FR2520121A1 - PROCESS AND REAGENTS FOR THE USE OF B-D-GALACTOSIDASE AS A IMMUNOCYTOCHEMISTRY MARKER - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention concerne un procédé et des réactifs pour l'emploi de la ss-D-galactosidase comme marqueur en immunocytochimie. The present invention relates to a method and reagents for the use of ss-D-galactosidase as a marker in immunocytochemistry.
Les anticorps à marquage enzymatique et fluorescent sont couramment utilisés en immunohistochimie pour mettre en évidence la localisation des antigânes dans les tissus. [Proc. Soc. Enzyme-labeled and fluorescent antibodies are commonly used in immunohistochemistry to demonstrate the localization of antigens in tissues. [Proc. Soc.
Exp. Biol. Med. 47 : 200-202, 1941; J. Immunol. 45: 159-170, 1942;
J. Exp. Med. 91: 1-13, 1950; Arch. Pathol. Lab. Med. 102: 113-121, 1978; J. Clin. Pathol. 27: 14-20, 1974].Exp. Biol. Med. 47: 200-202, 1941; J. Immunol. 45: 159-170, 1942;
J. Exp. Med. 91: 1-13, 1950; Arch. Pathol. Lab. Med. 102: 113-121, 1978; J. Clin. Pathol. 27: 14-20, 1974].
Cependant la vogue de l'immunolocalisation enzy matique s'est récemment accrue car celle-ci apporte à l'anatomo- pathologiste certains avantages nets par rapport à l'immunofluores- cence. Ces avantages comprennent les préparations colorées plus stables contrastées et à détails fins, la permanence de lames, la possibilité d'observer le tissu environnant et, pour la plupart des antigènes, l'emploi d'une matière que l'on a préparée selon des techniques classiques de fixation et d'inclusion pour la micros- copie optique,
Par suite de ces avantages les méthodes immuno- enzymatiques sont si sensibles et si précises que parmi toutes les techniques immunohistochimiques, les techniques histochimiques immuno enzymatiques sont actuellement les plue utilisées pour le diagnostic anatomopathologique, Les méthodes cytochimiques immuno-enzymatiques, en particulier les méthodes histochimiques, fournissent des informations importantes, par exemple en pathologie rénale, dans l'étude des maladies bactériennes et virales, dans l'étude physiopathologique du système immunitaire ainsi que sur la sécrétion des @ormones ,
De plus > on a découvert des marqueurs spécifiques de maladies et de types cellulaires déterminés permettant d'obtenir une information importante sur l'histogénèse et la différenciation des tumours.However, the popularity of enzyme immunolocalization has recently increased as it provides the anatomopathologist with some clear advantages over immunofluorescence. These advantages include more stable contrasted and fine-detail stained preparations, the permanence of slides, the ability to observe the surrounding tissue and, for most antigens, the use of a material which has been prepared in accordance with conventional fixation and embedding techniques for optical microscopy,
As a result of these advantages, the immunoenzymatic methods are so sensitive and so precise that, among all immunohistochemical techniques, the enzymatic immunochemical techniques are currently the most used for anatomopathological diagnosis. Cytochemical immunoassay methods, in particular histochemical methods , provide important information, for example in renal pathology, in the study of bacterial and viral diseases, in the physiopathological study of the immune system as well as in the secretion of the hormones,
In addition, specific markers of specific diseases and cell types have been found to provide important information on histogenesis and tumor differentiation.
Une grande diversité de produits cellulaires, y compris des enzymes, des hormones polypeptidiques et stéroldes des immunoglobulines, des antigènes à caractère tumoral, des antigènes viraux et d'autres protéines à spécificité cellulaire ont été mis en évidence dans des coupes de tissus congelés ou fixés et incluses de façon typique grace à l'emploi de ces techniques. A wide variety of cellular products, including enzymes, polypeptide hormones and immunoglobulin steroids, tumor antigens, viral antigens and other cell-specific proteins have been demonstrated in frozen or fixed tissue sections. and typically included through the use of these techniques.
Les applications principales de ces procédés comprennent par exemple la mise en évidence de diverses catégories d'immunoglobulines dans les tumeurs d'origine lymphoréticulaire et les processus atypiques de prolifération du système lymphatique, l'identification des hormones polypeptidiques dans les tumeurs endocrines et la mise en évidence de divers marqueurs tumoraux tels que l'antigène carcino-embryonnaire et l'α-foetoprotéine dans les états néoplasiques et prénéoplasiques. The main applications of these methods include, for example, the demonstration of various categories of immunoglobulins in tumors of lymphoreticular origin and the atypical processes of proliferation of the lymphatic system, the identification of polypeptide hormones in endocrine tumors and the implementation of evidence of various tumor markers such as carcinoembryonic antigen and alpha-fetoprotein in neoplastic and preneoplastic states.
Un résumé concis de certaines applications des techniques immuno-enzymatiques en histopathologie figure dans Human
Pathology, 12 590-596 (1981).A concise summary of some applications of immunoassay techniques in histopathology appears in Human
Pathology, 12, 590-596 (1981).
Pas moins de 70 domaines d'emploi possibles sont énumérés. La possibilité d'identifier dans des cellules et des tissus fixés et inclus dans la paraffine de façon classique, une grande diversité de marqueurs dont beaucoup snt spécifiques d'une maladie donnée et certains sont même étiologiques, fournit à l'anatomopa thologiste de nouveaux critères objectifs de diagnostic contrairement aux paramètres traditionnels purement morphologiques souvent subjectifs. No fewer than 70 potential employment areas are listed. The ability to identify in cells and tissues fixed and included in paraffin in a conventional manner, a wide variety of markers, many of which are specific to a given disease and some are even etiological, provides the anatomist thologist with new criteria. diagnostic objectives contrary to traditional purely morphological parameters often subjective.
Actuellement, la peroxydase est l'enzyme la plus couramment employée en immunocytochimie [Am. J. Clin. Pathol. 71 483-488, 19791. Bien que d'une part cette enyme présente des avantages, tels qu'une stabilité notable, la possibilité d'utiliser un substrat insoluble très bien défini et de former des chaumes consti- tuées de couches multiples d'anticorps comportant uniquement des liaisons de type immunologique (c'est-à-dire le système PAP, peroxy- dase-antiperoxydase) on a rencontré certaines difficultés lors de l'emploi de ces procédés regroupés sous le nom de "procédés immunoperoxydasiques". Currently, peroxidase is the most commonly used enzyme in immunocytochemistry [Am. J. Clin. Pathol. 71 483-488, 19791. Although on the one hand this enyme has advantages, such as noticeable stability, the possibility of using a very well defined insoluble substrate and of forming stubbles consisting of multiple layers of Antibodies with only immunological binding (ie, PAP, peroxidase-antiperoxidase system) have encountered certain difficulties in employing these methods grouped together as "immunoperoxidase methods".
Des peroxydases et des pseudo-peroxydases endogènes sont présentes dans certains tissus et elles peuvent produire un résultat faussement positif ; le substrat chromogène le plus couram- ment utilisé qui est le tétrachlorure de diamino-3,3',4,4' benzidine (DAB) a une activité carcinogène notable [registry of toxic effeeja of Chemical Substances - Ed. NIOSH - U.S Dept, of Health and Human
Services - Cincinnati - 1980] et il est de plus en plus difficile de trouver un composé ayant un degré élevé de pureté sur le marché tJ, Histochem. n 28, pages 191-192 < 1980)). Endogenous peroxidases and pseudo-peroxidases are present in some tissues and can produce a false positive result; the most widely used chromogenic substrate, 3,3'-diamino-4,4'-benzidine tetrachloride (DAB), has a significant carcinogenic activity [Registry of Toxic Effects of Chemical Substances-Ed. NIOSH-US Dept. of Health and Human
Services - Cincinnati - 1980] and it is increasingly difficult to find a compound with a high degree of purity on the tJ market, Histochem. No. 28, pp. 191-192 (1980)).
La solution utilisée pour la mise en évidence de la peroxydase est instable et ne doit Strie préparée que quelques minutes avant l'emploi tSternberger L.A. : Immunocytochemistry 2e édition - John Wiley and Sons - New York, 1979). The solution used for the detection of peroxidase is unstable and should be prepared only a few minutes before using tSternberger L.A .: Immunocytochemistry 2nd Edition - John Wiley and Sons - New York, 1979).
