FR2520379A1 - Procede de preparation d'un disaccharide-tripeptide et d'un disaccharide-tetrapeptide possedant des proprietes immunostimulantes - Google Patents

Abstract

PROCEDE DE PREPARATION DE DISACCHARIDE-TRIPEPTIDES ET DE DISACCHARIDE-TETRAPEPTIDES DE FORMULE: (CF DESSIN DANS BOPI) DANS LAQUELLE R H OU ACETYLE, R H OU

Description

La présente invention se rapporte à un procédé pour préparer un

disaccharide-tripeptide et un disaccharide-tétrapeptide

possédant une activité immunostimulante et une activité de potentia-

lisation de la résistance non spécifique aux infections bactériennes.

On sait que les peptidoglucannes qui sont les composants de structure des parois de cellules bactériennes ont une activité immunostimulante lcf Experientia, 32, pages 677-683 ( 1976)l De nombreux chercheurs ont déjà essayé d'obtenir des peptidoglucannes solubles dans l'eau et possédant une activité immunostimulante à partir d'un produit de digestion des parois de cellules bactériennes par des enzymes lytiques Toutefois, les peptidoglucannes hydrosolubles obtenus par ces procédés consistent habituellement en un mélange de divers peptidoglucannes possédant des poids moléculaires différents et, par conséquent, une composition différente et des activités

différentes pour chaque lot de fabrication.

Dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 186 196, on décrit un composé de formule (I) ou (II: N-Ac Glc-N-Acyl-Mur N-Ac Glc-N-Acyl-Mur l l L-Ala L-Ala l l D-Glu ou D-Glu l l méso-DAP méso-DAP D-Ala

(I) (II)

dans lesquelles N-Ac Glc représente le groupe N-acétylglucosaminyle, NAcyl-Mur représente le groupe N-acylmuramyle, L-Ala représente le groupe L-alanyle, D-Glu représente le groupe D-glutamyle, méso-DAP représente le groupe méso-2,6-diaminopimélyle ou le reste de l'acide méso-2,6diaminopimélique, et D-Ala le reste de la D-alanine, étant spécifié que le groupe carboxyle de l'acide D-glutamique et/ou du reste d'acide méso-2, 6-diaminopimélique peut être à l'état libre ou amidé, ainsi que d'autres peptidoglucannes à bas poids moléculaire, et on indique que le composé de formule (I) ou (II) est obtenu à l'état isolé (c'est-à-dire qu'on n'obtient pas un mélange des deux composés) et possède une activité immunostimulante Le procédé décrit dans ce brevet des Etats-Unis d'Amérique consiste

à utiliser une enzyme lytique pour hydrolyser les parois cellu-

laires de Mycobacteria, Nocardiae ou Escherichia coli Toutefois, les auteurs ont simplement obtenu un composé de formule (I) dans laquelle Acyl représente le groupe glycolyle et le groupe carboxyle des radicaux glutamyle et méso-2,6-diaminopimélyle est amidé en hydrolysant des parois cellulaires dont les lipides ont été éliminés par catalyse de la lysozyme et de la muramyl-L-alanine amidase de Myxobacter AL 1, en produisant trois fractions de peptidoglucannes et en soumettant la fraction au poids moléculaire le plus bas à électrophorèse de préparation Méme dans un exemple dans lequel

les peptidoglucannes insolubles préparés à partir des parois cel-

lulaires d'E coli sont hydrolysés par la lysozyme, la fraction qui, parmi les trois fractions de peptidoglucannes, possède le

poids moléculaire le plus bas, consiste en un mélange de disaccha-

ride-tétrapeptide et de disaccharide-tripeptide Par conséquent,

les auteurs n'ont jamais obtenu le composé à l'état de composé unique.

On sait que Streptomyces sp L-3 peut produire une enzyme: l'endopeptidase de l'acide D-alanyl-méso-2,6-diaminopimélique (en

abrégé ci-après "endopeptidase") qui peut couper de manière spéci-

fique les chaînons d'acide D-alanyl-méso-2,6-diaminopimélique entre les sous-motifs de peptides dans les peptidoglucannes des parois

de cellules bactériennes lcf Biken Journal, 19, pages 75-91 ( 1976)l.

Toutefois, comme on le verra clairement à la lecture de l'exemple comparatif figurant ci-après, cette souche a une production extrêmement faible en l'endopeptidase, et permet à peine de produire cette enzyme en quantité suffisante pour les applications

pratiques.

La demanderesse a signalé dans Agr Biol Chem, 39, pages 1533-1543 ( 1975) qu'on obtenait une endo-N-acétylmuramidase appelée enzyme M-1 qui hydrolyse les chainqns glucosidiques entre l'acide N-acétylmuramique et la N-acétylglucosamine, libérant des fragments avec des restes d'acide Nacétylmuramique à l'extrémité

réduite, à partir de la mutanolysine partiellement purifiée prove-

nant du bouillon de culture de Streptomyces globisporus B-1829.

La demanderesse a procédé à des études approfondies visant à la mise au point d'un procédé perfectionné pour préparer l'endopeptidase en quantité suffisante pour une utilisation pratique en tant qu'enzyme lytique A la suite de ces recherches, elle a trouvé qu'on pouvait transformer Streptomyces sp L-3 mentionné ci-dessus en la souche Streptomyces nitrosporeus SK qui a une excellente capacité de production de l'endopeptidase recherchée, qu'on pouvait obtenir une nouvelle endopeptidase à haute activité à partir d'un bouillon de culture de Streptomyces globisporus avec des rendements élevés et en outre que, lorsqu'on utilisait à la fois l'endopeptidase du mutant: Streptomyces

nitrosporeus SK ou Streptomyces globisporus et l'endo-N-acétyl-

muramidase de Streptomyces globisporus pour hydrolyser certaines

parois de cellules bactériennes, on pouvait obtenir un disaccharide-

tripeptide et un disaccharide-tétrapeptide à l'état de composé

isolé (et non à l'état de mélange des deux).

L'invention concerne donc un procédé pour préparer un disaccharidetripeptide et un disaccharide-tétrapeptide possédant une activité immunostimulante et une activité de potentialisation de la résistance non spécifique aux infections bactériennes sous la forme d'un composé isolé Conformément à l'invention, on produit le disaccharide-tripeptide et le disaccharide-tétrapeptide en

utilisant à la f Dis les enzymes endopeptidase et endo-N-acétylmura-

midase obtenues à partir de micro-organismes spécifiques pour

hydrolyser des parois de cellules bactériennes.

D'autres buts et avantages de l'invention apparaîtront

à la lecture de la description ci-après.

Ces buts et avantages ont été atteints dans un procédé

pour préparer un disaccharide-tripeptide et un disaccharide-tétra-

peptide de formule: -

CH 2 OH CH 2 OR 1

H, ' H-

-O

OH H O O OH

HO

H NIHCOCH 3 NHCOCH 3

(D)CHHCH 3

HN CO

(L) CHCO NH

I l (III)

O 1 CH 3 H 2 NCOCH(CH 2)2

C (D) 1

HN CO

(D) I

H 2 NCH (CH 2) 3 CHCOR 2

CONH 2 (L)

dans laquelle R 1 représente l'hydrogène ou un groupe acétyle, R 2 (D) représente un groupe hydroxy ou un groupe -NHCHCOOH, les notations l CH 3 (D) et (L) indiquant la configuration, procédé qui se caractérise en ce que l'on utilise une endo-N-acétylmuramidase de Streptomyces Rlobisporus et une endopeptidase de Streptomyces nitrospreus SK ou Streptomyces globisporus pour hydrolyser des parois de cellules bactériennes contenant un motif d'acide muramique dans lequel le

groupe amino est acétylé, de l'isoglutamine et de l'acide méso-2,6-

diaminopimélfque ayant un groupe carboxyle amidé en tant que cons-

tituants du peptidoglucanne de paroi cellulaire et, si on le désire, lorsqu'on obtient un produit dans lequel Ri représente le groupe

acétyle, on hydrolyse ce produit.

