FI95913B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen syklisen neurokiniini A -peptidin valmistamiseksi - Google Patents

Description

95913

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen syklisen neuro-kiniini A -peptidin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti 5 käyttökelpoisen syklisen neurokiniini A -peptidin valmistamiseksi, jolla on kaava — Ai -Ä2 -A3 -A4 — 10 Ra Rl -0C--B--NH —

H E

jossa 15 A: on Gin, gin, Asn tai asn, A2 on Trp, trp, Phe, phe, Tyr, tyr, Phg, phg, Cha, cha, Phe(4'-Cl), phe(4'-Cl), Npa, npa, Phe(4'-N02) tai phe-( 4 · -N02), A3 on Trp, trp, Phe, phe, Tyr, tyr, Phg, phg, Cha, 20 cha, Phe(4'-Cl), phe(4’-Cl), Npa, npa, Phe(4’-N02), phe(4’-N02), Vai tai vai; A4 on Gly, Ala, ala tai S-Ala, B on ryhmä, jolla on kaava 25 : : -N-CH2-

R

30 jossa R on vetyatomi tai alkyyliryhmä, jossa on 1 - 4 hiiliatomia, tai fenyylialkyleeniryhmä, jossa alkyleeniraken-neosa on suora tai haarautunut ja 1 - 6-hiiliatominen ja • jossa fenyylirakenneosa on substituoimaton tai on mono- • « substituoitu C1.4-alkyyli-, C1.4-alkoksi-, hydroksi- tai ha-35 logeeniryhmällä, R2 ja R2 ovat kumpikin toisistaan riippumatta iso-propyyli-, isobutyyli-, sec-butyyli-, n-butyyli- tai 2-(metyylitio)etyyliryhmä, 2 95913 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi .

Nämä uudet sykliset peptidijohdannaiset ovat neuro-kiniini A:n antagonisteja ja ovat siten hyödyllisiä ast-5 manvastaisia, anti-inflammatorisia ja antiartriittisia aineita.

Aine P ja sen sukuiset takykiniinit, neurokiniini A ja neurokiniini B, ovat ryhmä luonnossa esiintyviä peptidejä, joiden on osoitettu esiintyvän laajasti ruumiin ku-10 doksissa ja joilla on osoitettu olevan laaja valikoima biologisia vaikutuksia. Vaikka aine P:n ja neurokiniini B:n agonisteja ja antagonisteja tunnetaan ja vaikka neurokiniini A:n agonisteja myös tunnetaan, neurokiniini A:n antagonisteja ei vielä ole raportoitu. Hakijat ovat nyt 15 löytäneet neurokiniini A: n antagonistiluokan. Tällaiset yhdisteet eivät ole vain mielenkiintoisia biokemiallisesta näkökulmasta, vaan tällaisilla yhdisteillä on myös arvokkaita farmakologisia ja lääketieteellisiä käyttömahdollisuuksia.

20 Julkaisussa Pept. Proc. Eur. Pept. Symp. 18th Symp.

(1984) 369-372 kuvataan syklisten aine P -peptidijohdannaisten synteesi, jolloin syklisoituminen saadaan aikaan joko kytkemällä Glu5:n tai Glu6:n sivuketju Lys10:n tai Lysu:n sivuketjuun tai kytkemällä Glu6:n sivuketju C-ter-:* 25 minaaliseen amidiryhmään etyleenisillan välityksellä.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetut yhdisteet sitä vastoin ovat syklisiä neurokiniini A -antagonisteja. Lisäksi kaavan 1 mukaiset sykliset neurokiniini A -johdannaiset eroavat edellä mainitussa julkaisussa ku-30 vatuista peptideistä siinä, että yhdistäviä amidiseoksia on modifioitu, edullisesti pelkistetyksi amidi-isosteerik-si (-NR-CHj-), ja syklisoituminen tapahtuu peptidiketjun kahden terminaalisen aminohapon välillä.

Seuraavia aminohappojen ja amino- ja karboksitermi-35 naalisten ryhmien tavallisia lyhenteitä käytetään koko ajan tässä patenttijulkaisussa: 3 95913

Gly (tai G) - glysiini Ala (tai A) - alaniini Vai (tai V) - väliini Leu (tai L) - leusiini 5 Ile (tai I) - isoleusiini

Fum - fumaryyli Orn - ornitiini Pro (tai P) - proliini Phe (tai F) - fenyylialaniini 10 Trp (tai W) - tryptofaani

Met (tai M) - metioniini Ser (tai S) - seriini Thr (tai T) - treoniini Cys (tai C) - kysteiini 15 Tyr (tai Y) - tyrosiini

Asn (tai N) - asparagiini Gin (tai Q) - glutamiini Asp (tai D) - asparagiinihappo Glu (tai E) - glutamiinihappo 20 Lys (tai K) - lysiini

Arg (tai R) - arginiini His (tai H) - histidiini Nle - norleusiini Hyp - hydroksiproliini : 25 Cha - sykloheksyylialaniini

Glt - glutaryyli Mal - maleyyli β-Ala - S-alaniini Npa - β-(2-naftyyli)alaniini 30 Phg - fenyyliglysiini « “ 3,4-dehydroPro - 3,4-dehydroproliini NMePgl - N-metyylifenyyliglysiini Sar - sarkosiini (N-metyyliglysiini) pSubPhe - parasubstituoitu fenyylialaniini 35 SubPhe - orto-, meta- tai para-, mono- tai disubs- 4 95913 tituoitu fenyylialaniini

Ac - asetyyli

Sue - sukkkinyyli

Phe(4'-Cl) - parakloorifenyylialaniini 5 Phe(4'-N02) - paranitrofenyylialaniini NMeVal - N-metyylivaliini

Jokaisessa tapauksessa aminohapon kolmikirjaiminen koodi, jossa ensimmäinen kirjain on iso kirjain, merkit-10 see, että aminohapolla on L-konfiguraatio. Samaan tapaan, jos aminohapon kolmikirjaimisen koodin ensimmäinen kirjain on pieni kirjain, aminohapolla on D-konfiguraatio.

Alkyyliryhmän ja alkoksiryhmän alkyyliosan katsotaan sisältävän suorat, haarautuneet ja sykliset alkyyli-15 ryhmät, esimerkiksi metyyli, etyyli, propyyli, isopropyy-li, butyyli, isobutyyli ja tert-butyyli. Tämän keksinnön mukaisten fenyylialkyleeniryhmien alkyleenirakenneosa voi sisältää 1-6 hiiliatomia ja voi olla suora tai haarautunut, esimerkiksi metyleeni, etyleeni, propyleeni, butylee-20 ni, isopropylideeni ja sec-butylideeni. Tämän keksinnön mukaisten fenyylialkyleeniryhmien fenyylirakenneosa voi olla substituoimaton tai voi olla monosubstituoitu orto-, meta tai edullisesti para-asemaan. Substituoimaton fenyyli ja parahydroksifenyyli ovat edullisia. Halogeeniryhmä on : : 25 fluori-, kloori-, bromi- tai jodiryhmä.