De plus le substrat chromogène de la peroxydase présente une couleur brun foncé sur un fond brun clair ce qui pose parfois des problèmes importants d'évaluation de la préparation et peut conduire à une fausse positivité. In addition, the chromogenic substrate of the peroxidase has a dark brown color on a light brown background which sometimes raises important problems of evaluation of the preparation and may lead to false positivity.
D'autres substrats des peroxydases ou d'autres enzymes, tels que par exemple la glBcose-oxydase et la phosphatase alcaline, ont été proposés mais des résultats comparables à ceux donnés par le système peroxydase + DAB n'ont pas encore été obtenus à ce jour, en particulier du fait que beaucoup des procédés conduisènt à la formation-de composés chromogènes solubles dans les solvants organiques utilisés pour la déshydratation et l'éclaircissement des préparations ou sont moins sensibles pour révéler les antigènes tissulaires. La demanderesse a découvert que l'emploi de ss-D-galac- tosidase comme marqueur permet de supprimer les inconvénients associés aux techniques cytochimiques immuno-enzymatiques connues, en particulier le procédé cytochimique à l'immunoperoxydase. Other substrates for peroxidases or other enzymes, such as for example glcose oxidase and alkaline phosphatase, have been proposed but results comparable to those given by the peroxidase + DAB system have not yet been obtained for this purpose. especially because many of the processes result in the formation of soluble chromogenic compounds in organic solvents used for dehydration and lightening of preparations or are less sensitive to reveal tissue antigens. The Applicant has discovered that the use of ss-D-galactosidase as a marker makes it possible to eliminate the disadvantages associated with known cytochemical immuno-enzymatic techniques, in particular the cytochemical process with immunoperoxidase.
L'invention concerne un procédé cytochimique immunoenzymatique pour l'identification d'antigènes dans les tissus en particulier dans les tissus humains, caractérisé en ce qu'on utilise comne marqueur l'enzyme (3-D-galactosidase. Selon l'invention, on identifie les antigenes dans les tissus par formation d'un produit insoluble et coloré obtenu par l'action de la ss-D-galactosidase sur un substrat chromogène spécifique. Plus précisément l'invention fournit un procédé pour l'identification d'antigènes dans les tissus qui comprend la liaison de l'enzyme ss-D-galactosidase à l'antigène à identifier par l'intermédiaire d'un agent de liaison spécifique quelconque et la mise en évidence de l'activité ss-D-galactosidasique par réaction avec un substrat spécifique capable de former un produit insoluble et coloré sous l'effet de la ss-D-galactosidase. The invention relates to an immunoenzymatic cytochemical method for the identification of antigens in tissues, in particular in human tissues, characterized in that the enzyme (3-D-galactosidase, according to the invention, is used. identifies the antigens in the tissues by forming an insoluble and colored product obtained by the action of ss-D-galactosidase on a specific chromogenic substrate More specifically, the invention provides a method for the identification of antigens in the which comprises binding of the enzyme ss-D-galactosidase to the antigen to be identified via any specific binding agent and demonstrating ss-D-galactosidase activity by reaction with a specific substrate capable of forming an insoluble and colored product under the effect of ss-D-galactosidase.
L'enzyme ss-D-galactosidase utilisé dans le procédé de l'invention peut être une ss-D-galactosidase quelconque d'origine microbienne bien qu'elle soit de préférence la ss-D-galactosidase d'Escherichia coli. The ss-D-galactosidase enzyme used in the process of the invention may be any ss-D-galactosidase of microbial origin, although it is preferably Escherichia coli ss-D-galactosidase.
Selon l'invention la ss-D-galactosidase peut etre liée à l'antigène à identifier par l'intermédiaire d'un type quelconque d'agent de liaison spécifique. En particulier, par exemple, on peut utiliser l'une quelconque des techniques de marquage ou de pontage précédemment décrites pour la peroxydase dans les procédés immunoperoxydasiques pour lier la p-D-galactosidase à l'antigène à révéler. According to the invention the ss-D-galactosidase can be bound to the antigen to be identified via any type of specific binding agent. In particular, for example, any of the previously described peroxidase labeling or bridging techniques can be used in immunoperoxidase methods to bind β-D-galactosidase to the antigen to be revealed.
Selon les techniques préférées, on fait réagir ledit antigène avec un premier anticorps qui est spécifique de l'antigène lui-meme et qui à son tour est lié à la ss-D-galactosi- dase soit directement soit par l'intermédiaire d'un système de conjugaison quelconque capable de fournir un conjugué de la ss-D- galactosidase. Un conjugué de p-D-galactosidase approprié peut en particulier être par exemple un conjugué enzyme anti-anticorps du type décrit par exemple dans FEBS lett. 95, 311 (1978) ou dans Am. According to preferred techniques, said antigen is reacted with a first antibody which is specific for the antigen itself and which in turn is bound to ss-D-galactosidase either directly or via a any conjugation system capable of providing a conjugate of ss-D-galactosidase. A suitable p-D-galactosidase conjugate may in particular be, for example, an anti-antibody enzyme conjugate of the type described for example in FEBS Lett. 95, 311 (1978) or in Am.
J. Clin. Pathol. 71, 483 (1979), ou un conjugué enzyme-système biotine-avidine selon l'une quelconque de ces configurations possibles; par exemple du type indiqué dans J. Histochem. Cytochem. vol. 27, n 0 8, 1131 (1979). De préférence on effectue successivement le stade de réaction de l'antigène à identifier avec le premier anticorps spécifique de l'antigène lui-meme et le ou les stades suivants conduisant à établir un pont entre ledit anticorps spécifique et la ss-D-galactosidase.J. Clin. Pathol. 71, 483 (1979), or an enzyme-biotin-avidin conjugate according to any of these possible configurations; for example of the type indicated in J. Histochem. Cytochem. flight. 27, No. 8, 1131 (1979). Preferably, the reaction stage of the antigen to be identified is carried out successively with the first antibody specific for the antigen itself and the following step or steps leading to a bridge between said specific antibody and ss-D-galactosidase.
Pour mettre en évidence l'activité P-D-galactosi dasique, selon le procédé de l'invention, on peut utiliser un substrat chromogène quelconque qui est spécifique de l'enzyme P-D-galactosi- dase et qui en plus est capable de fournir sous l'action de la ss-D- galactosidase un produit réactionnel coloré, insoluble et stable. To demonstrate the PD-galactosi dasic activity, according to the process of the invention, it is possible to use any chromogenic substrate which is specific for the PD-galactosidase enzyme and which, in addition, is capable of providing under the action of ss-D-galactosidase a colored, insoluble and stable reaction product.
Le produit qui dérive dudit substrat chromogène sous l'effet de la ss-D-galactosidase , en plus de son caractere coloré et stable, doit Titre insoluble soit dans les solvants aqueux soit dans les solvants organiques couramment utilisés pour le traitement des tissus en histologie et de préférence il est à la fois insoluble dans les solvants aqueux et les solvants organiques. The product which derives from said chromogenic substrate under the effect of ss-D-galactosidase, in addition to its colored and stable character, must be insoluble either in aqueous solvents or in the organic solvents commonly used for the treatment of tissues in histology and preferably it is both insoluble in aqueous solvents and organic solvents.
De préférence le substrat chromogène spécifique de la ss-D-galactosidase est soluble dans les mêmes solvants. Preferably, the chromogenic substrate specific for ss-D-galactosidase is soluble in the same solvents.
Ce substrat chromogène spécifique de la p-D-galac- toidase peut etre un dérivé quelconque de type ss-D-galactosidase qui, dès qu'il est décomposé par l'enzyme, est capable de former un produit réactionnel coloré insoluble et stable comme précédemment indiqué. Des exemples de substrats chromogènes particulièrement utiles dans le procédé de l'invention sont par exemple certains dérivés de type indolyl- et naphtyl-ss-D-galactoside. This chromogenic substrate specific for pD-galactosidase may be any derivative of the ss-D-galactosidase type which, as soon as it is decomposed by the enzyme, is capable of forming an insoluble and stable colored reaction product as previously indicated. . Examples of chromogenic substrates which are particularly useful in the process of the invention are, for example, certain derivatives of the indolyl- and naphthyl-ss-D-galactoside type.
