FI98378C - Uusi, erittäin termostabiili -amylaasi - Google Patents

Description

98378

Uusi, erittäin termostabiilic£-amylaasi - En ny, synner-ligen termostabilo*·-amylas 5 Tämä keksintö koskee termostabiilien o(.-amylaasien alaa.

Tarkemmin sanottuna esillä oleva keksintö koskee uusia, erittäin termostabiileja ot-amylaaseja, menetelmää tällaisten entsyymien valmistamiseksi ja näiden oC-amylaasien käyttämistä teollisessa tärkkelyksen nesteyttämismenetelmässä.

10 ot-amylaasien käyttäminen tärkkelyksen entsymaattiseen muuttamiseen sokereiksi, esimerkiksi moottorialkoholin tai runsaasti fruktoosia sisältävän siirapin (HFS) valmistamiseen, on hyvin tavallista. Teollisista tärkkelyksen nes-15 teyttämismenetelmistä on suihkukeittäminen lähes yleismaailmallisesti parhaana pidetty tärkkelyksen nesteyttämistapa, mutta tämän menetelmän toteuttamisessa tarvitaan välttämättä termostabiileja o^-amylaaseja.

20 HFS:ää valmistetaan runsaspitoisista DX-siirapeista, joissa termi DX merkitsee dekstroosin (D-glukoosin) painoprosenttia laskettuna siirapin kuiva-aineesta (DS). Yleisesti omaksuttu entsymaattinen nesteyttämismenetelmä tärkkelyksen muuttamiseksi runsaspitoiseksi DX-siirapiksi on kokonaisuudessaan 25 kaksi-vaihemenetelmä. Ensimmäinen vaihe on nesteyttäminen, s.o.tärkkelyksen hydrolyysi oligosakkaridien, n.s. maltodekstriinien seokseksi. Tätä menetelmää katalysoivat oC-amylaasit ja tyypillisessä suihkukeittomenetelmässä kuumennetaan tärkkelyslietettä vähintäin useita minuutteja 105-30 110°C:ssa, tavallisesti <^ramylaasin yksinkertaisen annoksen kanssa ja pidetään sitten noin 90°C:ssa vähintäin 1 tunnin ajan. Kokonaisnesteyttämismenetelmän ensimmäisessä vaiheessa suoritetaan tärkkelyslietteen hyytelöiminen ja mekaaninen laimennus. Menetelmän toisessa vaiheessa tapahtuu lisähajoa-35 mistä (dekstriinisointia). Suihkukeittämismenetelmän suhteen viitataan U.S.patenttiin N:o 3,912,590.

Tähän asti kaikkein parhaimpina pidetyt termostabiilit . 98378 2 (/.-amylaasit teollisia nesteyttämismenetelmiä varten ovat peräisin bakteereista ja Bacillus suvusta. Siten suihkukeit-tämisraenetelinään hyvin soveltuva ^.-amylaasi on TERMAMYL® Bacilllus licheniformis bakteerista, jota toimittaa NOVO 5 NORDISK A/S, Tanska. Bacillus stearothermoohiluksesta peräisin olevia ok-amylaaseja on selostettu U.S.patenteissa N:ot 2,695,683 ja 4,284,722. Bacillus stearothermophilus ck-amylaasia, (THERMOLASE™), on saatavissa yhtiöstä Enzyme Development Corporation, NY, USA.

10

Johtuen tähän asti saatavissa olevien oL-amylaasien ominaisuuksista, suoritetaan nesteyttämismenetelmä tyypillisesti pH-arvolla noin 6,0-6,5. pH-arvoilla alle 6 vähenee amy-lolyyttinen aktiivisuus nopeasti ja pH-arvoilla yli 6,5 15 tulee haitallisten sivutuotteiden, kuten maltuloosin tai maltuloosin "esiasteiden" muodostuminen kiusalliseksi.

Bacillus licheniformis </»-amylaasi esimerkiksi inaktivoituu nopeasti pH-arvoilla alle 6,0. Sen lisäksi se vaatii ainakin 50 ppm kalsiumia stabilointa varten, kun sitä käytetään 20 teollisessa tärkkelyksen nesteytyksessä, ja se inaktivoituu täydellisesti 120°C:ssa. Bacillus stearothermophilus <A--amylaasilla on tiettyjä etuja Bacillus licheniformis entsyymiin nähden, erityisesti alhaisempi pH-optimi. Nämä entsyymit eivät kuitenkaan sovellu tärkkelyksen nesteyttämi-25 seen pH-arvoilla alle 5.

Seuraavaa sokeriksi muuttamisvaihetta, jossa maltodekstriinit muutetaan dekstroosiksi, katalysoidaan useimmiten glu-koamylaasientsyymin avulla. Kaupallisia glukoamylaasivalmis-30 teitä, jotka on tavallisesti johdettu Aspergillus tai Rhi-zopus lajeista, on saatavissa useilta valmistajilta, esimerkiksi AMG™ 200 L, joka on Aspergillus niaeristä saatu tuote ja jota valmistaa NOVO NORDISK A/S, Tanska. Nämä glukoamylaasientsyymit toimivat optimaalisesti pH-arvolla 35 4,0 - 4,5.

Nyt on eristetty erittäin termofiilisiä archaebakteereita tulivuori- ja merenalaisista hydrotermisistä systeemeistä 3 98378 (G.Fiala & K.O.Stetter; Arch.Microbiol., 145.56 - 61 (1986) ja R.M.Kelly & J.W.Deming, Biotech. Progress, 4, 47-62 (1988). Tähän asti tunnetut äärimmäisen termofiiliset bakteerit kuuluvat sukuihin Pvrococcus. Pvrodictium ja Pyroba-5 culum. On oletettu, että Pvrococcus- sukuun kuuluvat jäsenet sisältävät lämmönkestäviä proteaaseja ja amylaaseja (K.O.Stetter, J.Chem. Technol. Biotechnol.,42(4); 315-317 (1988)). Pvrococcus woesein kasvuolosuhteita on tutkittu (Zillig et ai.; Syst. Appi. Microbiol.,9, 62-70 (1987)).

10 Pyrococcus amylaaseja ei ole kuitenkaan koskaan eristetty tai tutkittu.

pH-arvon lisäsäätelyiden tarpeen poistamiseksi on tekniikka jo kauan etsinyt termostabiileja tärkkelyksen nesteyttämis-15 entsyymejä, jotka pystyvät nesteyttämään niin alhaisella pH:11a kuin 4,0. Sitäpaitsi pidetään parhaana välttää kal-siumsuolojen lisäämistä puhdistuskulujen vähentämiseksi.