Conformément à l'invention, on obtient le peptidoglucanne hydrosoluble recherché de formule (III) possédant de fortes activités physiologiques et une basse toxicité sous la forme de composé unique

avec un rendement élevé et une structure chimique bien déterminée.

Le composé de formule (III) comprend le P-N-acétylgluco-

saminyl-( 1 4)-N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminy 1-(L)-méso-

2,6-diaminopimélo-(D)-amide (en abrégé ci-après "GMP 3-A"l), la 3-N-

acétylglucosaminyl-(l-> 4)-N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-

(L)-méso-2,6-diaminopimélo-(D)-amide-(L)-D-alanine (en abrégé ci-

après "GMP 4-A"), le P-N-acétylglucosaminyl-( 1 > 4)-N,6-O-diacétyl-

muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-méso-2,6-diaminopimélo-(D)-

amide (en abrégé ci-après "GMP 3-B") et la f-N-acétylglucosaminyl-

( 1 * 4)-N,6-O-diacétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-méso-

2,6-diaminopimélo-(D)-amide-(L)-D-alanine (en abrégé ci-après

"GMP -B").

Commrne exemples de bactéries convenant comme sources des parois cellulaires, on citera Lactobacillus plantarum, Corynebacterium diphteriae, la première étant préférée en raison de son absence de caractère pathogène On peut produire des mutants résistant aux médicaments ou des mutants déficients en structures particulières de ces bactéries en utilisant un mutagène afin d'accroître la teneur en peptidoglucannes des parois cellulaires On peut obtenir les parois cellulaires servant de matières premières en cultivant ces bactéries de la manière habituelle, en séparant les cellules du bouillon de culture, en provoquant une rupture mécanique des cellules, en soumettant les cellules brisées à une centrifugation différentielle, en traitant les parois cellulaires brutes obtenues par une saumure à haute concentration afin d'éliminer les protéines intracellulaires et en traitant les parois cellulaires par la trypsine afin d'éliminer les autres protéines On peut encore traiter les parois cellulaires obtenues dans ces conditions par une solution aqueuse d'alcali 0,05 a 0,5 N, de préférence 0,1 à 0,2 N; les parois cellulaires ainsi traitées par un alcali sont également utilisées comme matières premières On peut aussi obtenir les parois cellulaires traitées par un alcali en traitant au départ les cellules entières par une solution aqueuse d'alcali 0,05 à 0,5 N, de préférence 0, 1 à 0,2 N, et en soumettant ensuite les cellules entières aux opérations décrites ci-dessus Le traitement par une solution aqueuse d'alcali est habituellement réalisé à température ambiante en une durée de 30 min à 4 h Parmi les alcalis qui conviennent, on citera les hydroxydes de métaux alcalins comme l'hydroxyde de lithium, l'hydroxyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium, et les carbonates de métaux alcalins comme le carbonate

de sodium ou Le carbonate de potassium.

Les parois cellulaires ainsi obtenues sont traitées par deux enzymes, à savoir l'endo-N-acétylmuramidase et l'endopeptidase, ce qui provoque la lyse des parois cellulaires Il est préférable de traiter d'abord par l'endo-N-acétylmuramidase puis de traiter par

l'endopeptidase ou de traiter simultanément par les deux enzymes.

Ces enzymes doivent etre aussi pures que possible afin d'éviter

desscissions indésirables du produit.

L'endo-N-acétylmuramidase est de préférence une enzyme produite par Streptomyces globisporus B-1829 (cette enzyme est

désignée ci-après en abrégé par la notation "acétylmuramidase M 1 ").

Le micro-organisme Streptomyces globisporus B-1829 est déposé au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and

Technology, Japon et à l'American Type Culture Collection, Etats-

Unis d'Amérique sous les numéros respectifs FERM-P 596 et ATCC 21553, et les caractéristiques morphologiques, de culture et physiologiques de cette souche sont décrites avec le procédé de culture et le procédé de purification de l'enzyme à partir du bouillon de culture

dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 929 579 et dans Agr.

Biol Chem, 39, pages 1533-1543 ( 1975).

L'endopeptidase est une enzyme produite par Streptomyces nitrosporeus SK ou Streptomyces globisporus B-1829 La souche Streptomyces nitrosporeus SK est un mutant possédant une forte

capacité de production de l'endopeptidase, obtenu par la demande-

resse à partir de Streptomyces sp L-3 décrit dans Biken Journal, 19, pages 75-91 ( 1976) et est déposée au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japon, sous le numéro FERM BP-216 La méthode de dérivation (mutation), la méthode de culture et les caractéristiques morphologiques, de culture et physiologiques de la souche sont décrites, avec le procédé de purification de l'endopeptidase (en abrégé ci-après "endopeptidase SK"), à partir du bouillon de culture ci-après

dans les exemples de référence Pour isoler et purifier l'endo-

peptidase de Streptomyces globisporus B-1829 (cette endopeptidase est désignée ci-après en abrégé par la notation "endopeptidase AM"), on cultive la souche et on recueille une enzyme bruteà partir du bouillon de culture comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 929 579 puis on purifie l'enzyme brute comme décrit ci-après dans un exemple de référence L'endopeptidase AI est nettement distincte de l'endopeptidase SK par ses propriétés physicochimiques et elle a en outre des spécificités à l'égard des substrats qui sont différentes de celles de la carboxypeptidase DD produite par Streptomyces albus G lcf Biochemistry, 9, 2955, 2961

( 1970)l; cette enzyme est donc une nouvelle endopeptidase.

Le traitement de lyse des parois cellulaires servant de matières premières par les deux enzymes est habituellement réalisé

dans une solution tampon à p H 7,0 à 8,5 en présence d'un conserva-

teur (par exemple chloroforme, nitrite de sodium, etc) à 37 C environ La réaction de lyse est terminée lorsque la quantité de sucres réducteurs libérée atteint une valeur constante lorsqu'on a utilisé l'endo-Nacétylmuramidase, et lorsque la quantité de groupes amino libres produite atteint une valeur constante dans le cas de l'endopeptidase La durée de réaction peut varier avec les quantités d'enzyme et les quantités et propriétés des parois cellulaires, mais elle est habituellement de 8 à 60 h, de préférence de 24 à 48 h. L'endopeptidase peut #tre immobilisée par une technique connue (cf par exemple Ichiro Chibata (ed), "Immobilized Enzyme", Kodansha, Tokyo, 1975) permettant alors une utilisation continue Ainsi, par exemple, l'enzyme peut être immobilisée par liaison ionique sur du CM-Sephadex C-25 (type Na+ de la Firme Pharmacia Fine Chemicals AB,

Suède) ou par une réaction de copulation sur la p-aminobenzylcellu-

lose diazotée.

Pour isoler le produit voulu du mélange de réaction,

on peut exploiter la chromatographie d'échange d'ions, la chromato-

graphie sur colonne sur gel de silice, etc, la filtration sur gel et les techniques analogues utilisées habituellement en combinaison entre elles Lorsque les parois cellulaires ayant servi de matières premières proviennent de Lactobacillus plantarum et n'ont pas été traitées par un alcali, on obtient GMP 3-A, GMP 4-A GMP 3-B et GMP 4-B et, lorsque les parois cellulaires servant de matières premières ont été traitées par un alcali, on obtient GMP 3-A et GMP 4-A GMP 3-B et GMP 4-B peuvent 9 tre convertis quantitativement en GMP 3-A et GMP 4-A, respectivement, par hydrolyse en milieu acide L'hydrolyse peut être effectuée dans une solution aqueuse 0,05 à 0,5 N, de préférence 0,1 à 0,2 Nd'un acide minéral (par exemple l'acide chlorhydrique) à une température de 40 à 800 C, de préférence d'environ 60 C, pendant une durée de 2 à 9 h, de préférence de 5 à 7 h. Le composé de formule (III) peut être converti en l'un de ses sels par traitement à l'aide d'une base minérale (par exemple l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de potassium ou l'hydroxyde d. 'amuonium), d'une base organique (par exemple l'isopropylamine ou

la diéthylamine), d'un acide minéral (par exemple l'acide chlorhy-

drique, l'acide bromhydrique ou l'acide sulfurique) ou d'un acide organique (parexemple l'acide méthanesulfonique) de la manière habituelle. Le composé de formule (III) et ses sels acceptables pour l'usage pharmaceutiq Ve ont d'excellentes activités pharmacologiques,

par exemple une activité immunostimulante et une activité de poten-

tialisation de la résistance non spécifique aux infections bacté-

riennes et ils peuvent donc être utilisés pour la prophylaxie et le traitement d'infections microbiennes variées et le traitement du

cancer chez les mammifères, y compris les humains.