Les substrats que l'on préfère particulièrement- sont les dérivés de type indolyl-P-D-galactoside et parmi eux on préfère particulièrement le bromo-5 chloro-4 indolyl-3 ss-D-galac- toside. Parmi les dérivés de type naphtyl-ss-D-galactoside, on pré- frère le bromo-6 naphtyl-2 P-D-galactoside. Particularly preferred substrates are indolyl-β-D-galactoside derivatives, and of these, 5-bromo-4-chloroindol-3-s-D-galactoside is particularly preferred. Among the naphthyl-ss-D-galactoside derivatives, 6-bromo-2-naphthyl-β-D-galactoside is prepared.
Pour mettre en évidence l'activité ss-D-galactosi- dasique, il peut parfois etre nécessaire de faire réagir le substrat chromogène en présence d'un ou plusieurs réactifs additionnais qui peuvent par exemple itre des agents de couplage, des agents d'oxy- dation ou des agents de transfert d'é-lectrons. In order to demonstrate the ss-D-galactosidase activity, it may sometimes be necessary to react the chromogenic substrate in the presence of one or more additional reagents which may for example be coupling agents, oxyoxides or - cation or electron transfer agents.
Ainsi par exemple, lorsqu'on utilise comme substrat chromogène un dérivé de type naphtyl-ss-D-galactoside, La présence d'un agent approprié de couplage azoïque est nécessaire pour mettre en évidence l'activité enzymatique et un agent de couplage azoïque peut également etre éventuellement présent dans le réactif révélateur lorsqu'on emploie un chromogène de type indolyl-ss-D-galactoside. Thus, for example, when a naphthyl-ss-D-galactoside derivative is used as the chromogenic substrate, the presence of an appropriate azo coupling agent is necessary to demonstrate the enzymatic activity and an azo coupling agent can be used. may also be present in the developing reagent when an indolyl-ss-D-galactoside chromogen is employed.
Des agents de couplage azoïque appropriés peuvent par exemple titre la p-rosaniline hexazotée, le Fast Blue VB, BB et RK, le Fast Carnet GBC et similaires, la p-rosaniline hexazotée étant particulièrement préférée. Suitable azo coupling agents may, for example, hexazotinated p-rosaniline, Fast Blue VB, BB and RK, Fast Carnet GBC and the like, with hexazotized p-rosaniline being particularly preferred.
De plus, pour accélérer la réaction de révélation à catalyse enzymatique, en particulier lorsqu'on utilise un substrat de type indolyl-B-D-galactoside, un agent oxydant ou un agent de transfert d'électrons peut également être présent dans le milieu réactionnel. Les agents oxydants ou de transfert d'électrons peuvent titre, sous réserve qu'ils soient appropriés, l'un quelconque des agents oxydants et agents de transfert d'électrons connus en chimie minérale et organique, les agents minéraux étant particulièrement préférés. In addition, to accelerate the enzyme catalyzed revelation reaction, particularly when using an indolyl-B-D-galactoside substrate, an oxidizing agent or an electron transfer agent may also be present in the reaction medium. The oxidizing or electron-transfer agents may, provided that they are suitable, any of the known oxidizing agents and electron transfer agents in mineral and organic chemistry, the inorganic agents being particularly preferred.
Des exemples d'agents oxydants ou d'agents de transfert d'électrons préférés sont en particulier le méthosulfate de phénazine, les sels de tétrazolium ou l'un quelconque des couples ioniques redox appropriés. Examples of preferred oxidizing agents or electron transfer agents are, in particular, phenazine methosulfate, tetrazolium salts or any of the appropriate redox ion pairs.
Un sel de tétrazolium approprié peut par exemple être le chlorure de p-nitro Bleu de tétrazolium ou le chlorure de tétranitro Bleu de tétrazolium. For example, a suitable tetrazolium salt may be tetrazolium p-nitro chloride or tetrazolium tetranitro chloride.
Un couple ionique redox approprié peut par exemple être choisi parmi les couples ioniques Fe2+/Fe3+, Ce2+/C34+, I-VO43-,
I-/VO3-, I-/WO2-4, I-/B4O72-, I-/Mo42-, I-/Mo7O24, 6- et similaires.A suitable redox ion pair may for example be chosen from Fe2 + / Fe3 +, Ce2 + / C34 +, I-VO43- ionic pairs,
I- / VO3-, I- / WO2-4, I- / B4O72-, I- / Mo42-, I- / Mo7O24, 6- and the like.
Les couples de type Fe2+/Fe3+ en particulier, peuvent etre apportés par les cyanures complexes ou les sulfates correspondants; les cyanures complexes sont de préférence les ferrocyaZ nures/ferricyanures alcalins, en particulier le ferrocyanure/ferri cyanure de potassium. Couples of Fe2 + / Fe3 + type in particular can be provided by the complex cyanides or the corresponding sulphates; the complex cyanides are preferably alkali metal ferrocyanides / ferricyanides, in particular potassium ferrocyanide / ferrocyanide.
Les couples Ce2+/ce4+ sont de préférence apportés par les sulfates respectifs. The Ce2 + / ce4 + couples are preferably provided by the respective sulphates.
Les couples ioniques sont apportés par les sels respectifs, de préférence les sels de métaux alcalins ou alcalino- terreux. The ionic pairs are provided by the respective salts, preferably the alkali or alkaline earth metal salts.
Selon le procédé de l'invention, on peut préparer les échantillons de tissus selon I'une quelconque des techniques connues par exemple les techniques de congélation, fixation et inclusion couramment employées en histochimie. According to the method of the invention, the tissue samples can be prepared according to any of the known techniques, for example the freezing, fixation and inclusion techniques commonly employed in histochemistry.
Par exemple, on examine très facilement selon le procédé de l'invention des tissus fixés par la formaline et inclus dans la paraffine. For example, formalin-fixed and paraffin-embedded tissues are very easily examined according to the method of the invention.
L'évaluation des échantillons peut être effectuée evec un microscope optique ordinaire quelconque grossissant 20 à 800 fois. The evaluation of the samples may be performed with any ordinary optical microscope magnifying 20 to 800 times.
L'emploi de l'enzyme S-D-galactosidase et d'un substrat chromogène spécifique approprié permet comme précédemment indiqué de supprimer les inconvénients rencontrés lorsqu'on emploie par exemple la peroxydase. The use of the enzyme S-D-galactosidase and a suitable specific chromogenic substrate makes it possible, as previously indicated, to eliminate the disadvantages encountered when, for example, peroxidase is used.
Par exemple, en particulier, les problèmes provoqués par la présence dans les échantillons de tissu de peroxydases et de pseudo-peroxydases endogènes qui, comme précédemment indiqué, limitent fortement les méthodes immunohistochimiques peroxydasiques, sont évités dans le procédé de l'invention car l'enzyme ss-D-galactosidase est généralement absente dans les tissus humains et qu'en tout cas la gamme des pH d'activité de la ss-D-galactosidase humaine est totalement différente de la gamme des pH d'activité de la p-D-galactosi- dase microbienne utilisée dans le procédé de l'invention : la gamme d'activité de la ss-D-galactosidase humaine est d'environ 5,5-6 tandis que par exemple la gamme des pH d'activité de la ss-D-galactosidase d'Escherichia coli est d'environ 7,0-7,5. For example, in particular, the problems caused by the presence in the tissue samples of endogenous peroxidase and pseudo-peroxidase which, as previously indicated, strongly limit the peroxidase immunohistochemical methods, are avoided in the process of the invention because the ss-D-galactosidase enzyme is generally absent in human tissues and in any case the pH range of activity of human ss-D-galactosidase is totally different from the pH range of activity of pD-galactosi microbial dase used in the process of the invention: the range of activity of human ss-D-galactosidase is approximately 5.5-6 while for example the pH range of activity of ss-D Escherichia coli galactosidase is about 7.0-7.5.
De plus, la ss-D-galactosidase est inactivée en moins d'une minute à environ 550C (The Enzymes, 1960, 2e édition,- pages 409430 vol. 4 Ed : P.D. BOYER, H. LAm)Y > K. MYRBACH, Academic Press
New York) qui est une température normalement atteinte lors des opérations classiques d'inclusion. Par suite de l'absence d'interférence par les p-D-galactosidases endogènes, les problèmes de coloration du fond qui se posent avec les peroxydases habituellement utilisées du fait de l'activité caractère peroxydasique des tissus ne se posent pas avec la p-D-galactosidase. In addition, ss-D-galactosidase is inactivated in less than one minute at about 550C (The Enzymes, 1960, 2nd Edition, - pages 409430, vol 4 Ed: PD BOYER, H. LAm) Y> K. MYRBACH, Academic Press
New York) which is a temperature normally reached during conventional inclusion operations. Due to the absence of interference by the endogenous β-galactosidases, the problems of background staining with the peroxidases usually used due to the tissue peroxidase activity do not occur with pD-galactosidase.