Esillä olevan keksinnön kohteena on sen vuoksi välttää tähän asti tunnettujen a-amylaasien puutteita hankkimalla 20 uusi, erittäin termostabiili α-amylaasi, jolla on alhainen pH-optimi ja joka on olennaisesti riippumaton kalsiumio-neista.

Nyt on keksitty esillä olevan keksinnön mukaan, että Pyro-25 coccus kannat tuottavat α-amylaaseja, joilla on erinomaisen termostabilisuuden lisäksi pH-optimi edullisen alhaisilla pH-arvoilla ja jotka ovat olennaisesti riippumattomia kal-siumioneista.

30 Keksintö tarjoaa ensimmäisen aspektinsa mukaisesti a-amy-laasin, jolle on tunnusomaista, että a) sen pH-optimi on välillä 5,2-5,8 määrättynä 90°C:ssa ilman substraatin mukana olemista, b) sen lämpötilaoptimi on välillä 90-105°C määrättynä pH-35 arvolla 5,5 ilman substraatin mukana olemista, c) se on olennaisesti riippumaton Ca-ioneista, 4 98378 d) sen jäännösaktiivisuus 1 h kuluttua llO°C:ssa on suunnilleen 70 % määrättynä stabiloivien määrien substraattia mukana ollessa, ja e) se on saatavissa viljelemällä Pyrococcus-kantaa.

5

Parhaina pidettyjä Pvrococcus-kantoi a ovat P.woesei ja P.furiosus. erityisesti P.woesei. DSM N:o 3773, ja P.furio-sus. DSM Nro 3638.

10 Toisena aspektina keksintö tarjoaa menetelmän näiden a-amy-laasien valmistamiseksi siten, että viljellään a-amylaasia tuottavaa kantaa Pvrococcus jossakin sopivassa ravinneväli-aineessa, joka sisältää hiili- ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja, minkä jälkeen seuraa halutun entsyymin 15 talteenotto. Tämän menetelmän parhaina pidetyissä suoritusmuodoissa viljellään P.woesei- tai P.furiosus -kantaa, erikoisesti P.woesei -kantaa DSM Nro 3773 tai P.furiosus -kantaa DSM Nro 3638.

20 Kolmannessa aspektissa keksintö tarjoaa tärkkelyksen nes-teyttämismenetelmän, joka käsittää tärkkelyksen vesilietteen entsymaattisen nesteyttämisen keksinnön mukaisen a-amylaasin mukana ollessa. Tämän menetelmän parhaana pidetyssä suoritusmuodossa suoritetaan tärkkelyksen nesteyttä-25 minen olennaisesti ilman kalsiumsuolan lisäämistä tärkke-lyslietteeseen. Eräässä toisessa parhaana pidetyssä suoritusmuodossa suoritetaan menetelmä suihkukeittämällä lämpötilassa, joka on välillä 100-140°C korkeintaan 120 minuutin ajan, mitä seuraa vaihtoehtoisesti lämpötilan alentaminen, 30 joka on pidettävä välillä 90-100°C noin 30-120 minuuttia, minkä jälkeen näin nesteytetty tärkkelys on stabiilia ret-rogradaatiota vastaan, jolloin pH pidetään välillä suunnilleen 4,0-5,5 läpi koko menetelmän. Esillä olevan keksinnön vielä eräässä parhaana pidetyssä suoritusmuodossa suorite-35 taan nesteytetylle tärkkelykselle sen jälkeen entsymaatti-nen sokeriksi muuttaminen glukoamylaasin mukana ollessa, olennaisesti ilman pH m välillä tapahtuvaa säätelyä. Vielä eräässä tämän keksinnön parhaana pidetyssä suoritusmuodossa 5 98378 suoritetaan nesteytetylle tärkkelykselle etanolikäyminen hiivan avulla joko samanaikaisesti sokeriksi muuttamisen kanssa tai sen jälkeen.

5 Kasvukokeet Pyrococcuksen kanssa ovat nyt osoittaneet, että tämän suvun jäsenet erittävät kaikkein termostabiileinta ja lämpöaktiivisinta tärkkelystä hydrolysoivaa entsyymiä, mitä koskaan on selostettu. Nämä tärkkelystä hajottavat entsyymit pystyvät hydrolysoimaan umpimähkä!sesti a-l,4-glykosi-10 di-sidoksen useissa glukoosipolymeereissä, kuten esimerkik si amylopektiini, glykogeeni, maltodekstriini ja amyloosi. Näiden entsyymien polysakkaridihydrolyysin mallista nämä entsyymit on identifioitu a-amylaaseiksi.

15 Nykyään tunnetaan kaksi Pyrococcus-laiia. P.woesei ja P.fu-riosus. Näiden organismien tuottamilla a-amylaaseilla on ilmeisesti samoja ominaisuuksia, vaikka ne saattavat olla hieman erilaisia rakenteeltaan. P.woesein -kantaa on saatavissa DSM:stä N:olla 3773. P.furiosuksen -kantaa on saata-20 vissa DSM:stä N:olla 3638.

Keksinnön mukaiset entsyymit stabiloituvat substraattinsa avulla, so. polysakkaridien, kuten esimerkiksi tärkkelyk sen, glykogeenin, haarautuneiden tai suoraketjuisten glu-25 koosipolymeerien, amyloosin, amylopektiinin, maltodekstrii nin tai niiden seoksen, avulla, ja ne ovat stabiileja ilman metalli-ionien mukana oloa. Substraatin stabilointivaikutus syntyy polysakkaridikonsentraatioilla noin 0,5 paino-% tai siitä yli. Pienemmät polysakkaridikonsentraatiot eivät ai-30 kaansaa stabilointia.

Keksinnön mukaisten entsyymien lämpötilaoptimi on 90-105°C, ja ne ovat aktiivisia välillä 40°C-140°C, erikoisesti välillä 60-120°C, vielä erikoisemmin välillä 6 98378 80 - 110°C ja kaikkein erikoisimmin välillä 90 - 105°C. Tämä leveä lämpötilaväli 100 astetta on hämmästyttävä. Entsyymit ovat katalyyttisesti aktiivisia pH-välillä 3,5 - 8,0. Noin 60 % aktiivisuus mitataan pH:11a 3,5 ja 7,0. pH-optimi 5 entsymaattislle aktiivisuudelle on pH-välillä 4,0 - 6,0, erikoisemmin pH-välillä 4,0 - 5,5 määrättynä väliaineesta, joka sisältää stabiloivia määriä polysakkarideja, ja pH-välillä 5,2 - 5,8 määrättynä ilman stabiloivia määriä polysakkaridia .