Uudet yhdisteet voidaan myös esittää rakennekaavalla la.

i— Ai-A2-A3-a4 — 30 R2 Rl

- (0)C -J-n-ch2 -j-NH J

hr h 35 5 95913

Pitäisi olla ilmeistä, että uudet sykliset peptidi-johdannaiset käsittävät peptidejä, joissa luonnossa esiintyvän neurokiniini A:n kahden karboksiterminaalisen aminohapon normaalia peptidiamidisidosta on muunnettu ja lii-5 tetty syklisoimalla aminohappotähteeseen a2. Käyttäen pep-tidikemistien soveltamaa tavanomaista nimistöä, niitä kaavan 1 mukaisia yhdisteitä, joissa Rx ja R2 ovat kumpikin sec-butyyliryhmiä, ja B on ryhmä -NHCH2- (ts. ne yhdisteet, joissa aminohappotähteen A4 aminohappotähteeseen Ax liittä-10 vä rakenneosa koostuu kahdesta Leu-tähteestä, joita liittää toisiinsa pelkistetty amidisidos), voidaan merkitä Leu ijr[CH2NH]Leu. Tämä merkintätapa ilmaisee, että toiseksi viimeisen Leu:n amidikarbonyyliryhmä on pelkistetty mety-leeniryhmäksi- 15 Termi "mikä tahansa aminohappo", kuten sitä tässä käytetään, sisältää luonnossa esiintyvät aminohapot kuin myös muut sellaiset "proteiineihin kuulumattomat" a-ami-nohapot, joita peptidikemian asiantuntijat yleisesti käyttävät valmistettaessa synteettisiä analogeja luonnossa 20 esiintyville peptideille. Luonnossa esiintyvät aminohapot ovat glysiini, alaniini, β-alaniini, väliini, leusiini, isoleusiini, seriini, metioniini, treoniini, fenyyliala-niini, tyrosiini, tryptofaani, kysteiini, proliini, histi-diini, asparagiinihappo, asparagiini, glutamiinihappo, ·.*. 25 glutamiini, arginiini, ornitiini ja lysiini. Esimerkkejä "proteiineihin kuulumattomista" a-aminohapoista ovat nor-leusiini, norvaliini, alloisoleusiini, homoarginiini, tia-proliini, dehydroproliini, hydroksiproliini (Hyp), homose-riini, sykloheksyyliglysiini (Chg), a-amino-n-butaanihappo 30 (Aba), sykloheksyylialaniini (Cha), aminofenyylibutaani- *· happo (Pba), fenyylialaniinit, jotka on substituoitu fe- nyylirakenneosan orto-, meta- tai para-asemaan yhdellä tai kahdella seuraavista: (C^-C* )-alkyyli-, (Cj-C4 )-alkoksi-, halogeeni- ja nitroryhmät, tai substituoitu metyleenidiok-35 siryhmällä, β-2- ja -3-tienyylialaniini, β-2- ja -3-fura- - · · 6 95913 nyyliaianiini, β-2-, -3- ja -4-pyridyylialaniini, B-(bent-sotienyl-2- ja -3-yyli)alaniini, β-(1- ja -2-naftyyli)ala-niini, seriinin, treoniinin ja tyrosiinin O-alkyloidut johdannaiset, S-alkyloitu kysteiini, tyrosiinin O-sulfaat-5 tiesteri, 3,5-dijodityrosiini ja luonnossa esiintyvien aminohappojen D-isomeerit.

Luonnossa esiintyvät aminohapot, paitsi glysiini ja β-alaniini, sisältävät kiraalisen hiiliatomin. Ellei erityisesti toisin ilmoiteta, optisesti aktiivisilla aminoha-10 poilla, joihin tässä viitataan, on L-konfiguraatio. Kuten on tapana, tässä esiin kirjoitettu peptidien rakenne on sellainen, että aminoterminaalinen pää on vasemmalla puolella ketjua ja karboksiterminaalinen pää on oikealla puolella ketjua.

15 Kaavan 1 mukaiset polypeptidit voivat muodostaa farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja minkä tahansa ei-toksisen orgaanisen tai epäorgaanisen hapon kanssa. Kuvaaviin epäorgaanisiin happoihin, jotka muodostavat hyväksyttäviä suoloja, kuuluvat suola-, vetybromidi-, rikki- ja 20 fosforihappo, ja happamat metallisuolat, kuten natrium- monovetyortofosfaatti ja kaliumvetysulfaatti. Kuvaaviin orgaanisiin happoihin, jotka muodostavat hyväksyttäviä suoloja, kuuluvat mono-, di- ja trikarboksyylihapot. Kuvaavia tällaisista hapoista ovat esimerkiksi etikka-, gly-25 köli-, maito-, palorypäle-, maloni-, meripihka-, glutaa- ri-, fumaari-, omena-, viini-, sitruuna-, askorbiini-, ma-leiini-, hydroksimaleiini-, bentsoe-, hydroksibentsoe-, fenyylietikka-, kaneli-, salisyyli-, 2-fenoksibentsoe-sekä sulfonihapot, kuten metaanisulfonihappo ja 2-hydrok-30 sietaanisulfonihappo.

^ Kuten missä tahansa geneerisessä yhdisteryhmässä, tietyt ryhmät ovat edullisia. Edullisina pidetään niitä kaavan 1 mukaisia peptidijohdannaisia, joissa kumpikin A2 ja A3 on Trp, trp, Phe, phe, Tyr, tyr, Cha, cha, Phg tai 35 phg, ja niitä peptidijohdannaisia, joissa A4 on Gly, Ala • · 7 95913 tai ala. Edullisempia ovat ne peptidijohdannaiset, joissa Ax on Gin, kumpikin A2 ja A3 on Trp tai Phe, ja A4 on Gly.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan 1 mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi on tunnusomaista, että 5 A. peräkkäin sidotaan Boc-A4, Boc-A3, Boc-a2 ja Boc-

Aj, joissa Boc on aminoryhmän butyylioksikarbonyylisuojary-hmä, hartsiin sidottuun, muunnetun sidoksen sisältävään dipeptidijohdannaiseen, jolla on kaava

10 H H

NH2 1 I ·B 11 I ~ CO “O Rl R2 15 jossa Rx, R2 ja B ovat edellä määriteltyjä, ja jossa ryhmä Θ 20 on hartsi, kasvavan peptidiketjun terminaaliseen aminoryh-mään, joka on sillä välin paljastettu poistamalla sen ami-nosuojaryhmä, ja sen jälkeen tuote irrotetaan hartsista ja , lineaarinen johdannainen syklisoidaan trietyyliamiinilla 25 ja difenyylifosfonyyliatsidilla, tai B. a) peräkkäin sidotaan Boc-A3, Boc-A2, Boc-A1 ja sellainen aminohappo, jolla on kaava

H

30

Boc--C02H

R2 8 95913 joissa Boc on aminoryhmän butyylioksikarbonyylisuojaryhmä ja A3, A2, A3 ja R2 ovat edellä määriteltyjä, hartsiin sidottuun aminohappojohdannaiseen, jolla on kaava 5 jossa „ Θ on hartsi ja jossa A4 on edellä määritellyn mukainen, kasvavan peptidiketjun terminaaliseen aminoryhmään, joka on sillä välin paljastettu poistamalla sen aminosuojaryhmä, b) kondensoidaan aminoaldehydi, jolla on kaava 15

H

Boc--CHO

Rl 20 jossa R: on edellä määritellyn mukainen, sekoittamalla ami-noaldehydin etikkahapossa ja dimetyyliformamidissa olevaa liuosta hartsiin sidottuun välituotteeseen ja c) irrotetaan peptidi hartsista ja syklisoidaan lineaarinen johdannainen reaktiolla trietyyliamiinin ja 25 difenyylifosfonyyliatsidin kanssa.

Kaavan 1 mukaiset peptidit voidaan valmistaa joukolla erilaisia menetelmiä, jotka ovat alan ammattimiesten tiedossa. Tällaisiin menetelmiin kuuluu siis kiinteän faasin sekventiaalinen menetelmä, joka voidaan toteuttaa 30 käyttäen vakiintuneita automatisoituja menetelmiä, kuten : käyttäen automatisoitua peptidisyntetisaattoria. Kaavan 1 mukaisten peptidi johdannaisten valmistamiseksi A4:ä vastaavaa, hartsiin sidottua aminohappoa käytetään A3:a, A2:a ja Ax:ä vastaavien aminohappojen ja lopuksi NH2CHR2C02H:ta vas-35 taavan aminohapon lisäämiseksi peräkkäin. Sen jälkeen • f < 9 95913 muunnettu "Β''-amidisidos muodostetaan lisäämällä NH2CHR1C02H:ta vastaava aminohappo, irrottamalla hartsista ja syklisoimalla. Kunkin muunnetun peptidisidoksen valmistamiseksi käytettävät menetelmät ovat sinänsä tunnettuja 5 ja taitavat peptidikemistit toteuttavat ne vaivatta. Menetelmä sellaisten kaavan 1 mukaisten peptidijohdannaisten valmistamiseksi, joissa B on ryhmä -CH2NH-, siis ψ[(3Η2ΝΗ]-yhdisteiden valmistamiseksi, tunnetaan julkaisusta Sasaki ja Coy, Peptides, Voi. 8. s. 119-121, 1987, ja se kuvataan 10 tarkemmin edempänä. Menetelmä kaavaa 1 vastaavien peptidi-johdannaisten valmistamiseksi, joissa B kuitenkin on ryhmä -NHCO-, siis ψ[NHCO]-yhdisteiden, tunnetaan julkaisusta Chorev ja Goodman, Int. J. Pept. Protein Res.. 21(3). 258-68 (1983). Menetelmä kaavaa 1 vastaavien peptidijohdan-15 naisten valmistamiseksi, joissa B kuitenkin on ryhmä -C0CH2- tai -CH(0H)CH2-, siis vastaavien i|r[C0CH2]- ja i|i[CH(0H)CH2]- yhdisteiden, tunnetaan julkaisusta Holladay ja Rich, Tetrahedron Letters, 24(41). 4401-04, (1983).