La ss-d-galactosidase microbienne ne provoque pas de coloration du fond dans les tissus des mammifères et réagit avec le substrat chromogène disponible pour former des images morphologiques très contrastées et faciles à identifier. Les colorations obtenues sont bien mieux définies et discer.nables que celles géné raiement obtenues avec les techniques peroxydasiques également du fait que la plupart des substrats chromogènes de la j3-D-galactosi dase utilisés permettent d'avoir un fond presque totalement blanc. The microbial ss-d-galactosidase does not cause background staining in mammalian tissues and reacts with the available chromogenic substrate to form highly contrasting and easily identifiable morphological images. The colorations obtained are much better defined and discernable than those generally obtained with peroxidase techniques also because most of the chromogenic substrates of the β-D-galactosidase used make it possible to have an almost completely white background.
Par conséquent, l'observation et l'interprétation des sites d'immunoréactivité spécifique sont fortement facilitées.Therefore, the observation and interpretation of specific immunoreactivity sites are greatly facilitated.
Le procédé utilisant la ss-D-galactosidase de l'invention apporte une sensibilité accrue et est particulièrement utile pour l'examen des tissus atteints de lésions hémorragiques ou inflammatoires. The method using the ss-D-galactosidase of the invention provides increased sensitivity and is particularly useful for the examination of tissues with haemorrhagic or inflammatory lesions.
De plus les réactifs utilisés pour les réactions histologiques p-D-galactosidasiques, en particulier par exemple les chromogènes de type indolyl-ss-D-galactoside que l'on préfère tout particulièrement employer, ne sont pas connus comme cancérigènes contrairement au substrat à fort contraste qu'est la diaminobenzidine que l'on emploie principalement dans les. colorations peroxydasiques. Moreover, the reagents used for the pD-galactosidetic histological reactions, in particular for example the indolyl-ss-D-galactoside type chromogens which are most particularly preferred, are not known as carcinogens in contrast to the high-contrast substrate which is the diaminobenzidine that is used mainly in. peroxidase stains.
De plus., les réactifs utilisés pour la mise en pratique du procédé de l'invention sont stables et produisent des lames qui sont également stables de façon permanente et qu'on peut examiner avec un microscope optique ordinaire simple.
Graciez aux avantages précédemment exposés, le procédé immunocytochimique à la -D-galactosidase de l'invention apporte un degré très élevé de précision et de sensibilité au moins comparable à celui des techniques peroxydasiques tout en étant simulta- nément dépourvu des inconvénients caractéristiques de ces dernières techniques.In addition, the reagents used to practice the method of the invention are stable and produce slides that are also permanently stable and can be examined with a simple ordinary optical microscope.
In view of the above-mentioned advantages, the immunocytochemical process with the -D-galactosidase of the invention provides a very high degree of precision and sensitivity at least comparable to that of peroxidase techniques while simultaneously being free of the characteristic disadvantages of the latter. techniques.
Par suite de la grande sensibilité, le procédé de l'invention permet d'obtenir également des résultats optimaux dans la localisation des antigènes dans des matibres fixées et incluses de façon courante dont l'antigénicité résiduelle n'est quine fraction de celle observée dans un tissu congelé. Due to the high sensitivity, the method of the invention also makes it possible to obtain optimal results in the localization of the antigens in commonly fixed and included materials whose residual antigenicity is only a fraction of that observed in a particular case. frozen tissue.
Bien qu'avec le procédé de l'invention un prétraitement des échantillons de tissu soit généralement inutile, néanmoins pour accroître encore la sensibilité de la technique, un pré traite- ment, par exemple selon Heydermann (J. Clin. Pathol. 32, 971-978 (1979)) peut parfois etre utile pour éliminer de légères interférences possibles dues aux peroxydases endogènes et/ou au fer tissaulaire. Although with the method of the invention pretreatment of the tissue samples is generally unnecessary, however, to further enhance the sensitivity of the technique, pretreatment, for example according to Heydermann (J. Clin Pathol 32, 971 No. 978 (1979)) may sometimes be useful in eliminating slight possible interference due to endogenous peroxidases and / or tissue iron.
Le procédé de l'invention permet également d'identifier une grande diversité de produits cellulaires et en particulier une gamme étendue de marqueurs dont beaucoup sont spécifique de maladies données et certains sont meme éthiologiques, ces produits cellulaires et marqueurs pouvant par exemple etre ceux précédemment indiqués dans la présente description. The method of the invention also makes it possible to identify a large variety of cellular products and in particular a wide range of markers, many of which are specific to given diseases and some are even ethiological, these cellular products and markers being for example those indicated above. in the present description.
L'invention fournit également des réactifs pour la réalisation du procédé immunohistochimique utilisant la ss-D-ga- lactosidase décrit ci-dessus. The invention also provides reagents for carrying out the immunohistochemical method using the ss-D-galactosidase described above.
Un réactif peut etre soit 1) un réactif spécifique comprenant comme composants essentiels,
a) un anticorps spécifique de l'antigène à identifier,
b) de la I3-D-galactosidase ou un conjugué de ss-D-galactosidase et c) un substrat chromogène spécifique de la p-D-galactosi-
dase et capable de former un produit insoluble et coloré sous
l'effet de la ss-D-galactosidase; soit 2) un réactif comprenant comme composants essentiels,
a') un conjugué ss-D-galactosidase anti-anticorps et et b') un substrat chromogène spécifique de la p-D-galactosidase et
capable de former un produit insoluble et coloré sous l'effet
de la P-D-galactosidase. A reagent can be either 1) a specific reagent comprising as essential components,
a) an antibody specific for the antigen to be identified,
b) β-D-galactosidase or ss-D-galactosidase conjugate; and c) a chromogenic substrate specific for β-galactosidase.
dase and capable of forming an insoluble and colored product under
the effect of ss-D-galactosidase; or 2) a reagent comprising as essential components,
a ') an anti-antibody ss-D-galactosidase conjugate and and b') a chromogenic substrate specific for pD-galactosidase and
able to form an insoluble and colored product under the effect
PD-galactosidase.
Bien entendu un réactif du type indiqué en 1) cidessus est utile uniquement pour la détermination de l'antigène particulier qui peut etre reconnu par l'anticorps constitutif a) spécifique de l'angigène lui-même. Of course, a reagent of the type indicated in 1) above is only useful for the determination of the particular antigen that can be recognized by the constitutive antibody a) specific for the angiogen itself.
Au contraire un réactif du type indiqué an 2) cidessus convient à la détermination d'un antigène quelconque
En fait l'anti-anticorps conjugné avec la $ss-Dgalactosidase dans le composant a') est tel qu'il est capable de reconnattre sans distinction tout anticorps dirigé contre tout antigene à identifier sous réserve que ce dernier anticorps soit produit dans une espèce contre laquelle l'anti-anticorps do composant a') est "anti". rar conséquent l'anti-anticorps du compo- sant a') est "spécifique d'espèce", c'est-à-dire spécifique de l'espèce dans laquelle l'anticorps contre les antigènes à identi- fier est produit. Ainsi par exemple un anti-anticorps qui est antilapin (ctest-a-dire qui est "anti" espèce lapin) est capable de reconnattre tout anticorps produit chez le lapin; un anti-anticorps qui est anti-chèvre ou anti-mouton est capable de reconnaître tout anticorps produit respectivement chez la chèvre ou chez le mouton; et de façon analogue, un anti-anticorps qui est anti-sollris est capable de reconnaître tout anticorps produit chez la souris.In contrast, a reagent of the type indicated in 2) above is suitable for the determination of any antigen
In fact, the anti-antibody conjugated with the ss-D-galactosidase in component a ') is such that it is capable of recognizing without distinction any antibody directed against any antigen to be identified, provided that the latter antibody is produced in one species. against which the anti-antibody of component a ') is "anti". Therefore, the anti-antibody of component (a) is "species specific", that is specific for the species in which the antibody against the antigens to be identified is produced. Thus, for example, an anti-antibody which is anti-rabbit (ie, which is "anti" rabbit species) is capable of recognizing any antibody produced in rabbits; an anti-antibody which is anti-goat or anti-sheep is capable of recognizing any antibody produced respectively in the goat or in the sheep; and similarly, an anti-antibody that is anti-stressed is able to recognize any antibody produced in mice.