10

Keksinnön mukaisten entsyymien erinomaiset ominaisuudet kävivät ilmi, kun havaittiin entsymaattista aktiivisuutta jopa autoklaavissa pidon jälkeen 6 h ajan 120°C:ssa 3 barin paineessa. Melkein 20 % ^.-amylaasin aktiivisuudesta havait-15 tiin jopa 120°C:ssa. 60 min jälkeen mitataan 100 % jäännös-aktiivisuus 90°C:ssa, ainakin 80 % lämpötilassa 100°C, noin 70 % lämpötilassa 110°C, ja ainakin 60 % lämpötilassa 120°C. o(-amylaasin täydelliseen inaktivointiin tarvittiin ainakin 12 tuntia autoklaavissa 120°C:ssa paineessa 3 baria. On 20 myös merkittävää, että entsyymi on katalyyttisesti aktiivinen sen jälkeen, kun sitä on keitetty pesuaineiden, kuten 2 % SDS:ää mukana ollessa.

In vitro lisätutkimukset ovat osoittaneet, että metalli-25 ioneja tai muita solunsisäisiä tekijöitä ei tarvita puhdistetun entsyymin katalyyttistä aktiivisuutta varten. 1 -5 mM lisääminen raskasmetalleja kuten Cr2+, Cu2+ tai Zn2+ aiheutti entsyymin inhiboitumista. Tätä inhiboitumista voitiin nostaa lisäämällä 5 mM EDTA:a.

30

Esillä olevan keksinnön mukaisten o^ramylaasien ainutlaatuisten ominaisuuksien ansiosta niitä voidaan käyttää olemassa olevissa kaupallisissa menetelmissä ja uusissa sovellutuksissa. Ainutlaatuinen termostabilisuus ja kyky muuttaa 35 luonnon tärkkelystä samoin kuin liukenevaa tärkkelystä, ilman metalli-ionien mukana olemista, pH-arvoilla alle 5 ja lämpötiloissa yli 100°C, sakkaridien seokseksi tekee näistä entsyymeistä ihanteellisesti sopivia teolliseen tärkkelyksen 7 98378 risteyttämiseen, esimerkiksi moottorialkoholin tai runsaasti fruktoosia sisältävän siirapin (HFS) tuottamiseen. Näiden entsyymien käyttämisen ansiosta tärkkelyksen nesteyttämis-menetelmät voidaan toteuttaa erinomaisin teknisin eduin.

5 Ei ole tarpeen säätää uudelleen pH-arvoa nesteyttämis- ja sokeriksi muuttamisvaiheiden välissä. Vältetään haitallisten sivutuotteiden muodostuminen. Ei ole tarpeen lisätä kalsiumia entsyymin stabilointia varten, ja tällä tavoin voidaan vähentää ioninvaihtopuhdistusten kustannuksia huomat-10 tavasti. Korkeamman lämpötilan vuoksi reaktio edistyy nopeammin.

oC-amvlaasin valmistaminen

Keksinnön mukaisia ot-amylaaseja voidaan valmistaa viljele-15 mällä Pyrococcus kantaa sopivassa kasvuväliaineessa ja ottamalla tällä tavoin talteen valmistunut entsyymi.

Pvrococcuksella esiintyy kasvun maksimi lämpötilassa 80 -106°C, ylimmän lämpötilarajän ollessa noin 110°C, ja pH-20 arvoilla 4,5 - 7,5. Organismin entsyymisynteesi tapahtuu milloin tahansa kasvun aikana ja alkaa jo aikaisessa logaritmisessa vaiheessa ja saavuttaa optiminsa stationäärisen vaiheen aikana. Useista proteiinijuovista, jotka on havaittu käyttämällä elektroforeesia polyakryyliamidigeelin gra-25 dientilla, ainoastaan yksi suurempi juova esittää amylo- lyyttistä aktiivisuutta. Tämän entsyymin molekyylipaino on suunnilleen 70 KDa.

Kuten edellä mainittiin, P.woesein kasvuolosuhteita on 30 tutkittu, ja viljelymenetelmää on selostettu (Zillig et ai., edellä). Käymismenetelmän saamiseksi teollisesti sopivammaksi on kehitetty keksinnön mukaisen oO-amylaasin valmistusmenetelmä, jossa suoritetaan jatkuvaa kaasun johtamista ravinneväliaineeseen. Havaittiin, että jatkuva kaasun joh-35 taminen ravinneväliaineeseen stimuloi entsyymin tuottamista.

On käynyt ilmi, että solunulkoinen entsyymipitoisuus kasvaa noin kaksinkertaiseksi. Kun jatkuvasti johdetaan kaasua H2/C02 ja käytetään sakkarideja, kuten tärkkelystä, 8 98378 amyloosia, amylopektiiniä, glykogeeniä, haarautuneita tai suoraketjuisia oligosakkarideja ja maltodekstriiniä tai niiden seoksia hiililähteenä, alkuainerikkiä elektroniak-septorina ja 3 % NaCl, erittyy väliaineeseen 220 U/l oC-5 amylaasia. Kun kaasun johtaminen ei ole jatkuvaa, voidaan havaita ainoastaan 120 U/l cL-amylaasia samoissa olosuhteissa.

Tämän lisäksi on kehitetty tarkemmin määritelty ravinnevä-10 liaine Pvrococcuksen kasvua varten. Päinvastoin kuin selostettu toinen väliaine, tämä väliaine ei ole samea, eikä se sisällä alkuainerikkiä. Tässä väliaineessa voidaan saada aikaan hyvä kasvu ja entsyymin tuotanto johtamalla jatkuvasti kaasua N2/C02. Tällä ravinneväliaineella saadaan ent-15 syymin tuotanto vielä suuremmaksi, jopa viisinkertaiseksi noin 200 U/l:sta yli 1,000 U/l:aan solunulkoista entsyymiä.