Menetelmä kaavaa 1 vastaavien peptidijohdannaisten valmis-20 tamiseksi, joissa B kuitenkin on ryhmä -CH2S-, siis i|»[CH2S]--yhdisteiden, tunnetaan julkaisusta Spatola ja Darlak, Tetrahedron Letters, 44(3). 821-33 (1988). Menetelmä kaavaa 1 vastaavien peptidijohdannaisten valmistamiseksi, joissa B kuitenkin on ryhmä -CH20-, siis i|r[CH20]-yhdistei- ' ' 25 den, tunnetaan julkaisusta TenBrink, J. Pro. Chem.. 1987, 52, 418-22.

Sen jälkeen kun lineaarinen peptidi on irrotettu hartsista ja halutut suojaryhmät poistettu, lineaarinen peptidi syklisoidaan käyttäen tavanomaisia menetelmiä, ku-30 ten käsittelyä trietyylietyyliamiinilla ja difenyylifos- * fonyyliatsidilla dimetyyliformamidissa. Ennen epäpuhtaan syklisen peptidin puhdistusta tavalliseen tapaan, kuten kromatografiaa käyttämällä, mahdolliset jäljellä olevat suojaryhmät tai funktionaalisten ryhmien esiasteet pois- 35 tetaan tai muutetaan halutuksi ryhmäksi.

* 1 · 10 95913

Spesifisesti kaavan 1 mukaiset yhdisteet, joissa B on ryhmä -CH2N(R)-, valmistetaan pelkistämällä kaavan 3 mukainen N-metoksi-N-metyyliamidi kaavan 4 mukaisen alde-hydin tuottamiseksi. Pelkistys voidaan suorittaa millä ta-5 hansa sinänsä tunnetulla ja ammattimiesten helposti toteuttamalla tavalla, kuten käyttäen litiumaluminiumhydridiä (LAH). Tämä pelkistys voidaan suorittaa sopivasti lisäämällä noin yksi molaarinen ekvivalentti LAH:ä jäähdytettyyn, tyypillisesti noin 0 °C:seen liuokseen, jossa on 10 kaavan 3 mukaista yhdistettä ei-reaktiivisessa liuottimes-sa, kuten eetteriliuottimessa, kuten tetrahydrofuraanissa (THF) tai dietyylieetterissä. Sen jälkeen kun reaktio on olennaisesti täydellinen, tyypillisesti noin 30 minuutin kuluttua, reaktioseos sammutetaan lisäämällä esimerkiksi 15 10 % kalium- tai natriumvetysulfaattia ja sitten vettä.

Tuote voidaan sitten eristää esimerkiksi uuttamalla ve-siseosta liuottimena, kuten dietyylieetterillä, pesemällä eetterifaasi kylmällä, laimealla suolahapon vesiliuoksella, kuivaamalla ja poistamalla liuotin.

»· · • 4 1

Iti I Hitti 1:11*· · 11 95913 0 ? 5 BocNH \ JL BocNH^ y \0H Y xn —och3 -►

Rl Rl CH3 2 3

10 LAH/THF

Γ 1)NH2 0

1S BocNv' - ,_1 BotNV\H

f NH I 2) NaCNBH3 X| H, 0 R, 5 4 20

Kaavan 4 mukainen aldehydi saatetaan sitten reagoimaan kaavan 6 mukaisen hartsiin sidotun peptidin kanssa 25 f 0 “γ1'® R2 30 jossa R ja R2 ovat kaavalle 1 määriteltyjen mukaiset ja jossa ® on peptidihartsi. Aluksi muodostuva Schiffin emäs -addukti pelkistetään in situ käyttäen esimerkiksi natri-umsyaaniboorihydridiä, tuloksena kaavan 7 mukainen hart-35 siin sidottu muunnettu dipeptidi

. « I

12 95913

ö R

Ri | O

5 Boc-NH CHz 7 R2 jossa R, Rz ja Rz ovat kaavalle 1 määriteltyjen mukaiset ja jossa ® on peptidihartsi.

10 Kaavan 3 mukaiset N-metoksi-N-metyyliamidit valmis tetaan vastaavasta N-Boc-suojatusta haposta tavalliseen tapaan. Karbonyylidi-imidatsolia lisätään N-Boc-suojatun aminohapon kuivatulle liuokselle eetteriliuottimessa, kuten dietyylieetterissä. Reaktioseoksen annetaan sekoittua 15 10 minuutista tuntiin, tyypillisesti noin 15-20 minuuttia.

N,0-dimetyylihydroksyyliamiini-HCl:a DMF:ssä ja steerises-ti estettyä amiinia, kuten di-isopropyylietyyliamiinia, lisätään, ja seoksen annetaan sekoittua noin 6 tunnista 24 tuntiin asti huoneenlämmössä. Sitten haluttu tuote eriste-20 tään haihduttamalla liuotin, ja karkea puhdistus voidaan suorittaa esimerkiksi flash-kromatografiällä piidioksidi-geelissä metyleenikloridi ajoliuoksena.

Käytetty hartsikantaja voi olla mikä tahansa poly-peptidien kiinteäfaasivalmistuksen alalla tavanomaisesti '? 25 käytetty sopiva hartsi, edullisesti polystyreeni, jota on ristisidottu 0,5 - 3 % divinyylibentseeniä, joka on joko kloorimetyloitu tai hydroksimetyloitu kohtien tarjoamiseksi esterin muodostamiseen aluksi mukaantuotavan a-amino-suojatun aminohapon kanssa.

30 Esimerkin hydroksimetyylihartsista ovat kuvanneet

Bodanszky ym., Chem. Ind. (London) 38. 1597-98 (1966).

Kloorimetyloitu hartsi on saatavana kaupallisesti Bio Rad Laboratoriesilta Kalifornian Richmondista, ja tällaisen hartsin valmistuksen ovat kuvanneet Stewart ym., "Solid 35 Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco

• I

il : iH i Hiili I I t in i 13 95913 1969), luku 1, s. 1-6. Suojattu aminohappo voidaan liittää hartsiin Gisinin menetelmällä, Helv. Chem. Acta, 56. 1476 (1973). Monia hartsiin liitettyjä suojattuja aminohappoja on saatavina kaupallisesti. Esimerkiksi sellaisen kaavan 1 5 mukaisen polypeptidin valmistamiseksi, jossa karboksiter-minaalinen pää on Thr-tähde, tert-butyylioksikarbonyyli-(Boc-) -suojattua Thr:a liitettynä bentsyloituun hydrok-simetyloituun fenyyliasetamidometyyli- (PAM-) -hartsiin voidaan käyttää, ja sitä on kaupallisesti saatavana.

10 α-aminosuojatun aminohapon hartsikantajaan kytkemi sen jälkeen suojaryhmä poistetaan käyttäen mitä tahansa sopivaa menetelmää, kuten käyttäen trifluorietikkahappoa metyleenikloridissa, trifluorietikkahappoa yksinään tai HCl:a dioksaanissa. Suojaryhmän poisto toteutetaan lämpö-15 tilassa 0 °C ja huoneenlämmön välillä. Muita normaaleja irrotusreagensseja ja olosuhteita spesifisten a-aminosuo-jaryhmien poistamiseksi voidaan käyttää, a-aminosuojaryh-män poistamisen jälkeen toiset aminosuojatut aminohapot liitetään peräkkäin halutussa järjestyksessä. Vaihtoehtoi-20 sesti useampia aminohapporyhmiä voidaan liittää yhteen liuosmenetelmällä ennen liittämistä hartsin kantamaan aminohapposekvenssiin .