Par conséquent, l'invention fournit divers réactifs du type 2) ci-dessus qui different les uns des autres en ce qui concerne la "spécificité d'espèce" tels que par exemple un réactif spécifique du lapin contenant contenant un conjugué de B-D-galacto- sidase-antisérum anti-lapin comme composant a'); un réactif spécifique de la chèvre (ou spécifique du mouton) contenant un conjugué ss-D-galactosidase-antisérum anti-chèvre (ou anti-mouton) comme composant a'); et un réactif spécifique de la souris contenant un conjugué ss-D-ga- Iacto6idase-antisérum anti-souris comme composant a'). Therefore, the invention provides various reagents of type 2) above which differ from each other with respect to "species specificity" such as for example a rabbit-specific reagent containing a BD-galacto conjugate. sidase anti-rabbit antiserum as component a '); a goat-specific (or sheep-specific) reagent containing a ss-D-galactosidase-anti-goat anti-serum (or sheep anti-serum) conjugate as component a '); and a mouse specific reagent containing a ss-D-galactoididase-anti-mouse antiserum conjugate as component a ').
Chacun desdits types de réactifs 2) peut entre utilisé pour l'identification d'un antigène quelconque sous réserve qu'on emploie un anticorps dirigé contre l'antigène qui est produit dans l'espèce appropriée : cette espèce étant par exemple le lapin pour un réactif spécifique du lapin, la chèvre pour un réactif spécifique de la chèvre, le mouton pour un réactif spécifique du mouton et la souris pour un réactif spécifique de la souris. Each of these types of reagents 2) can be used for the identification of any antigen provided that an antibody directed against the antigen which is produced in the appropriate species is used: this species being, for example, the rabbit for a particular antigen. rabbit-specific reagent, goat for goat specific reagent, sheep for sheep specific reagent and mouse for mouse specific reagent.
Il est cependant évident que dans tous les cas un anticorps spécifique de l'antigène à mettre en évidence, meme s'il n'est pas incorporé dans un réactif du type 2) ci-dessus) doit toujours etre utilisé pour permettre la détection de l'antigène. However, it is obvious that in all cases an antibody specific for the antigen to be detected, even if it is not incorporated in a reagent of type 2) above, must always be used to allow the detection of antigen.
Si on le désire, un anticorps spécifique de l'antigène à identifier ou une série d'anticorps spécifiques d'une série d'antigènes à identifier peuvent etre fournis séparément avec le réactif 2). If desired, an antibody specific for the antigen to be identified or a series of antibodies specific for a series of antigens to be identified may be provided separately with reagent 2).
Chacun desdits réactifs 1) et 2) peut de plus comprendre de nombreux composants complémentaires tels que par exemple un agent de couplage azotique, un agent oxydant ou un agent de transfert d'électrons et un tampon. Each of said reagents 1) and 2) may further comprise a number of complementary components such as, for example, a nitro coupling agent, an oxidizing agent or an electron transfer agent and a buffer.
Les divers composants de chaque réactif peuvent etre conditionnés, ensemble ou séparément, de façon appropriée quelconque permettant l'emploi facile et rapide du réactif. The various components of each reagent may be packaged, together or separately, in any suitable manner allowing easy and rapid use of the reagent.
Dans chaque réactif, les caractéristiques des divers composants sont celles précédemment indiquées dans la description du procédé de l'invention, les composants préférés étant également ceux indiqués comme préférés dans la description cidessus. In each reagent, the characteristics of the various components are those previously indicated in the description of the process of the invention, the preferred components being also those indicated as preferred in the description above.
Ainsi par exemple, selon une forme préférée, le réactif indiqué en 1) ci-dessus comprend comme composants essentiels a) un anticorps spécifique de l'antigène à identifier, b) un conjugué de ss-D-galactosidase et c) un indolyl-P-D-galac- toside comme substrat chromogène. Thus, for example, according to a preferred form, the reagent indicated in 1) above comprises as essential components a) an antibody specific for the antigen to be identified, b) a conjugate of ss-D-galactosidase and c) an indolyl- PD-Galactose as a chromogenic substrate.
Selon une forme préférée, le réactif indiqué en 2) ci-dessus comprend comme composantsessentiels a') un conjugué p-D- galactosidase-anti-anticorps spécifique d'espèce et b') un indolyl-ss-D-galactosidase comme substrat chromogène. In a preferred form, the reagent indicated in 2) above comprises as essential components a) a p-D-galactosidase-anti-specific antibody of species and b ') an indolyl-ss-D-galactosidase as chromogenic substrate.
Dans la forme préférée du réactif 1) ci-dessus le conjugué spécifique de ss-D-galactosidase est de préférence un conjugué ss-D-galactosidase-anti-anticorps ou un conjugué p-D-ga- lactosidase-systeme biotine-avidine. In the preferred form of reagent 1) above, the specific ss-D-galactosidase conjugate is preferably a ss-D-galactosidase-anti-antibody conjugate or a p-D-galactosidase-biotin-avidin conjugate.
Dans la forme préférée ci-dessus du réactif 2), le conjugue ss-D-galactosidase-anti-anticorps spécifique d'espèce est de préférence un conjugué ss-D-galactosidase-anti-anticorps de lapin ou un conjugué B-D-galactosidase-anti-anticorps de chèvre ou de mouton ou un conjugué B-D-galactosidase-anti-anticorps de souris. In the above preferred form of reagent 2), the ss-D-galactosidase-anti-species-specific antibody conjugate is preferably a ss-D-galactosidase-anti-rabbit antibody conjugate or a BD-galactosidase-conjugate. anti-goat or sheep antibody or a BD-galactosidase-anti-mouse antibody conjugate.
Dans les deux formes préférées indiquées ci-dessus des réactifs 1) et 2), le substrat chromogène de type indolyl--D- galactoside est de préférence le bromo-5 chloro-4 indolyl-3 p-D-ga- lactoside. In the two preferred forms indicated above, reagents 1) and 2), the indolyl-D-galactoside chromogenic substrate is preferably 5-bromo-4-chloroindolyl-3β-D-galactoside.
L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. The invention is illustrated by the following nonlimiting examples.
Exemple 1
On identifie l'insuline humaine dans le pancréas humain selon les techniques suivantes. Example 1
Human insulin is identified in the human pancreas by the following techniques.
On utilise du tissu pancréatique humain fixé dans de la formaline tamponnée avec 10 % de phosphate et inclus de façon courante dans la paraffine. On place les coupes de tissu inclus dans la paraffine dans du tampon salé phosphaté à pH 7,2 (PBS) et on traite avec du peroxyde d'hydrogène à 7,5% pendant 5 minutes et finalement avec du borohydrure de sodium à 0,02 % pendant 2 minutes. (J. Clin. Pathol. 32, 971-978 (1979)]. Après plusieurs lavages dans le PBS, on incube les coupes pendant une nuit à 4 C avec un antisérum de lapin anti-h-insuline dilué au 1/1 000 avec du PBS. Human pancreatic tissue fixed in 10% phosphate buffered formalin is used and routinely included in paraffin. The paraffin-embedded tissue sections were placed in phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS) and treated with 7.5% hydrogen peroxide for 5 minutes and finally with 0% sodium borohydride, 02% for 2 minutes. (J. Clin Pathol 32: 971-978 (1979)] After several washes in PBS, the sections are incubated overnight at 4 ° C. with rabbit antiserum anti-h-insulin diluted 1/1000. with PBS.