Tämän väliaineen koostumus käy ilmi esimerkistä 2. On kiinnostavaa, että on voitu myös osoittaa, että jos viljelyihin johdettiin ainoastaan typpeä, kasvu ja entsyymituotanto 20 laskivat. Koska tämä väliaine ei ole samea, voidaan nyt helposti monitoroida kasvua mittaamalla optinen tiheys. Organismi erittää myös verrattain suuren määrän entsyymiä.

Edellä mainittuja väliaineita (rikin kanssa ja ilman rikkiä) käytetään amylaasin tuottamiseksi pienissä samoin kuin 25 suurissa määrissä.

Esillä olevan keksinnön mukaisia oC-amylaaseja voidaan valmistaa myös rekombinaatio DNA-teknologian avulla.

30 ol-amylaasien eristäminen

Keksinnön mukaisten öL-amylaasien eristäminen voidaan suorittaa konventionaalisten menetelmien avulla. Entsyymi voidaan ottaa talteen helposti soluvapaasta päällä olevasta osasta. Ne adsorboituvat luonnossa esiintyviin ja liukeneviin 35 tärkkelyksiin, minkä ansiosta nämä entsyymit voidaan puhdistaa suuressa mittakaavassa. o^-amylaasin stabilointi 0,05 % maltodekstriinin kanssa on kuitenkin välttämätön. Ne voidaan saostaa päällä olevasta osasta kylmänä tai lisäämällä - 98378 9 orgaanisia liuottimia kuten etanolia, mikä ei vähennä entsyymin aktiivisuutta.

Tärkkelyksen nesteyttämismenetelmä 5 Keksinnön mukaista nesteyttämismenetelmää voidaan käyttää tärkkelyksen entsymaattiseen muuttamiseen sokereiksi, esimerkiksi moottorialkoholin tai runsaasti fruktoosia sisältävän siirapin (HFS) tuotantoon. Sopivia nesteyttämisolo-suhteita ovat korkeintaan 120 minuuttia lämpötilassa 100-10 140°C, mieluummin 1-60 minuuttia lämpötilassa 100-120°C, kaikkein mieluimmin 1-30 minuuttia lämpötilassa 105-110°C, mitä seuraa vaihtoehtoisesti lämpötilan alentaminen ja sen pitäminen välillä 90-100°C noin 30-120 minuutin ajan. Pidetään parhaana, ettei lisätä kalsiumsuoloja tärkkelyksen 15 vesilietteeseen. pH tulisi pitää välillä 3,5-6,0, mieluummin 4,0-5,5, kaikkein mieluimmin 4,2-4,8. Jatkuvaa menetelmää pidetään parhaana ja kuumennus on kaikkein mieluimmin suihkukeittämistä. Keksinnön mukainen a-amylaasi nesteyttää hyvin tärkkelystä annospitoisuuksilla 5-500 NU 20 (katso jäljessä NU:n määritelmää), mieluummin 10-50 NU per gramma tärkkelyksen DS:ää (kuiva-aine). Tärkkelyksen kon-sentraatio on tavallisesti välillä 15-45 % DS (paino/paino-% kuiva-ainetta), useimmiten 25-35 % DS.

25 Nesteytetty tärkkelys voidaan tämän jälkeen muuttaa entsymaattisesti sokeriksi glukoamylaasin mukana ollessa, olennaisesti ilman pH:n välillä tapahtuvaa säätämistä. Tässä tapauksessa tärkkelys nesteytetään tämän keksinnön mukaisen a-amylaasin kanssa pH-arvolla 3,5-6,0, mieluummin 4,0-4,5, 30 kaikkein mieluimmin pH-arvolla 4,2-4,8. Nesteytetty tärkkelys voidaan sen jälkeen myös muuttaa entsymaattisesti sokeriksi glukoamylaasin mukana ollessa, yhdessä haaroja poistavan entsyymin kuten pullulanaasin kanssa (ks. EP 63909 yksityiskohtien suhteen) ja/tai esimerkiksi A.niae-35 ristä saadun happoa kestävän a-amylaasin avulla (ks. EP 140 410 yksityiskohtien suhteen.

10 98378

Keksinnön mukaista nesteyttämismenetelmää voidaan käyttää myös etanolin tuottamiseen. Tässä tapauksessa tärkkelys nesteytetään ct-amylaasin kanssa pH-arvolla 3,5 - 6,0, mieluummin 4,0 - 5,5, mitä seuraa sokeriksi muuttaminen gluko-5 amylaasin avulla ja käyminen samanaikaisesti tai sen jälkeen hiivan avulla. Sen jälkeen voidaan alkoholi ottaa talteen tekniikasta tunnetuin menetelmin. Koko menetelmä suoritetaan mieluummin pH-arvolla noin 4,5 ilman pH:n säätelyä välillä ja samanaikainen sokeriksi muuttaminen ja käyminen suori-10 tetaan lämpötilassa 30 - 35°C suunnilleen 96 h ajan. Nes- teyttäminen voidaan suorittaa joko alhaisilla DS-pitoisuuk-silla (15 - 20 %) tai korkeilla DS-pitoisuuksilla (20 -40 %). Korkean DS-pitoisuuden menetelmissä on DS-pitoisuus alennettava noin 20 %:iin ennen käymistä, jotta saadaan 15 noin 10 tilavuus-% alkoholia, mikä on suunnilleen maksimi, minkä useimmat hiivat voivat kestää.

Alkoholivalmistuksen raaka-aine voi olla jalostettua tärkkelystä, kuten kosteana jauhettua maissitärkkelystä, raako-20 ja, käsittelemättömiä materiaaleja kuten maissia, vehnää, riisiä, hirssiä, maniokaa ja perunaa (jonka tärkkelyspitoi-suus vaihtelee välillä 15 - 80 %), ja muita tärkkelystä sisältäviä materiaaleja kuten teollisuuden jäte- ja sivutuotteita.

25

Kuvio 1: P.woesein viljely panosviljelyssä tärkkelyksessä, johon johdetaan jatkuvasti kaasua lämpötilassa 98°C. (· amylaasin aktiivisuus; Δ jäännöstärkkelys; g pH? ooptinen tiheys 578 nm:llä).

30 Kuvio 2: Lämpötilan ja pH:n vaikutus P.voeseistä saadun cAramylaasin aktiivisuuteen.

Kuvio 3; P.woeseista saadun ok-amylaasin terminen stabili-suus (D 70 - 90°C; ♦ 100°C; H 110°C; o 120°C; A 130°C).

