FR2467602A1 - Procede pour la purification d'interferon et interferon ainsi obtenu - Google Patents
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Abstract
Procédé pour la purification d'interféron et interféron ainsi obtenu Ce procédé comprend : a. La soumission d'une solution aqueuse d'interféron de fibroblastes humain à la chromatographie sur des perles de verre poreuses ; et b. La soumission de la solution d'interféron résultante à la chromatographie sur un chélate de zinc immobilisé. Utilisation de ce procédé pour la purification poussée de l'interféron.
Description
Procédé pour la purification d'interféron et
interféron ainsi obtenu.
L'interféron est une glycoprotéine produite par les cellules vivantes pour se défendre contre les infections virales. Sa structure chimique peut varier légèrement en
fonction du type de cellule qui est utilisée pour sa produc-
tion. Cet interféron a diverses activités biochimiques telles que des activités antivirales, antiprotozoaires, inhibitrices de la croissance des cellules et immunosuppressives et peut par conséquent être appliqué avec succès en médecine. En ce qui concerne une revue générale des connaissances actuelles sur l'interféron, on peut se référer au livre "Interferons and their actions" by W.E. Stewart II, CRC Press, Inc.,
Cleveland, Ohio.
Pour l'application médicale chez l'homme, l'interféron doit être préparé à partir de cellules humaines et les
procédés suivants pour cette préparation sont utilisés actu-
ellement: 1. Production par infection de leucocytes fraîchement recueillis provenant de donneurs de sang humains avec le virus Sendai. Ceci donne ce qu'on appelle "l'interféron de leucocytes" comme décrit par Cantell et collaborateurs, In Vitro, 3 35-38,
(1974).
2. Production sur des cellules de fibroblastes diploïdes humaines cultivées à l'aide de ce qu'on appelle "plan de
super-induction poly-I:C". L'interféron de fibroblastes résul-
tant diffère de l'interféron de leucocytes par plusieurs critères biologiques et physicochimiques voir A. Billiau et
coll., J. Gen. Virol., 19, 1-8, (1973)).
3. Production dans les lignes de cellules lymphoblas-
toides d'un inducteur d'interféron viral. L'interféron de lymphoblastes résultant ressemble fortement à l'interféron de leucocytes (voir Strander et coll., J. Clin. Microbiol.,
1, 116-117, (1975)).
La présente invention concerne l'interféron de fibro-
blastes humain, c'est-à-dire l'interféron produit par le
deuxième des procédés mentionnés ci-dessus, et plus spéci-
fiquement elle concerne un procédé pour la purification de
cet interféron.
La purification de l'interféron est nécessaire à la fois pour étudier les propriétés chimiques de l'interféron
et pour son application clinique puisque une solution d'inter-
féron brute peut contenir des protéines contaminantes qui ont un effet négatif sur les résultats de ces études et de cette application. Pour les deux buts envisagés, il faut d'assez grandes quantités d'interféron purifié. Bien qu'un grand nombre de techniques pour la purification partielle et quelques procédés pour la purification complète de l'interféron aient été décrits, tous comportent des défauts. Ces défauts sont en général soit l'obligation d'utiliser des absorbants ou des réactifs complexes, soit d'utiliser un procédé à nombreux stades, qui n'est pas applicable à une production à grande échelle, soit le fait que seulement une petite fraction de l'activité initiale
totale de l'interféron est récupérée sous forme purifiée.
Par conséquent, on a besoin d'avoir un procédé de purification d'interféron, et particulièrement un procédé de purification d'interféron de fibroblastes humain qui conduit à une grande récupération de l'activité sous forme purifiée, qui ne nécessite pas de réactifs complexes oï une complexité de stades, et qui est capable d'être utilisé sur une échelle
assez grande.
Comme résultat de leurs recherches intenses, les auteurs de la présente invention ont maintenant découvert qu'une récupération élevée de l'activité interféron sous la forme d'interféron complètement purifié peut être obtenu en traitant l'interféron de fibroblastes humain avec un procédé de purification simple en deux stades qui est une combinaison des deux premières méthodes connues. Ce procédé de purification en deux stades consiste (a) à soumettre une solution aqueuse d'interféron à la chromatographie sur perles de verre poreuses, et (b) à soumettre la solution aqueuse d'interféron résultante
à la chromatographie sur an chélate de zinc immobilisé.
Si, dans le premier stade, une solution d'interféron contenant des protéines contaminantes est mise en contact avec les perles de verre poreuses à pH neutre ou légèrement alcalin, l'interféron sera sélectivement adsorbé sur ces perles de verre et l'ensemble des protéines contaminantes restera dans la solution et pourra être éliminé par lavage. L'interféron adsorbé pourra être élué ensuite des perles de verre à un
pH acide.