Après lavage dans le PBS, on ajoute aux coupes des anticorps constitués d'immunoglobulines anti-lapin provenant d'anes et conjugués à la p-D-galactosidase d'Escherichia coli selon la technique décrite dans FEBS Letters 95, 311 (1978), dilués au 1/30 dans du PBS contenant 1 % de sérum de porc normal. Apres 30 minu tes à la température ordinaire, on lave les tissus dans du PBS et on révèle l'activité enzymatique en utilisant une solution obtenue par dissolution dans du PBS à pH 7,2 de
Br-5 C1-4 indolyl-3 ss-D-galactoside 0,44 g/l chlorure de magnésium 1,1 mmol/l ferricyanure de potassium 3,0 mmol/l ferrocyanure de potassium 3,0 mmol/l
On effectue le traitement avec cette solution révélatrice par incubation pendant une heure à 370C.Après lavage et contre-coloration avec du rouge neutre, on déshydrate les coupes et on les monte dans de l'Eukitt, On examine les tissus avec un microscope optique tLeitz Orthoplan) avec un grossissement de 200.After washing in PBS, antibodies consisting of anti-rabbit immunoglobulins derived from anes and conjugated to Escherichia coli β-galactosidase are added to the sections according to the technique described in FEBS Letters 95, 311 (1978), diluted in 1/30 in PBS containing 1% normal pig serum. After 30 minutes at room temperature, the tissues are washed in PBS and the enzymatic activity is revealed using a solution obtained by dissolving in PBS at pH 7.2.
Br-5 C1-4 indolyl-3 ss-D-galactoside 0.44 g / l magnesium chloride 1.1 mmol / l potassium ferricyanide 3.0 mmol / l potassium ferrocyanide 3.0 mmol / l
The treatment is carried out with this revealing solution by incubation for one hour at 370 ° C. After washing and counterstaining with neutral red, the sections are dehydrated and mounted in Eukitt. The tissues are examined with a light microscope. Orthoplan) with a magnification of 200.
La réaction positive apparat en bleu intense. La coloration positive apparatt très bien car le fond est incolore et les noyaux sont rouges. On compare les résultats avec ceux obtenus dans le meme tissu traité avec le même antisérum anti-insuline puis traité selon la technique peroxydasique PAP (Sternberger - J. Histochem.The positive reaction appears in intense blue. The positive staining appears very well because the bottom is colorless and the nuclei are red. The results are compared with those obtained in the same tissue treated with the same anti-insulin antiserum and then treated according to the PAP peroxidase technique (Sternberger-J. Histochem.
Cytochem. 18 315 (1970)).~Le résultat obtenu selon la technique peroxydasique est une réaction positive de couleur brun intense.Cytochem. 18, 315 (1970)). The result obtained according to the peroxidase technique is a positive reaction of intense brown color.
La coloration positive est cependant moins évidente et moins nette que celle obtenue avec la méthode à la p-galactosidase par suite de la coloration légèrement brune du fond. Donc la méthode à la ss-D-galactosidase permet d'obtenir une bien meilleure coloration que celle obtenue selon la technique peroxydasique PAP.Positive staining, however, is less obvious and less distinct than that obtained with the β-galactosidase method as a result of the slightly brown coloration of the background. Thus, the ss-D-galactosidase method makes it possible to obtain a much better coloration than that obtained according to the PAP peroxidase technique.
Exemple 2
En utilisant le mode opératoire de l'exemple 1 mais en remplaçant l'antisérum anti-insuline par des antisérums appropriés, tous produits chez le lapin, on identifie également les antigènes suivants caséine humaine dans le tissu mammaire humain; antigène HB de surface (HBsAG) dans le foie humain; lysozyme humaine dans l'intestin grêle humain; myoglobine humaine dans le muscle squelettique humain; et glucagon humain dans le pancréas humain.Example 2
Using the procedure of Example 1 but replacing the anti-insulin antiserum with appropriate antisera, all produced in rabbits, the following human casein antigens are also identified in human breast tissue; HB surface antigen (HBsAG) in the human liver; human lysozyme in the human small intestine; human myoglobin in human skeletal muscle; and human glucagon in the human pancreas.
On obtient des résultats analogues à ceux obtenus dans l'exemple 1. Results similar to those obtained in Example 1 are obtained.
Exemple 3
On identifie la myoglobine humaine dans le muscle squelettique selon la technique suivante. On utilise du tissu musculaire squelettique humain fixé dans de la formaline tamponnée avec 10% de phosphate et inclus de façon courante dans la paraffine. On place les coupes de tissu inclus dans la paraffine dans du PBS t on incube pendant une nuit à 40C avec de l'antisérum de lapin anti-myoglobine (Bebringwerke) dilué au 1/500 avec du PBS. Après lavage dans le PBS, on suit le mode opératoire de l'exemple 1 et on obtient le même type de résultat.Example 3
Human myoglobin is identified in skeletal muscle by the following technique. Human skeletal muscle tissue bound in formalin buffered with 10% phosphate and commonly included in paraffin is used. The paraffin-embedded tissue sections were placed in PBS and incubated overnight at 40C with anti-myoglobin rabbit antiserum (Bebringwerke) diluted 1/500 with PBS. After washing in PBS, the procedure of Example 1 is followed and the same type of result is obtained.
Selon une technique analogue et en utilisant les antisérums appropriés, on identifie les antigènes suivants insuline humaine dans le pancréas humain; caséine humaine dans le tissu mammaire humain antigène HB de surface (HBsAg) dans le foie llumain; lysozyme humaine dans l'intestin grele humain; glucagon humain dans le pancréas humain. In an analogous technique and using the appropriate antisera, the following antigens are identified as human insulin in the human pancreas; human casein in human breast tissue HB surface antigen (HBsAg) in human liver; human lysozyme in human small intestine; human glucagon in the human pancreas.
Exemple 4
On identifie comme salit l'antigène HB de surface (HBsAg) dans le foie humain. On utilise du tissu hépatique humain fixé et inclus comme décrit dans l'exemple 1. On reprend le mode opératoire de l'exemple 1 en remplaçant l'antisérum anti-insuline par de l'antisérum de lapin anti-HBsAg (Behringwerke) dilue au 1/500 avec du PBS, De plus, on utilise une solution révélatrice dans le PBS semblable à celle employée dans l'exemple 1 mais ne contenant pas les réactifs ferrocyanure de potassium et ferricyanure de potassium. On obtient le méme type de résultat que dans l'exemple 1 selon ce mode opératoire.En opérant de façon analogue mais en utilisant les antisérums appropriés, on identifie les antigènes suivants insuline humaine dans le pancréas humain; caséine humaine dans le tissu mammaire humain; lysozyme humaine dans l'intestin grêle humain; myoglobine humaine dans le muscle squelettique humain; et glucagon humain dans le pancréas humain.Example 4
Surface HBsAg (HBsAg) in the human liver is identified as dirty. Human liver tissue fixed and included was used as described in Example 1. The procedure of Example 1 was repeated, replacing the anti-insulin antiserum with anti-HBsAg rabbit antiserum (Behringwerke) diluted with 1/500 with PBS. In addition, a PBS developer solution similar to that used in Example 1 but not containing the potassium ferrocyanide and potassium ferricyanide reagents is used. The same type of result is obtained as in Example 1 according to this procedure. By operating in a similar manner but using the appropriate antisera, the following antigens are identified as human insulin in the human pancreas; human casein in human breast tissue; human lysozyme in the human small intestine; human myoglobin in human skeletal muscle; and human glucagon in the human pancreas.
Exemple 5
On identi-fie la lysozyme humaine dans l'intestin grele humain selon le mode opératoire suivant. On utilise du tissu d'intestin grele humain fixé et inclus comme décrit dans l'exemple 1.Example 5
Human lysozyme is identified in the human small intestine according to the following procedure. Human small bowel tissue attached and included was used as described in Example 1.
On reprend le mode opératoire de l'exemple l en remplaçant l'antisérum anti-insuline par de l'antisérum de lapin anti-lysozyme (DAKO) dilué au 1/500 avec du PBS et en utilisant comme solution révélatrice une solution dans le PBS à pH 7,2 contenant
Br-5 C1-4 indolyl-3 p-D-galactoside 0,44 g/l chlorure de magnésium 1.1 mmol/l iodure de potassium 17 tungstate de sodium 0 > 0015 %
On obtient des résultats analogues à ceux obtenus dans l'exemple 1.The procedure of Example 1 is repeated, replacing the anti-insulin antiserum with anti-lysozyme rabbit antiserum (DAKO) diluted 1/500 with PBS and using as solution solution a solution in PBS. at pH 7.2 containing
Br-5 C1-4 indolyl-3β-galactoside 0.44 g / l magnesium chloride 1.1 mmol / l potassium iodide 17 sodium tungstate 0> 0015%
Results similar to those obtained in Example 1 are obtained.