35 Kuvio 4; (A) P.furiosuksen erittämäoC-amylaasi tärkkelyksessä tapahtuvan kasvun aikana 98°C:ssa. (B) Kasvu jatkuvasti johdetussa kaasussa.

11 98378

Kuvio 5: Lämpötilan ja pH:n vaikutus P.furiosuksesta saadun c<--amylaasin aktiivisuuteen.

Kuvio 6: P. f uriosuksesta saadun ck.-amylaasin terminen sta»· bilisuus.

5 Kuvio 7: Lämpötilan ja pH:n vaikutus P.voeseista saadun stabiloimattoman oC-amylaasin aktiivisuuteen määrättynä ilman substraatin mukana olemista.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat esillä olevaa kek-10 sintöä lisää.

ESIMERKKI 1 P.woeseista saatu c^-amylaasi P.woesein viljely (vertaa kuviota 1)

Pyrococcus woeseitä viljeltiin väliaineessa, jota ovat 15 selostaneet Zillig ja ai.(edellä) 98°C:ssa. Johdettiin jatkuvasti 20 1 viljelyihin kaasua H2/CO2 (80/20) ja vedettiin 50 ml näytteitä eri pituisten aikavälien jälkeen. Amylaasiaktiivisuus määrättiin solu-vapaasta päällä olevasta osasta Bergmeyerin ja Grassin mukaan, Methods of 20 enzymatic analysis, 3.painos, osa 2, 151-152; Verlag Chemie, Weinheim (1983). 250yUl:aan natriumasetaattipuskuria (50 mM, pH 5,5), joka sisälsi 1 % (paino/tilavuus) tärkkelystä lisättiin suunnilleen 100yu1 entsyymiliuosta ja in-kubointi suoritettiin 95°C:ssa 30 min ja 60 min ajan.

25 o<~-amylaasin aktiivisuus 1 U määritellään entsyymin määränä, joka vapauttaa 1 yu moolin pelkistävää sokeria per minuutti maltoosin ollessa standardina. Jäännöstärkkelys-konsentraa-tio määrättiin käyttäen HPLC:tä, kuten on selostettu taulukossa 1.

30 Taulukko 1: Sokerien määrä (%), jotka vapautuvat Pyrococcus woeseistä saadun c^-amylaasin entsymaattisesta vaikutuksesta tärkkelykseen.

35 12 98378

Aika DPn DP7 DP6 DP 5 DP4 DP 3 DP2 DPI

O h 100 0 0 0 0 0 O O

4.5 h 84 33223 3 O

7.0 h 71 44247 8 O

5 12.5 h 57 6 7 3 5 10 12 O

23.5 h 35 14 16 5 6 11 13 O

35.5 h 29 13 17 5 7 12 16 1

Menetelmät: Lisättiin 0,5 U entsyymiä per ml natriumasetaat-10 tipuskuria (50 mM, pH 5,5). Lopullinen tärkkelyksen kon- sentraatio oli 1 % (paino/tilavuus). Xnkubointi suoritettiin 90°C:ssa ja näytteitä vedettiin eri pituisten aikavälien jälkeen. Kukin näyte puhdistettiin sitten ioninvaihtohartsin avulla (Serdolyt MB, Serva, Heidelberg, Saksa) ja sokerit 15 analysoitiin sitten HPLC:n avulla käyttäen Aminex HPX-42 A pylvästä (Bio-Rad, Richmond, Kalifornia, USA). Eluoidut sokerit monitoroitiin differentiaalirefraktometrin avulla (Knauer, Bad Homburg, Saksa). DP = Polymerointiaste; DPI = glukoosi.

20

Proteiinin erotus

Solunulkoisten proteiinien erottaminen (20yug, 0,2 U) suoritettiin 1,5 mm paksuissa poolyakryyliamidigeeli-gradien-teissä (5 - 30 %, paino/tilavuus) 400 V vakiojännitteellä 25 24 h lämpötilassa 4°c. Proteiinijuovan selville saamiseksi, joka ilmaisee amylaasiaktiivisuuden, geeliä liotettiin 50 mM asetaattipuskurissa, pH 5,5, joka sisälsi 1 % tärkkelystä 1 h ajan 4°C:ssa. Geeliä inkuboitiin vielä 90°C:ssa 30 min ajan ja lopuksi sitä inkuboitiin liuoksessa, joka 30 sisälsi 0,15 % (paino/tilavuus) jodia ja 1,5 % (paino/tilavuus) kaliumjodidia, kunnes kirkas alue tuli näkyviin.

Samassa geelissä olevat proteiinit värjättiin hopealla, Heukeshovenin ja Dernickin mukaan, Electrophoresis 6, 103 -112. Erotettiin myös standardiproteiineja (10/xg kukin), 35 joilla on tunnettu molekyylipaino. Amylolyyttistä aktiivisuutta osoittavan proteiinin molekyylipaino on noin 70 KDa.

13 98378 pHtn ia lämpötilan optimi (vertaa kuviota 2) Lämpötilaoptimin määrääminen suoritettiin entsyymin kanssa, joka oli puhdistettu osittain geelisuodattamalla Superose 12 pylväässä ja stabiloitu 0,5 % maltodekstriinin avulla.

5 Inkubointi suoritettiin vesihauteessa (40°C - 100°C) ja gly-seriinihauteessa (105°C - 130°C), pH 5,5. Inkubointi yli 100°C lämpötiloissa suoritettiin suljetuissa Hungate putkissa liuoksen kiehumisen välttämiseksi. 250yul:aan natrium-asetaattipuskuria (50 mM, pH 5,5), joka sisälsi 0,5 % (pai-10 no/tilavuus) tärkkelystä, lisättiin 20μΐ entsyymiliuosta (1600 U/l) ja inkubointi suoritettiin 10 min ajan. Sitten mitattiin muodostuneet pelkistävät sokerit kuten ovat selostaneet Bergmeyer ja Grassi (edellä). Entsyymin pH-optimin määräämistä varten käytettiin seuraavia puskureita: 50 mM 15 natriumsitraattia (pH 3,5 - 4,0 varten), 50 mM natriumase-taattia (pH 4,5 - 6,0 varten) ja 50 mM kaliumfosfaattia (pH 6,5 - 8,0 varten). pH:n määrääminen suoritettiin 90°C:ssa.

20 Testattu entsyymi on aktiivinen laajalla lämpötilavälillä 40 - 130°C ja pH-välillä 3,5 - 8,0. Maksimaalinen aktiivisuus havaitaan pH-arvolla 5 ja lämpötilassa 100°c.