Si ensuite, dans le second stade, la solution d'inter-
féron éluée est mise en contact avec un gel de chélate de zinc immobilisé à pH neutre ou légèrement alcalin, l'interféron
sera sélectivement adsorbé sur cechélate de zinc et les pro-
téines contaminantes qui pourraient être encore présentes
resteront en solution et pourront être éliminées par lavage.
L'interféron adsorbé peut ensuite être élué du chélate de zinc à pH acide et il en résultera un produit final extrêmement pur. En utilisant ce procédé de purification en deux stades, un haut degré de purification peut être atteint puisque le produit final possède une si grande pureté qu'il peut être considéré comme étant pratiquement complètement pur. En outre, une récupération importante de l'activité interféron initiale peut être obtenue. Cette récupération sera d'environ 50 à 70% dans le premier stade, et de 90 à 95% dans le second stade
donnant ainsi- une récupération totale d'environ 45 à 67%.
Un avantage spécial est dû au fait que le produit final du procédé de purification de la présente invention sera exempt de tout agent réactif pour la peau. Les produits obtenus avec les premier procédés de purification entraînent toujours des réactions de la peau après application clinique aux malades, mais il est apparu que le produit de la présente invention n'entraîne pas de telles réactions et ceci est extrêmement
important pour l'utilisation clinique.
Un autre avantage provient du fait que les réactifs sont facilement accessibles et peuvent être utilisés un grand nombre de fois successives puisque aussi bien les perles de verre que le chélate de zinc immobilisé peuvent être récupérés ou régénérés après usage. En outre, le procédé de la présente invention n'utilise que deux stades et tous ces faits donnent un procédé simple qui peut être utilisé sur une assez grande échelle. Donc la présente invention fournit un procédé pour la purification d'interféron qui consiste (a) à soumettre une solution aqueuse d'interféron de fibroblastes humain à la chromatographie sur perles de verre poreuses, et (b) à soumettre la solution d'interféron obtenue à la chromatographie
sur chélate de zinc immobilisé.
Il faut remarquer ici que les deux stades du procédé de la présente invention sont connus par eux-mêmes et ont été utilisés antérieurement pour la purification d'interféron de fibroblastes humain.Voir A. Billiau et coll., Antimicrobial Agents
and Chemotherapy, 16, 49-55 (1979) pour le premier stade,et V.G.
Edy et coll., J. Biol. Chem. 252, 5934-5935 (1977) pour le second stade. Au moment de ces publications, cependant, lesdits stades étaient utilisés complètement séparés et il n'y avait rien qui puisse faire penser qu'une purification pratiquement complète pouvait être réalisée en combinant ces stades dans un
procédé simple à deux stades.
En outre, plusieurs autres procédés étaient connus pour la purification d'interféron mais il était difficile de prévoir qu'une combinaison des deux stades susmentionnés conduirait au résultat désiré sans être obligé d'ajouter des stades supplémentaires.De plus, l'absence de toute réactivité avec la peau dans les produits-finis du procédé de la présente invention peut être considérée comme surprenante et inattendue parce que jusqu'ici tout interféron de fibroblastes purifié montrait encore dette réactivité de la peau par application clinique au malade (Voir A. Billiau et coll., Antimicrobial
Agents and Chemotherapy, 16, 56-63 (1979)).
En outre, il faut remarquer que la combinaison des deux stades dans un procédé à deux stades a conduit à une légère modification du premier; dans la mesure ou l'éluat des perles de verre est concerné, dans le premier article de Billiau
mentionné ci-dessus cet éluat est dialysé contre le poly-
éthylène-glycol dans un tampon acétate de sodium afin de le
préparer pour la lyophilisation et à l'usage clinique; tou-
tefois, dans la présente invention cet éluat sera dialysé contre
un tampon phosphate afin de le préparer pour la chromato-
graphie dans le stade de purification suivant comme on le décrit
plus loin dans la présente spécification.
On va maintenant décrire en détail le procédé de la présente invention. La solution de départ pour le procédé de purification de la présente invention peut être une quelconque solution aqueuse d'interféron de fibroblastes humain qui renferme des protéines contaminantes et qui a besoin d'être purifiée. Cette solution peut provenir d'un procédé de préparation classique de l'interféron et d'un quelconque stade de ce procédé. Il faut remarquer que le procédé n'est applicable qu'à l'interféron de fibroblastes humain et que d'autres types d'interféron
nécessiteront un procédé différent de purification.
Bien que la solution de départ puisse renfermer un quelconque milieu aqueux pour conserver l'interféron en solution, on obtient de bons résultats avec une solution d'interféron dans le milieu essentiel minimal de Eagle (voir Science 130, 432 (1959)). Un stabilisant peut être ajouté à ce milieu si on le désire, et le stabilisant préféré sous ce rapport est une fraction protéinique de plasma humain telle
qu'elle est fournie par les banques de sang.