Le composé de formule (III) et ses sels acceptables pour l'usage pharmaceutique peuvent être administrés par voie orale, parentérale ou intrarectale sous la forme de composition classique

en mélange avec des véhicules ou diluants classiques, et de préfé-

rence par voie parentérale sous la forme de solution aqueuse Les doses des composés peuvent varier avec leur nature, le mode d'administration, la sévérité de la maladie et Vage des patients, mais elle est habituellement de 0,001 à 50 mg/kg/j Les composés

peuvent être administrés avec d'autres agents midrobiens, antibio-

tiques ou anticancéreux.

On a mis en évidence les activités pharmacologiques de GMP 3-A$ GMP 4-A$ Gmp 3-B et GM 4-B de la manière suivante: Essai 1 Activité immunostimulante (activité immuno-adjuvante) Les animaux sensibilisés ont été préparés de la manière suivante A des groupes de 5 cobayes femelles de la souche Hartley pesant 200 à 300 g, on a injecté dans la pelote de la patte arrière gauche 0,2 ml d'une émulsion eau-dans-l'huile contenant 1 mg d'ovalbumine cristalline en tant qu'antigène et 100/ug du composé soumis aux essais L'émulsion eau-dans-l'huile consistait en Drakeol 6 VR (de la Firme Pennylvania Refining Co, Etats-Unis d'Amérique>, Arlacel A (Atlas Chemical Industries Inc, Etats-Unis d'Amérique) et du sérum physiologique tamponné au phosphate 1/75 M (p H 7,0) dans des proportions relatives de 4:1:5 en volume Aux

cobayes témoins, on a injecté une émulsion eau-dans-l'huile de compo-

sition analogue contenant l'antigène mais non le composé soumis aux

essais (adjuvant incomplet de Freund).

Réponse cornéenne Pour l'étude de l'induction de l'hypersensibilité de type retardé à l'ovalbumine, c'est-à-dire l'amélioration de l'immunité à médiation cellulaire, on administre aux cobayes,deux semaines après la sensibilisation,une injection intracornéenne d'une solution d'ovalbumine ( 20 mg/ml de sérum) de manière à former un disque transitoire d'opacité d'environ 5 mm de diamètre On examine les yeux au bout de 48 h et on note l'étendue et le degré d'opacité cornéenne Les réactions sont notées de 3, 0 pour une réaction forte avec toute la cornée épaissie, opaque et blanc gris 9 tre, à 1,0 pour une légère opacité Lorsqu'on n'observe pas de différence visible

avec l'oeil non injecté, on note O pour la réaction.

Réaction de la peau Pour l'étude de l'induction de l'hypersensibilité de type retardé à l'ovalbumine, on administre aux cobayes, trois semaines après la sensibilisation, une injection intradermique de solution d'ovalbumine ( 0,1 mg/O,l ml de sérum physiologique) sur une pelote de patte arrière tondue Au bout de 48 h, on mesure les dimensions de l'induration On calcule l'étendue de l'induration

par la formule donnée dans Biken Journal, 20, pages 95-103 ( 1977).

Production d'anticorpshumoraux.

Pour étudier l'accroissement de la production d'anticorps

humoraux, on saigne les cobayes quatre semaines après la sensibili-

sation par ponction cardiaque On mesure les teneurs en azote d'anticorps anti-ovalbumine quantitativement par une technique spectrophotométrique. Les résultats de ces expériences sont rapportés dans le

tableau 2 ci-après.

Essai 2 Accroissement de la résistance non spécifique aux infections bactériennes On utilise des souris males de la souche Std-dd Y pesant environ 23 g Les composés soumis aux essais sont dissous dans du sérum physiologique et administrés par voie intraveineuse aux animaux 72, 48 et 24 h avant injection intrapéritonéale par Pseudomonas

aeruginosa n 12 (dimension de l'inoculum: 2 x 106 cellules/souris).

On note le nombre des survivants 7 j après l'injection Les résultats

obtenus sont rapportés dans le tableau 2 ci-après.

Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toute-

fois en limiter la portée; dans ces exemples, les indications de parties

et de pourcentages s'entendent en poids, sauf mention contraire.

On décrira d'abord dans des exemples de référence la préparation des enzymes et des parois cellulaires servant dans l'invention. Exemple de référence 1 Dérivation de Streptomyces nitrosporeus SK à partir de Streptomyces sp L-3: On soumet une souche parente de Streptomyces sp L-3 isolée d'un échantillon de terre de Kashiwara, Nara, Japon par Kotani et coll lcf Biken Journal, 3, 139 ( 1960)l à sous-culture répétée 15 fois sur un milieu incliné (p H 7,4) contenant un amidon soluble ( 1 %), un extrait de levure ( 0,2 %), des parois cellulaires de Lactobacillus plantarum ATCC 8014 ( 0,1 %) et de la gélose ( 2 %), ce

qui provoque l'acclimatation de la souche parente au milieu.

1 l La souche parente ainsi traitée est cultivée sur le milieu ci-dessus à 30 C pendant 7 j pour formation suffisante de spores Les spores sont prélevées à l'aide de sérum physiologique stérilisé ( 5,0 ml); on étend 0, 5 ml du mélange sur le milieu ci-dessus dans une botte de Pétri et on cultive à 300 C pendant 4 j On recueille les colonies formées qui sont entourées de grandes zones de lyse et on les transfère sur le milieu incliné ci-dessus Cette opération est répétée 15 fois et on sélectionne ainsi une souche possédant

une capacité de production particulièrement forte pour l'endopepti-

dase La souche obtenue par la culture monocellulaire ci-dessus est plantée sur le milieu incliné mentionné ci-dessus et cultivée jusqu'à croissance suffisante de spores Les spores sont prélevées par du sérum physiologique stérilisé ( 5,0 ml) et lavées deux fois avec du sérum physiologique puis transférées dans une boite de pétri qu'on éclaire à la lumière ultraviolette d'un stériliseur à

ultraviolet Toshiba de 15 W pendant 10 min à une distance de 15 cm.

La solution ainsi exposée ( 0,5 ml) est étalée sur le milieu ci-

dessus dans une botte de Pétri et cultivée de la même manière; on

recueille ainsi une souche présentant une grande zone de lyse com-

parativement à la dimension de la colonie Cette opération est

répétée 5 fois pour obtention de la souche SK recherchée.

Les caractéristiques morphologiques, de culture et physiologiques de la nouvelle souche SK obtenue par la mutation

ci-dessus sont rapportées dans les tableaux 3 à 6 ci-après.

Les parois cellulaires du mutant ci-dessus contiennent

le reste d'acide L,L-2,6-diaminopimélique.

En comparant les caractéristiques morphologiques, de

culture et physiologiques de la souche SK avec la description du

Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8 e édition, la classification de l'ISP et Hutter System of Streptomyces, on note comme micro-organismes apparentés Actinomyces atrolivaceus, Streptomyces halstedii et Streptomyces nitrosporeus Toutefois, Actinomyces atrolivaceus ne peut être confondu avec le présent mutant parce que ses spores ont une structure de surface verruqueuse, Streptomyces halstedii ne peut pas non plus être confondu avec le présent mutant parce qu'il a 3 à 10 spores Le plus ressemblant au présent mutant est Streptomyces nitrosporeus, mais il y a de

légères différences entre les deux micro-organismes dans l'utilisa-

tion du fructose et du rhamnose; par suite, le présent mutant est considéré comme une souche nouvelle de Streptomyces nitrosporeus qu'on désigne sous le nom de souche SK La souche SK est clairement distincte de la souche parente par sa capacité de production de

l'endopeptidase, comme on le montre dans le tableau 7 ci-après.