Kunkin polypeptidisekvenssiin mukaan otettavan aminohapon kanssa käytettävä α-aminosuojaryhmä voi olla mikä • · ί : 25 tahansa alalla tunnettu tällainen suojaryhmä. Mahdollisten α-aminosuojaryhmäluokkien joukossa ovat (1) asyylityyppi-set suojaryhmät kuten: formyyli, trifluoriasetyyli, fta-lyyli, tolueenisulfonyyli (tosyyli), bentseenisulfonyyli, nitrofenyylisulfenyyli, trityylisulfenyyli, o-nitrofenok-30 siasetyyli ja α-klooributyyli, (2) aromaattiset uretaani-;. tyyppiset suojaryhmät kuten bentsyylioksikarbonyyli ja substituoitu bentsyylioksikarbonyyli, kuten p-klooribent-syylioksikarbonyyli, p-nitrobentsyylioksikarbonyyli, p-bromibentsyylioksikarbonyyli,p-metoksibentsyylioksikarbo-35 nyyli, 1-(p-bifenylyyli)-1-metyylietoksikarbonyyli, a, a- 14 95913 dimetyyli-3,5-dimetoksibentsyylioksikarbonyyli ja bents-hydryylioksikarbonyyli, (3) alifaattiset uretaanisuojaryh-mät kuten tert-butyylioksikarbonyyli (Boc), di-isopropyy-limetoksikarbonyyli, isopropyylioksikarbonyyli, etoksikar-5 bonyyli ja allyylioksikarbonyyli, (4) sykloalkyyliure-taanityyppiset suojaryhmät kuten syklopentyylioksikarbo-nyyli, adamantyylioksikarbonyyli ja sykloheksyylioksikar-bonyyli, (5) tiouretaanityyppiset suojaryhmät kuten fenyy-litiokarbonyyli, (6) alkyylityyppiset suojaryhmät kuten 10 trifenyylimetyyli (trityyli) ja bentsyyli, ja (7) trial- kyylisilaaniryhmät kuten trimetyylisilaani. Edullinen a-aminosuojaryhmä on tert-butyylioksikarbonyyli.

Asianmukaisen kytkemisreagenssin valinta on sinänsä tunnettua. Erityisen sopiva kytkentäreagenssi silloin, kun 15 lisättävä aminohappo on Gin, Asn tai Arg, on Ν,Ν'-di-iso-propyylikarbodi-imidi ja 1-hydroksibentsotriatsoli. Näiden reagenssien käyttö estää nitriilien ja laktaamien muodostumisen. Muita kytkentäreagensseja ovat (1) karbodi-imidit (esim. N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidi ja N-etyyli-N'-20 (γ-dimetyyliaminopropyylikarbodi-imidi), (2) syanamidit (esim. N,N-dibentsyylisyanamidi), (3) keteeni-imiinit, (4) iso-oksatsoliumsuolat (esim. N-etyyli-5-fenyyli-iso-oksat-solium-3'-sulfonaatti), (5) monosykliset typpeä sisältävät aromaattisluonteiset heterosykliset amidit, joissa on yh-25 destä neljään typpeä renkaassa, kuten imidatsolidit, py- ratsolidit, ja 1,2,4-triatsolidit. Spesifisiä hyödyllisiä heterosyklisiä amideja ovat N,N'-karbonyylidi-imidatsoli ja N,N'-karbonyyli-di-l,2,4-triatsoli, (6) alkoksyloitu asetyleeni (esim. etoksiasetyleeni), (7) reagenssit, jotka 30 muodostavat seka-anhydridin aminohapon karboksyylirakenne- osan kanssa (esim. etyylikloroformiaatti ja isobutyyliklo-roformiaatti) tai kytkettävän aminohapon symmetrinen an-hydridi (esim. Boc-Ala-O-Ala-Boc) ja (8) typpeä sisältävät heterosykliset yhdisteet, joilla on hydroksiryhmä yhdessä 35 rengastypessä (esim. N-hydroksiftaali-imidi, N-hydroksi- 15 95913 sukkinimidi ja 1-hydroksibentsotriatsoli). Muita aktivoin-tireagensseja ja niiden käyttöä peptidien kytkennässä on kuvannut Kapoor, J. Pharm. Sei.. 59, s. 1-27 (1970). Edullisena pidetään symmetrisen anhydridin käyttöä kytkentä-5 reagenssina kaikille aminohapoille paitsi Arg, Asn ja Gin.

Kulloistakin suojattua aminohappoa tai aminohapposekvenssi pannaan kiinteäfaasireaktoriin noin nelinkertainen ylimäärä, ja kytkentä suoritetaan liuoksessa dime-tyyliformamidirmetyleenikloridi (1:1) tai pelkässä dime-10 tyyliformamidissa tai edullisesti pelkässä metyleeniklori-dissa. Niissä tapauksissa, joissa epätäydellistä kytkeytymistä esiintyy, kytkentämenettely toistetaan ennen a-ami-nosuojaryhmän poistoa, joka edeltää seuraavan aminohapon kytkemistä kiinteäfaasireaktorissa. Kytkentäreaktion on-15 nistumista synteesin joka vaiheessa seurataan ninhydrii-nireaktiolla, kuten ovat kuvanneet E. Kaiser ym., Analvt. Biochem. 34. 595 (1970).

Sen jälkeen, kun haluttu aminohapposekvenssi on saatu, peptidi irrotetaan hartsista. Tämä voidaan tehdä 20 hydrolyysillä, kuten käsittelemällä hartsiin liittynyttä polypeptidiä liuoksella, jossa on dimetyylisulfidia, p-kresolia ja tiokresolia vedettömässä fluorivetyhapossa.

Kuten kiinteäfaasipeptidisynteesin alalla tiedetään, monilla aminohapoilla on funktionaalisia ryhmiä, : : 25 jotka vaativat suojausta ketjun valmistuksen aikana. Asi anmukaisen suojaryhmän käyttö ja valinta kuuluu ammattimiesten taitoihin, ja se riippuu suojattavasta aminohaposta sekä muiden suojattujen aminohappotähteiden läsnäolosta peptidissä. Tällaisen sivuketjusuojaryhmän valinta on sii-30 nä mielessä kriittistä, että sen pitää olla sellainen, joka ei irtoa α-aminorakenneosan suojaryhmän poiston aikana. Esimerkkejä sopivista sivuketjun suojaryhmistä ly-siinille ovat bentsyylioksikarbonyyli ja substituoitu bentsyylioksikarbonyyli, mainitun substituentin ollessa 35 valittu joukosta halogeeni (esim. kloori, bromi, fluori) 16 95913 ja nitro (esim. 2-klooribentsyylioksikarbonyyli, p-nitro-bentsyylioksikarbonyyli, 3,4-diklooribentsyylioksikarbo- nyyli), tosyyli, t-amyylioksikarbonyyli, t-butyylioksikar-bonyyli ja di-isopropyylimetoksikarbonyyli. Treoniinin ja 5 seriinin alkoholihydroksyyliryhmä voidaan suojata asetyy-li-, bentsoyyli-, tert-butyyli-, trityyli-, bentsyyli-, 2,6-diklooribentsyyli- tai bentsyylioksikarbonyyliryhmäl-lä. Asparagiinihapon ja glutamiinihapon karboksyylihydrok-syyliryhmä voidaan suojata bentsyyli- tai sykloheksyyli-10 ryhmällä. Edullinen suojaryhmä on bentsyyli.

Nämä ryhmät voidaan poistaa sinänsä tunnetulla tavalla. Tyypillisesti suojaryhmät poistetaan sen jälkeen, kun peptidiketjun synteesi on valmis, mutta suojaryhmät voidaa poistaa millä tahansa muulla sopivalla hetkellä.

15 Kaavan 1 mukaisten peptidijohdannaisten kyky toimia neurokiniini A:n antagonisteina voidaan osoittaa niiden kyvyllä kilpailla joditetun neurokiniini A:n kanssa nisäkkään neurokiniini A -reseptoreista (NK2-reseptoreista) käyttäen Buckin ym. menetelmää, Science 226: 987-989, 20 1984, ja niiden kyvyllä stimuloida tai inhiboida neuro kiniini A:n indusoimaa fosfatidyyli-inositolien kierrätystä käyttäen Bristowin ym. menetelmää, British J. Pharmacol. 90: 211-21, 1987.