En opérant de façon analogue mais en utilisant les antisérums appropriés, on identifie les antigènes suivants insuline humaine dans le pancréas humain; caséine humaine dans le tissu mammaire humain; antigène HB de surface (HBsAg) dans le foie humain; myoglobine humaine dans le muscle squelettique humain; glucagon humain dans le pancréas humain. By operating analogously but using the appropriate antisera, the following antigens are identified as human insulin in the human pancreas; human casein in human breast tissue; HB surface antigen (HBsAg) in the human liver; human myoglobin in human skeletal muscle; human glucagon in the human pancreas.
Exemple 6
On identifie la caséine humaine dans le tissu mammaire humain de la façon suivante. On utilise du tissu mammaire humain congelé. On prépare des coupes avec un cryostat et on les traite comme dans l'exemple 1 en remplaçant l'antisérum antiinsuline par de l'antisérum de lapin anti-caséine dilué au 1/1 000 dans du PBS. On obtient des résultats analogues à ceux de l'exemple 1.Example 6
Human casein is identified in human breast tissue as follows. Frozen human breast tissue is used. Cryostat sections were prepared and treated as in Example 1 by replacing the antiinsulin antiserum with anti-casein rabbit antiserum diluted 1/1000 in PBS. Results similar to those of Example 1 are obtained.
En opérant de façon analogue sur des tissus congelés en utilisant les antisérums appropriés, on identifie les antigènes suivants insuline humaine dans le pancréas humain; antigène HB de surface (HBsAg) dans le foie humain; lysozyme humaine dans l'intestin grêle humain; myoglobine humaine dans le muscle squelettique humain; et glucagon humain dans le pancréas humain. By operating analogously on frozen tissues using the appropriate antisera, the following antigens are identified as human insulin in the human pancreas; HB surface antigen (HBsAg) in the human liver; human lysozyme in the human small intestine; human myoglobin in human skeletal muscle; and human glucagon in the human pancreas.
Exemple 7
On identifie comme suit l'antigène HB de surface (HBsAg) dans le tissu hépatique humain.Example 7
HB surface antigen (HBsAg) is identified in human liver tissue as follows.
On utilise du tissu hépatique humain fixé et inclus comme décrit dans l'exemple 1. Human liver tissue fixed and included is used as described in Example 1.
On place des coupes de tissu inclus dans la paraffine dans du PBS à pH 7,2. Paraffin-embedded tissue sections were placed in PBS at pH 7.2.
On lave les coupes avec du PBS pendant 15 minutes puis on incube à 370C pendant 2 heures avec de l'antisérum de lapin anti-HBsAg (solution à 1/500 dans le PBS). The sections are washed with PBS for 15 minutes and then incubated at 370C for 2 hours with anti-HBsAg rabbit antiserum (1/500 solution in PBS).
Après 15 minutes de lavage dans le PBS, on ajoute aux coupes une solution dans le PBS (50 pl) contenant des fragments Fc d'immunoglobulines anti-lapin provenant d'ânes (4,5 x 106 M) et conjugués à de la p-D-galactosidase d'Escherichia coli (1,5 x 10 selon le mode opératoire indiqué dans FEBS Letters 95, 311 (1978) et contenant 1 % de sérum normal d'âne Après 30 minutes à la température ordinaire, on lave les coupes avec du PBS pendant 15 minutes puis on applique une solution révélatrice obtenue par dissolution dans le PBS à pH 7,2 de
Br-5 Cl-4 indolyl-3 ss-D-galactoside 0,44 g/l chlorure de magnésium 0,9 mmol/l iodure de sodium 1% tungstate de sodium 0,0015 %
Après 30 minutes d'incubation à la température ordinaire et lavage avec du PBS, on contre-colore les noyaux avec du rouge neutre et on déshydrate les coupes que l'on monte dans 1 'Eukitt. After washing for 15 minutes in PBS, a solution in PBS (50 μl) containing anti-rabbit immunoglobulin Fc fragments from donkeys (4.5 × 10 6 M) and conjugated to pD was added to the sections. Escherichia coli galactosidase (1.5 x 10 according to the procedure indicated in FEBS Letters 95, 311 (1978) and containing 1% normal donkey serum. After 30 minutes at room temperature, the sections are washed with PBS for 15 minutes and then a developer solution obtained by dissolution in PBS at pH 7.2
Br-5 Cl-4 indolyl-3 ss-D-galactoside 0.44 g / l magnesium chloride 0.9 mmol / l sodium iodide 1% sodium tungstate 0.0015%
After 30 minutes of incubation at room temperature and washing with PBS, the nuclei are stained with neutral red and the sections are dried and mounted in Eukitt.
On examine les tissus avec un microscope optique (Leitz Orthoplanl avec un grossissement de 200. La réaction positive apparatt en bleu intense. La coloration positive est très nette car le fond n'est pas coloré et les noyaux sont rouges. On compare les résultats avec ceux obtenus dans le meme tissu traité avec le meme antisérum anti-HBsAg puis traité selon la technique peroxydasique PAP de Sternberger (voir la référence dans l'exemple 1). The tissues are examined with an optical microscope (Leitz Orthoplanl with a magnification of 200. The positive reaction appears in deep blue, the positive staining is very clear because the background is not colored and the nuclei are red. those obtained in the same tissue treated with the same anti-HBsAg antiserum and then treated according to Sternberger's peroxidase PAP technique (see reference in Example 1).
On observe des résultats analogues à ceux décrits dans l'exemple 1. Results similar to those described in Example 1 are observed.
On répète le mode opératoire de l'exemple 7 en utilisant une solution révélatrice contenant 0,0015 % de tetra- borate de sodium ou 0,0075 % de molybdate de sodium au lieu de 0,0015 % de tungstate de sodium. The procedure of Example 7 was repeated using a developer solution containing 0.0015% sodium tetraborate or 0.0075% sodium molybdate instead of 0.0015% sodium tungstate.
On observe également des résultats analogues à ceux décrits dans l'exemple 1. Results similar to those described in Example 1 are also observed.
Exemple 8
On prépare un réactif pour l'identification histochimique de l'antigène HB de surface (HBsAg) sur 50 coupes de tissu hépatique humain comprenant a) une solution d'antisérum de lapin anti-HBsAg au 1/500 dans du
PBS : 2,5 ml; b) une solution de conjugué de ss-D-galactosidase d'Escherichia coli
et de fragments Fc d'immunoglobulines anti-lapin au 1/100 dans
du PBS : 2,5 ml; et c) un composant lyophilise à dissoudre avant l'emploi dans l'eau
distillée pour obtenir 2,5 ml d'une solution aqueuse ayant la
composition suivante
Br-5 Cl-4 indolyl-3 ss-D-galactoside 0,44 g/l
chlorure de magnésium 0,9 mmol/l
iodure de sodium 1 X
tungstate de sodium - 0,0015 %
On utilise les composants a), b) et c) du réactif selon le mode opératoire décrit dans exemple 7.Example 8
A reagent for the histochemical identification of surface HBsAg (HBsAg) is prepared on 50 sections of human liver tissue comprising a) a 1/500 anti-HBsAg rabbit antiserum
PBS: 2.5 ml; b) an Escherichia coli ss-D-galactosidase conjugate solution
and Fc fragments of anti-rabbit immunoglobulin at 1/100 in
PBS: 2.5 ml; and c) a lyophilized component to dissolve before use in water
distilled to obtain 2.5 ml of an aqueous solution having the
next composition
Br-5 Cl-4 indolyl-3 s-D-galactoside 0.44 g / l
magnesium chloride 0.9 mmol / l
sodium iodide 1 X
sodium tungstate - 0.0015%
The components a), b) and c) of the reagent are used according to the procedure described in Example 7.
On prépare des réactifs analogues ayant la meme composition que ci-dessus mais avec un composant lyophilisé c) contenant 0,0015 X de tétraborate de sodium ou 0,0075 59 de molybdate de sodium au lieu de 0,0015 % de tungstate de sodium, les.concen- trations (%) du tétraborate de sodium et du molybdate de sodium correspondant également à 2,5 ml de la solution aqueuse. Analogous reagents having the same composition as above but with a lyophilized component c) containing 0.0015% sodium tetraborate or 0.0075% sodium molybdate instead of 0.0015% sodium tungstate are prepared. The concen- trations (%) of sodium tetraborate and sodium molybdate also correspond to 2.5 ml of the aqueous solution.