Les endopeptidases produites par la souche SK et par la souche parente ont toutes deux le meme mode d'action, mais on ne peut pas assurer que les deux enzymes sont identiques ou non parce que la souche parente a une capacité de production trop faible en l'enzyme Pour cette raison, on appelle endopeptidase SK l'enzyme produite par la souche SK etdans toute la présente demande, on la

distingue de l'endopeptidase produite par la souche parente.

La souche SK ayant les caractéristiques morphologiques, de culture et physiologiques ci-dessus est cultivée dans un milieu approprié La culture peut être effectuée sous secousse ou en culture stationnaire, mais elle est de préférence effectuée sous secousse à une température de 20 à 400 C de préférence d'environ 30 C pendant 1 à 4 j, de préférence pendant 2 à 3 j Le milieu consiste en un milieu quelconque classique du type utilisé pour la culture des micro-organismes du genre Streptomyces, par exemple un milieu à p H 6 à 9, de préférence 7 à 8, contenant des sucres (par exemple du glucose, de la dextrine, du maltose, de l'amidon soluble), des sources d'azote (par exemple de la farine de soja déshuilée, de l'extrait de levure, de la polypeptone, de l'extrait de viande, de la liqueur de macération de mals), des sels minéraux (par exemple du chlorure de sodium, du sulfate d'ammonium, du chlorure d'ammonium, du sulfate de magnésium, du sulfate ferrique, du sulfate de zinc, du chlorure de calcium, du carbonate de calcium, un phosphate), des vitamines ou des produits analogues On peut, si on le désire,

ajouter au milieu, en tant qu'inducteurs de la formation de l'endo-

peptidase S Kdes cellules entières ou des parois cellulaires de microorganismes tels que Lactobacillus plantarum ou Corynebacterium diphtheriae Pour isoler l'endopeptidase SK du bouillon de culture, on peut éliminer les cellules et les débris insolubles du bouillon de culture et soumettre la solution résultante à traitement par une résine échangeuse cationique, relargage par du sulfate d'ammonium et traitement par du CM-Sephadex C-25 (type Na+), ces traitements

étant utilisés en combinaison entre eux.

Exemple de référence 2

Culture de Streptomyces nitiosporeus SK et préparation de l'endo-

peptidase SK: On inocule la souche SK en quantité de 2 % dans un milieu (p H 7,4, 50 1) contenant de la dextrine ( 2 %), de la farine de soja déshuilée ( 2 %), de l'extrait de levure ( 0,5 %), du chlorure de sodium ( 0,2 %) et des parois cellulaires ( 0,2 %) de Lactobacillus plantarum ATCC 8014 et on cultive à un débit d'aération de 50 1/min et à une vitesse d'agitation de 180 tr/min à 30 C pendant 3 j; on ajoute un agent filtrant ( 2 kg) au bouillon de culture et on filtre le mélange au filtre- presse On ajoute au filtrat ( 50 1) la résine Amberlite CG-50 (type H+, de la Firme Rohm and Haas Co, 2,5 kg a l'état humide) et on règle le mélange à p H 5,0 puis on agite pendant 1 h On sépare la résine, on la lave à l'eau puis on élue par une solution aqueuse saline 0,2 M ( 10 1) On règle l'éluat à p Hli 7,5 et

on le sature à 80 % par le sulfate d'ammonium On redissout le préci-

pité obtenu dans une proportion minimale d'eau et on dialyse la solution contre l'eau à 4 C pendant 2 j On jette la solution sur une colonne de 5, 6 x 40 cm de CM-Sephadex C-25 (type Na+ de la Firme Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède) qu'on élue par un gradient linéaire aux concentrations O à 0,5 M de Na Cl On rassemble les fractions éluées par Na Cl 0,05 à 0,1 M, on concentre, on élimine

les sels minéraux et on lyophilise; on obtient 300 mg d'endopepti-

dase SK.

Exemple de référence 3 Préparation de l'endopeptidase AM 3: On inocule la souche Streptomyces globisporus B-1829 en quantité de 1 % dans un milieu (p H 7,5, 70 1) contenant de la

dextrine ( 2 %), de la farine de soja déshuilée ( 0,5 %), de la poly-

peptone ( 0,2 %), du chlorure de sodium ( 0,2 %), Mg SO 4 (Ojl%), Na 2 HPO 4 ( 055 %) et Ca C 12 (O,02 %) et on cultive à un débit d'aération de 70 1/min et à une vitesse d'agitation de 250 tr/min à 30 C pendant 3 J Onfiltre le bouillon de culture et on ajoute au filtrat ( 70 1) la résine Amberlite CG-50 (type H+, 6,5 kg), puis on agite le mélange pendant 1 h On sépare larésine, on la lave puis on l'élue par Na 2 HPO 4

0,2 M (p H 7,5) et on sature l'éluat à 60 % par le sulfate d'ammonium.

On sépare le précipité par filtration et on le redissout dans une petite quantité d'eau déminéralisée puis on déminéralise la solution par un électrodialyseur (chambre de dialyse SELEMION type DU-Ob, de la Firme Nippon Rensui Co, Japon) pendant 2 à 5 h On jette la solution sur une colonne de 5,0 x 20 cm de CM-Sephadex C-25 (type Na+) qu'on élue par un gradient linéaire de Na Cl de concentration O à 0,06 M On recueille les fractions actives, on concentre, on soumet & filtration sur gel de Sephadex G-25 (de la Firme Pharmacia)

Suède puis on lyophilise; on obtient 800 mg d'endopeptidase AM.

Les caractéristiques des endopeptidases SK et AM obtenues

comme décrit ci-dessus sont indiquées dans le tableau 8 ci-après.

Le poids moléculaire de chacune des enzymes a été estimé par la méthode d'électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide décrite dans J Biol Chem, 246, 6328 ( 1971) Le point isoélectrique est déterminé par le mode opératoire décrit dans Acta Chem Scand, 20,

820 ( 1966).

Exemple de référence 4 Préparation de l'acétylmuramidase M 1: On cultive la souche Streptomyces globisporus B-1829 dans un milieu (p H 7,5, 70 1) contenant 2 % de dextrine, 0,5 % de farine de soja déshuilée, 0,2 % de polypeptone, 0,17 % de chlorure de sodium, 0,1 % de Mg SO 4, 0,5 % de Na 2 HPO 4 et 0,02 % de Ca C 12 à un débit d'aération de 70 1/min et une vitesse d'agitation de 250 tr/min, à 300 C pendant 3 j On filtre le bouillon de culture et on ajoute au filtrat ( 70 1) 6,5 kg de résine Amberlite CG-50 (type H), puis on agite le mélange pendant 1 h et on filtre On élue la résine séparée par Na 2 HP 04 0,2 M (p H 7,5) et on sature l'éluat à 60 % par le sulfate d'ammonium On sépare le précipité par filtration

et on le redissout dans une petite quantité d'eau déminéralisée.