La teneur initiale en protéines et l'activité inter-
féron de la solution de départ ne sont pas liées à des limites critiques. Cependant, la solution peut être d'abord diluée ou concentrée si on estime que la teneur en protéine est si élevée qu'il y a un risque de précipitation ou au contraire, si on pense qu'elle est si basse qu'elle rende le procédé non économique. Il faut noter ici que la quantité de protéines contaminantes peut dépasser celle de l'interféron et qu'elle peut être supérieure à 85% de la quantité totale des
substances dissoutes.
Le premier stade du procédé de la présente invention comprend la chromatographie sur perles de verre poreuses. Ces perles de verres poreuses sont vendues sous plusieurs marques déposées et sont fréquemment indiquées comme ayant "une taille contrôlée des pores", c'est-à-dire une taille de pores assez
uniforme rassemblée autour d'une valeur moyenne spécifique.
24d7602 p o Cette valeur moyenne peut être par exemple 350 ou 900 A bien qu'en général une valeur quelconquede 170 à 1700 A ou davantage puisse être utilisée (voir W. Haller, Nature, 206, 693-696
(1965) et H.G. Bock et coll., Science, 191, 380-383 (1976)).
Le diamètre des perles peut être moins régulier et peut être compris en général entre environ 50um et environ 500,pm. Ces perles peuvent être empilées dans des colonnes, mais il sera plus facile de les utiliser non empilées pour une opération
du type par charge.
Dans le premier stade du procédé, la solution de départ est mise en contact avec les perles de verres poreuses
en vue d'une adsorption sélective d'interféron sur les perles.
Ce contact peut être effectué avec le maximum d'économies en secouant la solution de départ avec une certaine quantité de perles de verre dans un récipient, mais le passage de la solution de départ sur une colonne remplie de perles de verre est également possible. Le contact conduit à une adsorption d'interféron sur les perles de verre à partir de la solution tandis que l'ensemble des protéines contaminantes présentes dans la solution de départ ne se fixe pas aux perles et reste
en solution.
Le pH pendant le contact est celui de la solution de départ. Ce pH est normalement d'environ 7,4 si le milieu essentiel minimal de Eagle est utilisé bien qu'en général le système travaille bien pour un pH de départ compris entre 7 et 8,2. A un pH supérieur à 8,2, une partie de l'interféron est rendue inactive et pour un pH inférieur à 7, une grande partie de l'interféron appliqué n'est pas adsorbée sur les
perles de verre.
La durée du contact n'est pas liée à des limites critiques bien qu'il faut qu'elle soit naturellement suffisante pour que presque tout l'interféron soit adsorbé sur les perles;
cette durée peut varier normalement entre 0,5 et 26 heures.
Après le contact, la solution restante peut être éliminée, par exemple par décantation ou par vidange. Ensuite, les perles de verre peuvent être lavées avec un liquide de lavage classique tel qu'une solution saline de pH sensiblement neutre tamponnée au phosphate pour éliminer d'éventuelles protéines contaminantes non liées. La concentration molaire de ce liquide doit être assez faible afin d'empêcher l'élution de l'interféron adsorbé. De bons résultats de lavage ont été
obtenus avec une solution saline tamponnée au phosphate conte-
nant des sels de calcium et de magnésium (voir R. Dulbecco et coll., J. Exp. Med., 99, 167-182 (1954)) mais d'autres liquides peuvent être utilisés avec le même effet. En outre, des lavages peuvent être effectuésavec une solution tampon
spécial à pH plus faible, telle que le tampon 0,01 M glycine-
HCl de pH 3,5 pour éliminer toutes les protéines contaminantes qui ont été liées sur la colonne par mégarde. Le pH de ce liquide de lavage ne doit pas être inférieur à environ 3, et sa concentration ionique ne doit pas être supérieure à environ
0,05 M puisque des valeurs de pH plus faibles et des concen-
trations ioniques plus élevées provoquent l'élution d'une
grande quantité d'interféron.
Après le stade du lavage, l'interféron adsorbé peut petre élué des perles de verre à l'aide d'une solution tampon aqueuse acide. Cette solution doit en général avoir un pH compris entre 1,5 et 2,7 et de préférence-un pH de 2. On ne peut pas obtenir une bonne élution à des valeurs de pH supérieures à 2,7, et l'instabilité de l'interféron élué se produit à des pH inférieurs à 1,5. La concentration ionique (molarité) de la solution d'élution est sensiblement moins critique et peut varier en pratique entre 0,05 M et 0,5 M. Des valeurs inférieures à 0,05 M tendent à produire un effet tampon insuffisant, entraînant ainsi un défaut de réglage du pH, et des valeurs supérieures à 0,5 M tendent à entraîner
la cristallisation des constituants.