Johtuen kaavan 1 mukaisten peptidijohdannaisten 25 kyvystä toimia neurokiniini A:n antagonisteina, ne ovat hyödyllisiä immunosupressoreina ja artriitin, astman, kivun, tulehduksen, kasvaimen kasvun, ruuansulatuskanavan liikaliikkuvuuden, Huntingtonin taudin, psykoosin, neurii-tin, neuralgian, päänsäryn, migreeni mukaanluettuna, kor-30 kean verenpaineen, virtsan pidätyskyvyttömyyden, urtikari-: an, karsinoidisyndrooman oireiden, infuenssan ja tavalli sen nuhakuumeen hoidossa. Ammattimiehet voivat vaivatta määrittää tehokkaat annokset, olivatpa ne suun kautta tai parenteraalisesti, ja ne ovat sellaiset annokset, jotka 35 aiheuttavat neurokiniini A -reseptorin (NKz-reseptorin) an- * · < 17 95913 tagonismin. Esimerkiksi kaavan 1 mukaisten peptidien tehokkaat annokset voisivat olla noin 0,5 pg - 500 mg potilaan painokiloa kohti päivässä. Yhdisteitä annetaan sopivasti sellaisten kerta-annosten muodossa, jotka sisältävät 5 noin 1 - 500 mg aktiivista yhdistettä ja joita voidaan antaa yhdestä neljään kerta-annosta päivässä. Tässä käytetyn termin "potilas" katsotaan tarkoittavan nisäkkäitä, kuten kädellisiä, ihmiset mukaanluettuina, lampaita, hevosia, nautoja, sikoja, koiria, kissoja, rottia ja hiiriä.

10 Vaikka jotkin peptidijohdannaisista voivat selvitä suolen läpi kulkemisesta suun kautta antamisen jälkeen, edullisena pidetään antamista muuten kuin suun kautta, esimerkiksi ihonalaisesti, laskimonsisäisesti, lihaksensisäisesti tai vatsaontelonsisäisesti, antamista depot-15 injektiona, implantaattivalmisteena, tai levittämällä limakalvoille, kuten nenän, nielun ja keuhkoputkien limakalvoille, esimerkiksi aerosolipullosta, joka sisältää kaavan 1 mukaisen peptidijohdannaisen sumutteen tai kuivan jauheen muodossa.

20 Parenteraalista antotapaa varten yhdisteet voidaan antaa injektiokelpoisina annoksina yhdisteen fysiologisesti soveliaassa laimennusaineessa olevaa liuosta tai suspensiota yhdessä farmaseuttisen kantajan kanssa, joka voi olla steriili neste, kuten vesi tai öljyt, johon on tai ei *: 25 ole lisätty pinta-aktiivista ainetta ja muita farmaseutti sesti hyväksyttäviä apuaineita. Esimerkkejä niistä öljyistä, joita voidaan käyttää valmisteissa, ovat raakaöljy-, eläin-, kasvi- ja synteettisperäiset, esimerkiksi maapähkinäöljy, soijaöljy ja mineraaliöljy. Yleensä vesi, suola-30 liuos, dekstroosin vesiliuos ja sen kaltaiset sokeriliuokset, etanoli sekä glykolit, kuten propyleeniglykoli ja po-lyetyleeniglykoli, ovat edullisia nestemäisiä kantajia, erityisesti injektoitaville liuoksille.

Yhdisteet voidaan antaa sellaisen depot-injektion 35 tai implantaattivalmisteen muodossa, joka voidaan formu- 18 95913 loida sillä tavoin, että vaikuttavaa ainetta pääsee vapautumaan jatkuvasti. Vaikuttava aine voidaan puristaa rakeiksi tai pieniksi lieriöiksi ja istuttaa ihon alle tai lihaksen sisään depot-injektioina tai implantaatteina. Im-5 plantaateissa voidaan käyttää inerttejä materiaaleja, kuten biohajoavia polymeerejä tai synteettisiä silikoneja, esimerkiksi Silasticia, Dow-Corning Corporationin valmistamaa silikonikumia.

Seuraavat ei-rajoittavat esimerkit valaisevat tätä 10 keksintöä.

Esimerkki 1

Neurokiniini A -reseptorin antagonismi syklisen Gln-Trp-Phe-Gly-Leu ψ[CH2NH]Leu:n ja syklisen Gln-Trp-Phe-Gly-Leu i|r[CH2NCH3]Leu:n vaikutuksesta osoitettuna kilpailu-15 na joditetun neurokiniini A:n reseptorilla

Virtsarakot useista hamstereista kerättiin yhteen, jauhettiin ja homogenisoitiin puskurissa 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), joka oli 120 mM NaCl:n suhteen ja 5 mM KCl:n suhteen, 4 eC:ssa ja sentrifugoitiin voimalla 48 000 x g 20 15 minuutin ajan. Pohjasakka jälleensuspensoitiin 30 mi nuutin ajaksi puskuriin 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), joka oli 10 mM EDTA:n suhteen ja 300 mM KCl:n suhteen, 4 °C:ssa. Suspensio sentrifugoitiin kuten edellä, ja pohjasakka pestiin kahdesti pelkällä 50 mM Tris-HCl -puskurilla (pH 7,4) :* 25 ja sentrifugoitiin samalla tavalla. Sitten kudos jälleen suspensoitiin inkubaatiopuskuriin, ja pieni näyte (noin 3 - 5 mg kudosta) lisättiin jokaiseen määritysputkeen määrityksen aloittamiseksi. Määritysputket sisälsivät inku-baatiopuskuria, joka koostui 50 mM Tris-HCl:stä (pH 7,4), 30 0,02 % BSArsta, 40 pg/ml basitrasiinista, 4 pg/ml kymos- : tatiinista, 4 pg/ml leupeptiinistä, 2 mM MnCl2:sta, ja 0,1 nM 125jodihistidyyli1-neurokiniini A: ta (Amersham Corp. ) sekä otsikon yhdisteiden ja standardien pitoisuuksia väliltä 0,03 nM - 100 pM. Määrityksen annettiin edetä tasa-35 painopisteeseen asti 120 minuutin ajan huoneenlämmössä.

19 95913 Tämän ajan jälkeen kunkin putken sisältö suodatettiin nopeasti läpi Whatmanin GF/B-suodattimista, joita oli etukäteen liotettu 0,5 % BSArssa, ja suodattimet pestiin nopeasti kahdesti jääkylmällä pelkällä 50 mM Tris-HCl-pusku-5 rilla (pH 7,4). Suodattimiin sitoutunut radioaktiivisuus kvantitoitiin gammalaskurissa. Spesifinen sitoutuminen (maksimi) määriteltiin sitoutumisten välisenä erona 1 μΜ leimaamattoman neurokiniini A: n (NKA) läsnäollessa tai poissaollessa. Testattavien yhdisteiden tai standardien 10 kilpailu joditetun NKA:n sitoutumista vastaan ilmaistiin prosentteina tästä maksimaalisesta kilpailusta. IC50-arvo-jen (pitoisuuksien, jotka vaadittiin inhiboimaan 50 % reseptoriin sitoutumisesta) havaittiin olevan 0,01-0,5 nM otsikon yhdisteille (kuvio 1).

