur.
Claims (4)
1 Procédé de préparation de facteur stimulant
les colonies et de kallikréine provenant d'une urine humai-
ne, respectivement, caractérisé en ce qu'il consiste à concentrer l'urine de sujets humains normaux ou une solution contenant du facteur stimulant les colonies et de la kallikréine provenant d'urine humaine en les protéines qui y sont contenues, à mettre en équilibre le liquide
concentré obtenu avec une solution tampon contenant un sta-
bilisant, à soumettre le liquide à une chromatographie
par filtration sur gel à hautes performances en introdui-
sant le liquide dans une colonne remplie d'un gel ayant une limite d'exclusion moléculaire, déterminée avec une protéine globulaire, de 105 5 x 105 et mis en équilibre avec cette solution tampon pour séparer les fractions du facteur stimulant les colonies et les fractions de
kallikréine, et à les recueillir.
2 Procédé de préparation suivant la revendica-
tion 1, caractérisé en ce que cette solution tampon a une force ionique de 0,05-0,5 et un p H de 6,0-8,0 et contient
0,01-0,1 % (P/v) d'un stabilisant.
3 Procédé de préparation suivant la revendication 1,
caractérisé en ce que le stabilisant est de l'octyl-phénoxy-
polyéthoxyéthanol ou un polyéthylène glycol ayant tous deux
une masse moléculaire de 1000-10 000 daltons.
4 Procédé suivant la revendication 1, caracté-
risé en ce que la quantité de stabilisant contenue est
de 0,01-0,1 % (P/v) par rapport à la solution tampon.
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