Tout agent,ou des combinaisons d'agentstampons solubles dans l'eau appropriés, peuvent être utilisés à des fins d'élution, pourvu que les conditions susmentionnées de pH et de concentration ionique soient satisfaites. Donc, la
solution d'élution peut contenir une combinaison d'un amino-
acide et d'un acide minéral, ou une combinaison d'unsel minéral et d'un acide minéral, ou tout autre combinaison ou bien une seule substance. De bons résultats ont été obtenus avec une solution tampon de o,l Mole KClHCl de pH 2, et encore de meilleurs résultats avec une solution tampon de 0,3 mole glycine-HCl de pH 2,0. La solution d'élution peut contenir un stabilisant approprié, par exemple se trouvant sous la forme d'une fraction protéinique de plasma humain telle que mentionnée ci-dessus. A l'aide de cet éluant acide, l'interféron adsorbé
peut être élué presque en totalité des perles de verre.
Après l'élution, les perles de verre peuvent être lavées et régénérées, par exemple en les rinçant avec des acides forts pendant plusieurs jours ou en les chauffant sur un bain de vapeur avec l'acide nitrique à 10%, dans les deux cas en les lavant ensuite plusieurs fois avec de l'eau jusqu'à neutralité. Ensuite, elles peuvent être ré-utilisées pour la chromatographie d'interféron de la façon décrite
ci-dessus.
Le résultat du traitement d'élution est une solution aqueuse d'interféron qui comprend la plus grande partie de l'activité interféron de la solution de départ et qui, en outre, ne renferme qu'une petite proportion des protéines contaminantes. En pratique, la récupération de l'activité interféron dans ce premier stade du procédé de la présente invention va de 50 à 70% et l'activité spécifique du produit par mg de protéine est sensiblement augmentée par rapport
à la matière de départ.
L'éluat ainsi obtenu dans le premier stade possède un pH acide et comprend de la glycine ou une autre substance qui le rend moins propre à être utilisé immédiatement dans le second stade. Par conséquent, il faut neutraliser cet éluat
et le débarrasser de la glycine avant le traitement ultérieur.
Ceci peut être réalisé en dialysant l'éluat contre une
solution saline de pH sensiblement neutre tamponnée au phosphate.
De bons résultats ont été obtenus dans la présente invention en utilisant une solution tampon contenant 0,02 mole de
phosphates de sodium (phosphate disodique et phosphate mono-
sodique) et 1 mole de chlorure de sodium et ayant un pH de 7,4,
mais d'autres solutions tampons peuvent convenir également.
La teneur élevée en chlorure de sodium dans cette solution tampon est transmise à la solution d'interféron et un effet
favorable pendant le deuxième stade.
Le second stade du procédé de la présente invention
comprend la chromatograohie sur chélate de zinc immobilisé.
La solution de départ pour ce second stade est une solution aqueuse d'interféron de fibroblastes humain telle que provenant du premier stade mentionné ci-dessus après neutralisation et élimination de la glycine. Cette solution
peut être diluée ou concentrée si on le désire mais norma-
lement ces traitements ne seront pas nécessaires.
Un type quelconque de chélate de zinc immobilisé sur un support approprié peut être utilisé pour le second stade du procédé de la présente invention mais la matière préférée est un chélate de zinc d'iminodiacétate immobilisé sur le Sépharose (voir J. Porath et coll., Nature, 258, 598-599 (1975) et V.G. Edy et coll., J. Biol. Chem. 252, 5934-5935 (1977) qui
dans la présente mémoire sont incorporés à titre de référence).
Cet adsorbant peut être préparé en couplant d'abord 1' imino-
diacétate disodique sur le sépharose à activation époxy (c'est-à-dire l'agarose ayant une chaîne latérale avec un groupe terminal époxy) puis en introduisant les ions zinc à chélater par le groupe iminodiacétique. Si la matière couplée est empilée déjà dans une colonne, le zinc peut être introduit facilement en faisant passer une solution de chlorure de zinc à travers la colonne et le produit est immédiatement prêt à être utilisé. Dans ce produit, les ions zinc sont liés par
de fortes liaisons et sont capables de lier d'une façon réver-
sible les molécules d'interféron, ce dernier procédé dépendant
du pH.
Plus spécifiquement, les ions zinc chélatés et immo-
bilisés sont capables de lier l'interféron de fibroblastes humain d'une façon tout à fait sélective à pH neutre ou légèrement alcalin et avec une concentration ionique faible en additifs minéraux. Cependant, en diminuant le pH et en
augmentant la concentration ionique, l'interféron est élué.