15 Esimerkki 2

Neurokiniini A -reseptorin antagonismi syklisen Gln-Trp-Phe-Gly-Leu t|r[CH2NH]Leu:n ja syklisen Gln-Trp-Phe-Gly-Leu ψ[0Η2Ν0Η3] Leu:n vaikutuksesta osoitettuna vaikutuksena fosfatidyyli-inositoliaineenvaihduntaan 20 Virtsarakot useista hamstereista kerättiin yhteen ja silputtiin 350 pm kokoon kudossilppurilla. Sitten silputtua kudosta inkuboitiin 37 °C:ssa Krebs-HEPES-puskuris-sa vaihtaen tuoretta puskuria 15 - 30 minuutin välein. Sitten kudosta inkuboitiin tässä puskurissa, joka sisälsi ·* 25 100 - 200 pCi 3H-inositolia, 37 °C:ssa. Sitten kudos pes tiin, ja sitä inkuboitiin toiset 30 minuuttia Krebs-HEPES-puskurissa (jossa oli 10 mM Li*) 37 °C:ssa vaihtaen tuoretta puskuria 15 minuutin välein. Näytteitä kudosmassasta (noin 10 - 20 mg määritysputkea kohti) pantiin sitten Li*-30 puskuriin, testattavat yhdisteet lisättiin 25 piissä, ja j·* eri konsentraatioita NKA:ta lisättiin 25 plrssa 250 pl lo pulliseen tilavuuteen. Testattava yhdiste tutkittiin pitoisuuksina välillä 1 nM - 100 pM, ja NKA-pitoisuudet olivat välillä 1 nM * 10 pM. Testattava yhdiste tutkittiin 35 myös yksinään ilmoitettuina pitoisuuksina agonistiaktiivi- 20 95913 suuden testaamiseksi. 30 minuutin kuluttua huoneenlämmössä fosfatidyyli-inositolien käyttö lopetettiin lisäämällä 940 μΐ kloroformirmetanolia (1:2), sen jälkeen 310 μΐ kloroformia, sen jälkeen 310 μΐ vettä. Sitten kutakin putkea 5 sekoitettiin vortexilla 15 sekuntia ja sitten sentrifugoi-tiin nopeudella 3000 rpm 10 minuuttia faasien erottamiseksi. 900 μΐ yläfaasista (vesifaasista) laitettiin sitten 0,5 ml:n Bio-Rad AG-lX8-ioninvaihtopylvääseen (formiaatti-muodossa). 50 μΐ alafaasista (kloroformifaasista) otettiin 10 joka putkesta ja pantiin laskentaputkeen, kuivattiin ja laskettiin tuikenesteessä. Pylväissä olevaa materiaalia pestiin järjestyksessä: 1) 10 ml vettä

2) 5 ml puskuria 5 mM dinatriumtetraboraatti/60 mM

15 natriumformiaatti 3) 10 ml IM ammoniumformiaattia 0,1 M muurahaishapossa

Viimeinen (kolmas) pesuliuos kerättiin talteen ja 1 ml sekoitettiin 6 ml:n ACS-tuikeainetta kanssa ja laskettiin.

20 Sitten näiden lukemien (kaikki inositolifosfaatit) suhde vastaaviin orgaanisen faasin lukemiin laskettiin joka näytteelle. Suhteita testattavien yhdisteiden ja/tai standardien läsnäollessa vertailtiin sitten suhteisiin kont-rolliputkissa (ts. ilman stimuloivaa agonistia). Annos-25 vaste -käyrät laadittiin ja testattavien yhdisteiden kyvyt stimuloida tai inhiboida neurokiniini A:n indusoimaa fos-fatidyyli-inositoliaineenvaihduntaa määritettiin graafisella analyysillä tai tietokoneohjelman avulla. Nämä esitetään kuvioissa 2-5.

30 Esimerkki 3 • Neurokiniini A:n antagonismi syklisen Gln-Trp-Phe-

Gly-Leu ψ[ΟΗ2ΝΟΗ3]Leu:n vaikutuksesta in situ rotan virtsa rakon preparoinnissa

Rottia (Sprague-Dawley naaraita, 150-200 g) nuku-35 tettiin ketamiini-HCl:11a (100 mg/kg i.p.) uretaanilla 21 95913 täydennettynä (1,2 g/kg i.p.). Rakko otettiin esiin ja tyhjennettiin Drayn menetelmän (J. Pharmacol. Methods 13: 157-65, (1985)) mukaisesti. Neula pantiin virtsarakon kolmion kärkeen, ja suolaliuosta perfusoitiin rakon läpi no-5 peudella 100 μΐ minuutissa. Rakon ulosvirtaama kerättiin virtsaputkeen asetetun polyetyleenikanyylin kautta. Rakon supistuksia tarkkailtiin virtaus-paine -anturilla, joka oli kytketty sarjaan perfuusiosysteemin kanssa. Testattavia yhdisteitä pantiin virtsarakon kolmion päälle 40 - 100 10 pl:ssa suolaliuosta tai sellaista suolaliuosta, jossa oli mahdollisimman pieni määrä DMS0:ta. Kantaja-aineella, jossa oli 75 %:in asti DMS0:ta, ei ollut suoraa vaikutusta, eikä se vaikuttanut myöhemmän NKA:n aiheuttamiin supistuksiin. NKA:n kynnyspitoisuus supistukseen oli noin 10 pg, 15 ja tätä määrää käytettiin rutiininomaisesti. Antagonistia pantiin samaan tapaan rakon päälle 5 minuuttia ennen NKA:n panemista toistamiseen. 10 pg:n NKA:ta paneminen toistamiseen ei aiheuttanut takyfylaksiaa. Supistuksen amplitudi (voima) ja yhden minuutin aikavälit tallennettiin jatku-20 vasti kultakin eläimeltä. Kuviossa 6 nähdään esimerkkejä käyristä.

Esimerkki 4 I. Boc-Leu-aldehydin synteesi (Fehrentz, J.-A. ja Castro, B. Synthesis. 1983, 676-678): 25 A. N-t-Boc-leusiini-N-metoksi-N-metyyliamidi: 15,0 mmol Boc-leusiinihydraattia liuotettiin 30 ml:an kuivaa eetteriä. Liuos kuivattiin vedettömällä MgS04:lla, ja kiinteä aine poistettiin suodatuksella. 16,5 mmol karbonyylidi-imidatsolia lisättiin suodokseen, ja 30 reaktioseosta sekoitettiin 20 minuuttia huoneenlämmössä. Saatuun liuokseen lisättiin suspensio, jossa oli 0,N-dime-tyylihydroksyyliamiinihydrokloridia (22,5 mmol) 15 ml:ssa dimetyyliformamidia ja 3,9 ml di-isopropyylietyyliamiinia. Reaktioseosta sekoitettiin yli yön huoneenlämmössä. Reak-35 tioseos laimennettiin etyyliasetaatilla (75 ml) ja pestiin 22 95913 kylmällä 1 N HClrlla (3 x 40 ml), kyllästetyllä NaHC03:lla (3 x 40 ml) ja kyllästetyllä NaClrlla (1 x 40 ml). Orgaaninen faasi kuivattiin MgS04:lla, suodatettiin, ja etyyliasetaatti poistettiin in vacuo. Analyysitiedot: Rf (pii-5 dioksidigeeli F254): 0,51 (etyyliasetaatti/heksaani 3/2); 1H-NMR (CDC13) (TMS sis.): 6=0,95 ppm (2d, 6H, J=6,6 Hz); 1,42 (s, 11 H); 1,64-1,80 (m, 1H); 3,20 (s, 3H); 3,80 (s, 3H); 4,72 (m, 1H); 5,10 (d, 1H, J=7,5 Hz). Massaspektr: M+H*: teorettinen 275, havaittu 275.

10 B. Boc-leusiinialdehydi: 2,5 mmol Boc-leusiini-N-metoksi-N-metyyliamidia liuotettiin kuivaan eetteriin (30 ml). Tähän liuokseen lisättiin 3,2 mmol litiumaluminiumhydridiä (1 M liuos tet-rahydrofuraanissa). Reaktioseosta sekoitettiin 20 minuut-15 tia huoneenlämmössä ja sitten reaktio sammutettiin huolellisesti lisäämällä liuos, jossa oli NaHS04:a (0,6 g) 10 ml:ssa vettä. Reaktioseos lisättiin 75 ml:an eetteriä ja pestiin kylmällä 1 N HCl:lla (3 x 30 ml), kyllästetyllä NaHC03:lla (3 x 30 ml) ja kyllästetyllä NaCl:lla (1 x 30 20 ml). Orgaaninen faasi kuivattiin MgS04:lla, suodatettiin, ja liuotin poistettiin in vacuo. Analyysitiedot: Rf (pii-dioksidigeeli 60 F254): 0,68 (etyyliasetaatti/heksaani 3/2). Massaspektr: M+H*: teorettinen 216, havaittu 216.