On jette la solution sur une colonne de 3,0 x 70 cm de CM-Cellulose (type Na+ de la Firme Bio-Rad Laboratories, Etats-Unis d'Amérique) équilibrée par du tampon au phosphate 0,05 M, p H 7,0 L'élution est effectuée par paliersavec du tampon au phosphate 0,05 M et 0,1 M, p H 7,0 La fraction élude par le tampon au phosphate 0,1 M est dialysée contre l'eau et jetée sur une colonne de 3,0 x 60 cm de CM-Sephadex C-25 (type Na+) équilibrée par du tampon au phosphate 0,05 M et qu'on élue par palieisavec du tampon au phosphate 0,05 M et 0,1 M, p H 7,0 On dialyse la fraction élude par le tampon au phosphate 0,1 M contre du tampon au phosphate 0,05 M, p H 7,0 On soumet la solution dialysée à filtration sur gel de Sephadex G-75 (de la Firme Pharmacia, Suède), on élimine les sels de la fraction active obtenue, on la concentre et on la lyophilise; on obtient 1100 mg d'acétylmuramidase M. Exemple de référence 5 Préparation des parois cellulaires: On met 520 g de cellules entières humides de Lactobacillus plantarum ATCC 8014 en suspension dans 4 1 de sérum physiologique et on les broie au broyeur de laboratoire DYNO de la Firme Shinmaru Enterprises Corporation, Japon On centrifuge le mélange à 800 x g pendant 10 min afin d'éliminer les cellules broyées et on ajoute au liquide surnageant du chlorure de sodium à la concentration M. On récolte les parois cellulaires à l'aide d'une centrifugeuse tournant à 9000 x g pendant 30 min, on lave avec une grande quantité d'eau déminéralisée et on recueille par centrifugation Ce traitement est répété trois fois On met les parois cellulaires lavées en suspension dans du tampon au phosphate 0,05 M, p H 7,0, et on ajoutte 4,2 g de trypsine, puis on abandonne le mélange au repos à 37 C pendant 6 h On refroidit le mélange de réaction et on le centrifuge ( 800 x g, 15 min) afin d'éliminer les débris insolubles puis on centrifuge à nouveau le liquide surnageant ( 9000 x g, 30 min) pour recueillir les parois cellulaires On lave les parois cellulaires par du tampon au phosphate 0,05 M, p H 7,0, et on les recueille par centrifugation Ce traitement répété deux fois donne 86 g de parois

cellulaires purifiées.

Exemple de référence 6 ' Préparation de parois cellulaires traitées par un alcali: On met 80 g des parois cellulaires obtenues dans l'exemple de référence 5 en suspension dans 4,4 1 de Na OH 0,1 N et on agite

la suspension à température ambiante pendant 30 min à 2 h, on neutra-

lise par HC 1 concentré puis on centrifuge ( 9000 x g, 30 min) pour recueillir les parois cellulaires On les lave avec une solution saline H puis de l'eau et on lyophilise; on obtient 40 g de parois

cellulaires traitées à l'alcali.

Exemple de référence 7 Préparation de parois cellulaires traitées à l'alcali: On met 121 g de cellules entières humides de Lactobacillus plantarum ATCC 8014 en suspension soigneusement dans de l'eau de ville ( 1 litre) et on ajoute 4 g de Na OH solide Apres dissolution complète de Na OH, on agite le mélange à température ambiante pendant 30 min On règle le mélange à p H 7,0 environ par l'acide chlorhydrique concentré et on centrifuge ( 800 x g, 10 min); on lave le précipité obtenu à l'eau une fois Les cellules entières ainsi traitées à l'alcali sont ensuite soumises aux opérations décrites dans l'exemple de référence 5: on obtient 18 g de parois cellulaires traitées à

l'alcali.

Exemple de référence 8 Lmmobilisation de l'endopeptidase AM 3: On dissout 500 mg de l'endopeptidase AI 3 obtenue dans l'exemple de référence 3 dans 20 ml de tampon au phosphate 0,05 H

(p H 8,0) et on ajoute cette solution à 1000 mg de p-aminobenzylcellu-

lose diazotée de la manière habituelle puis on agite à 40 C pendant h et on soumet à incubation de 1 h à 37 C Lorsque la réaction est terminée, on sépare l'enzyme immobilisée par filtration et on la lave avec du tampon au phosphate 0,25 M, p H 8,0, puis à l'eau afin d'éliminer l'enzyme libre L'enzyme immobilisée dans ces

conditions est conservée à basse température.

Exemple de référence 9 Immobilisation de l'endopeptidase A 3: On purifie 200 mg de l'endopeptidase A 3 obtenue dans l'exemple de référence 3 en la soumettant à filtration sur gel sur une colonne de 2,0 x 100 cm de Sephadex G-100 On ajoute l'enzyme purifiée à une suspension de CMSephadex C-25 (type Na+, 5,0 g à l'état humide) dans 50 ml de tampon au phosphate 0,001 M, p H 6,5,

et on agite le mélange a 4 C pendant 24 h On sépare la résine CM-

Sephadex C-25 par filtration et on la lave avec soin par 500 ml du tampon ci-dessus; on obtient ainsi l'endopeptidase A% 3 fixée sur

CM-Sephadex C-25.

Exemple 1

Préparation de GMP 3-A, GMP 4-A, GMP 3-B et GMP 4 -B: On met 43 g des parois cellulaires purifiées obtenues dans l'exemple -de référence en suspension dans du tampon Tris-acide chlorhydrique, p H 8,5, concentration finale 0,02 M, et on disperse bien par exposition aux ultrasons puis on traite à la chaleur a C pendant 10 min Apres refroidissement, on ajoute à la suspension 43 mg de l'acétylmuramidase l obtenue dans l'exemple de référence 4 et 280 mg de nitrite de sodium et on complète à volume total de 4,3 1 par de l'eau déminéralisée On soumet le mélange à incubation de 24 h à 37 C On ajoute au mélange 105 mg d'endopeptidase SK obtenue dans l'exemple de référence 2 et on agite le mélange à la meme température pendant 24 h puis on chauffe à 100 C pendant 2 min afin d'achever la réaction On refroidit le mélange de réaction et on le centrifuge ( 9000 x g, 30 min) afin d'éliminer les insolubles; on fait passer le liquide surnageant sur une colonne de 5,6 x 50 cm d'ECTEOLA-cellulose de la Firme Brown Co, Etats-Unis d'Amérique, et on concentre la fraction non adsorbée sous vide à une température inférieure a 50 C On jette la solution concentrée sur une colonne de 5,6 x 83 cm de Sephadex G-50 reliée en série à une colonne de ,6 x 77 cm de Sephadex G-25, on recueille les fractions contenant les substances à poids moléculaire moyen et on les concentre sous vide à une température inférieure à 50 C On traite la solution concentrée par la résine Dowex 50 W x 2 (type Na+,de la Firme Dow Chemical Co, Etats-Unis d'Amérique), et on concentre de la même manière la fraction non absorbée On jette la solution concentrée sur une colonne de gel de silice de 7 x 70 cm et on développe par 700 ml de propanol a 70 %; on recueille les fractions contenant Gc MP 3-A, GMP 4-A, CHMP 3-B et GMI P 4-B et on les concentre On jette à nouveau la solution concentrée sur une colonne de Nylon contenant du gel de silice ( 7 x 80 cm), et on développe par le mélange acide isobutyrique-NH 40 H 0,5 M ( 5:3 en volume) On coupe la colonne à une longueur déterminée On extrait une partie de chaque portion par le même solvant que ci-dessus et on soumet l'extrait à chromatographie sur couche mince et on développe par le solvant On recherche les portions contenant les peptidoglucannes On recueille deux groupes

de portions contenant un peptidoglucanne homogène à la chromatogra-

phie sur couche mince, on les lave à l'éther afin d'éliminer l'acide isobutyrique et on les extrait à l'eau On concentre l'extrait et on élimine les sels minéraux par filtration sur gel La fraction contenant un mélange de GMP 3-A et de GMP 4-A et la fraction contenant

3 4

un mélange de GMP 3-B et de GMP 4-B sont soumises chacune à chromato-

graphie sur une colonne de 4,5 x 30 cm de CM-Sephadex C-25 (type H), -3 qu'on élue par 2,0 1 d'acide chlorhydrique 0,5 x 10-3 N afin de séparer en chacune des fractions contenant respectivement GMP 3-A GMP 4-A, GMP 3- B et GMP 4-B On recueille les fractions contenant chacune des composés en proportion prédominante et on les neutralise avec soin par Na OH 0,01 N puis on concentre sous vide à une température

inférieure à 50 C Chacune des solutions concentrées est déminéra-

lisée par filtration sur gel dans une colonne de 5,0 x 80 cm de Sephadex G-25, concentrée sous vide à des températures inférieures à 50 C; on obtient GMP 3-A, GMP 4-A, GMP 3-B et GMP 4-B en quantités

respectives de 0,7 g, 0,7 g, 1,6 g et 1,4 g.