Une bonne élution peut être obtenue en utilisant un gradient de pH à une concentration ionique constamment élevée, (voir
l'article d'Edy susmentionné).
Dans le second stade du procédé de la présente invention, la solution de départ est mise en contact avec le chélate de zinc immobilisé en vue d'absorber sélectivement l'interféron. Ce contact peut être effectué en faisant passer la solution de départ sur une colonne remplie d'adsorbant ou en agitant cette solution avec une certaine quantité d'ad- sorbant dans un récipient. L'utilisation d'une colonne est préférée dans ce cas puisque l'adsorbant peut facilement être préparé sous la forme indiquée ci-dessus. Le contact conduit à une adsorption de l'interféron à partir de la solution sur le chélate de zinc tandis que les protéines contaminantes, dans la mesure o elles sont encore présentes, ne seront pas
liées et resteront en solution.
Le pH est normalement de 7,4 pendant le contact si la solution de départ est dialysée contre la solution saline tamponnée au phosphate susmentionnée bien qu'en général le système travaille avec un pH de départ de 7 à 8,2. A un pH supérieur à 8,2 une certaine activité est perdue et pour un pH inférieur à 7, une grande quantité d'interféron n'est
pas adsorbée et passe directement à travers la colonne.
La durée de contact n'estras liée à des limites critiques bien qu'elle doit être naturellement suffisante pour que l'interféron soit adsorbé presque en totalité. Cette
durée peut varier entre 0,5 et 26 heures.
Après contact, la solution restante est éliminée et la colonne peut être lavée avec un agent de lavage classique tel qu'une solution tamponnée au phosphate ayant un pH de 7,4 pour enlever de la colonne les protéines résiduelles non adsorbées. De plus, des lavages peuvent être effectués avec une solution tampon à pH plus faible telle qu'une solution 0,1 mole acétate de sodium/acide acétique ayant un pH de 5,9 pour enlever d'éventuelles protéines qui ontêté liées par mégarde sur la colonne. Le pH de cette solution tampon ne doit pas être inférieur à environ 5,9 pour empêcher l'élution de l'interféron. Tous ces fluides de lavage peuvent contenir 1 mole de chlorure de sodium, exactement comme le fluide dialyseur mentionné ci-dessus afin d'empêcher une fixation J
non spécifique des protéines sur l'adsorbant.
Après lavage, l'interféron peut être élué de l'adsor-
bant chélate de zinc à l'aide d'une solution aqueuse acide.
il Cette solution peut avoir en général un pH compris entre 4 et 6 et pour de meilleurs résultats un gradient de pH de 6 descendant à 4 peut être utilisé. On n'obtiendra pas de bonne élution avec des valeurs de pH supérieures à 6,0 et l'interféron élué deviendra instable aux valeurs du
pH inférieures à 4.
La concentration ionique (molarité) de l'agent d'élution n'est pas très critique et peut varier en pratique entre 0,05 mole et 0,5 mole. Des valeurs inférieures tendent à donner un effet tampon insuffisant entraînant ainsi un défaut de réglage du pH, et des valeurs supérieures tendent à augmenter les difficultés par suite de la cristallisation des constituants. On obtient de bons résultats avec une solution d'acétate de sodium 0,1 mole réglée à pH 4,2 avec de l'acide acétique glacial bien que d'autres solutions comme
celles mentionnées dansl'article de Edy ne soient pas exclues.
Si cet agent d'élution ayant un pH de 4,2 est utilisé immé-
diatement après le liquide de lavage de pH 5,9, un gradient de pH sera automatiquement réalisé. En variante, des solutions d'acétate de sodium 0, 1 mole à pH graduellement décroissant pourront être utilisées successivement. Toutes ces solutions d'élution devront contenir 1 mole de chlorure de sodium afin
de maintenir l'équilibre de NaCl dans la colonne.
A l'aide d'un tel agent d'élution, pratiquement tout l'interféron adsorbé peut être élué de l'adsorbant chélate de zinc. Après l'élution, l'adsorbant peut être lavé et régénéré, par exemple en rinçant la colonne avec une solution tamponnée d'éthylènediaminetétracétate (EDTA), en éliminant par lavage l'EDTA avec une solution saline tamponnée au phosphate ayant un pH de 7,4, en traitant la colonne avec une solution acide de chlorure de zinc jusqu'à ce que le chélate soit saturé de zinc et en éliminant l'excès de chlorure de zinc par lavage avec une solution tampon d'acétate de sodium et en équilibrant la colonne à des valeurs de pH sensiblement neutres. Le résultat du traitement d'élution est une solution aqueuse d'interféron qui comprend encore la totalité ou une grande partie de l'activité interféron de la solution de départ et o la teneur en protéines -contaminantes a té
réduite à une valeur très petite. La récupération de l'acti-
vité interféron dans le second stade peut aller de 90 à 95%, donc la récupération totale du procédé complet à deux stades
atteint environ 45 à 67%.