II. Leu-Gln-Trp(CHO)-Phe-Gly-PAM-hartsin synteesi: ?· 25 Normaaleja kiinteän faasin peptidisynteesiteknii koita automatisoidulla peptidisyntetisaattorilla käytettiin alkaen Boc-Gly-PAM-hartsista. Loput aminohapot lisättiin peräkkäin (Phe, Trp(CHO), Gin, Leu). Sitten Boc-suo-jaryhmä poistettiin trifluorietikkahapolla, hartsi neutra-30 loitiin di-isopropyylietyyliamiinilla. Sitten hartsi pes-* tiin dimetyyliformamidilla ja dikloorimetaanilla ja kui vattiin.

« · 4 23 95913 III. Pelkistetyn amidisidoksen (Leu t|r[CH2NH]Leu) muodostaminen

Boc-Leu-aldehydi (2 mmol) liuotettiin 1 % etikka-happoon dimetyyliformamidissa (10 ml), ja tämä liuos li-5 sättiin reaktioastiaan, jossa oli peptidi-hartsi (0,5 mmol, ks. II edellä). Tähän seokseen lisättiin liuos, jossa oli NaCNBH3:ä (150 mg) 2 ml:ssa dimetyyliformamidia. Seosta ravisteltiin 4 tuntia, reaktioastia laskettiin kuivaksi, ja hartsi pestiin dimetyyliformamidilla, sitten di-10 kloorimetaanilla.

IV. Syklo[Leu i|i[CH2NH]Leu-Gln-Trp-Phe-Gly] :n synteesi:

Peptidi irrotettiin hartsista, ja kaikki suojaryh-mät poistettiin käyttäen vedetöntä HF:a ja anisolia 15 (10:1). Osa epäpuhdasta peptidiä (77 mg) syklisoitiin li uottamalla dimetyyliformamidiin (15 ml) ja sitten lisäämällä trietyyliamiinia (0,2 ml) ja difenyylifosfonyyliat-sidia (0,08 ml). Huoneenlämmössä 12 tunnin sekoittamisen jälkeen liuotin poistettiin in vacuo. Sitten Trp(CH0)-täh-20 de deformyloitiin liuottamalla epäpuhdas syklinen peptidi liuokseen 1:1 asetonitriili:vesi (v/v) (60 ml) ja lisäämällä trietyyliamiinia (2,0 ml). Deformylaatioreaktioseos-ta sekoitettiin 12 tuntia huoneenlämmössä, ja sitten liuotin poistettiin in vacuo. Epäpuhdas syklinen peptidi puh-25 distettiin käyttäen käänteisfaasi-HPLC-menetelmiä puhtaan yhdisteen saamiseksi. Saanto: 27,9 mg, 38,2 pmol. Analyysitiedot: Aminohappoanalyysi (HCl-digesti): Glx (0,83),

Phe (0,97), Gly (1,03); nopea-atomipommitusmassaspektro-metria: (M+H)*; teoreettinen 731, havaittu 731; peptidipi-30 toisuus: 50,7 %.

.,· V. Syklo[Leu f[CH2NCH3]Leu-Gln-Trp-Phe-Gly] :n syn teesi : N-metyyli-Leu-Gln-Trp(CHO)-Phe-Gly-PAM-hartsi(valmistettu edeltävän kohdan II mukaisesti käyttäen Boc-N-me-35 tyylileusiinia) saatettiin reagoimaan 2,0 mmol Boc-Leu ai- 24 95913 dehydiä kanssa kuten kohdassa III edellä on kuvattu. Sitten peptidisynteesi päätettiin kuten kohdassa IV edellä on kuvattu. Analyysitiedot: Aminohappoanalyysi (HCl-digesti): Glx (0,72), Gly (1,04), Phe (0,96). Peptidipitoisuus: 63,7 5 %. Nopea-atomipommitusmassaspektrometria: M+H*; teoreetti nen 745, havaittu 745.

VI. Syklo[Leu i|i[CH2NR]Leu-Gln-Trp-Phe-Gly] :n synteesi :

Boc-Leu [ ψ( CH2NH) ] -Leu-Gln-Trp( CHO)-Phe-Gly-PAM-hart-10 si valmistetaan edeltävien vaiheiden II ja III mukaisesti. Sitten hartsi saatetaan reagoimaan 2,5 mmol R-CHO:ta kanssa 10 ml:ssa 1 % H0Ac:a dimetyyliformamidissa NaCNBH3:n läsnäollessa kuten kohdassa III edellä on kuvattu. Sitten peptidin synteesi päätetään kuten kuten kohdassa IV edellä 15 on kuvattu.

Kuvio 1 kuvaa syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu) :n ja syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu) :n kykyä antagoni-soida agonistin sitoutumista NKA-reseptoriin, kuten osoittaa testattavien yhdisteiden kyky kilpailla 125I-leimatun 20 NKA:n kanssa sitoutumisesta hamsterin virtsarakkoon (esi merkki 1). Abskissa (x-akseli) ilmaisee logaritmisesti neurokiniini A (NKA-) -reseptorin agonistin tai antagonistin pitoisuuden. Ordinaatta (y-akseli) ilmaisee havaitun spesifisen sitoutumisen kullekin testatulle agonistille *. 25 tai antagonistille mitattuna prosentteina maksimaalisesta spesifisestä sitoutumisesta. Kokeet ovat keskiarvo ± keskiarvon standardipoikkeama 6-12 kokeesta. IC50-arvot arvioitiin graafisesti 50 %:n inhibition pisteistä ja luetellaan kuviossa. Syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu) 30 oli voimakkaampi kilpailija kuin syklo(Gln-Trp-Phe-Gly- ; Leu-CH2NH-Leu) ja oli voimakkaampi kuin agonisti, NKA, it se.

. · · < il i M·» Mfc ' - 25 95913

-- NKA

-«·- Syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu ) g Syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu) 5 Kuviot 2 ja 3 kuvaavat vastaavasti syklo(Gln-Trp-

Phe-Gly-Leu-CHjNH-Leu ):n ja syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu):n kykyä tuottaa annoksesta riippuva reseptori-välitteisen, NKA:n indusoiman PI-kierrätyksen antagonismi hamsterin virtsarakossa (esimerkki 2). Abskissa (x-akseli) 10 ilmaisee logaritmisesti NKA-reseptorin agonistin tai antagonistin pitoisuuden. Ordinaatta (y-akseli) ilmaisee havaitun PI-kierrätyksen prosentteina kontrollista. Arvot ovat keskiarvo ± keskiarvon standardipoikkeama yhdestä kolmella rinnakkaisella suoritetusta kokeesta. Kunkin an-15 nos-vaste -käyrän identiteetti on kuvioissa luetellun mukainen. Syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu) (kuvio 2) 10 nM ja 100 nM pitoisuuksina sekä syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu) (kuvio 3) 100 nM, 1 μΜ ja 10 μΜ pitoisuuksina siirsivät NKA:n annos-vaste -käyrää oikealle. Kumpikaan 20 yhdiste yksinään pitoisuuksina 10 μΜ asti ei indusoinut lainkaan PI-kierrätystä.

Kuvio 2 -Θ- NKA

25 φ- syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu) -*Ss- NKA + lOOnM syklo( Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu) -rfb- NKA + 1 μΜ syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu) -B- NKA + 10 μΜ syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu) 30 Kuvio 3

-Θ- NKA

-·- syklo( Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu) -- NKA + lOOnM syklo( Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu ) _NKA + 1 μΜ syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu) --B- NKA + 10 μΜ syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu) 35 i 26 95913

Kuviot 4 ja 5 vertailevat syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu):n ja syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu) :n kykyjä antagonisoida reseptorivälitteistä, NKA:n indusoi-maa PI-kierrätystä hamsterin virtsarakossa (esimerkki 2).

5 Abskissa (x-akseli) ilmaisee logaritmisesti NKA-pitoisuu-den. Ordinaatta (y-akseli) ilmaisee havaitun PI-kierrätyk-sen prosentteina kontrollista. Arvot ovat keskiarvo ± keskiarvon standardipoikkeama yhdestä kolmella rinnakkaisella suoritetusta kokeesta. Kunkin annos-vaste -käyrän identi- 10 teetti on kuvioissa luetellun mukainen. Kumpikin peptidi pitoisuuksina 100 nM (kuvio 4) ja 1 μΜ (kuvio 5) tuotti samankaltaisen NKA:n annos-vaste -käyrän siirtymän oikealle. Kummassakin antagonistipitoisuudessa molemmat peptidit olivat keskenään yhtä vahvoja.