On utilise ces réactifs pour l'identification de l'antigène HBsAg dans le tissu hépatique humain selon le mode opératoire de l'exemple 7. These reagents are used for the identification of HBsAg antigen in human liver tissue according to the procedure of Example 7.
Exemple 9
On prépare un réactif spécifique du lapin pour la mise en évidence histochimique d'un type quelconque d'antigènes sur 50 coupes de tissu humain, comprenant a') une solution de conjugé de p-D-galactosidase d'Escherichia coli
et de fragments Fc d'immunoglobulines anti-lapin à 1/100 dans
du PBS : 2,5 ml
et b') un composant lyophilisé à dissoudre avant l'emploi dans de tteau
distillée pour fournir 2,5 ml d'une solution aqueuse ayant la
composition suivante
Br-5 Cl-4 indolyl-3 ss-D-galactoside 0,44 g/l
chlorure de magnésium 0,9 mmol/1
iodure de sodium 1%
tungstate de sodium 0,0015 %
On utilise les composants a') et b') du réactif dans des modes opératoires analogues à celui décrit dans les exemples 1 à 7 pour l'identification de l'insuline humaine dans le pancréas humain, la caséine humaine dans le tissu mammaire humain, l'antigène HB de surface (I;;BsAg) dans le foie humain, la lysozyme humaine dans l'intestin grole humain, la myoglobine humaine dans le muscle squelettique humain et le glucagon humain dans le pancréas humain, en employant dans tous les cas un anti-sérum produit chez le lapin, c'est-à-dire respectivement un antisérum anti-insuline produit chez le lapin,un un antisérum anti-casdine produit chez le lapin, un antisérum anti-HBsAg produit chez le lapin, un antisérum anti-lysozyme produit chez le lapin, un antisérum anti-myoglobine produit chez le lapin et un antisérum antiglucagon produit chez le lapin
On prépare des réactifs analogues spécifiques du lapin ayant la meme composition que ci-dessus mais avec un composé lyophilisé b') contenant 0,0015 Z de tétraborate de sodium ou 0,0075 % de molybdate de sodium au lieu de 0,0015 % de tungstate de sodium, les pourcentages des concentrations du tétraborate de sodium et du molybdate de sodium correspondant 9 2,5 ml de solution aqueuse. On utilise lesdits réactifs pour l'identification de tous les antigènes mentionnés ci-dessus dans cet exemple selon des modes opératoires analogues à ceux décrits dans les exemples 1 et 7.Example 9
A rabbit specific reagent is prepared for the histochemical detection of any type of antigen in 50 sections of human tissue, including a) Escherichia coli pD-galactosidase conjugate solution.
and Fc fragments of anti-rabbit immunoglobulin at 1/100 in
PBS: 2.5 ml
and b ') a lyophilized component to dissolve before use in a dish
distilled to provide 2.5 ml of an aqueous solution having the
next composition
Br-5 Cl-4 indolyl-3 s-D-galactoside 0.44 g / l
magnesium chloride 0.9 mmol / l
sodium iodide 1%
sodium tungstate 0.0015%
Components a ') and b') of the reagent are used in procedures analogous to those described in Examples 1 to 7 for the identification of human insulin in the human pancreas, human casein in human breast tissue, HB-surface antigen (I ;; BsAg) in the human liver, human lysozyme in the human gut, human myoglobin in human skeletal muscle and human glucagon in the human pancreas, using in all cases an anti-serum produced in rabbits, that is to say respectively an anti-insulin antiserum produced in rabbits, an anti-casdine antiserum produced in rabbits, an anti-HBsAg antiserum produced in rabbits, an antiserum anti-lysozyme produced in rabbits, anti-myoglobin antiserum produced in rabbits and anti-glucagon antiserum produced in rabbits
Similar rabbit-specific reagents having the same composition as above are prepared but with a lyophilized compound b ') containing 0.0015% sodium tetraborate or 0.0075% sodium molybdate instead of 0.0015% sodium hydroxide. sodium tungstate, the percentages of the concentrations of sodium tetraborate and corresponding sodium molybdate 9 2.5 ml of aqueous solution. These reagents are used for the identification of all the antigens mentioned above in this example according to procedures analogous to those described in Examples 1 and 7.
Exemple 10
On prépare un réactif spécifique de la chèvre pour l'identification histochimique d'un antigène sur 50 coupes de tissu humain, ayant la meme composition que le réactif décrit dans l'exem- ple 9 mais contenant un conjugué de ss-D-galactosidase et de fragments
Fc d'immunoglobulines anti-chèvre au lieu du conjugué de p-D-galacto- sidase et de fragments Fc d'immunoglobulines anti-lapin. On prépare des réactifs semblables mais contenant un conjugué de -D-galactosi- dase et de fragments Fc dtimmunoglobulines anti-lapin ou respectivement un conjugué de -D-galactosidase et de fragments Fc d'immunoglobulines anti-souris au lieu du conjugué de ss-D-galactosidase et de fragments Fc d'imunoglobulines anti-lapin.Example 10
A goat specific reagent is prepared for the histochemical identification of an antigen on 50 sections of human tissue, having the same composition as the reagent described in Example 9 but containing a conjugate of ss-D-galactosidase and fragments
Anti-goat immunoglobulin Fc instead of pD-galactosidase conjugate and anti-rabbit immunoglobulin Fc fragments. Similar reagents containing a conjugate of -D-galactosidase and anti-rabbit immunoglobulin Fc fragments or a -D-galactosidase conjugate and anti-mouse immunoglobulin Fc fragments are prepared instead of the ss-conjugated conjugate. D-galactosidase and Fc fragments of anti-rabbit immunoglobulins.
On emploie chaque réactif pour l'identification de la myoglobine humaine dans le muscle squelettique humain et de l'antigène HB de surface (HBsAg dans le tissu hépatique humain) selon des modes opératoires analogues à ceux décrits dans les exemples 1 et 7 mais en utilisant respectivement de l'antisérum anti-myoglobine et de l'antisérum anti-HBsAg produits respectivement chez la chevre ou le mouton ou chez la souris. Each reagent is used for the identification of human myoglobin in human skeletal muscle and HB surface antigen (HBsAg in human liver tissue) according to procedures analogous to those described in Examples 1 and 7 but using respectively anti-myoglobin antiserum and anti-HBsAg antiserum produced respectively in the goat or sheep or in the mouse.
Bien entendu diverses modifications peuvent cotre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. Naturally, various modifications can be made by the person skilled in the art to the devices or processes which have just been described solely by way of nonlimiting examples without departing from the scope of the invention.
Claims (16)
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| GB8201547 | 1982-01-20 |
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| FR2520121B1 FR2520121B1 (en) | 1985-08-23 |
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ID=10527737
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|---|---|---|---|
| FR8300851A Expired FR2520121B1 (en) | 1982-01-20 | 1983-01-20 | PROCESS AND REAGENTS FOR THE USE OF B-D-GALACTOSIDASE AS A MARKER IN IMMUNOCYTOCHEMISTRY |
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| GB2017105A (en) * | 1978-03-24 | 1979-10-03 | Weltman J K | Method of preparing enzyme conjugates their use and coupling agents for use in the method |
| GB2098730A (en) * | 1981-04-21 | 1982-11-24 | Welsh Nat School Med | Immunolocalisation |
-
1982
- 1982-12-21 IT IT24880/82A patent/IT1153912B/en active
-
1983
- 1983-01-13 DE DE19833300961 patent/DE3300961A1/en not_active Withdrawn
- 1983-01-20 FR FR8300851A patent/FR2520121B1/en not_active Expired
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2017105A (en) * | 1978-03-24 | 1979-10-03 | Weltman J K | Method of preparing enzyme conjugates their use and coupling agents for use in the method |
| GB2098730A (en) * | 1981-04-21 | 1982-11-24 | Welsh Nat School Med | Immunolocalisation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2520121B1 (en) | 1985-08-23 |
| DE3300961A1 (en) | 1983-07-28 |
| IT1153912B (en) | 1987-01-21 |
| IT8224880A0 (en) | 1982-12-21 |
| IT8224880A1 (en) | 1984-06-21 |
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