L'activité spécifique du produit peut s'élever jusqu'à 109 unités/mg de protéine,activité qui est supérieure à celle de touteautre valeur obtenue jusqu'à présent. La pureté de la solution finale d'interféron peut être déterminée par plusieurs procédés. Un de ces procédés est un dosage normal de protéine, par exemple avec la fluorescamine. Un autre procédé comprend le marquage de l'interféron purifié avec un marqueur radio-actif tel que ' 125I et en soumettant l'interféron à une électrophorèse dansle gld'acrylamide suivie
d'une autoradiographie aux rayons X. Ceci indique si l'inter-
féron purifié est un produit simple ou multiple. De plus, on peut essayer de voir si le produit final entraîne une réaction
de la peau en l'appliquant sur le corps humain.
Tous ces procédés donnent une très grande pureté quand ils- sont appliqués aux produits finis du procédé de purification de la présente invention. Ainsi, il est montré par exemple dans les exemples-de-la présente invention que les impuretés restantes ne pourront pas être mesurées par des dosages de protéines et que les produits finis paraissent être des produits homogènes au moyen de l'électrophorèse. De plus, les produits ne donnent pas du tout de fièvre ni aucune
réaction avec la peau quand on les applique à l'homme.
En conclusion, le procédé de purification à deux stades de la présente invention conduit à une récupération importante de l'activité interféron initiale sous une forme très pure. Le produit est approprié pour la thérapie clinique parce qu'il n'entraîne pas de réactivité de la peau. Une production à grande échelle est rendue possible maintenant puisque les
réactifs sont très accessibles et facilement régénérables.
Ceci signifie que de grandes quantités d'interféron de fibroblastes humain peuvent être fournies à l'aVenir, au fur et à mesure que l'exigent la caractérisation chimique et
l'utilisation clinique.
La présente invention est illustrée par les exemples
descriptifs et non limitatifs ci-après.
Exemple I
La matière de départ est une solution aqueuse d'inter-
féron provenant de cellules du type fibroblaste d'embryon
humain, stimulées avec l'acide poly-inosinique-polycytidylique.
L'interféron est dans un milieu essentiel minimal de Eagle à pH 7,4 contenant 1% en volume d'une fraction protéique de plasma humain fourni par la Croix Rouge Belge. L'activité interféron et le taux de protéine de cette solution, dans une expérience à petite échelle, sont établis sur le tableau A. Cette solution de départ est mélangée avec des perles
de verre poreuses (électro-Nucléonic Inc) ayant une dimen-
sion des pores d'environ 350 A et une grosseur des perles de 75 à 120pm, dans un rapport d'environ 30 ml de solution pour environ 1 ml de perles de verre. Le mélange est agité doucement pendant 2 heures afin demaintenirles perles en suspension et de provoquer une adsorption sélective de l'interféron sur les perles à partir de la solution.Ensuite on laisse déposer les perles et le liquide surnageant est éliminé par décantation. Les perles sont lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate contenant 8 ml NaCl, 1,15 g de Na2HP04 0,2 g KH2PO4, 0,2 g KCI, 0,12 g MgSO4 et 0,10 g CaCl2 par litre (voir Dulbecco et coll., J. Exp. Med., 99, 167-182 (1954)) à raison de 20 ml de solution par ml de perles. Ensuite, elles sont lavées une fois avec une solution tampon 0,01 mole glycine-ECl ayant un pH de 3,5 dans les mêmes proportions. Les perles sont éluées en les agitant
deux fois 5 minutes avec une solution tampon 0,3 mole glycine-
HC1 de pH 2, et en les agitant 2 fois 30 minutes avec la même solution tampon, chaque fois à raison de 2 ml de solution tampon par ml de perles. Cette solution tampon contient 0,09
mg/ml de fraction protéique de plasma humain comme stabilisant.
Le taux de protéines et l'activité interféron des éluats combinés sont indiqués sur le tableau A et on voit que la récupération de l'activité interféron dans cette expérience
est de 68%.