Terminen stabilisuus (vertaa kuviota 3) 25 Entsyymiä sisältävää näytettä inkuboitiin vesihauteessa (70 - 90°C) ja glyseriinihauteessa (100 - 130°C). Näytteitä otettiin useiden eri pituisten aikavälien jälkeen ja ds-amylaasin aktiivisuus määrättiin Bergmeyerin ja Grassin mukaan (edellä). 200^.1:aan natriumasetaattipuskuria 30 (50 mM, pH 5,5), joka sisälsi 1 % (paino/tilavuus) tärkke lystä, lisättiin suunnilleen 50yul entsyymi liuosta ja inkuboitiin 30 ja 60 min ajan 95°C:ssa. (□ 70 - 90°C; φ100°C; 110°C; o 120°C; A 130°C).

35 Metallikationien ia EDTA:n vaikutus

Metallikationien ja EDTA:n vaikutus P.woeseistä saadun oC.-amylaasin aktiivisuuteen saatiin aikaan entsyymin kanssa, joka oli osittain puhdistettu geelisuodatuksen avulla 14 98378

Superose 12 pylväässä (Pharmacia, Ruotsi), katso taulukkoa 2. Otettiin talteen oC-araylaasia sisältävät fraktiot ja ne konsentroitiin nelinkertaisiksi. Lisättiin 25yul entsyymiä (400 U/l) natriumasetaattipuskuriin, (100yu 1,50 mM, pH 5,5), 5 joka sisälsi 1 % (paino/tilavuus) tärkkelystä. Lisättiin metallikationeja, jotka oli liuotettu natriumasetaattipuskuriin (100 mM, pH 5,5) eri konsentraatioissa. Inkubointi suoritettiin glyseriinihauteessa (100°C) 40 min ajan. Pelkistävät sokerit saatiin selville lopuksi Bergmeyerin ja 10 Grassin (edellä) mukaan. Arvot esittävät entsyymiaktiivisuutta mitattuna prosenteissa.

Taulukko 2

Metalli-ionin konsentraatio (mM) 0 12 5 15 EDTA 100 95 85 60

Ca2+ 100 120 120 85

Co2+ 100 120 100 80

Cr2+ 100 621 20 Cu2+ 100 620

Fe2+ 100 80 55 15

Mg2+ 100 95 85 110

Mo2+ 100 105 100 120

Ni2+ 100 70 65 50 25 Zn2+ 100 15 0 0 ESIMERKKI 2 P.furiosuksesta saatu d-amylaasi P.furiosuksen viljely (vertaa kuviota 4)

Kasvukokeet suoritettiin panosviljelyssä N2/C02-atmosfääris-30 sä (80 %/20 %) kompleksisessa väliaineessa, jonka koostumus on seuraava (per litra): (NH4)2S04 1.300 g

MgS04 .7 H20 0.250 g

NaCl 30.000 g 35 KH2P04 1.400 g

CaCl2 0,050 g

FeS04 .7 H20 0,038 g

Na2Se03 .5 H20 5 yUM

- 98378 15 hivenalkuaineet ** 10 ml tryptoni 1.000 g hiivauute 1.000 g tärkkelys 1.000 g 5 resatsuriini 0.001 g kysteiini .HC1 0.500 g

pH 6,2 - 6,5 lämpötila 90 - 100°C

10 kaasu N2/C02, 80/20 (jatkuva kaasun johtaminen) ** hivenaineliuos (per litra):

MnCl2 . 4 H20 0,10 g

CoCl2 . 6 H20 0,20 g

NiCl2 . 6 H20 0,10 g 15 ZnCl2 0,10 g

CaCl2 . 2 H20 0,05 g

CuS04 . 2 H20 0,05 g

Na2Mo04.2 H20 0,05 g.

20 Käyttämällä jatkuvaa kaasun johtamista havaittiin entsyymi-aktiivisuus, joka oli yli 1,000 U/l. Nämä kasvuolosuhteet aikaansaivat noin 80 % entsyymin erityksen viljelynestee-seen.

25 Proteiinin erotus

Fysiokemiallisten tutkimusten suorittamiseksi solunulkoi-nen amylaasi puhdistettiin osittain geelisuodatuksen avulla.

Kaikki kokeet suoritettiin ilman metalli-ionien mukana olemista ja aerobisissa olosuhteissa.

30 pH:n ia lämpötilan optimi (vertaa kuviota 5)

Kuten kuviossa on esitetty, Pvrococcus furiosuksesta peräisin oleva amylaasi on aktiivinen laajalla lämpötilavälil-lä 40 - 130°C ja pH-välillä 3,5 - 8,0. Maksimaalinen ak-35 tiivisuus mitataan 100 - l05°C:ssa ja pH-arvolla 4,5. Noin 60 % entsyymin aktiivisuudesta on vielä havaittavissa 130°C:ssa. Pyrococcus furiosuksesta saadun (Χ,-amylaasin in-kubointiolosuhteet pH:n ja lämpötilan optimin määräämistä 16 98378 varten olivat samat kuin Pyrococcus woeseista saadulla o<=-amylaasilla.

Terminen stabilisuus (vertaa kuviota 6) 5 Paitsi erinomaisen korkeata lämpötilaoptimia amylaasilla on huomattava terminen stabilisuus. Kuten kuviossa on esitetty, aiheuttaa inkubointi kiehuvassa vesihauteessa 6 h ajan ainoastaan 20 % vähennyksen entsymaattiseen aktiivisuuteen. Jopa 130°C:ssa voidaan vielä havaita entsymaattista 10 aktiivisuutta 30 min kuluttua.

Metalli-ionien ia EDTA:n vaikutus 5 mM lisääminen molybdeeni-, kalsium- tai magnesiumioneja ei aiheuttanut minkäänlaista vaikutusta amylaasin aktiivi-15 suuteen. Voitiin havaita heikko aktiivisuuden väheneminen koboltti-, nikkeli- ja rautaionien mukana ollessa ja täydellinen inhibointi havaittiin lisättäessä 5 mM sinkki- tai kupari-ioneja. Koska EDTA:11a ei ollut mitään vaikutusta, voidaan sen vuoksi olettaa, että entsymaattinen aktiivisuus 20 ei vaadi metalli-ionien lisäämistä.