Les propriétés physicochimiques et les résultats d'analyse

de ces quatre composés sont rapportés dans le tableau 9 ci-après.

On a soumis chacun des quatre composés à hydrolyse par la N-acétylmuramylN-alanine amidase isolée de Streptomyces globisporus B-1829; ils ont donné les produits de dégradation indiqués dans le tableau 10 ci-après avec les résultats des analyses effectuées sur ces produits L'analyse a été effectuée par une méthode connue et décrite dans Biochemistry, 5, 3079 ( 1966); ibid, 6, 921 ( 1967); et Biochem Biophys Res Com, 40, 57 ( 1970) et leur structure chimique a été déterminée par des méthodes d'analyse instrumentales (SM, SMCG,

RMN, IR, UV) et analyse enzymatique.

Exemple 2

Préparation de GMP -A, GMP 4-A, GMP 3-B et GMP 4-B: On met 1200 g de parois cellulaires purifiées de Lactobacillus plantarum ATCC 8014 obtenues par le mode opératoire de l'exemple de référence 5 en suspension dans 30 1 de tampon phosphaté

(p H 8,0, concentration finale 0,04 M) et on ajoute 2,4 g d'acétyl-

muramidase, 50 ml de chloroforme, 14,3 g de Co C 12 i 6 H 202 0,58 g d'endopeptidase Am puis on complète à volume final de 60 1 par de l'eau de ville On agite le mélange à 37 C pendant 24 h On règle à p H 2,5-3,0 par l'acide chlorhydrique concentré et on élimine les insolubles par centrifugation On neutralise le liquide surnageant avec soin par une solution diluée de Na OH et on fait passer sur une colonne de 10 x 140 cm de résine Diaion PA 316 (type Cl-,de la Firme Mitsubishi Chemical Industries Co, Ltd, Japon) afin d'éliminer les impuretés On jette la fraction non adsorbde sur une colonne de 14 x 190 cm de résine Diaion PK 212 (type H+ de la Firme Mitsubishi Chemical Industries Co, Ltd, Japon) qu'on élue par une solution saline 0,3 M On neutralise l'éluat avec soin par une solution diluée de Na OH et on jette sur une colonne de 5,0 x 50 cm de gel de silice (Kieselgel 60 F 254, de la Firme E Merck AG, République Fédérale d'Allemagne) On lave la colonne par 10 1 de mélange chloroforme/ méthanol/eau, 15:10:2 en volume,et on élue par un mélange chloroforme/ méthanol/eau, 10:10:2 en volume, 15 1; on obtient une fraction contenant un mélange de GMP 3-B et GMP 4-B puis on élue par 10 1 de méthanol, ce qui donne une fraction contenant un mélange de GMP 3 -A et Gm P 4-A Chacune des deux fractions est concentrée sous vide à une température inférieure à 50 C puis jetée sur une colonne de x 135 cm de résine Dision HP-20 de la Firme Mitsubishi Chemical Industries Co, Ltd, Japon Après élution de chacune des colonnes par 10 1 d'eau de ville puis 10 1 de méthanol à 5 %, on obtient GMP 3-A et GMP 3-B à partir de la fraction élude à l'eau et GMP 4-A et GP 4 B à partir de la fraction éluée par le méthanol à 5 % Chacune des fractions de GMP 3-A, GMP 4-A GMP 3-B et GMP 4-B est concentrée sous vide & température inférieure à 50 C puis jetée sur une colonne de 15 x 135 cm de CN-Sephadex (type H+), qu'on élue par 10 1 d'acide chlorhydrique 0,5 x 103 N On neutralise l'éluat par une solution diluée de Na OH, on concentre sous vide à température inférieure à 'C et on élimine les sels minéraux par filtration sur gel sur une colonne de 6,0 x 160 cm de Sephadex G-25 On concentre les solutions sous vide à température inférieure à 50 C et on les lyophilise; on obtient GMP 3-A GMP 4-A GMP 3-B et GMP 4-B en quantitésrespectivesde

38 g, 38-g, 67,8 g et 56,2 g.

Exemple 3

Préparation de GMP 3-A et GMP 4-A: On met 1200 g de parois cellulaires de Lactobacillus

plantarum ATCC 8014 traitée à l'alcali, obtenuespar le mode opéra-

toire de l'exemple de référence 6 en suspension dans 30 1 de tampon phosphaté (p H 8,5, concentration finale 0,02 M) et on disperse avec soin On mélange la suspension avec 2,4 g d'acétylmuramidase M 1, 50 ml de chloroforme, 14,3 g de Co C 12,16 H 20 et l'endopeptidase A immobilisée ( 1,0 g à l'état sec) obtenue dans l'exemple de référence 8 puis on ajoute de l'eau de ville jusqu'à volume final de 60 1 On agite le mélange à 37 C pendant 48 h On sépare l'enzyme immobilisée du mélange de réaction On règle la solution obtenue à p H 2,5-3,0 par l'acide chlorhydrique concentré et on sépare le précipité par centrifugation à haute vitesse On neutralise le liquide surnageant avec soin par une solution diluée de Na OH et on le Jette sur une colonne de 10 x 140 cm de résine Diaion PA 316 (type Cl-) afin d'éliminer les impuretés On jette à nouveau la fraction non adsorbée sur une colonne de 14 x 190 cm de résine Diaion PK 212 (type H),

21 -

qu'on élue par une solution saline 0,3 M On neutralise l'éluat par une solution diluée de Na OH et on jette sur une colonne de 20 x 135 cm

de résine Diaion HP-20 qu'on dilue par l'eau, ce qui donne une frac-

tion de GMP 3-A, puis au méthanol à 5 %, ce qui donne une fraction de GMP 4-A Chacune des fractions ainsi obtenues est déminéralisée et concentrée sur un instrument à osmose inverse (RO-Module RT-1 de la Firme Sumitomo Chemical Co, Ltd, Japon) puis jetée sur une colonne de 15 x 135 cm de CMSephadex (type H+) qu'on élue par 10 1 d'acide chlorhydrique 0,001 N On neutralise l'éluat par une solution diluée de Na OH, on concentre sous vide à température inférieure à 50 C puis on élimine les sels par filtration sur gel sur une colonne de 6,0 x 160 cm de Sephadex G-25 L'éluat obtenu est concentré sous vide à température inférieure à 50 C et lyophilisé; on obtient ainsi

GMP 3-A et GMP 4-A en quantités respectives de 110 g et 90 g.

Exemple 4

Préparation de GMP 3-A et GMP 4-A: On met 1200 g de parois cellulaires de Lactobacillus plantarum ATCC 8014 traitée à l'alcali, obtenuespar le mode opératoire

de l'exemple de référence 7, en suspension dans 30 1 de tampon phos-

phaté (p H 8,5, concentration finale 0,02 M) et on disperse avec soin.

On mélange la suspension avec 2,4 g d'acétylmuramidase M 1 et 50 ml de chloroforme puis on complète à volume final de 60 1 par de l'eau de ville On agite le mélange à 37 C pendant 24 h On règle le mélange de réaction à p H 2,5-3,0 par l'acide chlorhydrique concentré et on sépare le précipité par centrifugation à haute vitesse On neutralise le liquide surnageant par une solution concentrée de Na OH et on fait passer sur une colonne de 10 x 140 cm de Diaion PA 316 (type Cl-) afin d'éliminer les impuretés On déminéralise la fraction non adsorbée sur un électrodialyseur (chambre de dialyse SELEMION Type DU-Ob) et on règle à p H 6,5 par l'acide chlorhydrique On garnit

une colonne de 10 x 100 cm de l'endopeptidase A% 3 fixée sur CM-

Sephadex G-25 comme décrit dans l'exemple de référence 9 et on fait passer sur cette colonne la solution ci-dessus au débit de 100 ml/min

en maintenant & 37 C Cette opération est répétée deux à trois fois.