Après l'élution les perles de verre sont régénérées en les rinçant avec des acides forts pendant plusieurs jours puis en les lavant avec de l'eau distillée jusqu'à neutralité. Avant d'être ré-utilisées elles sont stérilisées par chauffage en autoclave. Une partie des éluats combinés est dialysée contre 4 x 500 ml d'une solution saline tamponnée au phosphate contenant 0,02 mole de phosphate de sodium et 1 mole de chlorure de sodium et ayant un pH 7,4. Cette solution tampon est changée toutes les 6 à 8 heures. Il en résulte que le pH devient égal à environ 7, 4 et que la concentration de la glycine est ramenée de 0,3 mole à environ 0,0001 mole, tandis qu'une quantité de chlorure de sodium égale à 1 mole est introduite. La solution résultante d'interféron est passée avec un débit de 20 ml/h à travers une colonne de chélate de zinc immobilisé ayant 0,9 x 8 cm. Le chélate de zinc immobilisé a été préparé en couplant l'iminodiacétate sur le "Sépharose à activation époxy 6 B" et en ajoutant une solution de chlorure de zinc comme décrit par Edy et Coll. dans J. Biol. Chem. 252,
pages 5934-5935 (1977).
Après l'application de l'interféron, la colonne est lavée avec un volume defl -ml (égal à une "couche") d'une solution saline tamponnée au phosphate (la même que celle utilisée pour la dialyse) pour éliminer les protéines non adsorbées. Ensuite, elle est lavée avec 3 volumes d'une "couche" d'un tampon acétate de sodiumào,l mole ayant un pH de 5,9
contenant 1 mole de chlorure de sodium pour éliminer d'éventuel-
les protéines adsorbées non désirées.
Ensuite, la colonne est éluée avec 2 volumes d'une "couche" d'une solution tampon d'acétate de sodium à 0,1 mole contenant 1 mole de chlorure de sodium et montrant un gradient de pH de 6 à 4. Les fractions comprises dans une gamme de pH de 5,2 à 4,5 sont recueillies car elles contiennent l'ensemble
de l'activité interféron.
Le taux de protéioeet l'activité interféron de l'éluat résultant sont montrés dans le tableau A. On voit que la récupération de l'activité interféron dans ce second stade est
de 94% donnant ainsi une récupération totale de 64%.
L'éluat montre une activité interféron spécifique d'environ 1,1 x 109 unités/mg,ce qui signifie que le produit possède une grande pureté. La colonne de chélate de zinc est régénérée en la lavant avec 5 volumes d'une "couche" de 0,05 mole d'EDTA dans une solution saline tamponnée au phosphate ayant un pH de 7,4. L'EDTA restant est éliminé par lavage avec 5 volumes d'une "couche" d'une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4). Ensuite, le zinc est introduit de nouveau par lavage avec une solution de C,1 mole d'acétate de scditm (pH 4) contenant 1 mole de
NaCl et 1 mmole de ZnCl2 jusqu'à saturation. Le point de satu-
ration est déterminé en mélangeant une goutte de l'éluat provenant de la colonne avec une petite quantité d'une solution de carbonate de sodium et en observant la formation d'un précipité. Ensuite, l'excès de zinc est éliminé par lavage avec un tampon d'acétate de sodium (pH 4) et la colonne est équilibrée à pH 7,4 en vue de l'application d'un nouvel échantillon par lavage avec 5 volumes d'une couche de solution
saline tamponnée au phosphate.
La pureté du produit final est déterminée par dosage des protéines par électrophorèse dans un gel d'acrylamide et en l'appliquant sur la peau humaine. Dans le dosage des protéines (procédé à la fluorescamine) la quantité de protéines est presque non mesurable (la valeur limite dans ce procédé est d'environ 2 pg par millilitre). L'électrophorèse dans un gel d'acrylamide après marquage avec un marqueur radio-actif puis autoradiographie aux rayons X révèle l'existence d'une seule bande radioactive qui correspond à un poids moléculaire d'environ 22 000. On ne remarque aucune réaction avec la peau par application à l'homme. Ceci conduit à la conclusion que le produit de cet exemple possède une grande pureté et peut être
considéré comme étant entièrement pur.
cm O %40 I-Y o o' Matière Volume Protéine totale Activité totale Activité spécifiqIxe 4 ml mg unités unités/mg _r4._l, Solution de départ Perles de verre: non adsorbé + lavages Eluats Solution dialysée Chélate de zinc: non adsorbé + lerslavages 2èmeslavages Eluats 67 92 81 2)04 2 03
-. 0)00.2
4 x 106 " ' 217 x 2)7 x 2;55 îo6 o X 106
.________ _ I ___ _._.__._ _
x 104 1>5 x 106 1)5 x 106 l.1 x 109
Exemple II
On utilise la même matière de départ que dans l'exemple 1 pour deux expériences à grande échelle. Le procédé est similaire à celui de l'exemple I, sauf que les éluats provenant des perles de verre sont dialysés contre 4 x 4 litres d'une solution saline tamponnée au phosphate et qu'une colonne de chélate de zinc de 1,5 x 16 cm est utilisée. Cette colonne de chélate de zinc (volume d'une "couche" égale 30 ml) est lavée d'abord avec un volume d'une "couche" de solution saline tamponnée au phosphate puis avec 5 volumes d'une "couche" de tampon à l'acétate de sodium. L'élution est effectuée avec 2 volumes d'une "couche" de solution tampon à 0,1 mole d'acétate de sodium ayant un pH de 4,2 contenant 1 mole de chlorure de sodium, qui donne un gradient de pH dans l'éluat. Les fractions dans la gamme de pH de 5,2 à 4,5 sont recueillies et contiennent
l'ensemble de l'activité interféron.