Substraatin spesifisyys

Osittain puhdistettu solunulkoinen amylaasi Pyrococcus furiosuksesta hydrolysoi luonnosta saatua tärkkelystä, 25 liukoista tärkkelystä, amylopektiiniä, maltodekstriiniä ja amyloosia. Tärkkelyksen pääasialliset hajoamistulokset olivat oligosakkarideja, kuten maltoheksaoosi, maltopen-taoosi, maltotetraoosi, maltotrioosi ja maltoosi (taulukko 3). Koska Pyrococcus furiosuksesta saatava amylaasi hajottaa 30 o£-l,4-glykosidisidoksia tärkkelyksessä ja amyloosissa umpi-mähkäisesti, sitä voidaan nimittää oC-amylaasiksi.

Taulukko 3 : Sokerien määrä (%), jotka ovat vapautuneet Pyrococcus furiosuksesta saatavan amylaasin entsymaattisen 35 aktiivisuuden vaikutuksesta inkuboinnin aikana tärkkelyksen kanssa.

17 98378 Tärkkelys DPn DP7 DP6 DP5 DP4 DP3 DP2 DPI O h 100 0 0 0 0 0 0 0 0.5 h 93 1111120 1.5 h 41 4 6 10 11 11 12 5 5 3.0 h 35 8 9 11 10 10 12 5 8.0 h 1 4 6 15 19 21 27 8 24.0 h O 2 2 6 16 25 33 16 48.0 h O O 3 6 12 20 30 29 10 Menetelmät: 1 ml kohti natriumasetaattipuskuria (50 mM, pH 5,5) lisättiin 0,5 U entsyymiä. Tärkkelyksen lopullinen konsentraatio oli 1 % (paino/tilavuus). Inkubointi suoritettiin 90°C:ssa ja näytteitä otettiin eri pitkien aikavälien jälkeen. Kukin näyte puhdistettiin sitten ioninvaih-15 tohartsin avulla (Serdolyt MB, Serva, Heidelberg, Saksa) ja sokerit analysoitiin sitten HPLC:n avulla käyttäen Aminex HPX-42 A pylvästä (Bio-Rad, Richmond, Kalifornia, USA).

Eluoituja sokereja monitoroitiin differentiaali-refrakto-metrin avulla (Knauer, Bad Homburg, Saksa), DP = polymeroin-20 tiaste; DPI = glukoosi.

ESIMERKKI 3 Nesteyttämismenetelmä

Valmistettiin 30 % (paino/paino) maissitärkkelysliete deio-25 noituun veteen ja pH säädettiin arvoon 4,5. Sen jälkeen se siirrettiin ruostumatonta terästä olevaan putkeen, joka oli varustettu tiiviisti sopivalla kannella, ja lisättiin 17 NU P.woesein oCramylaasia per g tärkkelystä.

30 Putkea kuumennettiin 105°C:ssa 60 min, minä aikana tärkkelys nesteytyi täydelleen. Nesteytymisen jälkeen mitattiin DE ja sen havaittiin olevan 16.

Putken sisältö jäähdytettiin 60°C:een ja lisättiin 35 0,24 AG A.niaerin glukoamylaasia per g tärkkelystä säätä mättä pH-arvoa uudelleen. 72 h kuluttua oli näytteellä seuraava hiilihydraattikoostumus mitattuna HPLC-analyysin avulla.

18 98378 % DPX 95,5 DP2 3,0 DP3 0,9 5 DP4 0,5 jossa DP merkitsee polymerointiastetta (DP^^ = monosakkari-dit, DP2 = disakkaridit jne).

10 oL-amylaasin aktiivisuuskoe

Aktiivisuusstandardi NU (joka on lyhennys NOVO #-amylaasi-yksiköstä) on entsyymin määrä, joka hydrolysoi 5,26 mg liuotettua tärkkelystä per tunti 37°C:ssa, pH 5,6 ja 0,0043 M Ca++ reaktioaikana, joka on 7 - 20 minuuttia. AF9 15 kansio, joka selostaa analyyttistä menetelmää, on saatavissa pyynnöstä NOVO Nordisk A/S, Tanska.

Pyrococcus ot-amylaasin aktiivisuus määrätään 60°C:ssa ja se on sukua Termamyyli-standardille, jota on tutkittu sa-20 moissa olosuhteissa.

ESIMERKKI 4

Stabiloimattoman ol-amylaasin karakterisointi pH;n ia lämpötilan optimi (vertaa kuviota 7) 25 Lämpötilaoptimin määrääminen suoritettiin esimerkissä 1 saadun entsyymin kanssa, joka puhdistettiin osittain geeli-suodatuksen avuilla Superose 12 pylväässä, mutta ei stabiloitu maltodekstriinin kanssa. Inkubointi suoritettiin vesihauteessa (40°C - 100°C) ja glyseriinihauteessa (105°C -30 130°C), pH 5,5. Yli 100°C;n lämpötilassa suoritettiin in kubointi suljetuissa Hungate putkissa liuoksen kiehumisen välttämiseksi. 250/iL:aan natriumasetaattipuskuria (50 mM, pH 5,5), joka sisälsi 0,5 % (paino/tilavuus) tärkkelystä, lisättiin 20^1 entsyymiliuosta (1600 U/l) ja inkubointi 35 suoritettiin 10 min ajan. Muodostuneet pelkistävät sokerit mitattiin sitten Bergmeyerin ja Grassin mukaan (edellä).

Entsyymin pH-optimin määräämistä varten käytettiin seuraavat puskurit: 50 mM natriumsitraattia (pH-arvoa 3,4 - 4,0 19 98378 varten), 50 mM natriumasetaattia (pH-arvoa 4,5 - 6,0 varten) ja 50 mM kaliumfosfaattia (pH-arvoa 6,5 - 7,5 varten).

Määrääminen suoritettiin 90°C:ssa.

5 Kuten kuviossa on esitetty, keksinnön mukaista <?(-amylaasia on mahdollista karakterisoida myös sen pH-optimin avulla, joka on välillä 5,2 - 5,8, määrättynä 90°C:ssa, ja lämpöti-laoptimin avulla, joka on välillä 90 - 105°C, määrättynä pH-arvolla 5,5, kun se mitataan ilman että mukana on stabiloi-10 va määrä substraattia. Maksimaalinen aktiivisuus ilmenee pH-arvolla 5,5 ja lämpötilassa 100°C.

60 min kuluttua mitattiin jäännösaktiivisuudeksi 100°C:ssa 100 %, 110°C:ssa ja 120°C:ssa 70 %, ja 130°C:ssa 10 %.