Le mélange de réaction ainsi obtenu est jeté sur une colonne de 14 x 190 cm de résine Diaion PK 212 (type H), qu'on élue par 20 1 de solution saline 0,3 M On neutralise l'éluat par une solution diluée de Na OH et on jette sur une colonne de 20 x 135 cm de résine Diaion HP-20 On procède ensuite comme décrit dans l'exemple 3 pour

obtenir respectivement GMP 3-A et GMP 4-A en quantités de 100 et 80 g.

-

Exemple 5

* Conversion de GMP 3-B et GMP 4-B en GMP 3-A et GMP 4-A

On dissout 1000 mg de GMP 3-B dans 10 ml d'acide chlorhy-

drique 0,1 N et on chauffe la solution à 60 C pendant 8 h Après refroidissement, on règle le mélange de réaction à p H 6,0 par une solution diluée de Na OH et on concentre sous vide à température inférieure à 50 C puis on déminéralise par filtration sur gel aur une colonne de Sephadex G-25 On concentre l'éluat sous vide à température inférieure à 50 C et on lyophilise; on obtient 960 mg

de GMP 3-A.

Lorsqu'on traite 1000 g de GMP 4-B comme décrit ci-dessus,

on obtient 966 mg de GMP 4-A.

6: 9 Z L 9 TZ O;O Z 06; 66 ú O O ú (Itu/'gn/) gdxoo Tzuvp eqàzv 1 c 1 Lc E gec L'ú 'z nued v T ap uo Tiavp-g 0 Z'z 17 z O'z quuapuzov e'suod-gd VU 9 câm 0 %. r- èn C> CM Ln (M punexj ap je Tdmoou T juv Anrp- f * c" cq eluelnm T 29 ounmm T pzi AT:iz>v 1 rivnuvi

91 IL T COO O

91147 gl/ç 91/9 9 T/6 çZTO'o 91147 9 T/L 91/9 91/6 ço"o 91/9 91/6 9 T/1 91/8 z O 91/6 91/01 91 IL 91/o T 8 O c 91/01 91/Zl 91 IL 911,71 T c 91/91 91/91 9 T/91 91/91 ç'zl a-"awo a úàm DOUO Tapdxe p xnvm-îuv sep lvzo:l exqmou/s:;u"&Tuxns op 9 xqmom O NI mi CD cm VI Cj

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TABLEAU 3

Caractéristiques morphologiques Forme des hyphes portant des spores Surface de la chaîne de spores Nombre de spores Spore flagellé, sporangium ramification simple lisse -50 néant Ln ru r%) -> 4 1.1 Â O AA Caractéristiques de culture sur divers milieux Croissance Mycélium aérien Milieu -Végétatio*C Forme Couleur gtation Forme Pigment soluble Végétatiopcouleur Couleur Milieu extrait de levure Dru très rare extrait de malt-gélose bonne épaisse gri,trare Milieu gélose à la farinebonne étalée vert jaune abondante _ gris très rare d 'atrnjne nle

milieu sel& miné'raux-

éMilieu selminéraux bonne étalée brun olive abondante gris néant gélose amidon _,

Milieu gélose au glycérol pou brun grisa-

et A l'asparagine modérée élevée jaune ale reuse tre pale Milieu gélose au glucosemodéréeélevée jaune pale rare néant et à l'asparagine modre leve jaune pale _ _ Milieu gélose à la bonne brun pale oton gris le brun jaunâtre tyros ine aeuse pale (traces)

Milieu gélose-saccharose pou-

-nitrate lesschoerare jaune pale pauvre dreusenéant

Milieu gélose peptone-

Miieu gélose peptone modérée plissée incolore néant néant extrait de levure-fer Milieu gélose à l'amidon ol bu-og et à l'extrait de levuredruegiâe et li'gextrait de levuremodéréeétalée, élevéjaune palempou brun-rougens ____ ___ ____ __ ___ ____ dre se risatre N éant Milieu gélose au glycérolmodérée étalée brun jaunatrepauvre très rare et au maléate de calcium pale Plaque de gélatine modéréeverticillé, néant brun sombre i corance au piedre Milieu lait écrémé modérée " néant paleu pale, Milieu liquide au nitratemodéréeverticillé pauvre néant Milieu au sérum de chevalmodéréelichénolde néant brun sombre de L 8 ffer Milieu aux oeufs modérée néant brun sombre Nota: L'observation a été effectuée comme défini dans International Streptomyces Project (ISP) dans Inter J.

Syst Bacteriol, 16, 313 ( 1966).

: non déterminé as a% I.') c> W I

TABLEAU 4

TABLEAU 5

Caractéristiques physiologiques Test Résultats Production de pigment mélanoide Pigment brun sombre dans la plaque de gélatine, le sérum de cheval de L Wffer et le milieu aux oeufs; négatif sur les autres milieux Liquéfaction de la gélatine positive Peptonisation du lait positive Production de N 2 S positive Hvdrolyse du malate de Ca positive Réduction des nitrates positive Hydrolyse de l'amidon positive Face opposée de la colonie pas de changement Production d'antibiotique négative Capacité de production de l'endopeptidase extrêmement forte -J r%) U Ln r\o co -dj CX mi C) cm Ln tu eauuss Toiv 99 TP,&nvo (,, eouvss Toao auuoq (-I+ eso:zlriqzovs esoumpiqx-,j eso:lzna;-(l JOITUUVM-(j

TO:ITBOUI

esou Tqvxv- l ++ gouvou Tolo ezz)n S

(q*T Tzzoo la mvqp Tza op euolp Z) ouoqaeo OP seoinos sep uo Tiva Tlîza -

9 livngym TABLEAU 7 Productiond'endopeptidase (U/ml) Durée de Culture sous secousse Culture stationnaire culture (jours) Souche SK Souche parente Souche SK Souche parente

1 0,9 O O O

2 2,5 O O O

3 2,0 O 0,1 O

0,5 O 0,3 0,2

7 0,2 O 0,4 0,3

9 0,1 O 0,6 0,2

Les chiffres rapportés dans le tableau indiquent l'activité lytique de l'endopeptidase produite L'activité lytique a été déterminée par mesure de la vitesse de réduction de

la turbidité d'une suspension de parois cellulaires de Lactobacillus plantarum ATCC 8014.

A un mélange consistant en une quantité adéquate de la suspension de parois cellulaires, du tampon Tris-acide chlorhydrique (p H 8,0, concentration finale 0,05 M) et une fraction aliquote d'une solution d'enzyme à un volume total de 4,0 ml, on a donné une absorbance de 0,5 à 600 nm et on a laissé réagir au bain-marie à 37 C Une unité d'activité lytique est définie comme la quantité d'enzyme provoquant une diminution linéaire initiale d'absorbance à 600 nm de 0,001 par minute L'unité d'activité lytique d'une solution d'enzyme est calculée par l'équation suivante: O Do-O Dt 1

Il/ml = t x -

v O,001 " t volume de la solution d'enzyme, (ml) dans laquelle: OD O est la densité optique du mélange de réaction au temps de réaction zéro, OD est la densité optique au bout de t minutes,

t est la dure de raction en minutes avec 0,3 O Do Dt < 0,13.

t est la durée de réaction en minutes, avec 0,03 < QD -OD< 0,13.

o Remarque: t O % O e ro tn go -4 %O

TABLEAU 8

Caractéristiques des endopeptidases SK et AM Endopeptidase SK Endopeptidase A 3 Source Streptomyces Streptomyces nitrosporeus SK globisporus B-1829 Condition de culture aération aération Induction nécessaire non nécessaire Stabilité au p H stable à p H 5,0-9,5 stable à p H 7,0-9,0 inactivé au-dessous de p H 5,0 p H optimal 9,0 8,5 Température optimale 55-60 C 55-60 C

Concentration optimale 0,02 M 0,04 M -

du tampon Poids moléculaire 1,6 x 104 1,3 x 104 Point isoélectrique p H 8, 3 p H 9,0 o ro ul o % 4 TABLEAU 9 Propriétés physicochimiques et analyse chimique de chacun des com Dosés w

* Les chiffres indiqués sont le rapport molaire avec le radical total d'acide glutamique.

ro Ln t Jl o PO GMP 3-A G 4-A h 3 MP-B j 4-B Aapect Poudre blanche

insoluble dan's.