15

Kuvio 4 -e-N KA

-«s.-NKA + lOOnM syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu) -a-NKA + lOOnM syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu) 20

Kuvio 5 -θ-NKA

a NKA + ΙμΜ syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CHjNH-Leu) a NKA + ΙμΜ syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu) 25

Kuvio 6. Kun NKA:ta (10 pg) pantiin suoraan esiin otetulle virtsarakon kolmiolle nukutetuilla rotilla, se tuotti pitkittyneen yhtäjaksoisesti kouristavan supistuksen ja frekvenssin kasvun. Kun toinen identtinen annos 30 annettiin 5 minuuttia syklo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-• Leu):n (25 pg) antamisen jälkeen, NKA:n vaikutukset olivat huomattavasti heikentyneet tai täysin salpautuneet kahdessa eri rotassa. Kummastakin eläimestä näytetään jatkuva käyrä. Menetelmät esimerkissä 3 kuvatun mukaisesti.

«· ·

Claims (11)

1. 27 95913 Patenttivaatimus Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen syklisen neurokiniini A -peptidin valmistamiseksi, jolla on kaava 5 — Αχ-Ä2-A3 -a4 — Ra Rl 1
2. 10 -OC--B--NH — H H jossa Ai on Gin, gin, Asn tai asn,
3. 15 A2 on Trp, trp, Phe, phe, Tyr, tyr, Phg, phg, Cha, cha, Phe(4’-Cl), phe(4'-Cl), Npa, npa, Phe(4'-N02) tai phe-( 4 ’ -N02), A3 on Trp, trp, Phe, phe, Tyr, tyr, Phg, phg, Cha, cha, Phe(4'-Cl), phe(4'-Cl), Npa, npa, Phe(4'-N02), phe(4'-20 N02), Vai tai vai; A4 on Gly, Ala, ala tai β-Ala, B on ryhmä, jolla on kaava
4. 25 -N-CH2- R jossa R on vetyatomi tai alkyyliryhmä, jossa on 1 - 4 hii-30 liatomia, tai fenyylialkyleeniryhmä, jossa alkyleeniraken- neosa on suora tai haarautunut ja 1 - 6-hiiliatominen ja jossa fenyylirakenneosa on substituoimaton tai on mono-• substituoitu Cj^-alkyyli-, C1.4-alkoksi-, hydroksi- tai ha logeeni ry hmä 11 ä,
5. 35 Rx ja R2 ovat kumpikin toisistaan riippumatta iso- propyyli-, isobutyyli-, sec-butyyli-, n-butyyli- tai 2-(metyylit io)etyyliryhmä, 28 95913 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että A. peräkkäin sidotaan Boc-A4, Boc-A3, Boc-A2 ja Boc-Aj, joissa Boc on aminoryhmän butyylioksikarbonyylisuojary- 5 hmä, hartsiin sidottuun, muunnetun sidoksen sisältävään dipeptidijohdannaiseen, jolla on kaava H H 10 Rl R2 jossa Rlf R2 ja B ovat edellä määriteltyjä, ja jossa 15 ryhmä Θ on hartsi, kasvavan peptidiketjun terminaaliseen aminoryh-20 mään, joka on sillä välin paljastettu poistamalla sen ami-nosuojaryhmä, ja sen jälkeen tuote irrotetaan hartsista ja lineaarinen johdannainen syklisoidaan trietyyliamiinilla ja difenyylifosfonyyliatsidilla, tai B. a) peräkkäin sidotaan Boc-A3, Boc-A2, Boc-Ai ja 25 sellainen aminohappo, jolla on kaava H Boc--C02H
6. 30 R2 « joissa Boc on aminoryhmän butyylioksikarbonyylisuojaryhmä ja A3, A2, At ja Rj ovat edellä määriteltyjä, hartsiin si-35 dottuun aminohappojohdannaiseen, jolla on kaava • ♦ I 29 95913 a4 — jossa Θ on hartsi ja jossa A4 on edellä määritellyn mukainen, kasvavan peptidiketjun terminaaliseen aminoryhmään, joka on 10 sillä välin paljastettu poistamalla sen aminosuojaryhmä, b) kondensoidaan aminoaldehydi, jolla on kaava H Boc--CHO 15 Ri jossa on edellä määritellyn mukainen, sekoittamalla ami-noaldehydin etikkahapossa ja dimetyyliformamidissa olevaa liuosta hartsiin sidottuun välituotteeseen ja 20 c) irrotetaan peptidi hartsista ja syklisoidaan lineaarinen johdannainen reaktiolla trietyyliamiinin ja difenyylifosfonyyliatsidin kanssa. » • · 95913 30 Förfarande för framställning av en terapeutiskt användbar cyklisk neurokinin A -peptid med formeln 5 — Αχ -Ä2 -A3 -A* — R2 Rl
7. 10 -OC--B--NH — H H i vilken
8. 15 Ax är Gin, gin, Asn eller asn, Ai är Gin, gin, Asn tai asn, A2 är Trp, trp, Phe, phe, Tyr, tyr, Phg, phg, Cha, cha, Phe(4'-Cl), phe(4’-Cl), Npa, npa, Phe(4'-N02) eller phe(4’-N02),
9. 20 A3 är Trp, trp, Phe, phe, Tyr, tyr, Phg, phg, Cha, cha, Phe(4'-Cl), phe(4'-Cl), Npa, npa, Phe(4'-N02), phe(4'-N02), Vai eller vai, A4 är Gly, Ala, ala eller β-Ala, B är en grupp med formeln ! 25 -N-CH2- R i vilken R är en väteatom eller en alkylgrupp med 1-4 30 kolatomer eller en fenylalkylengrupp, i vilken alkylen-* strukturdelen är rak eller förgrenad och innehäller 1-6 kolatomer och i vilken fenylstrukturdelen är osubstituerad eller monosubstituerad med en C^-alkyl-, C^-alkoxi-, hyd-roxi- eller halogengrupp, se t ai» iit «iM : s 31 95913 Rx och R2 är vardera oberoende av varandra en isopropyl-, isobutyl-, sec-butyl-, n-butyl- eller 2-(metyl-tio)etylgrupp, eller för framställning av ett farmaceutiskt god-5 tagbart sait av denna, kännetecknat därav, att A. Boc-A4, B0C-A3, Boc-A2 och Boc-Ä!, i vilka Boc är en butyloxikarbonylskyddsgrupp för aminogruppen, i nämnda ordningsföljd binds till ett dipeptidderivat som innehäl- 10 ler en modifierad bindning, är bunden tili ett harts och har formeln H H NH2 -| B 1— CO “O Rl R2 i vilken R2, R2 och B anger sanuna som ovan, och i vilken gruppen 20 Θ är ett harts, till den terminala aminogruppen i den växan- * 25 de peptidkedjan, som under tiden frilagts genom att amino-skyddsgruppen avlägsnats, varefter produkten lösgörs frän hartset och det lineära derivatet cykliseras med trietyla-min och difenylfosfonylazid, eller B. a) B0C-A3, Boc-A2 och BOC-Ä3 och en aminosyra med 30 formeln H Boc--C02H
10. 35 R2 32 95913 i vilka Boc är en butyloxikarbonylskyddsgrupp för aminog-ruppen och A3, A2, Ax och R2 anger samma som ovan, i nämnda ordningsföljd binds till ett aminosyraderivat som är bun-det till ett harts och har formeln 5 Ä4 - i vilken 10 ___ Θ är ett harts och A4 anger samma som ovan, till den ter-15 minala aminogruppen i den växande peptidkedjan, som under tiden frilagts genom att aminoskyddsgruppen avlägsnats, b) en aminoaldehyd med formeln H
11. 20 Boc--CHO Ri i vilken anger samma som ovan, kondenseras genom att blanda en lösning av aminoaldehyden i ättiksyra och dime-25 tylformamid med mellanprodukten som är bunden till hartset och c) peptiden lösgörs frän hartset och det lineära derivatet cykliseras genom en reaktion med trietylamin och difenylfosfonylazid.