Les taux de protéines et les activités interféron de la solution de départ et de ses produits sont indiqués dans le tableau B. D'après ce tableau,on voit que la récupération de l'activité interféron dans le premier stade est de 57,5% et 58%
respectivement, et dans le second stade de 91,4% et 91,6% res-
pectivement, entraînant ainsi une récupération totale de 52,6%
et 53,2% respectivement.
Les éluats montrent une activité interféron spécifique d'environ 1,7 x 109 et de 2 x 109 unités/mg,ce qui signifie que le produit possède une grande pureté. De plus, la pureté des produits finis est essayéede la même façon que dans l'exemple 1 et donne des résultats similaires. Cela signifie que le procédé de la présente invention est approprié en effet pour une
opération à grande échelle.
TABLEAU B
Matière Volume Protéine totale Activité totale Activité spécifique ml mg unités unités/mg
. i.m -u...
Solution de départ 3200 1075 2 64 x 107 5,9 x 104 3200 1462t9 1 5 x 108 1013 x 104 Perles de verre
non adsorbé 4700.
+ lavages 4700 -
Eluats 280 124t6 3168 x 10 2t96 x 105 280 169t54 8t7 x 107 5)13 x 10 Solution dialysée 705 Solution dialysée 100 44>46 1)32 x 107 2,96 x 105 60)55 3>11 x 10 5114 x 10 Chélate de zinc non adsorbé 130. 42 51 0 0 + ler lavages 130 6010 0
13 0 60101 0 06
21èmeslavages. 150 1160 0 76 x 106 0 47 x 106
01 48
Eluats 10 0007 1202 x 106... 17 x O ",10 0;014 2,85 x 10 2 x 10 cm t.- N0 NJ co -'
Claims (12)
1. Procédé pour la purification d'interféron qui consiste (a) à soumettre une solution aqueuse d'interféron de fibroblastes humain à la chromatographie sur des perles de verre poreuses et (b) à soumettre la solution d'interféron
résultante à la chromatographie sur chélate de zinc immobilisé.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le stade (a) comprend la mise en contact de la solution aqueuse d'interféron avec des perles de verre poreuses, à pH neutre ou légèrement alcalin en vue d'une adsorption sélective de la solution d'interféron sur les perles puis la mise en contact des perles avec un agent d'élution, à pH acide, afin d'éluer l'interféron adsorbé à partir des perles.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que les perles de verre, après l'adsorption et avant l'élution, sont lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate ayant un pH voisin de la neutralité, puis sont lavées avec une solution tampon ayant un pH plus faible allant
jusqu'à pH 3.
4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'agent d'élution a un pH compris entre 1,5 et 2,7 et une concentration ionique comprise entre 0,05 mole et 0,5 mole.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'élution à partir des perles de verre est effectuée
avec une solution tampon 0,3 mole glycine-HCl ayant un pH de 2.
6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'éluat provenant du stade (a) est dialysé contre une solution saline tamponnée au phosphate en vue de la
préparation du stade (b).
7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait quele stade (b) comprend la mise en contact de l'éluat dialysé Au stade (a) avec un chélate de zinc immobilisé, à pH neutre ou légèrement alcalin, en vue de l'adsorption sélective de l'interféron à partir de l'éluat sur l'adsorbant, et la mise en contact du chélate de zinc avec un agent d'élution à pH acide, en vue de l'élution de l'interféron à partir de l'adsorbant.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par
le fait que l'adsorbant est un chélate de zinc et un imino-
diacétate couplé sur le "Sépharose" à activation époxy.
9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que le chélate de zinc immobilisé, après l'adsorption
et avant l'élution, est lavé avec une solution saline tampon-
née au phosphate ayant un pH voisin de la neutralité, puis est lavé avec une solution tampon avant un pH plus faible allant
jusqu'à 5,9.
10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que l'agent d'élution a un pH compris entre 6 et 4 et que sa concentration ionique est comprise entre 0,05 Mole
et 0,5 Mole.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que l'élution à partir du chélate de zinc est effectuée avec une solution d'acétate de sodiumàO,l Mole ayant un pH de 4,2.
12. L'interféron purifié avec le procédé selon l'une
quelconque des revendications 1 à 11.
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