15

Claims (11)

1. 98378 1. α-amylaasi, tunnettu siitä, että a) sen pH-optimi on välillä 5,2-5,8 määrättynä 90°C:ssa ilman substraatin mukana olemista, 5 b) sen lämpötilaoptimi on välillä 90-105°C määrättynä pH-arvolla 5,5 ilman substraatin mukana olemista, c) se on olennaisesti riippumaton Ca-ioneista, d) sen jäännösaktiivisuus 1 h kuluttua 110°C:ssa on suunnilleen 70 % määrättynä stabiloivien määrien substraattia mu- 10 kana ollessa, ja e) se on saatavissa viljelemällä Pyrococcus-kantaa.
2. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen α-amylaasi, tunnettu siitä, että se on saatavissa viljelemällä P.woesei- tai

   15 P.furiosus -kantaa.
3. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen α-amylaasi, tunnettu siitä, että se on saatavissa viljelemällä P.woesei -kantaa DSM N:o 3773 tai P.furiosus -kantaa DSM Ν:θ 3638.
4. 4. Förfarande för framställning av en α-amylas enligt nägot av patentkraven 1-3, kannetecknat av att man odlar en a-amylas-producerande Pvrococcus stam i ett lämpligt nä-ringsmedium innehällande koi- och kvävekällor och oorganis- 15 ka salter med efterföljande utvinning av det önskade en-zymet.

   4. Menetelmä, jonka avulla voidaan valmistaa jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaista α-amylaasia, tunnettu siitä, että viljellään α-amylaasia tuottavaa Pyrococcus kantaa jossakin sopivassa ravinnevällaineessa, joka sisältää hii- 25 li- ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja, mitä seuraa halutun entsyymin talteenottaminen.
5. 5. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknat av att den α-amylas-producerande stammen är en stam av P.woesei 20 eller P.furiosus.

   5 P.furiosus. 3. a-amylas enligt patentkrav 2, kännetecknad av att den kan erhällas genom odling av stammen P.woesei DSM Nr. 3773 eller stammen P.furiosus DMS Nr. 3638. 10

   5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että α-amylaasia tuottava kanta on P.woesei- tai

   30 P.furiosus -kanta.
6. 6. Förfarande enligt patentkrav 5, kännetecknat av att den α-amylas-producerande stammen är P.woesei stammen DSM Nr. 3773 eller P.furiosus stammen DMS Nr. 3638. 25

   6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että α-amylaasia tuottava kanta on P.woesei -kanta DSM N:o 3773 tai P.furiosus -kanta DSM N:o 3638. 35
7. 7. Förfarande för överföring av stärkelse i flytande form, kännetecknat av att en vattenhaltig stärkelseuppslam-ning utsätts för enzymatisk överföring i flytande form i närvaro av en α-amylas enligt nägot av patentkraven 1-3. 30

   7. Tärkkelyksen nesteyttämismenetelmä, tunnettu siitä, että suoritetaan tärkkelyksen vesilietteelle entsymaattinen 98378 nesteyttäminen jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen a-amylaasin mukana ollessa.
8. 8. Förfarande enligt patentkrav 7 för överföring av stärkelse i flytande form, kännetecknat av att det ytterligare utförs väsentligen utan tillsats av ett kalciumsalt i stärkelseuppslamningen. 35

   8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen tärkkelyksen nesteyttä- . 5 mismenetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi suoritetaan olennaisesti ilman kalsiumsuolan lisäämistä tärkkelysliet-teeseen.
9. 9. Förfarande enligt patentkrav 7 eller 8 för överföring av stärkelse i flytande form, kännetecknat av att förfaran-det utförs genom spraykokning vid en temperatur mellan 100- 98378 140°C under högst 120 minuter, eventuellt med efterföljande sänkning av temperaturen som halls mellan 90-100°C under cirka 30-120 minuter, varefter den pa detta sätt i flytande form överförda stärkelsen är stabil mot retrogradering, 5 varvid pH halls vid cirka 4,0-5,5 under hela forfarandet.

   9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen tärkkelyksen nes-10 teyttämismenetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä suoritetaan suihkukeittämällä lämpötilavälillä 100-140°C korkeintaan 120 min ajan, mitä seuraa vaihtoehtoisesti lämpötilan alentaminen, joka pidetään välillä 90-100°C noin 30-120 min ajan, minkä jälkeen tällä tavoin nesteytetty tärkkelys on 15 kestävää retrogradaatiota vastaan, jolloin pH pidetään arvossa suunnilleen 4,0-5,5 läpi koko menetelmän.
10. 10. Förfarande enligt nägot av patentkraven 7-9 för över-föring av stärkelse i flytande form, kännetecknat av att den i flytande form överförda stärkelsen därefter försock- 10 ras enzymatiskt i närvaro av en glukoamylas väsentligen utan en mellanliagande justering av pH.

    10. Jonkin patenttivaatimuksista 7-9 mukainen tärkkelyksen nesteyttämismenetelmä, tunnettu siitä, että nesteytetty 20 tärkkelys muutetaan sen jälkeen entsymaattisesti sokeriksi glukoamylaasin mukana ollessa olennaisesti ilman välillä tapahtuvaa pH-arvon säätämistä.

    11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen tärkkelyksen nesteyt-25 tämismenetelmä, tunnettu että se lisäksi käsittää etanoli- käymisen hiivan avulla samanaikaisesti mainitun sokeriksi muuttamisen kanssa tai sen jälkeen. 30 1. a-amylas, kannetecknad av att a) den har ett pH-optimum mellan 5,2-5,8 bestämt vid 90°C i fränvaro av substrat, b) den har ett temperaturoptimum mellan 90-105°C bestämt vid pH 5,5 i fränvaro av substrat, 35 c) den är väsentligen oberoende av Ca-joner, d) dess restaktivitet efter 1 timme vid 110°C är cirka 70 % bestämt i närvaro av stabiliserande mängder av substrat, och 98378 e) den kan erhällas genom odling av en stam av Pyrococcus. 2. α-amylas enligt patentkrav 1, kännetecknad av att den kan erhällas genom odling av en stam av P.woesei eller
11. 11. Förfarande enligt patentkrav 10 för överföring av stärkelse i flytande form, kännetecknat av att det ytterli- 15 gare omfattar etanolfermentering med jäst samtidigt med eller efter nämnda försockring.