Solubilité Soluble dans l'eau, les alcools en C 1-C 3 à 507; il'nthr éthylique l ' l the thy ique Rotation spécifique lal 25 4 4 (c= 1,0, eau, au bout de 24 h) -8 -114 + 47 -12 Formule moléculaire ^ C 34 H 58018 N 85 H 20 C 37 H 63019 N 9)6 H 20 C 36 H 60019 N 8,3/2 H 20 C 39 H 65020 N 9,> 2 H 20 Analyse élémentaire C H N C Hl N C H N C H N Calculé 42,68 7,11 11, 72 42,49 7,18 12,06 46,20 6,78 11,97 46,10 6,87 12,41 Trouvé 42,94 7,17 11,78 42 39 6 93 11 78 46,50 6,91 11,95 45,97 6,66 12,36 Glucosamine O 90 0,94 0,83 0,85 Analyse des Acide muramique 1,08 1,06 0,91 1 0,89 aminosucres Acide glutamique ( 1 00) ( 1,00) ( 1,00) t ( 1,00) et amino Alanine 1911 2,14 1,13 2,16 acides Acide diaminopimqfqe 1,20 1,18 1,20 1, 19

s Acide diamino a Acide diamino-

Aminoacide sur C-terminal 4 pimélique alanine pimélique alanine Aminoacide sur N-terminal Acide diaminopimélique TABLEAU 10 Résultats des analyses effectuées sur les produits de dégradation w Les abréviations utilisées ont les significations suivantes N-Ac Glc-N-Ac Mur acide P-Nacétylglucosaminyl-< l-> 4)-N-acétylmuramique; N-Ac Glc N, 6-di Ac Mur acide 9-N-acétylglucosamninyl-< 1-> 4)-N,6-0-diacétylmuramique; L-Ala-Diso Gln-méso-A pm: L-alanyl-D-isoglutaminyl (L)-méso-2,6-diaminopimlo (D)amnide;

L-Ala D-îso Gln-m 5 so-A 2 pm D-Ala: L-alanyl-D-îsoglutaminyl (L) -méso-2, 6-diaminopimelo -

(D) -amide (L) -D-alanine; N-Ac Glc N-acétylglucosamine; N-Ac Mur acide Nacétylmuramique; et

N,6 -0-di Ac Mur acide N,6-0-diacétylmuramique.

*)cf Biochem, J, 77, 170 ( 1960) Lnl 1 \) C> 1

CMP -A ONP 4-A GWG -B H B

3 3 4 __ _ _ __ _ __ _ __ _ _ _ _ _ _

Produit de dégradation par catalyse à la N-Ac Glc'-N-Ac Mur, N-Ac Glc-NAc Mur, N-Ac Glc-N 6-0 N-Ac Glc-N,6 0 di Ac Mur, di AéMur, Nacetylmuramyl-L-alauine amidase trîpeptide tetrapeptide tripeptide ttaeide Fraction Séquence des aminoacides L-Ala-D-iso Gln L-Ala-D-iso Gln L-Ala-D-iso Gln L-Ala-D-iso Gln peptides (dégradation d'Edman) meso-A 2 pm rncso-A 2 pm-D-Alaméso____________D-Al produit de dégradation par cata y 8 E à l'exo-k-N-acetylglucosamidase* N-Ac Glc, N-Ac Mur N-Ac Glc, N,6-0- di Ac Mur Fraction Groupe 0-acétyle + sucres Liaison glycosidique Liaison g-1,4 Sucre réducteur N-Ac Mur, 6-0-di Ac Mur

Claims (4)

R E V E N D I C A T IONS

1 Procédé de préparation d'un disaccharide-tripeptide et d'un divaccharide-tétrapeptide de formule:

CH 2 OH -CH 2 OR 1

H O

HHH OH Ii OHH O HO" t H ti

H NH H 3 HCOCH 3 NHCOCH 3

(D)Ct ICH 3

HN CO

IN-

(L) CHCO NU

l I

CH 3 H 2 NCOCH (CH 2) 2

(D) l

HN CO

(D) I

H 2 NCH (CH 2)3 CHCOR 2

CONH 2 ()

dans laquelle R 1 représente l'hydrogène ou un groupe acétyle, R 2

(D)

représente un groupe hydroxy ou un groupe -NHCHCOOH, les signes (D) CH 3 et (L) indiquant la configuration, ce procédé se caractérisant en ce que l'on utilise une endo-N-acétylmuramidase de Streptomyces

globisporus et une endopeptidase de l'acide D-alanyl-méso-2,6-

diaminopimélique de Streptomyces nitrosporeus SK (FERM BP-216) ou de Streptomyces globisporus pour hydrolyser des parois de cellules bactériennes contenant un motif d'acide muramique dans lequel le

groupe amino est acétylé, de l'isoglutamine et un acide méso-2,6-

diaminopimélique portant un groupe carboxyle amidé en tant que constituants du peptidoglucanne de paroi cellulaire et, si on le désire, lorsqu'on obtient un produit dans lequel R 1 représente

un groupe acétyle, on hydrolyse ce produit.

2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que Streptomyces globisporus utilisé est Streptomyces globisporus

B-1829 (ATCC 21553).

3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les parois cellulaires sont des parois cellulaires de Lactobacillus plantarum ou de Corynebacterium diphtheriae 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise une endo-N-acétylmuramidase de Streptomyces globisporus

B-1829 (ATCC 21553) et une endopeptidase de l'acide D-alanyl-méso-

2,6-diaminopimélique de Streptomyces nitrosporeus SK (FERM BP-216) ou Streptomyces globisporus B-1829 (ATCC 21553) pour hydrolyser les

parois cellulaires de Lactobacillus plantarum.

Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les parois cellulaires n'ont pas été traitées par un alcali, le produit dans lequel R 1 représente un groupe acétyle n'est pas soumis

à l'hydrolyse, et les produits finals obtenus sont le P-N-acétyl-

glucosaminyl-( 1-> 4)-N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-

méso-2,6-diaminopimélo-(D)-amide, la P-N-acétylglucosaminyl-(l -> 4)-

N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-méso-2,6-diaminopimélo-

(D)-amide-(L)-D-alanine, le P-N-acétylglucosaminyl-( 1-> 4)-N,6-O-

diacdtylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-méso-2,6-diaminopimélo-

(D)-amide, et la O-N-acétylglucosaminyl-( 1-> 4)-N,6-O-diacétyl-

muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-méso-2,6-diaminopimélo-(D)-

amide-(L)-D-alanine. 6 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les parois cellulaires n'ont pas été traitées par un alcali, le produit dans lequel R 1 représente un groupe acétyle est hydrolysé

en milieu acide, et les produits finals sont le P-N-acétylglucosa-

minyl-( > 4)-N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-méso-

2,6-diaminopimélo-(D)-amide et la 9-N-acétylglucosaminyl-(l -> 4)-

N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-méso-2,6-diaminopimélo-

(D)-amide-(L)-D-alanine. 7 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les parois cellulaires ont été traitées par un alcali et en ce

que les produits obtenus sont le P-N-acétylglucosaminyl-(l -> 4)-

Nacdtylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-méso-2,6-diaminopimélo-

(D)-amide et la 9-N-acétylglucosaminyl-(l_> 4)-N-acétylmuramyl-L-

alanyl-D-isoglutaminyl-(L)-méso-2,6-diaminopimélo-(D)-amide-(L)-D-

alanine. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les parois cellulaires traitées à l'alcali ont été préparées en traitant les parois cellulaires par une solution aqueuse d'alcali 0,05 à 0,5 N ou en traitant les cellules entières par une solution aqueuse d'alcali 0,05 à 0, 5 N et en soumettant ensuite les cellules entières traitées à l'alcali à un procédé classique de préparation des

parois cellulaires.

9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la solution aqueuse d'alcali est à une concentration 0,1 à 0,2 N. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'alcali est choisi parmi les hydroxydes de métaux alcalins et les

carbonates de métaux alcalins.